Name: 섬유 아세포 유래 3D 매트릭스 시스템은 내피 튜브 형성 분석에 적용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 배우세요 섬유아세포 유래 3D 매트릭스를 이용한 내피 세포 튜브 형성 분석 방법을. 이 기술은 세포-세포외기질 상호작용 연구와 생물학적 환경 모델링에 활용됩니다.

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이 프로토콜의 개발은 PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 및 Rd12/0036/0041에 의해 지원되었다. 폰도 유럽 데 사롤로 지역 (FEDER); 에 의해 "CIBER 드 칸서", CB16/12/00273 및 CB16/12/00446, 인스티투토 드 살루드 카를로스 III-FEDER에서; 그리고 Fundación Científica AECC에 의해 (췌장암을 표적으로 하는 다각적인 접근). 크리스티나 페냐는 살루드 카를로스 III의 미겔 서브트 계약을 수령한 사람입니다. M. Eaude는 영어 텍스트를 도왔습니다. 우리는이 연구를 통해 도움과 조언을 실험실 회원에게 감사드립니다.

인간 조직 샘플은 마드리드 라몬 y 카잘 병원의 연구 윤리 위원회의 승인을 얻어 수 득하였다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>0.2% 젤라틴 용액 을 준비하십시오 : 500 mL의 PBS에 젤라틴 1 g을 추가하십시오. 용액을 오토클레이브하고 4 °C에서 유지하십시오. 사용하기 전에 0.22 μm 필터로 걸기.</li>
	<li>1% 글루타랄데히드 준비: 25% 글루타랄데히드 스톡 용액 1mL을 PBS 24 mL에 추가합니다. 사용하기 전에 0.22 μm 필터로 걸기.</li>
	<li>1 M 에탄놀라민 준비: 사용하기 전에 0.22 μm 필터로 멸균 H2O. 필터로 에탄올라민 용액을 준비하십시오. 참고: 에탄 올라민에는 보안 캡이 제공되기 때문에 바늘과 주사기가 필요합니다.</li>
	<li>아스코르브산 준비: 배지 100 mL에 0.1 mL의 50 mg/mL 스톡 용액 아스코르브산(빛에 민감한)을 추가합니다.</li>
	<li>라시스 버퍼 준비: NH4OH의 20 nM으로 PBS 0.5% 트리톤 100X를 준비한다. 사용하기 직전에 NH4OH를 추가하십시오.</li>
	<li>PBS 펜/스트렙 준비: 펜/스트렙 스톡 용액을 100 U/mL 펜과 100 μg/mL 스트렙에 희석하십시오.</li>
	<li>10% FBS로 DMEM 준비: DMEM 500mL에 10% FBS를 추가합니다. 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.1 mg/mL 노르모신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B를 보충제.</li>
	<li>준비 2% BSA 열 변성: 멸균 수의 100 mL에 BSA의 2 g을 추가합니다. 끓는 물에 7분간 데우면 됩니다.</li>
	<li>항생제로 FBS를 준비하십시오 : 200 U / mL 페니실린, 200 μg / mL 스트렙토 마이신, 100 μg / mL 젠타미신 및 2.5 g / mL 암포테리신 B로 FBS를 보충하십시오.</li>
</ol>2. 세포 배양 준비
<ol><li>불멸의 섬유아세포 세포주<ol>
<li>배양 재조합 텔로머라아제는 10% FBS로 DMEM에서 불멸화된 인간 포피 섬유아세포(BJ-hTERT, ATCC CRL-4001)를 형질화하고 37°C 및 5%CO2에서유지한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>내피 세포<ol>
<li>배양 인간 배양 정맥 내피 세포 (HUVECs, ATCC PCS-100-013)는 2% FBS를 함유하고 37°C 및 5%CO2에서유지한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>섬유 아세포 기본 배양 참고: CAF 설립 및 문화의 경우, 우리 그룹이 이전에 게시 한 프로토콜은6.<ol>
<li>간단히, 약의 작은 조각으로 조직 샘플을 잘라 2-3 mm3 항생제의 높은 농도와 FBS에 씨앗.</li>
		<li>첫 번째 섬유아세포가 나타났을 때, 세포 유지를 위한 FBM 배지로 배지를 대체하십시오. 참고: 조직 기원에 따라 세포 배양이 쉽게 오염 될 수 있습니다. 오염이 높은 조직(예: 결장6)으로항생제로 보충된 PBS에서 샘플을 세척하고 30-45분 동안 흔들어 주세요.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 섬유 아세포 유래 3D 매트릭스 (카스텔로 크로스와 쿠키에르만16에서적응)
<ol><li>6웰 플레이트의 각 웰에 0.2% 젤라틴 용액 2 mL를 넣고 37°C에서 1시간 동안 배양하거나 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	<li>젤라틴을 흡인하고 PBS의 2 mL로 씻습니다.</li>
