Name: 일정한 흐름에 있는 1 차적인 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 배우세요 일정한 유전단 응력 하에서 폐렴구균이 1차 인간 내피 세포에 부착하는 과정을 현미경으로 관찰하는 방법을. 이 기법은 세균 감염 메커니즘과 혈관 무결성 연구에 활용됩니다.

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<ol><li>Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae%3A+transmission%2C+colonization+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).</li>
<li>Bergmann, S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatility+of+pneumococcal+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Versatility of pneumococcal surface proteins.</a> Microbiology. 152, 295-303 (2006).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+is+required+for+vitronectin-mediated+internalization+of+Streptococcus+pneumoniae+by+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells.</a> Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).</li>
<li>Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+bacterial+enolase+and+plasminogen+promotes+adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+epithelial+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells.</a> International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).</li>
<li>Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae+is+a+plasmin%28ogen%29-binding+protein+displayed+on+the+bacterial+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface.</a> Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+plasmin%28ogen%29-binding+motif+in+surface+displayed+alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae.</a> Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).</li>
<li>Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nine+residue+plasminogen-binding+motif+of+the+pneumococcal+enolase+is+the+major+cofactor+of+plasmin-mediated+degradation+of+extracellular+matrix%2C+dissolution+of+fibrin+and+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration.</a> Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).</li>
<li>Jagau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+willebrand+factor+mediates+pneumococcal+aggregation+and+adhesion+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 511(2019).</li>
<li>Tischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+local+disorder+in+a+clinically+elusive+von+willebrand+factor+provokes+high-affinity+platelet+clumping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping.</a> Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).</li>
<li>Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+von+willebrand+factor+and+its+function+in+platelet+adhesion+and+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+Research+Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation.</a> Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).</li>
<li>Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+willebrand+factor+in+cardiovascular+disease%3A+Focus+on+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes.</a> Circulation. 117, 1449-1459 (2008).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+Willebrand+factor%2C+Jedi+knight+of+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124, 1412-1425 (2014).</li>
<li>Luttge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+induces+exocytosis+of+weibel-palade+bodies+in+pulmonary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).</li>
<li>Cornish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+in+a+Pipe+of+Rectangular+Cross-Section%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+A%22%5BJournal%5D)">Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section.</a> Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).</li>
<li>Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+von+Willebrand+Factor+Pathophysiology+Using+a+Flow+Chamber+Model+of+von+Willebrand+Factor-platelet+String+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation.</a> Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).</li>
<li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).</li>
<li>Bergmann, S., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single+cells+to+engineered+and+explanted+tissues%3A+New+perspectives+in+bacterial+infection+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Reviews+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology.</a> International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).</li>
<li>Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromachining+a+miniaturized+capillary+electrophoresis-based+chemical+analysis+system+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip.</a> Science. 261 (5123), 895-897 (1993).</li>
<li>Magnusson, M. K., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin%3A+Structure%2C+assembly%2C+and+cardiovascular+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).</li>
<li>Zerlauth, G., Wolf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+fibronectin+as+a+marker+for+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases.</a> The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).</li>
<li>Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2012.+Microfluidic+3D+cell+culture%3A+potential+application+for+tissue-based+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).</li>
<li>Fiddes, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circular+cross-section+PDMS+microfluidics+system+for+replication+of+cardiovascular+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions.</a> Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).</li>
<li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).</li>
<li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultralarge+von+willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128, 50-59 (2013).</li>
<li>Schneider, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+unfolding+triggers+adhesion+of+von+willebrand+factor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).</li>
<li>Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wall+shear+stress+as+measured+in+vivo%3A+consequences+for+the+design+of+the+arterial+system%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).</li>
<li>Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+Weibel-+Palade+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of Weibel- Palade bodies.</a> Blood. 117, 5033-5043 (2011).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+animal+cells%3A+A+manual+of+basic+Technique%2C+5th+edition%22">Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition</a>. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).</li>
<li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+JA+%22Epithelial+cell+culture-+a+practical+approach%22">Epithelial cell culture- a practical approach</a>. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218(1996).</li>
<li>Elm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectodomains+3+and+4+of+human+polymeric+Immunoglobulin+receptor+%28hpIgR%29+mediate+invasion+of+Streptococcus+pneumoniae+into+the+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).</li>
<li>Nerlich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+endothelial+cells+by+tissue-invasive+M3+type+group+A+streptococci+requires+Src+kinase+and+activation+of+Rac1+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).</li>
<li>Ho, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-cell+patterning+lab+chip%3A+mimicking+the+morphology+of+liver+lobule+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue.</a> Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328, 1662-1668 (2010).</li>
<li>Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration-on-a-chip%3F+The+perspectives+on+use+of+microfluidics+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine.</a> Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).</li>
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저자는 공개 할 것이 없다.

