Name: 오믹스 접근법에 대한 드로소필라 멜라노가스터 비행 근육의 해부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 간접 비행근 해부법을 통해 근육 발달 중 유전자 및 단백질 발현 변화를 연구하는 방법을 익히세요. 이 기술은 고품질 샘플을 제공하여 프로테오믹스 및 딥 시퀀싱 분석에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

안드레아스 라두르너와 프랭크 슈노어에게 감사의 말입니다. 우리는 우수한 기술 지원과 질량 분석 데이터를 생성하기위한 아칸샤 로이 산드라 에세르 에게 감사드립니다. 우리는 블루밍턴과 비엔나 스톡 센터가 파리를 제공한 것을 인정합니다. 우리는 LMU 생물 의학 센터 (Martinsried, DE)에서 질량 분광 샘플의 분석을 위한 공초점 화상 진찰과 Zentrallabor für Proteinanalytik에 도움을 위한 핵심 시설 Bioimaging에 감사드립니다. 우리의 작업은 도이치 포르충스 게마인샤프트 (MLS, SP 1662/3-1), 통합 단백질 과학 뮌헨 센터 (CIPSM) 루드비히 막시밀리안 대학 뮌헨 (MLS), 프레데리히 - 바우어 스티퉁 (MLS), 그리고 국제 맥스에 의해 지원되었다 플랑크 연구 학교 (EN).