	<li>2 mL의 1% 글루타랄데히드를 넣고 RT. 글루타랄데히드에서 30분 동안 배양하여 젤라틴을 가교합니다.</li>
	<li>글루타랄데히드를 흡인하고 2 mL의 PBS로 5 분 동안 우물을 씻습니다.</li>
	<li>1 M 에탄올아민 2 mL를 추가하고 RT. 에탄올라민에서 30 분 동안 배양하여 나머지 글루타랄데히드를 차단하는 역할을 합니다.</li>
	<li>에탄올아민을 흡인하고 2 mL의 PBS로 5 분 동안 우물을 씻습니다.</li>
	<li>10% FBS로 1mL의 DMEM을 추가합니다. 배지가 즉시 분홍색으로 변하면 배지를 제거하고 PBS 2 mL로 씻고 10 % FBS로 DMEM 1 mL을 다시 추가하십시오.</li>
	<li>섬유아세포 현탁액의 종자 1 mL, 각 우물에 5 x 105 세포. 각 우물의 총 부피는 2 mL가 될 것입니다.</li>
	<li>100% 합류까지 배양 세포가 도달한다. 그런 다음 배지를 제거하고 50 μg/mL 아스코르브산으로 10% FBS로 DMEM으로 교체하고 사용 시 추가 처리를 하십시오.</li>
	<li>6일 동안 매 2일마다 10% FBS 및 50 μg/mL 아스코르브산으로 배지를 신선한 DMEM으로 대체하십시오. 참고: 추가 치료가 사용되는 경우 (예를 들어, PDGF-BB, TGF-β 및 / 또는 기타 성장 인자), 아스코르브 산 처리가 추가되는 것과 같은 날을 추가하십시오.</li>
	<li>마지막 아스코르브산 처리 후 2일 후, 배지를 제거하고 PBS의 2 mL로 세척하였다.</li>
	<li>37°C에서 예열된 용해 완충액 1mL를 각 우물에 천천히 추가합니다. 섬유아세포가 용해될 때까지 RT에서 5-10분 동안 배양하십시오(현미경으로 관찰 가능).</li>
	<li>조심스럽게 lysis 버퍼를 제거하지 않고 2 mL의 PBS를 추가하십시오. 그런 다음 약 2.5 mL의 PBS를 흡인합니다. 총 3번의 세번을 두 번 반복합니다.</li>
	<li>결국, PBS의 2.5 mL을 제거하고 펜 / 스트렙 (각각 100 U / mL 및 100 μg / mL)으로 PBS 2 mL을 추가합니다. 필름으로 밀봉하고 최대 3 개월 동안 4 °C에서 보관하십시오. 참고: 실험에 따라 생성된 행렬의 장기 저장이 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 가능한 한 빨리 매트릭스를 사용하는 것이 좋습니다, 그리고 실험이 세포 파종을 포함하는 경우, 가능한 단백질 저하로 인해. 행렬이 콜라겐 관찰과 같은 구조 적 검사에 사용되는 경우 행렬을 고정하고 더 긴 기간 동안 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜은 6웰 배양 플레이트에 대해 지시된다. 다른 플레이트를 사용할 수 있지만 반응성 부량과 세포 현탁액 농도는 웰 영역에 따라 재계산되어야 합니다.</li>
</ol>4. 튜브 형성 분석
<ol><li>최대 합류까지 EBM-2 2% FBS에서 HUVEC 세포를 성장.</li>
	<li>8시간 동안 FBS없이 매체를 EBM-2로 교체하십시오.</li>
	<li>셀을 파종하기 전에 행렬을 준비합니다.<ol>
<li>냉장고에서 매트릭스를 제거하고 RT에서 1 시간 동안 놓습니다.</li>
		<li>2 mL의 열 변성 2% BSA를 추가하여 행렬을 차단합니다. 37 °C에서 1 시간 배양.</li>
		<li>흡인 BSA및 PBS의 2 mL에서 세척.</li>
	</ol>
</li>
	<li>종자 2 x 105 HUVEC 세포를 FBS 고갈 배지에서 이전에 3D 섬유아세포 유래 매트릭스로 코팅한 6웰 플레이트의 각 웰에.</li>
	<li>16 시간 동안 37 °C에서 내피 세포를 배양하십시오.</li>
	<li>20-40x 배율로 표준 밝은 필드 현미경하에서 튜브 와 같은 구조 형성을 검사합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li>
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<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kB-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner.</a> Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).</li>
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<li>Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+Snail1+in+the+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">The emerging role of Snail1 in the tumor stroma.</a> Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