VWF와 같은 메카노에민성 숙주 단백질과의 세균 상호 작용 시뮬레이션은 정의된 단방향 및 연속적인 액체 흐름을 생성할 수 있는 이난 세포 배양 시스템을 필요로 하며, 이로 인해 신뢰할 수 있는 전단 응력 생성 . 여러 미세 유체 펌프 시스템이 이미 설명되어 있습니다. Bergmann 외에서 포괄적인 검토는 상이한 2차원 및 3차원 세포 배양모델(17)의주요 측면을 요약한다.
미세 유체 기술은 1990 년대 초에 마이크로 미터와 심지어 나노 미터 규모18에서제어, 재현 성 및 투과 성 미세 환경의 개발로 시작된 매우 젊은 기술입니다. 제시된 미세 유체 접근법은 또한 광범위한 세균 접착 메커니즘 및 관련 단백질을 연구하기 위해 적용될 수 있다. VWF와 같은 메카노 반응 접착 성분을 포함하는 모든 상호 작용에 가장 적합하며, 일반적으로 표준 세포 배양 기술을 사용하여 접근할 수 없습니다. 예를 들어...

폐렴구균 감염의 병인은 플라스미노겐 및 VWF 1,2와 같은 인간 지혈의 세포 외 매트릭스 화합물 및 구성 요소의 다양성과 다각적인 상호 작용을 특징으로합니다. 3,4,5,6,7,8. 다중 도메인 당단백질 VWF는 혈관 혈전 형성 부위에서 혈전세포 모집 및 피브린 혼입을 중재함으로써 균형 잡힌 지혈의 주요 조절자 역할을 한다9. 출혈 조절 및 상처 치유를 위한 기능적이고 활동적인 VWF의 중요성은 일반적인 상속된 출혈 장애 인 폰 윌레브란트 병10에의해 입증됩니다.
구형 VWF는 최대 14.0 μg/mL11,10의농도로 인간의 혈액 시스템에서 순환합니다. 혈관 손상에 대한 응답으로, 내피 바이벨 팔라드 바디 (WBP)에 의한 VWF의 국소 방출은현저하게 11,12증가된다. 이전 연구는 인간 내피 세포에 대한 폐렴구균 준수 및 공극 형성 독소 폐렴의 생산이 크게 루미날 VWF 분비를 자극한다는 것을 보여준다13. 혈류의 유체역학적 힘은 메카노반응성 VWF 도메인의 구조적 개방을 유도한다. 10dyn/cm2의 유량에서 VWF는 최대 수백 마이크로미터길이의 긴 단백질 문자열로 multimerizes10,12.
내피 표면과 폐렴구균의 상호 작용에서 전단 응력 하에서 생성된 다중화된 VWF 현의 기능을 이해하기 위해 미세 유체 기반 세포 배양 접근법이 확립되었습니다. 소프트웨어 제어 식 공기 압력 펌프 시스템을 갖춘 미세 유체 장치가 사용되었습니다. 이를 통해 정의된 유량으로 세포 배양 배지의 연속적이고 단방향 재순환이 가능했습니다. 따라서 시스템은 내피 세포의 표면에 정의된 전단 응력을 적용하여 특수 채널 슬라이드 내부에 부착된 상태로 유지했습니다. 이 접근법은 정의된 일정한 흐름 조건 하에서 VWF 현이 분화된 내피 세포에서 생성되는 인간 혈관 시스템의 혈류 내 전단력을 시뮬레이션할 수 있게 했습니다. 이를 위해, 내피 세포는 특정 채널 슬라이드(재료 표참조)에서 경작되었고, 이는 유동 동안 현미경 분석을 위해 조정되었다. 미세 유체 펌프 시스템은 동포 내피 세포 층에 확장 된 VWF 문자열의 형성에 필요한 고도로 정의되고 제어 된 전단 응력 상황을 제공했습니다. VWF-분비후 히스타민 보충제에 의해 인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)를 동류성장한 인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)의 자극 후, 현 형성은 10dyn/cm2의전단 응력(들)을 적용하여 유도되었다. 전단 응력은 세포 층에 작용하는 힘으로 정의됩니다. 그것은 코니쉬 등에 따라 대략 계산됩니다. al.14 와 방정식 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ01.jpg">
여기서 = dyn/cm2의전단 응력, θ =점도(dyn∙s)/cm2, h =채널 높이의 절반, 채널 너비의 절반, Φ=mL/min의 유량.
방정식 1의 결과는 사용되는 다른 슬라이드의 높이와 너비에 따라 달라집니다(재질 표참조). 본 연구에서 0.4 μm의 루어 채널 슬라이드를 사용하여 챔버 슬라이드 계수 131.6을 사용하였다(공식 2 참조). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ02.jpg">
37°C에서 배지의 점도는 0.0072 dyn∙s/cm²이고 10 dyn/cm²의 전단 응력도 사용하였다. 그 결과 10.5 mL/min의 유량이 발생했습니다(수식 3 참조). <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ03.jpg">
여기서, 숙주 혈관구조에서 세균 감염 메커니즘의 조사 및 시각화를 위한 단방향 층류 시스템을 이용한 미세유체 세포 배양 절차의 적응 및 발전이 상세히 기술된다. 내피 층에 VWF 스트링의 생성은 또한 연속적이고 꾸준한 전단응력(15)을적용할 수 있는 다른 펌프 시스템을 사용하여 자극될 수 있다.
VWF 현 형성의 흐름 및 자극에 합류하는 1차 내피 세포를 배작한 후, 적색 형광 단백질(RFP)을 발현하는 폐렴구균을 일정한 현미경 조절하에 내피 세포 층에 첨가하였다. 내피 세포의 표면에 VWF 문자열에 박테리아를 부착하는 것은 VWF 특이적 형광 표지 항체를 사용하여 실시간으로 최대 3 시간 동안 현미경으로 시각화및 모니터링되었습니다. 이러한 접근법으로, 혈관 내피에 세균 부착을 촉진하는 유착 보조인자로서 VWF의 역할을 결정하였고8.