1. 푸파 준비
<ol><li>병에 원하는 유전자형의 파리를 올립니다(그림 1E). 해부 스톡의 신선한 플립을 만들거나 적어도 20 여성 처녀 파리와 십자가를 설정합니다. 파리가 퍼페이트되기 시작할 때까지 병을 유지하십시오.</li>
	<li>젖은 페인트 브러시로 프리 푸페를 수집하고 60mm 페트리 접시에 젖은 여과지로 옮김(그림 1F).</li>
	<li>강아지를 성별하고, 실험에 적합한 성별을수집한다(도 1G). 남성은 그렇지 않으면 불투명 한 pupa에 반투명 공으로 나타나는 고환의 존재에 의해 식별됩니다.</li>
	<li>페트리 접시에 시간, 날짜 및 유전자형을 표시한 다음 번화를 원하는 단계로 나이를 누린다(그림1H). 참고: 온도 제어 인큐베이터에서 십자가/주식 및 나이 퍼프를 유지합니다(즉, RNAi 십자가의 경우 25°C 또는 27°C, 더 높은 온도에서 Gal4 활성이 증가함에 따라 노크다운 효율40). 며칠 동안 숙성할 때는 번데어가 마르지 않도록 습도가 충분히 높은지 확인하십시오.</li>
</ol>2. 48 시간 APF 전에 IFM 해부
<ol><li>두 개의 #5 생물학 등급 집게, 파이펫, 파이펫 팁, 드라이 아이스 및 (RNA 샘플의경우) 절연 시약을 포함하여 필요한 장비를 조립합니다(재료 표 참조). 또한, 차가운 검은 해부 접시 (재료 표참조), 1 x 인산염 완충 식염수 (PBS) 버퍼, 얼음에 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브.</li>
	<li>젖은 페인트 브러시를 사용하여, 차가운 1x PBS(그림 2A, B)로약 3 분의 2를 가득 검은 해부 접시에 단계적 인 pupae를 전송합니다. 형광 해부 현미경으로 이동합니다. 참고: 30 분 시간 창 내에서 해부 할 수있는 만큼 많은 강아지를 사용하십시오. 경험에 따라, 이것은 3-15 pupae에서 범위. 검은 해부 요리에 대한 대안에 대한 자세한 방법을 참조하십시오.</li>
	<li>#5 포셉을 사용하여, 검은 해부 접시의 바닥에 강아지 중 하나를 밀어 명확하게 pupa를 볼 수 현미경 줌과 초점을 조정(그림 2C).</li>
	<li>한 집게(그림 2D)로강아지의 앞쪽을 잡은 다음 흉부 바로 뒤에 복부의 중앙에서 약간 벗어난 다른 집게의 단일 팁으로 강아지를 찌른다. 이것은 제자리에 있는 pupa를 붙잡고 IFMs가 복부로 이동하는 것을 방지합니다(그림 2E). 참고: pupal 무결성이 중단되는 즉시이 시점에서 해부 길이타이밍을 시작합니다. 근육 사멸 및 관련 전사체 및 단백질 변화를 최소화하기 위해 정의된 해부 길이(예: 20-30분)를 사용합니다. 이 기간에 가능한 한 많은 파리를 해부하십시오.</li>
	<li>첫 번째 집게를 사용하여 푸팔 케이스의 앞쪽 절반을 제거합니다(그림2F).</li>
	<li>동일한 포셉을 사용하여 흉부 바로 뒤에 노출된 강아지를 꼬집고 흉부에서 복부를 분리합니다(그림2G).</li>
	<li>집게를 사용하여 흉부 의 앞쪽 부분 (<35 h APF)을 부드럽게 짜내거나 흉부에서 찢어형으로 표시된 IFMs(그림 2H)를노출시십시오. IFM은 초기 시점에서 힘줄 부착이 깨지기 쉽기 때문에 표피에서 쉽게 분리됩니다. 집게를 사용하여 나머지 시체를 버리고 접시의 반대편으로 밀어 넣습니다.</li>
	<li>2.3-2.7단계를 반복하고, 추가 번데기해 한다.</li>
	<li>집게로 IFM 섬유를 수집하고 검은 해부 접시의 바닥에 더미로 구성(그림 2I,J). 집게를 사용하여 시야밖으로 밀어 파편을 제거합니다. 참고: 연습으로, 집게 끝은 서로 를 건드리지 않고 가까운 근접으로 가져올 수 있습니다. 이 기술은 IFM을 파괴하지 않고 느슨하게 잡는 데 사용할 수 있습니다. 다른 방법은 부드럽게 밀거나 단일 팁 또는 완전히 닫힌 집게로 IFM을 들어 올리거나, IFM으로 일부 지방 또는 다른 조직을 복용하고 단계 2.10에 설명 된 대로 지방을 제거하는 것을 포함한다.</li>
	<li>품질 관리는 IFM 근육 샘플을, 집게를 사용하여 샘플로부터 비IFM 근육, 지방, 표피 등을 제거한다(도2K,L). 참고: Mef2-Gal4를 사용하면 IFM은 초기 시점에서 다른 근육 유형보다 더 강하게 표시되어(그림 2K, K')형광 강도와 근육 모양에 따라 점프 근육과 애벌레 근육을 제거 할 수 있습니다. 지방 및 표피 조직은 다르게 보이며 근육 특이적 형광 라벨에 의해 표지되지 않습니다(그림 2K, K'). IFM이라고 표시된 다른 Gal4 줄에 대한 토론 섹션을 참조하십시오.</li>
	<li>잘린 파이펫 팁을 사용하여 IFM 더미를 냉각 된 1x PBS(그림 2M-O)의250 μL로 채워진 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮니다. 섹션 4로 즉시 진행하십시오. 참고: IFM 샘플은 파이펫 팁의 측면에 달라붙는 것만으로도 손실될 수 있습니다. IFM을 수집하기 전에 버퍼를 여러 번 위아래로 파이펫팅하면 표준 팁이 덜 끈적거리며, 표면 장력이 낮은 실리콘 또는 퍼플루오로알록시(PFA) 팁(재료 표참조)은 시료 손실을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.</li>
</ol>3. IFM 해부 후 48 시간 APF
<ol><li>두 개의 #5 생물학 등급 집게, 미세 가위, 표준 유리 현미경 슬라이드, 이중 스틱 테이프, 파이펫, 파이펫 팁, 드라이 아이스 및 (RNA 응용 프로그램의 경우) 격리 시약을 포함하여 필요한 장비를 조립합니다(재료 표참조). 1x PBS 및 미세 원심 분리튜브를 얼음위에 식힙니다.</li>
	<li>가볍게 젖은 페인트 브러시를 사용하여 단계형 번데기를 현미경 슬라이드에 장착 한 양면 끈적 끈적한 테이프 스트립으로 옮니다(그림 3A). 번데어를 같은 방향(아래쪽과 앞쪽 슬라이드 아래쪽)을 향하도록 줄에 놓습니다. 참고: 페인트 브러시 나 필터에 너무 많은 물을 사용하지 않도록주의하거나, 번데어가 잘 붙어있지 않습니다. 번데기가 달라붙지 않으면 먼저 마른 필터 나 티슈 페이퍼로 옮겨 서 건조시십시오. 30 분 시간 창 내에서 해부 할 수있는 만큼 많은 강아지를 마운트, 이상적으로 ~ 10 번페.</li>
	<li>푸팔 케이스에서 강아지를 제거합니다. 포셉을 사용하여 앞쪽 첨탑 위의 푸팔 케이스를 애타게 하고 엽니다(그림3B).</li>
	<li>한 쌍의 포셉을 뒤쪽쪽으로 가볍게 밀어 내어 집게가 움직일 때 푸팔 케이스를 절단합니다(그림3B'). 기본 강아지가 파열되지 않도록주의하십시오. 열린 케이스에서 강아지를 해방하고 즉시 두 번째 현미경 슬라이드에 1 x PBS의 방울로 전송(그림 3B", C).</li>