매트릭스는 불멸의 섬유아세포 또는 1차 섬유아세포 배양물로 생성될 수 있다. 섬유아세포는 높은 성장속도 및 응력 저항을 가진 시험관 내 배양에서 유지하기 쉽다. 그(것)들은 또한 사후 조직3에서격리될 수 있습니다, 오염은 조직 기원에 따라서 제한될 수 있더라도.
여기서 3D 매트릭스 모델은 ECM 조성 및 섬유 배향을 성공적으로 연구할 수 있는 참신하고 효과적인 시스템을 제공합니다. 또한 섬유아세포 활성화 상태, 유전자/단백질 발현, 다른 세포 유형과의 상호 작용 등의 분석에적합합니다. 환자에게서 섬유아세포로 생성된 행렬이 종양에 있는 기질 관련 기계장치의 개인화한 연구 결과 가능하게 한다는 것을 강조하는 것이 중요합니다. 예를 들면, 이 접근은 ECM가 중요한 역할이 있는 화학 저항의 연구 결과에 적용될 수 있습니다. 이 유형의 연구의 번역은 임상 실습에서 환자의 치료를위한 의사 결정에 도움이 될 수 있으며 개인화 된 의학을 구현할 수...

세포외 매트릭스 (ECM)는 조직의 모든 모형에서 존재하는 동적 구조물입니다. 그것은 세포 부착, 이동 및통신1에중요한 섬유의 그물을 만드는 단백질과 다당류로 구성되어 있습니다. ECM 조성물은 조직에 따라 다릅니다. 타입-I 콜라겐이 가장 널리 퍼진 구조 단백질이지만, 콜라겐 유형 II, III, V 및 XI는 또한 다양한 조직에서 발견될 수 있다2. 섬유아세포에 의해 생성된 섬유넥틴은 세포 부착에 필요하다2. 더욱이, 엘라스틴, 라미닌 및 표면 수용체와 같은 다른 구조 적 분자가 섬유 조립을 중재하고 상이한 ECM 조직에 특이적인 인테그린(integrins)이라고 불린다2. ECM은 세포 스캐폴드로서 중요한 역할을 하며 또한 생리적 및 병리학적 과정 둘 다에 관여할 수있다 1. ECM에 있는 이상은 ECM 조성 및/또는 그것의 조직을 바꾸는 암과 같은 병리에서 관찰됩니다. 종양에서, ECM은 종양 미세환경(TME)의 비세포 성분을 나타내며, 섬유아세포, 면역 세포, 내피 세포, 침구 및 다양한 수용성 인자와 같은 세포 성분의 복잡한 밀리유이다. TME는 암 진행및 전이를 촉진하는 것으로 알려져 있습니다. 암 관련 섬유아세포는, 종양 기질에 있는 우세한 세포 모형으로, 이프로세스3에서참여합니다. 정상 섬유아세포와 달리, CAF는 영구적으로 활성화되어 ECM 단백질 및 성장 인자(예를 들어, 성장 인자-β, TGF-β 변형)의 증가된 분비를 나타내고, α-평활근 액틴(α-SMA) 및섬유아세포 활성화 단백질(FAP)과 같은 일부 마커의 더 높은 발현을 나타낸다. 그러나, CAF는 이기종 세포 집단이며, 활성화 또는 마커 발현의 상이한 수준을 나타내는5. 섬유아세포 유래 행렬의 조성 및 구조가 섬유아세포 상태 및 특성에 따라 달라질 것이라고 가정할 수 있다.
이러한 맥락에서, 이러한 방법론의 목적은 생체 내 ECM 설정에 상응하는 섬유아세포에 의해 ECM 생성을 위한 적절한 시험관내 모델을 확립하는 것이다. 우리는 ECM에 의해 중재된 화학 저항 또는 이동 같이 종양 세포 기능의 추가 연구 결과를 위한 시험관 내 번역 방법론으로 이 접근을 제안합니다. 우리 그룹이 다른 곳에서 발표했듯이, CAF는 신선한 조직 샘플로부터 얻을 수 있지만, 배양에서의 CAF의 생존이 제한적이며 세포 통로 수가6으로감소한다는 점에 유의해야 한다. 또한, 환자의 샘플로부터 확립된 CAF 1차 배양은 매트릭스 생성을 위해 사용될 수 있다. 섬유아세포에서 유전자 발현의 조작은 또한 매트릭스 조성, 섬유 배향 등에 대한 가능한 효과를 평가하기 위해 다양한 시험관내 행렬을 생성하는 흥미로운 방법이다. 이러한 라인을 따라, 우리 그룹은 최근 다양한 유래 행렬의 조성 및 섬유 배향에서 달팽이 발현 섬유아세포의 역할을 보고했다7.