단백질 분비 및 형태 변화의 현미경 시각화 이외에,이 방법은 실시간으로 세균 감염 과정의 단일 단계를 모니터링하고 서로 다른 시점에서 부착 된 박테리아의 양을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 감염. 특정 소프트웨어 제어 펌프 시스템은 또한 최대 며칠 동안 정의된 일정한 유동 조건에서 내피 세포를 배양할 수 있는 가능성을 제공하고 정의된 펄스 매질 유동 배양을 가능하게 합니다. 또한,이 방법은 다른 세포 유형을 사용하여 적용 할 수 있습니다. 염색 프로토콜을 적응하면 진핵 세포로 내중화된 박테리아를 감지하고 시각화할 수 있습니다.
이 원고는 병리학 적 과정의 효율적이고 다양한 특성화를 위해 정의되고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 접근 법으로 사용할 수있는이 고급 실험 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>1 mL 루어-시린</td>지 <td>Fisher Scientific</td><td>10303002</td><td>슬라이드의 루어 연결을 사용한 젤라틴 주입용 1 mL</td></tr> 용량의 2 <tr><td>mL 루어-주사기</td><td>Sarstedt</td><td>9077136</td><td>채널 챔버 슬라이드의 루어 연결부에 유체를 피켤팅/주입하기 위해</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>eBioscience now Thermo Fisher</td><td>00-4555-56</td><td>프로테아제 믹스 내피 세포의 부드러운 분리에 사용</td></tr><tr><td>AlexaFluor350-conjugated Phalloidin</td><td>Abcam</td><td>ab176751</td><td>제조업체에서 사용할 수 있는 농도 없음, 재고 용액은 300 tets에 충분하며 회사는 100 &micro를 사용하는 것이 좋습니다. L 1:1,000 희석, 청색 형광(DAPI 필터 설정)</td></tr><tr><td>AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse anti-body</td><td>Thermo Fisher Sientific</td><td>A11001</td><td>stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence</td></tr><tr><td>AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-anti-rabbit-antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>스톡 농도: pFA 고정 후 미세유체 슬라이드에서 폐렴구균의 면역 염색을 위한 2mg/mL, 적색 형광</td></tr><tr><td>Bacto Todd-Hewitt-Broth</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>BD 249210</td><td>복합 박테리아 배양 배지</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-25G</td><td>가용, 차단 완충액</td></tr> 준비용 <tr><td>필터가 있는 세포 배양 플라스크</td><td>TPP</td><td>90026</td><td>25 cm2 표면의 코팅되지 않은 세포 배양 플라스크에서 HUVEC subcultivation</td></tr><tr><td>원심분리기 Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>392304</td><td>박테리아 방사(>2mL 부피)</td></tr> <tr><td>원심분리기 Allegra X-30</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B06314</td><td>진핵 세포 방사</td></tr><tr><td>원심분리기 Z 216 MK</td><td>Hermle</td><td>305.00 V05 - Z 216 M</td><td>박테리아의 회전 감소 (2 mL 미만의 부피)</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>3886.2</td> 적<td>색 형광 단백질과 클로람페니콜 내성 카세트를 운반하는 유전자 구조로 변형 된 폐렴 구균의 배양을 위해 0.2 mg / mL의 농도로 사용</td></tr><tr>관<td>류 튜브 용 클램프</td><td>ibidi</td><td>10821</td><td>슬라이드를 펌프 시스템에 연결하기 전에 튜브에 액체를 보관</td>하기위한 ibidi 10821</tr><tr><td>CO2-Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>MIDI 40</td><td>인큐베이터 크기는 연결된 채널 슬라이드가 있는 유체 장치의 크기에 완벽하게 맞게 조정되었으며 37°C에서 흐름 배양에 사용되었습니다. C 및 5 % CO2</td></tr><tr><td>CO2-Incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18 AIC</td><td>5 % CO2 및 37 &deg에서 정의 된 대기에서 박테리아 및 세포의 배양; C</td></tr><tr><td>콜롬비아 혈액 한천 플레이트</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>PA-254005.06</td><td>S. 