	<li>줄에 있는 모든 번데기의 경우 3.3 단계와 3.4 단계를 반복한 다음 이중 스틱 테이프 슬라이드를 옆으로 놓습니다.</li>
	<li>미세 가위를 사용하여, 흉부에서 멀리 pupa의 복부를 잘라 별도의 더미로 밀어(그림 3D, D'). 남은 번데기는 반복한다. 참고: pupal 무결성이 중단되는 즉시 3.6 단계로 해부 길이타이밍을 시작합니다. 세포 사멸 과 관련 전사체 및 프로테오믹 변화를 방지하기 위해 가능한 한 많은 파리를 20-30 분으로 해부하십시오. 1 d 성인 또는 >90 h 번데기를 해부 할 때, 미세 가위로 머리를 추가로 제거하는 것이 종종 편리합니다.</li>
	<li>티슈 페이퍼를 사용하여, 1x PBS의 대다수를 제거 (일반적으로 부유 지방과 흐린) 뿐만 아니라 복부의 더미(그림 3E). 남은 흉부류에 신선하고 차가운 1x PBS 한 방울을 넣습니다.</li>
	<li>가위를 사용하여 흉부 반으로 자른다(그림3F,F')머리에서 세로 몸체 축을 한 번 의 동작으로 절단합니다. 또는, 머리를 제거 한 경우, 먼저 머리가 부착 된 가위를 삽입하고 IFMs 사이에 흉부의 상단 절반을 세로로 잘라. 그런 다음 흉부의 복부 면을 동일한 방향으로 두 번째 컷으로 잘라냅니다.</li>
	<li>모든 번데어가 해부될 경우 3.7 단계와 3.8 단계를 반복하여 슬라이드 의 중심 근처에 흉부 반구 더미를 생성합니다. 반구가 마르지 않도록 슬라이드에 1x PBS가 충분히 있는지 확인하십시오. 참고: 48 시간 APF 후, IFM은 훈련 된 눈에 표준 해부 현미경의 밑에 표시 될 정도로 크다. 프로토콜의 이 시점에서, 형광 라벨을 가진 근육은 IFM 식별 또는 훈련 목적을 돕기 위해 형광 해부 범위로 이동될 수 있지만, 이것은 필요하지 않다.</li>
	<li>흉부에서 IFM을 해부합니다. #5 집게를 사용하여 반구 중 하나를분리합니다(그림 3G,H). IFM의 중간 위와 아래에 한 집게의 끝을 부드럽게 삽입합니다(그림3G', H'). 첫 번째 집게를 여전히 유지하면서 미세 한 가위를 사용하여 IFM의 한쪽 끝을 표피와 힘줄에서 멀리 자른다. 그런 다음 IFM의 다른 쪽 끝을 표피에서 자유롭게 자른다(그림3G',H''). 참고: 첫 번째 IFM 컷 후 흉부 방향에 따라 두 번째 IFM 절단이 더 쉽게 수행되도록 흉부 180°를 회전하는 것이 유용합니다.</li>
	<li>포임이 있는 흉부에서 IFM 번들을 제거합니다(그림3G'',H'''),PBS 버블의 가장자리로 이송하여 물 장력을 사용하여 제자리에 고정합니다(그림3I). 슬라이드의 반대쪽으로 시체를 밀어 넣습니다. 나머지 흉부 방수부에 대해 반복하여 해부된 IFM 컬렉션을 생성합니다. 참고: IFM이 깔끔한 더미에 머무르지 않으면 티슈가있는 1x PBS 중 일부를 제거하십시오. 모든 PBS가 증발하지 않도록 주의하고 해부된 IFM과 헴미토락스가 버퍼로 덮여 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>모든 IFM을 해부 한 후 해부 된 근육에 대한 품질 관리를 신속하게 수행하십시오. #5 집게를 사용하여 샘플에 들어갈 수 있는 점프 근육 이나 표피 조각을 제거합니다(그림3J-K'). 참고: 점프 근육은 IFM과 다르게 나타납니다. Mef2-Gal4 표지 된 근육을 형광 하에 해부하면 점프 근육은 형광이 약하고 모양과 질감이 다릅니다. 정상 광원에서는 IFM이 불투명하고 유백색인 동안 거의 반투명으로나타납니다(그림 3J-J',K).</li>
	<li>물 장력을 사용하여 한 쌍의 집게 사이에 해부된 IFM을 캡처(스퀴시하지 는 않지만)(그림 3L). IFMs를 냉각된 1x PBS의 250 μL로 미리 채워진 1.5 mL 마이크로원심지 튜브로 이송한다(도3M). 섹션 4를 즉시 진행하십시오. 참고: 포셉 팁이 서로 근접하여 버퍼 용액에서 해제되면 물 장력으로 인해 포셉 팁 사이에 버퍼 거품이 포착됩니다. IFM이 이 버블에 존재하는 경우 용액에서 해제하고 다른 버퍼 채워진 리셉터클로 쉽게 전송할 수 있습니다. 버퍼 버블에 포착 된 조직을 macerating 피하기 위해 서로 만지지 않고 서로 가까이 팁을 가지고 집게를 짜내는 것이 중요합니다.</li>
</ol>4. 펠릿 및 IFM 샘플 보존
<ol><li>1.5 mL 미세원심분리튜브를 탁상원심분리기에서 2,000 x g에서 3-5분 동안 원심분리하여 IFMs를 펠렛(도4A, B).</li>
	<li>파이펫팁(그림4C)을사용하여 버퍼를제거합니다.
</li>
	<li>RNA 적용의 경우, 원하는 RNA 분리 완충액의 50-100 μL에서 IFM 펠릿을 다시 일시 중단합니다(재료 표, 그림 4D참조). 그렇지 않으면 4.4 단계로 진행합니다. 참고: IFM은 질량 분석 준비 또는 상용 키트로 RNA의 격리를 위해 4.2단계 후에 건조 냉동될 수 있습니다(대표적인 결과 참조). RNA 적용의 경우 IFM 펠릿을 즉시 재중단하고 절연 버퍼로 동결하여 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>드라이 아이스에 샘플을 동결 하거나 액체 질소에 스냅 동결(그림 4E). 다운스트림 분석을 위한 시료 준비의 후속 단계가 준비될 때까지 -80°C에서 보관하십시오. 참고: 동결 보존 후, 샘플은 다운스트림 조사를 위해 처리하기 전에 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜에서는, 우리는 단백질, DNA, RNA 또는 그밖 거대 분자의 하류 격리를 위한 초기와 말기 pupae에서 Drosophila IFMs를 해부하는 기본적인 기술을 제시합니다. 이 프로토콜은 성인 파리에서 IFM을 해부하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. 우리는 mRNA-Seq, 프로테오믹스 및 RT-PCR 애플리케이션에 대한 해부 프로토콜의 유용성을 입증합니다. 시작 재료가 적고 입력 농도가 낮은 샘플을 분석할 수 있는 omics 기술의 지속적인 개선으로 이러한 해부는 많은 추가 응용 분야에서 유용하게 사용될 것입니다. IFM은 인간 근병증에 대한 확립 된 모델이기 때문에4,24 및 근육 유형 특정 개발9,12, 예를 들어 IFM 농축 대사체학, 크로마틴 형태 조사 3C 또는 4C를 통해, CLiP 상호 작용 또는 근위 병의 인광 -프로테오믹스를 통해 네트워크 평가를 접합.