더욱이, CAF 및 ECM은 혈관 생성 및 꽃병 외층8의일부로서 모두 혈관 시스템에 관여한다. ECM 리모델링은 혈관 신생을 유도; 매트릭스 금속 단백질화효소(MmPs)는 이 과정에 기여하는 가장 중요한 효소 유형인 것 같다9,10. ECM, ECM 거대분자, ECM에 포함된 잔류 성장 인자, 매트릭스 탄성, 및 매트릭스 두께를 생성하는 1차 세포의 조직 혈관화는 내피 세포 활성화에 관여하는 인자로 설명된다11. 종양에서 저산소증은 ECM 강성과 내피 새싹 생성 을 증가시킵니다12. 더욱이, CAFs는 종양기질에서혈관신생을 자극하는 혈관내피성장인자(VEGF) 및 혈소판 유래 성장인자(PDGF)를 분비한다. 이 분야에서, 시험관내 매트릭스 생성은 상이한 실험 조건 하에서 혈관신생 과정 또는 MMP 작용을 연구하는데 사용될 수 있다. 따라서, 생체외 에서 가장 유사한 생체외 재생은 혈관신생 또는 미세 환경 세포 상호작용에서 ECM의 역할을 조사하는 귀중한 도구가 될 수 있다.
매트릭스 증착을 강화하고 ECM을 생성하기 위해 아스코르브산을 가진 배양 된 섬유 아세포의 자극은 생체 내 매트릭스에서 유사한 생산 방법. 불멸화된 섬유아세포는 쉽게 배양되고 PDGF-BB, 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 또는 TGF-β14와같은 다양한 성장 인자에 의해 활성화된다. TME 내에서, CAFs는 ECM4의주요 성분으로 타입-I 콜라겐과 피브로넥틴을 합성합니다. 유사하게, 이들 성분은 시험관내에서 생성된 섬유아세포 유래 행렬의 주요 성분으로서 발견된다(도1).
생체 외 내 방법론은 생체 내 ECM에서 시뮬레이션하기 위해 상이한 생체 내 방법론이 있다. ECM 섬유의 혼합물을 가진 코팅된 배양 요리의 사용은 지난 몇 년 동안 연장되었지만, 이러한 2D 접근법은 가교 겔(예를 들어, 마트리겔)과 같은 3D 구조에 대한 개선이필요했다 1. Matrigel과 같은 설정은 3D 행렬을 시뮬레이션하는 표준 방법이 되었습니다. 피브린은 또한 행렬을 생성할 때 대안이지만 ECM1의강도와 내구성면에서 실패합니다. 다른 ECM 성분과 함께 사용되는 콜라겐은 전술한 문제 중 일부를 수정한다. 그러나, 이러한 콜라겐 겔은 지향될 수 있는 섬유와 강한 네트워크를 형성하지만, 매우 이질적이며, 이는 실험 반복에 문제가 될 수 있다1. 그럼에도 불구하고, 실험의 목적에 따라, Matrigel 또는 다른 하이드로겔의 사용이 더 적절하다고 가정해야 한다(예를 들어, 겔 수축이 쉽게 검출될 수 있는 매트릭스 수축 연구에서).
생성된 매트릭스의 잠재적면역원성은 일부 세포 유형의 실험에서 문제가 될 수 있다. 따라서, 우리의 방법을 사용할 때 ECM 생성 세포에 의한 면역 반응의 가능성을 줄이기 위해, 세포 단편 제거는 총15일수 없었지만, 행렬은 탈세포화 및 세척된다. 이상적인 ECM은 세포 배양과 호환되고 세포 신호를 통신하고 반응할 수 있어야 합니다. 우리의 절차는 ECM 생산 동안 어려움없이 변화의 도입을 허용 (예를 들어, 섬유 아세포 자극 성장 인자를 추가).