폐렴용 한천 기반 복합 배양 배지에 7% 양 혈액</td></tr><tr><td>보충 압력</td> 펌프 소프트웨어가 있는 컴퓨터 <td>Dell</td><td>Latitude 3440</td><td>Comuter</td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td>가열 가능한 챔버로 덮인 스테이지와 형광 필터, 제논 광원(SP8, DMi8) 및 DFC 365 FX 카메라(1392 x 1040, 1.4 메가픽셀)</td></tr><tr><td>Di 인산수소칼륨(KH2PO4)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 칼스루에</td><td>3904.1</td><td>PBS 완충액에 사용</td></tr><tr><td>건조 재료</td><td>Merck</td><td>101969</td><td>오렌지 실리카 비드 건조용 튜브 어댑터와 함께 유리병에 사용</td></tr><tr><td>ECGM 보충제 믹스</td> 내피 세포의 배양에 필요한 <td>ECGM 매체용 Promocell</td><td>C-39215</td><td>보충제 믹스: 0.02mL/mL 태아 송아지 혈청, 0.004mL/mL 내피 세포 성장 보충제, 0.1ng/mL 표피 성장 인자, 1ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자, 90 &마이크로; g/mL 헤파린, 1 &마이크로; g/mL 하이드로코르티손</td></tr><tr><td>ECGMS</td><td>Promocell</td><td>C-22010</td><td>ECGM 세포 접착력을 증가시키기 위해 5 % [w/w] FCS 및 1 mM MgSO4 보충</td></tr> 내<tr><td>피 세포 성장 배지(ECGM, 즉시 사용 가능)</td><td>HUVEC의 Promocell</td><td>C-22010</td><td>배양 배지, 이미 보충제 믹스의 모든 구성 요소가 보충됨</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청(FCS)</td><td>바이오크롬 현재 Merck</td><td>S 0415</td><td>감염 분석에 사용되는 세포 배양을 위한 보충제</td></tr><tr><td>FITC-conjugated goat anti-human VWF 항체</td><td>Abcam</td><td>ab8822</td><td>스톡 농도: 10 mg/mL, 유동 중 구형 및 다중합체 VWF의 면역검출용</td></tr><tr><td>유체 단위</td><td>ibidi</td><td>10903</td><td>유동 배양을 위한 유체 장치</td></tr><tr><td>젤라틴(돼지)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G-1890-100g</td><td>마이크로슬라이드 채널 표면의 사전 코팅용</td></tr><tr><td>히스타민 디하이드로클로라이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>H-7250-10MG</td><td>내피 내에서 VWF 분비 유도 Weibel Palade Bodies</td></tr><tr><td>Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)</td><td>Promocell</td><td>C-12203 Lot-Nr. 396Z042</td><td>1 차 내피 세포 풀링 된 기증자에서 액체 질소에 보관</td></tr> 된 <tr><td>인간 VWF 특이 항체 (단클론)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc73268</td><td>재고 농도 : 200 &micro; PFA 고정 후 미세유체 슬라이드에서 VWF의 면역 염색을 위한 g/mL</td></tr><tr><td>주입 Port</td><td>ibidi</td><td>10820</td>: <td>흐름 순환 중 저장소 튜브에 히스타민 또는 박테리아 주입</td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 35M</td><td>반광 현미경: 40x 물 대물렌즈를 사용하여 진핵 세포 분리 및 세포 계수 제어, 400배 배율 허용</td></tr><tr><td>Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)</td><td>ibidi</td><td>80176</td><td>fludic 재배를 위한 물리적으로 변형된 슬라이드 (&mu; &ndash; 채널 높이가 0.4mm이고 채널 볼륨이 100>인 슬라이드 I0.4</supLuer; L, 2.5cm의 성장 면적 및 25.4cm의 코팅 면적 2) 모든 종류의 유동 분석에 적합, 물리 처리는 친수성 및 접착성 표면을 생성합니다.