이러한 해부가 순수 IFM 샘플 대신 IFM용 으로 농축된 샘플을 생성한다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 이것은 모터 신경 내심, 힘줄 부착 및 근육 섬유의 기관 침입으로 인해 피할 수 없습니다. 생물정보학 분석은 IFM 농축 유전자 또는 단백질을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다, 그러나 추가 실험은 실제로 IFM 특정하다는 것을 증명하기 위하여 요구됩니다. 샘플 순도는 스트라이프45(힘줄), Act79B4,44(관형 근육), Act88F15(IFM) 또는 syb46(뉴런 특이적)과 같은 출판된 조직 특이적 마커를 사용하여 분석할 수 있다. 이러한 마커를 사용하여 IFM 특이적 콘텐츠로 데이터 세트를 정규화할 수 있지만, 사용자는 정상화를 위해 사용되는 유전자의 발현의 시간적 변화, 예를 들어 IFM 특이적 유전자 또는 튜불린의 경우 이러한 접근법을 편향시킬 수 있다는 경고를 받습니다.
유전자 부호화 조직 특이적 라벨링 방법, 예를 들어 EC-태깅47,48 또는 PABP 라벨링49,50 분리 RNA에 대한 최근 몇 년 동안 개발되었으며, 이는 진정으로 얻을 수 있는 데 도움이 될 수 있다. 조직 특정 RNA 견본. 그러나, EC 태깅은파리(47)의 지속적인 공급을 필요로 하므로 푸팔 단계 에는 적용되지 않는다. PABP 표지된 전사체의 민감도 및 완전성에는51에제한이 있을 수 있다. 개별 근육 섬유를 분리하는 FACS 접근법은 IFMs의 큰 크기와 동기화 특성에 의해 복잡합니다. INTACT52,53 스타일 접근법은 IFM으로부터 특정 세포실 구획을 분리하기 위해 적용될 수 있으며, 이는 IFM 핵 또는 미토콘드리아의 순수한 집단을 분리하는 데 유용할 수 있다. 수동 해부는 대부분의 다운스트림 응용에 대해 그대로 IFM 조직을 얻기 위해 여전히 현재 표준입니다.
시료 품질은 해부 공정의 몇 가지 중요한 단계에 따라 달라집니다. 해부는 기술적으로 까다롭고, 해부 속도와 샘플 순도는 경험에 따라 증가합니다. 세제 없이 냉각된 완충제에서 짧은 시간(20-30분)에 대해 해부하고 즉시 동결하면 마우스 힘줄격리(54)에대해 이전에 관찰된 바와 같이 시료 무결성을 보존하는 데 도움이 된다. IFM은 펠릿에서 모든 버퍼를 제거한 후 성공적으로 건조 동결될 수 있지만, 특히 RNA 격리를 위해, 분리 완충제에서 샘플을 동결하면 더 나은 결과를 얻을 수 있다. 최대 20개의 개별 해부로부터의 IFM은 RNA 또는 단백질 분리 이전에 결합되어 다운스트림 분석을 위해 초기 시점 또는 돌연변이체 16,32에서도충분한 물질을 확장하고 수집할 수 있습니다.
RNA 적용의 경우, 가장 중요한 단계는 RNA 자체의 분리일 수 있다. Guanidinium thiocyanate-페놀-클로로포름 절연(위의 방법 1)은 시험된 대부분의 상용 키트를 능가하며, 앞서 언급한 바와 같이 상당히저렴하다 55. 상용 키트와 RNA 격리 수율에서 관찰된 가변성은 이전관측56,57과일치한다. 우리는 또한 모든 RNA를 복구하는 데 도움이 이소 프로판 올 강수 시 글리코겐을 추가합니다. RNA 수율을 넘어서, RNA 무결성을 확인하여 해부 및 격리 공정 중에 샘플이 단편화되거나 저하되지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다. RNase 가 없는 작업도 필수적입니다. 마지막으로, RT 키트의 선택은 역전사 공정의 감도에 영향을 미칠 수 있다. 자세히 설명하지는 않지만 이러한 모든 점은 IFM 샘플의 품질과 다운스트림 응용 프로그램에서 얻은 데이터에 영향을 미칩니다.
몇 가지 중요한 수정은 기존 IFM 해부 프로토콜과 는 별개로 프로토콜을 설정합니다. IFM 면역형광에 대한 상세한 해부 프로토콜이19개존재하지만, 이 프로토콜은 IFM 조직의 보다 신속한 분리를 허용하는 푸팔 해부에 대한 다른 접근법을 제시한다. 이것은 프로테오메 또는 전사체 변경을 방지하기 위하여 제한된 해부 시간을 가진 IFM 조직 (상대적으로 말하기)의 다량의 집합을 허용합니다. 다른 프로토콜은 개별 myofibrils에서 GFP 염색을 시각화하기 위한 성인 IFM의 해부를기술합니다 39 또는 애벌레 바디 벽 근육의 염색을 위해58,그러나 pupal 단계에서 또는 RNA 또는 단백질의 격리를 위해 해부를 다루지 않습니다. 이 접근법은 또한 더 순수한 IFM 샘플을 생성할 수 있지만 노동 집약적이고 더 적은 물질을 생성하는 저온 절38에서pupal IFM의 미세 해부에 대한 기존 프로토콜과 구별된다. 다른 급속성 IFM 해부 프로토콜38,39,IFM은 스트레스 유도 및 기타 주요 발현 변화를 제한하기 위해 세제 없이 PBS 버퍼로 단리된다.
이 프로토콜의 핵심 은 초기 pupal 단계에서 IFM을 격리 할 수 있도록 라이브 형광 리포터를 포함하는 것입니다. 우리는 표준적으로 Mef2-GAL459 운전 UAS-CD8::GFP 또는 UAS-GFP를 사용합니다::Gma60. 이것은 IFM의 차등 라벨링을 허용합니다 (비행 근육은 다른 pupal 근육보다 더 강하게 표시되고 다르게 모양) 뿐만 아니라 GAL4-UAS 기반 조작의 성능, 예를 들어 구조 또는 RNAi 실험. 또한 Mef2-GAL4를 욕조-GAL80ts와 결합하여 RNAi 관련 조기 치사를 피하거나 UAS-Dcr2와 결합하여 RNAi 효율40을증가시킬 수 있다. 
Mef2-GAL4대신 사용할 수 있는 근육 유형 특이성, 시간발현 패턴 및 드라이버 강도19,61에서 변화하는 추가 GAL4 드라이버 또는 GFP 라인이 사용 가능합니다. 예를 들어 Act88F-GAL4는 처음에는 24h APF 를 중심으로 표현되므로 이전 타임포인트에는 사용할 수 없습니다. 그러나, 그것은 강하게 IFM를 표시하고 RNAi 관련 초기 치사성을 피하기 위하여 유용할 지도 모릅니다. 그-GFP 또는 Act88F-GFP라벨 IFM, 다시 시간적 제한으로, 그러나 그들은 마커 발현의 GAL4 의존성을 피하고 관심의 돌연변이 배경과 조합하여 유용할 수 있다. 다른 가능한 마커 라인의 목록은 사용할 수있습니다 19. 또한 유전자 및 GAL4/UAS 시스템의 사용은 유전자 발현 아티팩트를 유발할 수 있으므로, 예를 들어 드라이버 라인이 야생 형 배경 변형으로 교차하여 이러한 아티팩트가 아마도 그러하도록 적절한 컨트롤을 사용하는 것이 중요합니다. 모든 샘플에서 동일합니다.
첨부 된 비디오와 함께,이 상세한 프로토콜은 pupal IFM 해부를 보다 쉽게 접근할 수 있도록하고 근육 발달을 연구하기 위한 오믹스 접근법의 사용을 촉진하는 것을 목표로합니다. 해부된 IFM을 통해 접근할 수 있는 생화학 및 오믹스 분석과 Drosophila 유전학 및 세포 생물학의 힘을 결합하는 것은 myogenesis 및 근육 기능의 기계론적인 이해를 발전시키는 잠재력을 가지고 있습니다. 전사체 및 단백질 조절의 시스템 수준 관찰을 신진 대사 및 기능적 출력과 연결하는 향후 연구는 근육 유형 의 특정 개발 및 근육 장애의 발병 기전에 대한 깊은 이해를 제공할 것입니다.