<table><tbody><tr><td>수산화암모늄(NH4OH)</td><td>Roth</td><td>A990.1</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신-B</td><td>코닝</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>시그마</td><td>A7906-50G</td><td></td></tr><tr><td>둘베코의 변성 이글 배지(DMEM)</td><td>코닝</td><td>10-014-CVR</td><td></td></tr><tr><td>내피 기저 배지(EBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3121</td><td>사용 전 보충제 추가</td></tr> 내<tr><td>피 세포 기초 배지 보충제 (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>에탄올아민</td><td>시그마</td><td>411000-100ML</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td>사용 전 열 비활성화</td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 기초 배지 (FBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3131</td><td>사용</td></tr> <tr><td>전 보충제 추가섬유아세포 성장 매체 보충제 및 성장 인자(FGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-4126</td><td></td></tr><tr><td>소 껍질의 젤라틴</td><td>Sigma</td><td>G9391-100G</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>Sigma</td><td>g5882</td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르브산</td><td>Sigma</td><td>A92902-100G</td><td>감광성</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>3ANT-NR-2</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Roth</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>재조합 텔로머라제 형질 주입 불멸화 인간 포피 섬유아세포(BJ-hTERT)</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-4001</td><td></td></tr><tr><td>인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-013</td><td></td></tr></tbody></table>

섬유 아세포 유래 3d 매트릭스 시스템은 내피 튜브 형성 분석에 적용

Fibroblast-Derived 3D Matrix System Applicable to Endothelial Tube Formation Assay

세포외 매트릭스 (ECM)는 조직에 있는 세포를 위한 주요 지원으로 작동하는 3차원 비계입니다. 구조적 기능 외에도 ECM은 세포 이동, 증식 및 분화에도 참여합니다. 섬유아세포는 ECM 섬유 배열 및 생산을 변형시키는 세포의 주요 유형이다. 암에서, CAFs (암 관련 섬유아세포)는 영구적인 활성화 상태에, ECM 개조에 참여하고, 종양 세포 이동을 촉진하고, 종양 관련 혈관신생을 자극, 그밖 pro-tumorigenic 역할 중. 이 방법의 목적은 불멸의 섬유아세포 또는 인간 1차 CAF를 사용하여 생체 내 매트릭스와 유사한 섬유 조성물을 가진 3차원 매트릭스를 만드는 것이다. 섬유아세포는 전처리된 세포 배양 판에서 배양되고 아스코르브산 자극 하에 재배된다. 그런 다음 섬유 아세포를 제거하고 행렬은 추가 세포 파종을 위해 차단됩니다. 이 ECM 모델에서 섬유아세포는 활성화되거나 변형되어 세포 배양에서 효과를 연구할 수 있는 다양한 종류의 매트릭스를 생성할 수 있습니다. 3D 행렬은 또한 섬유 분포를 수정할 수 있는 분해 또는 가교 효소와 같은 세포 신호에 의해 형성됩니다. 이 맥락에서, 혈관 신생은 상피 종양 세포와 같은 그밖 세포 모형과 더불어 공부될 수 있습니다.