</td></tr><tr><td>황산마그네슘(MgSO4, unhydrated)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>ECGMS 매체</td></tr><tr><td>미세유체 펌프</td><td>제조용 ibidi</td><td>10905</td><td>기압 펌프</td></tr><tr><td>Neubauer 세포 계수 챔버</td><td>Karl Hecht GmbH& Co KG</td><td>40442002</td><td>HUVECs</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16 % (PFA)</td> <td>샘플의 교차 연결을위한</td> <td>전자 현미경 검사 과학</td><td>15710-S</td></tr> 용 현미경 계수 챔버 <tr><td>관류 세트</td><td>ibidi</td><td>10964</td><td>관류 세트 황색 / 녹색은 튜브 직경 1.6mm, 튜브 길이 50cm, 총 작업 부피 13.6mL, 데드 튜브 부피 2.8mL 및 저장소 크기 10mL. &micro;-slide L0.4Luer와 결합, 37 &deg에서; C 및 점도 0.0072 dyn x s/cm2 3.8mL/min의 유속 범위 최대 33.9mL/min, 3.5dyn/cm2 및 31.2dyn/cm2 사이의 전단 응력에 도달할 수 있습니다. microfluidic</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td></td><td></td>를 위한 50 cm 길이<td>로 해결책은 뒤에 오는 화학물질을 사용하여 준비되었다: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4, pH 7.4</td></tr><tr><td>플라스틱 큐벳</td><td>Sarstedt</td><td>67,741</td><td>(2 x 광학) 600nm</td></tr><tr><td>폐렴구균 특이적 항혈청</td>에서 OD 측정을 위한 <td>Pineda</td><td></td><td>열 비활성화 연쇄상구균 폐렴균 NCTC10319 및 D39, proteinA-sepharose 컬럼을 사용하여 IgG 정제.</td></tr><tr><td>폴리스티렌 또는 스티로폼 플레이트</td><td></td><td></td>: <td>이것은 채널 슬라이드에 파종된 세포에 대한 차가운 스트레스를 피하기 위한 예방 조치입니다. 포장 상자 재료와 같은 모든 유형의 스티로폼을 사용할 수 있습니다. 접시의 두께는 0.5cm일 수 있으며 크기는 20cm2이어야 합니다.</td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>6781.1</td><td>PBS 버퍼에 사용</td></tr><tr><td>펌프 제어 소프트웨어 (PumpControl v1.5.4)</td><td>ibidi</td><td>v1.5.4</td><td>압력 펌프 제어, 흐름 조건 설정 및 흐름 시작 / 종료를위한 컴퓨터 소프트웨어</td></tr> 반응 <tr><td>튜브 1.5 / 2.0 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706 / 72.695.500</td><td>항체 희석에 필요</td></tr><tr><td>50 mL의 반응 튜브 volume</td><td>Sarstedt</td><td>6,25,48,004</td><td></td></tr><tr><td>RFP-expressing pneumococci</td><td>National Collection of Type Cultures, Public Health England</td><td>10,319</td><td>게놈에 통합된 히스톤과 같은 단백질에 융합된 RFP를 발현하는 연쇄상구</td></tr>균 폐렴균 혈<tr><td>청형 47 혈청학적 피펫 5, 10 mL</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025/ 86.1254.025</td><td>대용량</td></tr> <tr><td>파이핑용탄산나트륨 (Na2CO3, 물 없음)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451614-25G</td><td>100 mM 탄산나트륨 완충</td></tr>액 제조용 <tr><td>인산이수소나트륨 (NaH2PO4)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>P030.2</td><td>PBS 버퍼에 사용</td></tr><tr><td>스펙트럼 광도계 Libra S22</td><td>Biochrom</td><td>80-2115-20</td><td>600nm에서 박테리아 현탁액의 광학 밀도(OD) 측정</td></tr><tr><td>차단 완충액 준비를 위한</td><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td>PFA 고정 후 진핵 세포 투과화를 위해 dH20으로 희석된 0.1% 말단 농도에 사용</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>옥소이드</td><td>LP0021</td><td>박테리아는 1 % [w / w] 효모 추출물 = 완전한 박테리아 배양 배지 THY를 함유 한 THB 보충제에서 배양됩니다</td></tr></tbody></table>.