현대 omics 기술은 근육 발달과 인간의 근육 장애의 근본적인 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 예를 들어, 동물 모델에서 유전적 및 생화학적 검증과 결합된 전사체 데이터의 분석은 결합 인자 RBM20의 손실이 30개 이상의 sarcomere의 표적 네트워크의 조절로 인해 확장된 심근병증을 유발한다는 것을 밝혀냈습니다. 이전에 심장 질환과 관련된 유전자, 티틴을포함1,2,3.
두 번째 예에서, 세포 배양, 동물 모델 및 인간 환자로부터의 연구는 근위축증이 MUSCLEblind(MBNL)의 격리 및 CELF14,5의상류조절로 인한 RNA 조절의 붕괴에 기인한다는 것을 보여주었다. MBNL과 CELF1 (CUGBP1 또는 Bruno-Like 2라고도 함) 사이의 교차 조절 및 시간 적 역학은 근위축증 환자의 지속적인 배아 접합 패턴을 설명하는 데 도움이됩니다. 추가적으로, 잘못 규제된 표적의 큰 네트워크는 질병의 복잡한 본질을 설명하는 것을 돕습니다4,6,7,8. 그 같은 연구 결과의 대다수는 인간 적인 근육 질병의 근본적인 기계장치를 이해하기 위하여 유전 모형 유기체에 있는 omics 접근을 이용합니다. 또한, 그들은 질병이나 노화 근육의 변화를 이해하기 위해 건강한 근육의 시간적 및 조직 유형 특정 유전자 발현, 단백질 수정 및 대사 패턴을 먼저 이해하는 것의 중요성을 강조합니다.
초파리 멜라노가스터는 또 다른 잘 확립된 유전 모델 유기체입니다. 사르코레의 구조와 개별 사르코망 성분은 파리에서 척추동물4,9,10으로매우 보존되며 간접 비행 근육(IFMs)은 연구할 수 있는 강력한 모델이 되었습니다. 근육 발달의 여러 측면11,12. 첫째, 섬유질 비행 근육은 기능적으로 그리고 형태학적으로 관형 신체근육과 구별11,13,근육 형 특정 발달 메커니즘의 조사를 허용. 스팔트 메이저(Salm)14,엑스트라덴티클(Exd), 호모토락스(Hth)15를 포함한 전사 인자는 세브릴라 운명 조절자로 확인되었다. 또한, 살름의 하류, CELF1 호몰로그 Bruno1 (Bru1, Aret)은 세브릴라 특이적 접합 프로그램16,17을지시한다.
둘째, IFM은 근형성 융합 및 myotube 부착부터 근위대 유족발생 및 사코메르 성숙9,18,19에이르기까지 근형성 자체의 과정을 이해하는 중요한 모델이다. 셋째, Drosophila 유전학은 sarcomere 형성, 기능 및 생물 물리학적 특성에 개별 단백질, 단백질 도메인 및 단백질 이소폼에 의한 기여의 조사를허용합니다 20,21,22 ,23. 마지막으로, IFM 모델은 근위축증, 근시근균, 근육퇴행성 질환, 작용병증 등과 같은 다중 인간 근육 장애의 연구를 위해 개발되었으며,24,25,26 ,27, 질병 메커니즘 및 잠재적 치료법에 대한 중요한 통찰력을 제공28,29,30. 따라서, Drosophila는 근육 형 특이적 전사, 접합 및 염색질 조절의 메커니즘뿐만 아니라 근육 발달에서 신진 대사의 역할을 포함하여 근형성 분야에서 많은 열린 질문을 해결하는 유용한 모델입니다. 현대 오믹스 기술의 적용, 특히 다양한 유전적, 생화학적 및 세포 생물학적 분석을 통해 Drosophila에서사용할 수 있는, 근육의 이해를 극적으로 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 개발, 노화 및 질병.
IFM은 비행에서 가장 큰 근육이며, 성인31,32의흉부 전체 길이에 걸쳐 거의 1mm에 걸쳐 있습니다. 그러나, 이러한 작은 크기는 조직 형 특이적 방식으로 Drosophila에서 오믹 기술을 적용하기에 충분한 샘플을 얻는 도전을 생성한다. 또한 IFM은 푸팔 단계 중에 형성되는 성인 근육의 일부입니다. 근체세포는 근체튜브를 형성하기 위해 융합되며, 이는 puparium 형성 후 약 24시간 동안 힘줄에 부착하고 30h APF(그림 1A-D)18,33,30h APF 주위의 근위병 발생을 개시하는 데 필요한 다짐 단계를 거칩니다. 34.
myofibers는 약 48 h APF까지 sarcomere 추가에 초점을 맞춘 초기 성장 단계를 겪고, 흉부의 전체 길이에 걸쳐 성장, 다음 성숙 단계로 전환, 있는 sarcomeres 길이와 폭에서 성장 하 고 72 h APF(그림 1A-D)32,35에의해 스트레치 활성화를 설정하기 위해 리모델링. 섬유 성숙의 개시는 적어도 부분적으로 Salm 및 E2F32,36,37에의해 통제되고, 그 접합이 Bru1에 의해 통제되는 다중 IFM 특이적인 sarcomere 단백질 이소폼은 이 기간 동안 통합됩니다 단계16,17. 성숙한 파리는 90-100 h APF에서 닫힙입니다. 즉, 근육 발달을 연구하기 위해 IFM은 오믹스 접근법을 사용하여 분석을 용이하게 하기 위해 여러 pupal 타임포인트에서 충분한 양, 품질 및 순도로 격리되어야 합니다.
IFM 해부를 위한 몇 가지 프로토콜이 게시되었습니다. 이러한 프로토콜은 의도된 응용 프로그램에 적합하지만 omics 접근 방식에 이상적인 프로토콜은 없습니다. 푸팔 및 성인 IFM19의면역형광에 대한 IFM 형태를 보존하는 프로토콜, 기계적 평가를 위한 IFM 섬유 분리31,또는 극저온절38에서 푸팔 IFM의 미세해부를 활용하는 프로토콜은 너무 전문화되고 시간및 오믹스 응용 프로그램에 대한 IFM 조직의 충분한 양을 합리적으로 얻기 위해 노동 집약적. 다른 프로토콜은 특히 성인 IFM38,39의신속한 해부를 위해 개발되었으며, 따라서 pupal 단계에 적용되지 않으며, 이상적이지 않거나 RNA 격리와 호환되지 않을 수 있는 버퍼를 사용한다. 따라서, 생화학 또는 오믹 응용을 위한 pupal IFM을 분리하기 위한 새로운 접근법을 개발할 필요가 있다.
여기서 우리는 16h APF에서 성인 단계16,32를통해 mRNA-Seq 분석을 위해 성공적으로 사용된 pupal 단계 동안 IFM의 해부를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 녹색 형광 단백질 (GFP) 라벨을 사용하여 pupal 및 성인 발달의 모든 단계에서 IFM을 식별하여 형광 해부 현미경하에서 살아있는 해부를 허용합니다. 이 접근 방식은 기존 IFM 해부 프로토콜보다 처리량이 높은 노동 집약적입니다. 이를 통해 시료의 신속한 분리 및 동결 보존이 가능하여, 오믹스 접근법뿐만 아니라 표준 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 서부 블로팅에 대해 여러 차례 해부 후 충분한 물질을 생성할 수 있습니다.
우리는 48 h APF 전(초기 변형 중, IFM 부착이 더 엄격할 때) 및 48시간 APF(푸팔 바디 플랜 및 IFM 부착이 잘 정의된 경우) 모두 IFM을 빠르게 해부하는 방법을 보여주는 두 부분으로 프로토콜을 제시합니다. 우리는 모든 시점에서 해부 된 IFM에서 고품질 RNA를 분리하고 RNA 격리 및 역 전사에 대한 다른 접근법에 대한 데이터를 제시 할 수 있음을 보여줍니다. 마지막으로, CELF1 호몰로그 Bruno1을 예로 사용하여 mRNA-Seq, 질량 분석법 및 RT-PCR에 해부 프로토콜의 적용을 입증한다. 우리는 Bruno1 돌연변이 IFM에서 프로테오믹스 데이터에서 사르코메르 단백질 이소폼의 오발성을 보여주고 Myosin중쇄(Mhc)의C 말단 스플라이스 이벤트의 Bruno1 조절을 조사하였다. 이러한 결과는 omics 데이터가 유전 적 및 생화학 적 실험을 보완하는 생물학적 현상에 대한 깊은 이해를 제공 할 수있는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>5x High Fidelity (HF) 버퍼</td><td>Thermo Fisher</td><td>F518L</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 배양 접시</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z643084-600EA</td><td>Greiner 접시, 60 mm x 15 mM, 통풍</td></tr><tr><td>블랙 해부 접시 (유리)</td><td>Augusta Laborbedarf</td><td>42021010</td><td>Lymphbecken, 검은색 유리, 4 cm x 4 cm</td></tr><tr><td>검은색 실리콘 해부 접시: 활성탄 가루</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9157</td><td>대부분의 약국에서도 구할</td></tr> 수 있는 <tr><td>블랙 실리콘 해부 접시: 실가드 184</td><td>시그마-알드리치</td><td>761036</td><td>요리는 실가드(~50g)와 활성탄 분말(200mg)을 혼합하고 페트리 접시(~4,60mm 접시)에서 경화하여 만듭니다.</td></tr><tr><td>푸른 유봉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td>살균 할 수있는 모든 펠릿 유봉은 모터 구동 그라인더와 함께 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>휴대 전화 카메라, 삼성 갤럭시 S9</td><td>삼성</td><td>SM-G960F / DS</td><td>현미경으로 촬영하지 않은 사진에 사용</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3691,0500</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경, 라이카 SP8X 직립 컨포칼</td><td>라이카</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경, Zeiss LSM 780 반전 컨포칼</td><td>Zeiss</td><td></td><td>www.zeiss.com</td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>Scotch/3M</td><td>3M ID 70005108587</td><td>양면 테이프, 대부분의 사무용품 취급점에서 사용 가능</td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Inox 직선 팁 11cm 집게, 0.05mm x 0.02mm 팁</td></tr><tr><td>EtOH(100%, RNase 무료)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-M</td><td></td></tr><tr><td>형광해부 현미경 카메라, Leica DFC310 FX 카메라</td>, <td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>형광해부 현미경 소프트웨어, Leica Application Suite(LAS) 버전 4.0.0</td>, <td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>형광해부 현미경, Leica M165 FC</td>, <td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>플라이 : Bru1 [M2]</td><td></td><td></td> <td>플라이 스톡; 이 서류상</td></tr><tr><td>비행거리: Bru1[M3]</td><td></td><td></td><td>플라이 주식; 이 논문</td></tr><tr><td>Fly: Mef2-GAL4</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>BDSC:27390</td><td>Fly stock</td></tr><tr><td>Fly: salm[1]</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>3274</td><td>Fly stock</td></tr><tr><td>Fly: salm[FRT]</td><td></td><td></td><td>Fly stock; Spletter et al., Elife, 2018</td></tr><tr><td>Fly: UAS-Bru1IR</td><td>Vienna Drosophila Research Center</td><td>GD41568</td><td>Fly stock, RNAi hairpin</td></tr><tr><td>Fly: UAS-GFP::Gma</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>BDSC:31776</td><td>Fly stock</td></tr><tr><td>Fly: UAS-mCD8a::GFP</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>BDSC:5130</td><td>Fly stock</td></tr><tr><td>fly: w[1118]</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>3605</td><td>Fly stock</td></tr><tr><td>fly: weeP26</td><td></td><td></td><td>Fly stock; Clyne et al., Genetics, 2003</td></tr><tr><td>GFP detection reagent, GFP-Booster</td><td>ChromoTek</td><td>gba488-100</td><td></td></tr> <tr>참조<td>Glycogen</td><td>Invitrogen</td><td>10814-010</td><td></td></tr><tr><td>이미지 처리 소프트웨어, Photoshop CS6</td><td>Adobe</td><td></td><td>www.adobe.com</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516-25ML</td><td>2-프로판올</td></tr><tr><td>방법 1(RNA 분리): TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>Guanidinium isothiocyanate 및 phenol monophasic solution</td></tr><tr><td>방법 2(RNA 분리): 방법 1 + TURBO DNA가 없는 키트</td><td>Invitrogen</td><td>AM1907</td><td>TRIzol 분리 후 DNA 제거 키트로 처리</td></tr><tr><td>방법 3(RNA 분리): TRIzol에서 Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2070S</td><td>RNA 분리, 상 분리를 사용하는 대신 상용 컬럼 사용. Monarch DNase I 반응 완충액에서 Monarch Dnase I으로 수행된 권장 DNase 처리.</td></tr><tr><td>방법 4 (RNA 분리) : RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>제공된 DNase 처리를 사용했습니다. IFM 펠릿은 동물 조직에 대해 제안된 바와 같이 RTL 완충액에서 균질화되었습니다.</td></tr><tr><td>방법 5 (RNA 분리): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td><td>Promega</td><td>Z6110</td><td>우리는 ' 섬유질 조직에서 RNA의 정제'.</td></tr><tr><td>방법 6 (RNA 분리) : Monarch Total RNA Miniprep Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>T2010G</td><td>우리는 조직 / 백혈구에 대한 프로토콜을 적용하고 300 &mu에서 용해했습니다. RNA 보호 시약의 L.</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM12400</td><td>RNase-free 마이크로분리 튜브, 1.5 mL</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Thermo Fisher</td><td>12342108</td><td>표준 슬라이드, 비충전, 1 mm</td></tr><tr><td>마이크로톰 블레이드</td><td>PFM Medical</td><td>207500003</td><td>C35 feather 80 mm</td></tr><tr><td>Monarch DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>T2004-21</td><td></td></tr><tr><td>Monarch DNase I 반응 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>T2005-21</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0480X</td><td></td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td>Marabu</td><td>1910000000</td><td>Marabu Fino Round No. 0 또는 모든 미술 용품의 유사한 브러시</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer(1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>인산염 완충 식염수 정제, 1L 용액용, pH 7.4</td></tr><tr><td>PFA PureTip 피펫 팁</td><td>Elemental Scientific</td><td>ES-7000-0101</td><td>샘플 손실 감소를 위한 표준 피펫 팁 대체품 옵션; 100 mL, 0.8 mm 오리피스</td></tr><tr><td>Phusion 고충실도 중합효소</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530XL</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5161</td><td>Universal 200 mL 피펫 팁</td></tr>: <tr><td>Preomics iST 8x Kit</td> 질량 분석법용 <td>Preomics</td><td>P.O.00001</td><td>펩타이드 준비 키트</td></tr><tr><td>Q Exactive 질량 분석기</td><td>Thermo Fisher</td><td>725500</td><td>질량 분석법은 LMU Biomedical Center의 단백질 분석 부서에서 수행되었습니다.</td></tr><tr><td>Qubit RNA Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-phalloidin</td><td>Invitrogen, Molecular Probes</td><td></td><td></td>10063052</tr><tr><td>RNA 농도 접근법 1 & RNA 무결성 추적, Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 농도 접근법 2, Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>RNA 농도 접근법 3, Qubit 4 형광계</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>RNA Pico Chips</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Promega</td><td>A7937</td><td></td></tr><tr><td>RNase가 없는 물, 디에틸 피로카보네이트(DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>DEPC는 밤새 물을 처리한 다음 오토클레이브하여 모든 RNase를 제거합니다.</td></tr><tr><td>RT 키트 #1: Super Script III 역전사 효소 키트</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td>역전사 키트</td></tr><tr><td>RT 키트 #2: LunaScript</td><td>New England Biolabs</td><td>E3010S</td><td>역전사 키트</td></tr><tr><td>RT 키트 #3: QuantiNova 역전사 키트</td><td>Qiagen</td><td>205410</td><td>역전사 키트</td></tr><tr><td>슬라이드 장착 버퍼, Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>DAPI 포함</td></tr><tr><td>통계 소프트웨어: GraphPad Prism</td><td>GraphPad Prism</td><td></td><td>www.graphpad.com</td></tr><tr><td>통계 소프트웨어: Microscoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>번들의 일부로 구입: Office Home & 학생용 2019</td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5405000760</td><td>Eppendorf Centrifuge 5425 또는 동급</td></tr>의 <tr><td>티슈/ Kimwipes</td><td>Sigma-Aldrich Z188956</td><td></td><td>표준 티슈 와이</td></tr>프 <tr><td>전사 피펫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z350796</td><td>플라스틱 피펫</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>3mm 절삭날, 팁 직경 0.05mm, 길이 8cm</td></tr><tr><td>Whatman 종이</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1004-070</td><td>여과지 원형, 4 등급, 70mm</td></tr></tbody></table>