PDGF-BB 자극 섬유아세포는 두꺼운 ECM을 생성한다. 헤레라 외. PDGF 자극 섬유 아세포는 두꺼운 매트릭스뿐만 아니라 높은 섬유 방향을 생성하는 방법을 보여주었다 7. BJ-hTERT 섬유아세포는 PDGF 유무에 관계없이 배양되었고 관찰된 대표적인 영역은 PDGF 자극 섬유아세포에 의해 생성된 매트릭스에서 보다 정렬된 세포 분포를보였다(도 1a). 콜라겐 I 및 피브로넥틴 단백질 발현은 PDGF 자극 섬유아세포로부터 유래된 매트릭스에서 증가하였고(도1b)및, 결과적으로, 매트릭스 두께가 증가하였다(도1c). 더욱이, 콜라겐 I 및 피브로넥틴은 방향성 히스토그램(도<stro...

The aim of this method is to obtain fibroblast-derived 3D matrices as a natural scaffold for subsequent cellular assays. 섬유아세포는 전처리된 배양판에 씨를 뿌리고 매트릭스 생성을 위한 아스코르브산으로 자극된다. 행렬은 탈세포화되고 관련 세포(예를 들어, 내피 세포)를 배양하도록 차단된다.

섬유 아세포 유래 3D 매트릭스 시스템은 내피 튜브 형성 분석에 적용

The extracellular matrix (ECM) is a three-dimensional scaffold that acts as the main support for cells in tissues. Besides its structural function, the ...