일정한 흐름에 있는 1 차적인 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

내피 세포의 표면과 연쇄상 구균 폐렴의 상호 작용은 폰 윌레브란트 인자 (VWF)와 같은 메카노 민성 단백질을 통해 혈류에서 매개됩니다. 이 당단백질은 전단 응력에 반응하여 분자 변형을 변화시켜 광범위한 숙주-리간드 상호작용에 대한 결합 부위를 노출시킵니다. 일반적으로, 정의된 전단 흐름 하에서 1 차 내피 세포의 배양은 혈관의 내벽의 생리학을 닮은 안정적이고 단단히 연결된 내피 층의 특정 세포 분화 및 형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. . 따라서, 세균성 병원체와 메카노민성 단백질을 포함하는 숙주 혈관구조 간의 상호작용의 기능적 분석은 표면에 영향을 미치는 것으로 알려진 생리적 유동력을 시뮬레이션할 수 있는 펌프 시스템의 확립을 요구한다. 혈관 세포.
이 연구에 사용된 미세 유체 장치는 정의된 유량으로 유체의 연속적이고 펄스없는 재순환을 가능하게 합니다. 컴퓨터 제어 식 공기 압 펌프 시스템은 연속, 단방향 및 제어 된 매체 흐름을 생성하여 내피 세포 표면에 정의 된 전단 응력적용합니다. 세포와 세균 부착의 형태학적 변화는 현미경 시각화를 위해 설계된 특수 채널 슬라이드를 사용하여 흐름에서 현미경으로 모니터링하고 정량화할 수 있습니다. 일반적으로 면역 표지 및 현미경 분석 전에 샘플 고정을 필요로하는 정적 세포 배양 감염과는 달리 미세 유체 슬라이드는 단백질, 박테리아 및 세포 성분의 형광 기반 검출을 모두 가능하게합니다. 샘플 고정 후; 직렬 면역 형광 염색; 실시간으로 직접 형광 기반 검출. 형광 박테리아 및 특정 형광 표지 항체와 함께,이 감염 절차는 혈관 과정과 관련된 과학적 응용 프로그램의 거대한 스펙트럼을위한 효율적인 다중 구성 요소 시각화 시스템을 제공합니다.

일정한 단방향 흐름에서 1차 HUVEC를 배양하면, 메카노에민티드 VWF13,14로채워진 셀룰러 WPB의 생성을 촉진하는 풍부하고 단단히 포장된 세포층의 형성을 초래한다. 이 프로토콜은 인간의 혈류에서 전단 응력 상황을 모방해야 하는 감염 분석을 위해 공기압 펌프 기반의 펄스리스 재순환 시스템의 사용을 설명합니다.
이 시스템은 소프트웨어가 제어하는 흐름 조건을 정의하여 설정할 수 있습니다. 도 1의 흐름 방식은 1차 내피 세포의 전문화(도1,인셋 1)와 폐렴구균의 전생(그림1,인셋 2)으로 시작하는 주요 워크플로우를 도시한다. 적용된 미세유체 시스템(그림 <strong class="xfi...

본 연구는 정의된 흐름 조건에서 전단 응력 하에서 분화된 인간 1차 내피 세포의 표면에서 생성된 폰 윌레브란트 인자 문자열에 대한 폐렴구균 준수의 현미경 모니터링을 설명합니다. 이 프로토콜은 차동 면역 염색 절차를 적용하여 특정 세포 구조의 상세한 시각화 및 박테리아의 정량화로 확장 될 수있다.