오믹스 접근법에 대한 드로소필라 멜라노가스터 비행 근육의 해부

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila 비행 근육은 전사 조절, 대체 접합, 신진 대사 및 기계생물학과 같은 다양한 과정을 연구하는 강력한 모델이며, 이는 모두 근육 발달과 근생 신생에 영향을 미칩니다. 질량 분석 또는 깊은 시퀀싱에 의해 생성된 Omics 데이터는 이러한 생물학적 프로세스에 대한 중요한 기계적 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이러한 접근법의 경우, 조직 특이적 샘플을 분석하여 오믹스 지문의 선택성과 특이성을 모두 증가시키는 것이 유익하다. 여기에서 우리는 omics 응용을 위한 높게 풍요로운 근육 견본을 생성하기 위하여 살아있는 pupae에서 형광 표지한 비행 근육의 해부를 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 먼저 초기 pupal 단계에서 비행 근육을 해부하는 방법을 설명 (&48 번화 증형성 후 시간 [APF]), 근육은 녹색 형광 단백질에 의해 식별 할 때 (GFP) 라벨. 그런 다음 근육이 해부 현미경으로 구별 될 때 늦은 번데기 (>48 h APF) 또는 성인에서 근육을 해부하는 방법을 설명합니다. 동반 된 비디오 프로토콜은 기술적으로 요구하는 해부를 근육과 초파리 연구 커뮤니티에 보다 광범위하게 접근 할 수 있게 합니다. RNA 적용을 위해, 우리는 다른 시점에서 그리고 다른 접근으로 격리될 수 있는 RNA의 양 그리고 질을 분석합니다. 우리는 또한 Bruno1 (Bru1)가 myosin 중계체인(Mhc)접합의 시간적 변화에 필요하다는 것을 보여주고, 해부 된 근육이 mRNA-Seq, 질량 분석 법 및 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)에 사용될 수 있음을 입증합니다. 응용 프로그램. 이 해부 프로토콜은 조직 특이적 오믹스 분석을 촉진하는 데 도움이 되며 일반적으로 근생의 여러 생물학적 측면을 연구하기 위해 적용될 수 있습니다.

초파리 비행 근육은 전사 조절, 대체 접합, 신진 대사 및 메카노생물학을 연구하는 강력한 모델입니다. 우리는 프로테오믹스및 깊은 시퀀싱에 이상적인 고농축 샘플을 생성하기 위해 살아있는 번데기에서 형광 표지된 비행 근육의 해부를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 견본은 근육 발달의 다양한 양상에 중요한 기계론적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

이 프로토콜은 pupae 발달 중 다양한 시점에서 Drosophila에서 GFP 표지된 간접 비행 근육의 해부를 용이하게 하여 유전자 및 단백질 발현의 변화를 평가합니다. 이러한 기술을 사용하여 최소한의 RNA 단백질 분해를 갖춘 고농축 비행 근육 샘플을 달성할 수 있으며 RT-PCR, 서부 블롯 또는 오믹 접근법에 적합합니다. 이러한 특수 한 해부는 연습과 기술이 필요하지만 해부 할 수있는 강아지의 수와 샘플의 품질은 경험을 통해 향상시킵니다.이 해분의 시각적 데모는 비 근육 조직으로부터 비행 근육을 구별하는 방법을 결정하고 pupal 표본에서 비행 근육의 신속한 격리를 촉진하는 데 중요합니다. 강아지를 무대에 올리기 위해 젖은 페인트 브러시를 사용하여 60mm 페트리 접시에 프리 푸파를 수집하고 옮기고 쌍안경 현미경으로 강아지를 성관계를 가십시오. 수컷은 고환의 존재에 의해 식별되며, 이는 불투명한 강아지에 반투명 글로브로 나타납니다.파리의 시간, 날짜 및 유전자형으로 접시에 라벨을 붙인 후, 적절한 단계까지 25~27도의 섭씨 인큐베이터로 푸파에나이를 노화시다. 48 H APF 이전의 IFM 해부의 경우 젖은 페인트 브러시를 사용하여 적절하게 준비된 푸파를 차가운 PBS로 채워진 검은 색 해부 접시로 옮기십시오. 형광 해부 현미경에서, 검은 해부 접시의 바닥에 강아지 중 하나를 밀어 5 집게를 사용합니다.pupae를 명확하게 시각화 할 수 있을 때까지 현미경 줌 및 초점을 조정합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 강아지의 전방을 파악하고 두 번째 한 쌍의 집게한 끝으로 새끼를 찌르고 복부의 약간 오프 센터, 흉부 바로 뒤에 있습니다. 첫 번째 포셉을 사용하여 푸팔 케이스의 전방 절반을 제거하고 흉부 바로 뒤에 노출된 새끼를 꼬집어 흉부에서 복부를 분리합니다.다음으로 흉부의 전방 부분을 부드럽게 짜서 형광으로 표시된 IFM을 노출시합니다. 그런 다음, 집게를 사용하여 나머지 시체를 접시의 반대편에 버리고 후속 푸파를 동일한 방식으로 해부합니다. 모든 강아지가 해부되면, IPM 섬유를 수집하고 검은 해부 접시의 바닥에 더미로 섬유를 구성하기 위해 집게를 사용합니다.집게를 사용하여 시야에서 파편을 밀어 내고 비IFM 근육, 지방, 큐티클 또는 샘플에서 원치 않는 조직을 제거하십시오. 그런 다음 클리핑 된 파이펫 팁을 사용하여 IFM 더미를 냉기 PBS 250 마이크로 리터를 포함하는 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 전송합니다. 48 H APF 후 IFM 해부의 경우 가볍게 젖은 페인트 브러시를 사용하여 미세 스코프 슬라이드에 장착 된 양면 스티커 테이프 스트립으로 준비 된 푸파를 전달하십시오.pupae를 선과 복부 측면 아래로, 앞쪽으로 슬라이드의 바닥쪽으로 방향을 지정합니다. 모든 강아지가 배치되었을 때, 포셉을 사용하여 앞쪽 첨탑 위에 첫 번째 pupal 케이스를 떼어 놓고 부드럽게 한 쌍의 포셉을 후방쪽으로 밀어 포스가 움직일 때 푸팔 케이스를 절단합니다. 열린 케이스에서 강아지를 풀어, 즉시 두 번째 현미경 슬라이드에 PBS의 드롭에 강아지를 전송.모든 강아지가 풀려나면 미세 한 가위를 사용하여 흉부에서 강아지의 복부를 자르고 복부를 별도의 더미로 밀어 넣습니다. 모든 토축이 제거되면, PBS의 대부분과 복부더미를 제거하기 위해 티슈 페이퍼를 사용합니다. 남은 흉부에 신선하고 차가운 PBS 한 방울을 넣은 후 가위를 사용하여 세로 체축을 따라 머리에서 잘라 내어 흉부를 반으로 나눕니다.모든 강아지가 해부되면 5 개의 포셉을 사용하여 중간 부분 중 하나를 선택하고 IFM의 중간 위와 아래에 하나의 포셉의 팁을 부드럽게 삽입하십시오. 여전히 집게의 첫 번째 쌍을 들고, 큐티클과 힘줄에서 IFM의 한쪽 끝을 잘라 미세 가위를 사용하여, pupae 180도 회전하기 전에, IFM의 다른 쪽 끝을 큐티클과 힘줄에서 무료로 절단 할 수 있도록. 집게를 사용하여 IFM 번들을 흉부에서 PBS 버블 가장자리로 전송하고 물 장력을 사용하여 번들을 제자리에 고정시하십시오.그런 다음 시체를 슬라이드의 반대쪽으로 밀어 내고 나머지 IFM을 동일한 방식으로 해부합니다. 모든 IFM이 수집된 경우 5개의 집게를 사용하여 샘플로 들어갈 수 있는 점프 근육이나 큐티클 조각을 제거합니다. 그런 다음 물 장력을 사용하여 한 쌍의 집게 사이에 해부된 IFM을 부드럽게 캡처하고 IFM을 냉간 PBS 250 마이크로리터가 들어있는 1.5 밀리리터 미세 센심 분리 튜브에 배치합니다.BRUNO1 IR IFMs의 mRNA 염기서열 분석 데이터는 야생형 염기서열 분석 데이터와 비교하여 유전자 단위 수준에서 발현의 변화를 나타낸다. 해부 된 IFM에 전체 프로테오메 질량 분광법을 사용하여, 유사한 조절은 단백질 과 단백질 동위원소 수준에서 관찰된다. Mhc의 최종 인트론으로 단백질 트랩 라인을 삽입한 후, GFP 표지 단백질의 통합은 90 H APF에서 M라인의 양쪽에 두 개의 점으로 IFM에서 관찰될 수 있으며, 다리 근육 조직에서GFP 신호는 sarcomere M 라인을 가로질러 균일하게 관찰될 수 있다.해부 된 IFM에 RT-PCR를 사용하는 경우, MFP 라벨 엑슨 34에서 37 이벤트에서 라벨이 없는 엑슨 34 에서 35 이벤트로 Mhc 등색 스위치를 사용하면 27섭씨에서 푸파리움 형성 후 30~48시간 사이에 감지할 수 있습니다. mRNA 염기서열 분석 데이터에서 다리 및 점프 근육 조직은 세 가지 Mhc isoforms를 모두 표현하여 성숙한 근육에서 GFP 라벨이 부착된 등도포의 발현을 유지합니다. Spalt 주요 돌연변이및 BRUNO1 IR-IFM은, GFP 표지된 Mhc isoform의 발현을 그(것)들이 발전할 때, 다리와 점프 근육 조직의 그것과 유사한 등소형 발현 프로필의 결과로, 그 결과, 그(것)들을 중단하는 것을 실패했습니다.해부는 RNA 분해를 방지하기 위해 30 분 이내에 수행되어야한다는 것을 기억하십시오. 그리고, 다른 세포 유형에 의한 오염을 제한하는 주의를 기울여야 한다. 이 방법은 RT-PCR 또는 서부 블로팅과 같은 생화학적 접근법에 적합한 IFM 농축 시료와 질량 분석법, 높은 처리량 시퀀싱, 크로마틴 형성 캡처 및 메타볼로믹스와 같은 오믹 스타일 접근법을 생성합니다.이 해부는 개발 및 유전자 규제의 근본적인 기계장치를 조사하기 위한 시스템 수준 데이터로 Drosophila에 있는 강력한 유전 접근을 보완할 수 있습니다.