이 프로토콜을 사용하면 다양한 유형의 배양을 확인하고 세포 외 행렬과의 상호 작용을 관찰할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 당신이 얻는 매트릭스가 섬유 아세포에 의해 재생되고 생체 내에서 생성 된 것과 매우 유사하다는 것입니다. 우리는 베이킹 접시에서 얻은 섬유 아세포를 사용할 때이 질병이 무관하다고 생각합니다.이러한 세포에서 매트릭스를 설정하면 지속적인 상황과 같은 영향을 미칠 수있는 방법을 계몽 할 수 있습니다. 이러한 방법은 또한 매트릭스 소유주의 생존자에게 물리적 인 연구( 예를 들어) 적용 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 시각화는 리젠트가 필요한 단계의 파이펫 팅 기술을 관찰하는 것이 중요합니다.이러한 메서드를 처음 시도할 때 예상보다 더 많은 시간이 걸릴 수 있습니다. 우리의 조언은 사전에 준비하고 다음 단계에 대한 준비를위한 기간 기간을 사용하는 것입니다. 원고 방향에 따라 0.2%의 젤라틴, 1%글루타랄데히드 및 1개의 어금니 에탄올라민 솔루션을 준비하는 것으로 시작합니다.사용하기 전에 0.22 마이크로미터 필터를 통해 각 솔루션을 실행해야 합니다. 다음으로, 아스코르브 산과 리시스 버퍼를 준비합니다. 원고에 설명된 대로 PBS 펜 스트렙을 희석하고 10%의 FBS로 DMEM을 준비합니다.살균물 100밀리리터에 BSA 2그램을 추가하고 끓는 수조에서 7분간 데우어 열변2%BSA를 준비합니다. 그런 다음 페니실린, 연쇄상 구균, 젠타미신 및 amphotericin B.Culture 재조합 텔로미어가 불멸의 인간 포피 섬유아세포 및 DMEM을 10%FBS로 변형시키고 37°C와 이산화탄소 5%로 유지했습니다. 1 차적인 섬유아세포 배양을 설치하기 위하여는, 약 2 3 밀리리터의 작은 조각으로 조직 견본을 잘라내고 항생제의 고농도로 FPS에 그(것)들을 종자.첫 번째 섬유아세포가 나타나면 배지를 세포 유지 관리를 위한 FBM 배지로 바꿉시다. 6웰 플레이트의 각 웰에 0.2%의 젤라틴 용액 2밀리리터를 넣고 섭씨 37도 또는 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 젤라틴을 흡인하고 PBS의 2 밀리리터로 각각 잘 씻으세요.각 웰에 글루타랄데히드 의 1 %의 2 밀리리터를 추가하고 젤라틴을 교차 연결하는 30 분 동안 실온에서 접시를 배양합니다. 글루타랄데히드를 흡인하고 5분 동안 PBS의 2밀리리터로 우물을 씻습니다. 남은 글루타랄데히드를 차단하려면 어금니 에탄올라민 1마리의 밀리리터 2개를 넣고 30분 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.에탄올라민을 흡인하고 PBS로 세치를 반복합니다. 10%FPS로 DMEM 1밀리리터를 추가합니다. 매체가 즉시 분홍색으로 변하면 제거한 다음 PBS 2밀리리터로 우물을 한 번 씻고 DMEM의 또 다른 밀리리터를 추가하십시오.각 우물에서 5 x 10을 가진 섬유 아세포 현탁액의 1 밀리리터를 씨앗과 100%의 합류가 도달 할 때까지 세포를 배양. 그런 다음 매체를 제거하고 10 % FBS와 밀리리터 아스코르브 산 당 50 마이크로 그램으로 DMEM으로 대체하십시오. 6일 동안 2일마다 배지를 교체합니다.마지막 아스코르브 산 치료 후 이틀 은 매체를 제거하고 PBS의 두 밀리리터로 우물을 세척. 세척 후, 천천히 예열 된 용해 버퍼의 1 밀리리터를 추가하고 섬유 아세포가 용해 될 때까지 5 ~ 10 분 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다. 리시스 버퍼를 제거하지 않고 각 웰에 PBS 2 밀리리터를 조심스럽게 추가한 다음 약 2.5 밀리리터를 흡입합니다.총 세개의 세차재에 대해 이 과정을 두 번 반복합니다. 마지막 세척 후, 펜 스트렙과 PBS의 두 밀리리터를 추가합니다. 필름으로 접시를 밀봉하고 최대 3 개월 동안 섭씨 4도에서 보관하십시오.최대 합류가 될 때까지 2%의 FBS로 HUVEC 세포와 EMB-2를 성장시보아 주어드실 수 있습니다. 그런 다음 8 시간 동안 FBS없이 EBM-2로 매체를 교체하십시오. 세포 씨를 위해 행렬을 준비하려면 냉장고에서 꺼내 실온에서 1 시간 동안 둡니다.2밀리리터의 열변성 2%BSA를 추가하고 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양하여 행렬을 차단합니다. 그런 다음 BSA를 흡인하고 PBS의 2 밀리리터로 세척하십시오. 종자 2 x 10 제5 HUVEC 세포에 섬유아세포 유래 행렬로 코팅된 판의 각 웰에.세포를 섭씨 37도에서 16시간 동안 배양한 다음 20-40배율의 표준 밝은 필드 현미경하에서 튜브와 같은 구조를 검사합니다. 이 프로토콜은 섬유아세포 유래 매트릭스 형성에 PDGF 치료의 영향을 검사하기 위해 사용되었다. PDGF로 배양 된 BGH 세 번째 섬유 아세포PDGF없이 배양 보다 행렬에서 더 정렬 된 세포 분포를 보였다.콜라겐 1 및 fibronectin 단백질 발현PDGF 자극 섬유아세포로부터 유래된 행렬에서 증가하였고 결과적으로 매트릭스 두께가 증가하였다. 더욱이, 방향성 히스토그램은 콜라겐 1과 섬유네틴이 평행 패턴을 나타낸다는 것을 보여줍니다. HUVEC 세포가 PDGF 자극 섬유아세포에서 파생된 탈세포화 행렬에 종자되었을 때 자극되지 않은 조건하에서보다 더 많은 모세혈관 과 같은 구조를 개발했습니다.PDGF-BB자극 섬유아세포에서 파생된 행렬이 내피 세포 활성화를 촉진한다는 것을 확인한다. 이 절차를 수행할 때 솔루션을 미리 준비하고 세포가 시작하기 전에 준비되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 내피 세포 연구 외에도 행렬은 상피 세포로 종자 될 수 있으며 미디어 또는 세포 독성 약물의 상태와 같은 외부 요인에 대한 반응을 관찰 할 수 있습니다.세포 외 매트릭스의 생성은 종양 거시 환경 실험의 디자인에 매우 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 동영상은 체외의 angiogenesis 분석에의 프로토콜을 보여줍니다 angiogenesis의 recapitulates 여러 단계의 것을. 시간 저속 돋아의 이미지, 루멘 형성, 분기 및 문합 - angiogenesis의 주요 기능은 - 표시됩니다.