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

이 내피 세포 배양 시스템의 사용은 혈류의 상황을 동화 할 수 있습니다. 그리고 이러한 상황으로, 우리는 세균 성 벡터의 식별및 또한 이 과정에 관여하는 세포 벡터의 확인을 포함하여 세균성 감염 과정을 분석할 수 있습니다. 이 기술은 또한 형태 발생 메커니즘에 미치는 영향을 포함하여 혈관 무결성에 세균 감염의 영향을 탐구하는 방법을 포장, 염증 반응및 면역 조절에.이 기술은 내피 세포의 몇 가지 특별한 처리를 필요로하므로 시각적 설명은 단지 구두 설명보다 낫다. 이 방법은 내피 세포 분화, 상처 치유, 종양 창세기 및 혈관 신생과 같은 침투 혈관 시스템과 상관 되는 연구의 여러 다른 영역에 대한 통찰력을 제공합니다. 주요 단계 중 하나는 표준화된 세포 재배뿐만 아니라 1차 내피 세포의 정확한 취급입니다.이 기술은 단지 구두 설명에 의해 명확 할 수없는 몇 가지 특별한 세포 배양 처리를 필요로한다. 먼저 깨끗한 벤치를 사용하여 멸균 환경에서 작업하십시오. 파이펫을 사용하여 2% 멸균 여과 된 돼지 젤라틴 PBS 용액의 100 마이크로리터를 온도 평형 채널 슬라이드의 단일 저장소에 주입합니다.젤라틴 코팅 채널 슬라이드를 얇은 폴리스티렌 또는 스티로폼 플레이트에 놓고 1밀리리터 루어 주사기로 슬라이드 온도가 떨어지는 것을 방지하여 밀리리터 HUVEC 서스펜션당 5분의 1의 100 마이크로리터를 슬라이드에 추가하여 씨를 뿌리고 HUVEC를 경작시합니다. 채널 슬라이드를 HUVEC와 함께 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 60분 동안 배양합니다. 그 후, ECGMS 배지의 60 마이크로 리터로 채널 슬라이드의 양쪽 끝에 각 중간 저수지를 채웁니다.섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 1시간 더 인큐베이션을 사용한다. 다음으로, 미세유체 펌프를 조정하기 위해 먼저 펌프 장치에 설정된 평형 관류를 연결하고, ECGMS 배지의 13.6 밀리리터를 채우고 펌프 제어 소프트웨어를 시작합니다. 유체 단위 설정의 메뉴에서 스크롤 창을 사용하여 적절한 관류 세트와 챔버 슬라이드 유형을 선택합니다.중간 점도에 대한 소프트웨어에서 평방 센티미터 당 0.007 다이네 초를 선택합니다. 인큐베이터 바깥쪽에는 건조실리카 구슬로 채워진 유리 병을 기압 튜브에 연결합니다. 소프트웨어 메뉴에서 유량 파라미터를 선택하고, 압력을 40밀리바르로 설정하고, 연속 배지 흐름을 시작하여 액체 배지로 펌프 튜브를 플러시한다.우리는 서브컨컬러재배 의 HUVEC를 사용하여 단단한 셀 부착을 보장하고 또한 시스템에서 기포를 꺼내고 펌프 시스템에 대한 독립적 인 전원 공급 장치를 사용하는 데 중점을 둡니다. 튜브 연결을 탭하여 기포를 제거하고 펌프 시스템에서 기포가 순환되지 않도록 하십시오. 채널 슬라이드를 연결하기 위해 펌프 제어 소프트웨어의 유동 순환을 중지하고 Luer 연결 근처의 튜브를 고정하여 중간 흐름과 관류 튜브를 보유합니다.채널 슬라이드를 연결하여 기포를 피하십시오. 펌프 제어 소프트웨어 고급 탭에서 소프트웨어 도구 주기 작성자를 사용하여 흐름 재배에 원하는 전단 응력 주기를 프로그래밍합니다. 흐름 순환에 대한 전단 응력 수준을 프로그래밍하고 장기 관류를 시작합니다.30분 동안 분당 5.44밀리리터의 유속도에 해당하는 평방 센티미터당 5개의 다인으로 시작하여 분당 10.85 밀리리터에 해당하는 평방 센티미터당 10dyne의 전단 응력에서 연속 유동을 시작합니다. 균형 잡힌 저수지 펌핑을 제어합니다. 연결된 채널 슬라이드를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에 연결된 채널 슬라이드로 유체 장치를 배치합니다.현미경 소프트웨어 제어를 시작하고 적절한 필터 설정을 선택하여 형광 현미경 모니터링에 대한 원리 설정을 조정합니다. 미세한 시각화를 위해 유체 장치를 섭씨 37도 의 가열 챔버에 놓습니다. 미리 따뜻해진 현미경의 무대에 채널 슬라이드를 놓습니다.히스타민과 박테리아를 주입하기 전에 세포 형태와 HUVEC 층의 무결성을 유동 순환에 제어합니다. 흐름 설정을 유지 관리합니다. 관류 관에서 순환하는 ECGMS 배지에 주입 포트를 통해 100 밀리머 히스타민 스톡 용액의 136 마이크로리터를 주입하여 내피 성 가능한 팔라데 몸에서 VWF의 방출을 유도한다.다중 머기 폭스바겐F 현의 면역 불발 검출을 위해, ECGMS 배지의 순환 13.6 밀리리터에 PBS의 200 마이크로리터의 부피에 VWF 특정 FITC 컨쥬게이드 항체의 20 마이크로그램을 주입한다. HUVEC 세포 표면에서 생성된 폭스바겐F 현에 대한 공압코칼 부착물을 정량화하기 위해, 주입 포트를 사용하여 ECGMS 배지에 최대 1밀리리터의 최대 부피로 Pneumococci를 발현하는 밀리리터 RFP당 8번째 CFU에 1.35배 10배를 주입한다. 현미경 배율에 대한 63X 오일 침지 목표를 선택하고 Pneumococci를 발현하는 RFP 검출 필터를 사용하여 현미경 소프트웨어의 형광 필터 설정을 RFP 채널로 조정한다.VWF 문자열에 대한 세균 부착의 정량화를 위해, 약 10 개의 형태 그대로 HUVEC를 포함하는 적어도 30 개의 대표 필드 뷰의 Z 스택의 스냅 샷을 만들고 Pneumococci의 양을 계산합니다. 면역형성 염색 전에 고정 후 세균 부착을 평가하기 위해, 흐름을 멈추고, 펌프 저수지에서 ECGMS 배지의 10 밀리리터를 제거하고, 5%의 파라포름알데히드로 보충된 PBS의 10밀리리터를 추가하고 원고에 따라 진행한다. 이 프로토콜에서, 원리 실험 단계는 세포 배양 플라스크에 있는 섭년소에 1 차적인 내피 세포의 사전 재배로 시작합니다.그런 다음 셀을 젤라틴 코팅 채널 슬라이드로 시드됩니다. 박테리아는 한천 판에서 재배되며, 복잡한 액체 배지에서 중간 로그 단계에서 재배합니다. 미세 유체 세포 배양의 경우, 내피 세포를 가진 채널 슬라이드는 펌프 시스템의 유체 단위의 관류 튜브에 연결되고 세포 분화를 위한 일정한 흐름을 실시한다.VWF 현의 생성은 FITC 표지 폭스바겐F 특이적 항체를 사용하여 면역 형광 검출에 의해 현미경으로 모니터링되는 평방 센티미터 당 10 dyne 초의 전단 응력에서 히스타민 주입에 의해 유도되었다. 순환 매체에 박테리아를 발현하는 적색 형광 단백질을 주입한 후, 폭스바겐에 대한 폐렴구균 부착물은 450나노미터에서 형광 방출에 의해 실시간으로 현미경으로 시각화되었다. PFA를 사용하여 세포의 고정 후, 차동 면역 형광 염색은 특정 감염 시점의 세균 부착의 시각화를 제공합니다.이 절차의 가장 중요한 단계는 생리적 전단 응력 수준을 조정하고 극단적 인 펌프 압력 변동을 피함으로써 슬라이드 표면에 단단한 세포 부착을 보장하는 것입니다. 현미경 시각화 외에도, 이 기술은 새로운 항 감염의 약리학적 효과를 연구하고 혈관 감염 과정의 장기적인 결과를 분석하기 위해 적용될 수 있다. 이 펌프 시스템은 에어로졸을 통한 변속을 방지하기 위해 기압으로 세균 병원균을 침투시킵니다.생물 안전 예방 조치를 따르는 것이 좋습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