dissection-drosophila-melanogaster-flight-muscles-for-omics

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 프로토콜은 해부하다하는 방법을...

Drosophila 애벌레 NMJ의 해부

근육 손상을 기본 메커니즘의 확인이 중요합니다. 여기 파라핀 - 임베디드 및 Drosophila 흉부 근육의 부분을 냉동을 준비 histological 기술을 제시한다. 이것은 근육 형태학 및 단백질 및 기타 근육 세포 구성 요소의 로컬 리 제이션의 분석이 가능합니다.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징

초파리 비행 근육은 근육 발달 및 생리학을 위한 모델 시스템으로 사용됩니다. 이 비디오는 성인의 비행 근육 조직에 대해 설명하고 번데기의 RNA 염기서열 분석에 적합한 간접 비행 근육 발달을 해부하는 프로토콜을 강조합니다.

초파리 Late Pupa IFM(Indirect Flight Muscle) 해부: 고처리량 조직 수집 방법

이 비디오는 초파리의 등쪽 종방향 근육에서 신경근 접합부의 구조적 무결성을 평가하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 절차에는 뉴런과 근육을 두 개의 서로 다른 항체로 염색하고 돌연변이 파리와 야생형 파리 사이의 형광 패턴을 비교하는 것이 포함됩니다. 돌연변이 파리에서 신경 염색의 감소는 근육 구조가 손상되지 않은 상태에서 신경 퇴행을 나타냅니다.

Drosophila에서 등쪽 종근 신경근 접합부의 구조적 무결성 평가

초파리 애벌레 수지상 arborization (다) 신경 세포를 사용하여 신경 세포의 형태 형성의 연구는 면역에 의해 신경 세포와 표피 단백질의 현장 시각화 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 애벌레 몸 벽에서 근육 조직을 제거하여 다 신경 세포와 주변 표피 세포의 면역 형광 분석을 개선하는 절차를 설명합니다.

제거<em&gt; 초파리</em감각 뉴런과 표피 세포의 면역 형광 분석을위한 애벌레 필렛에서&gt; 근육 조직

우리는 초파리 성인 근육 질량을 결정 하는 간접적인 방법 근육 영역을 측정 하는 방법을 보고 합니다. 간접 비행을 분석 하 여 우리의 방법론의 응용 근육 Myotonic 영양 질병의 초파리 모델에서 설명 합니다.

초파리 Melanogaster 성인 간접 비행 근육의 광 단면 근육 면적 결정

이 프로토콜, 초파리 간접 비행 근육의 미토 콘 드리 아 구조를 명료 하 게 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램 보여 줍니다.

3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 직렬 섹션 전자 단층 촬영에 의해 밝혀 초파리 간접 비행 근육의

초파리 는 근육 형성을 조절하는 주요 분자를 연구하기 위한 잘 정립된 모델입니다. 그러나 현재의 방법은 mRNA 전사 역학 및 세포융합 내 공간 분포를 결정하기에 충분하지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 RNA 형광 in situ hybridization 방법을 최적화하여 단일 분자 규모에서 mRNA를 검출하고 정량화할 수 있습니다.

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila (초파리의 단일 분자 스케일에서 근육 전사 역학 연구)

초파리는 근발생의 기본 메커니즘을 이해하는 강력한 모델입니다. 흉부 반절편 절편을 해부 및 준비하기 위한 이 프로토콜은 번데기 및 성인 단계 모두에서 간접 비행 근육의 현미경 분석을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 세포 형태, 단백질 국소화, 근육 구조 및 근형성의 기타 여러 측면의 공초점 이미징을 가능하게 합니다.

현미경 접근을 위한 Drosophila melanogaster 간접 비행 근육의 해부

배우세요 Drosophila melanogaster 간접 비행근 해부법을 통해 근육 발달 중 유전자 및 단백질 발현 변화를 연구하는 방법을 익히세요. 이 기술은 고품질 샘플을 제공하여 프로테오믹스 및 딥 시퀀싱 분석에 활용할 수 있습니다.

오믹스 접근법에 대한 드로소필라 멜라노가스터 비행 근육의 해부

더 많은 동영상 탐색