Angiogenesis 연구에 최적화된 섬유소 젤 비드 분석

방법은 콜라겐 유형 I 및 기본 인간 섬유 아세포로 구성된 3 차원 매트릭스의 준비를 위해 설명되어 있습니다. 이 조직 기질의 기본 기능을 모방하고 현미경의 여러 형태의 의무이기 때문 organotypic 젤은 침입 세포 마이그레이션을 평가하는 유용한 기판 역할을합니다.

Organotypic 콜라겐 I 분석 : 3 차원 컨텍스트에서 셀 행동을 평가하기 위해 가단 플랫폼

복잡한 조직의 고도로 조직화된 구조를 만들려면 여러 재료 및 세포 유형을 통합된 복합체로 조립해야 합니다.  이 조합 설계는 강력한 섬유질 기질 염기를 포함하는 두 가지 별개의 생물학적으로 파생된 물질과 새로운 혈관 형성을 향상시키기 위한 내피 세포와 장기 특이적 층상 세포 시트를 통합합니다.

조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

관 형성 분석법은 시험관 내 혈관 신생을 측정하기위한 신속하고 정량적 방법이다. 내피 세포는 조절 된 미디어와 결합 기저막 추출물에 도금된다. 튜브 형성은 시간 이내에 발생하고 새로 형성된 세관은 쉽게 정량화.

에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석<em&gt; 체외</em&gt; 혈관 신생 연구

이 원고는 통제된 환경에서 내피 세포관 형성을 사용하여 혈관 신생에 대한 주어진 화합물 또는 조건의 효과를 정량화하기 위한 튜브 형성 분석을 설명합니다.

전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교

프로토콜에는 회전 타원 체에 perfusable 혈관 네트워크를 설계 하는 방법을 설명 합니다. 회전 타원 체의 주변 microenvironment 신생 유도 microchannels 미세 장치에는 회전 타원 체 연결을 고안 이다. 메서드를 사용 하면 3 차원 문화에 오랫동안 기다려온 기술 회전 타원 체의 관류를 수 있습니다.

미세 소자에서 조직 모델 perfusable 혈관 네트워크

3차원 공동 배양 스페로이드 혈관신생 분석 시스템은 생리적 혈관신생을 모방하도록 설계된다. 공배양 스페로이드는 두 개의 인간 혈관 세포 전구체, ECFC 및 MSC에 의해 형성되고, 콜라겐 겔에 내장된다. 새로운 시스템은 혈관 신생 변조기를 평가하는 데 효과적이며 생체 내 연구에 보다 관련성이 있는 정보를 제공합니다.

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

이 프로토콜의 목표는 약물 선별 연구에 사용될 수 있는 3D 유방 내피 상양 모델을 빠르게 만들기 위해 사전 형성된 내피 네트워크에 다세포 스페로이드로서 유방 상피 세포를 직접 바이오프린트하는 것입니다.

내피 네트워크에 3D 다세포 유방 스페로이드의 직접 생체 인쇄

여기에 제시된 프로토콜은 기계학 연구, 질병 모델링 및 스크리닝 애플리케이션에 적합한 이중 극이 있는 다중 우물 판에서 48개의 조직의 병렬 배양에 대한 엔지니어링 된 결합 조직을 생성하는 프로토콜입니다. 프로토콜은 다른 장기와 종에서 섬유 아세포와 호환되며 인간의 기본 심장 섬유 아세포와 함께 여기에 예시됩니다.

섬유아세포, 선별 애플리케이션을 위한 인간 공학형 결합 조직

여기에서는 일차 전립선 상피 세포의 3차원 배양 및 후속 내강 분화를 지원하는 신속한 체외 시스템을 구축하는 방법을 제시합니다.

기본 전립선 세포 분화에 대한 신속한 필터 삽입 기반의 3D 문화 시스템

배우세요 섬유아세포 유래 3D 매트릭스를 이용한 내피 세포 튜브 형성 분석 방법을. 이 기술은 세포-세포외기질 상호작용 연구와 생물학적 환경 모델링에 활용됩니다.

섬유 아세포 유래 3D 매트릭스 시스템은 내피 튜브 형성 분석에 적용

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