본 논문은 성장의 다른 방법을...

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

우리는 살균 지속적인 흐름 회로에서 층류 유동 전단 응력에 따라 자기편 세포 수있는 방법을 설명하고 있습니다. 세포 '유착, 형태는 투명 챔버를 통해 신진 대사 분석 및 미래의 실험이나 문화에 대한 전단 노출 후 수확한 세포 회로에서 얻은 샘플을 공부하실 수 있습니다.

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

출처: Jagau, H. et al. 일정한 흐름의 원발성 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 일정한 배지 흐름 조건에서 내피 세포의 VWF(Von Willebrand Factor) 스트링에 대한 폐렴구균 부착의 실시간 시각화를 보여줍니다. VWF 방출을 자극하고, 문자열에 라벨을 붙이고, 박테리아 결합을 정량화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

일정한 배지 흐름 하에서 일차 인간 내피 세포에 대한 폐렴구균 부착 평가

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

이 기술은 이전 포유류의 세포의 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 세포에 미리 재배되고 세균 병원균의 세포 성장을, 수확 정상화하고 계량화 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 메소드는 프라이밍 단계뿐만 아니라 대상 셀 유형에 대한 호스트 세포의 다양한 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

우리는 환자 유래 내피와 전혈 상호 작용을 조사하기 위하여 체외 혈관 질병 모형을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 상황에서 1 차적인 내피 세포의 혈전 생성 특성의 연구를 허용합니다. 이 방법은 응고의 상이한 단계 도중 시혈전증 및 항응고 요법에서 평가하기위하여 특히 적합합니다.

시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구

당사는 CFBE41o-세포, THP-1 대식세포 및 슈도모나스 아에루기노사(공기-액체인터페이스)에 설립된 감염된 기도의 3차원 공동 배양 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다.- 이 모델은 항생제 효능, 상피 장벽 기능 및 염증 성 마커를 동시에 테스트하는 새로운 플랫폼을 제공합니다.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

이 기사에서는 신생아 마우스에서 일차 폐 내피 세포를 분리하고 배양했습니다.

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여기에서는 전폐절제술을 모방하도록 설계된 OOC(Organ-on-Chip) 시스템을 구축하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 글리코칼릭스 손상과 전폐절제술 후 합병증 사이의 잠재적 상관관계를 조사합니다.

3D 유체 칩에서 폐절제술 후 내피 글리코칼릭스 모델링 - 혈관 기반 장기 온 칩 시스템 제작에 대한 접근 방식

배우세요 일정한 유전단 응력 하에서 폐렴구균이 1차 인간 내피 세포에 부착하는 과정을 현미경으로 관찰하는 방법을. 이 기법은 세균 감염 메커니즘과 혈관 무결성 연구에 활용됩니다.

일정한 흐름에 있는 1 차적인 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염

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