Name: 다른 균질화 방법을 통해 마우스 뇌 / 척수에서 검색 된 여러 세포 유형의 동시 유량 세포 측정 특성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-19T01:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 마우스 뇌와 척수에서 다양한 세포 유형을 동시에 식별하는 유량 세포 측정법을. 이 방법은 신경퇴행성 질환 연구와 세포 표적화 평가에 활용됩니다.

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이 연구는 A.B., ALSA 교부금 nr에 보스턴 아동 병원 창업 기금에 의해 투자되었습니다. 17-IIP-343에서 M.P.에, 그리고 상 번호에 따라 근위축성 측삭 경화증 연구 프로그램을 통해 건강 담당 차관의 사무실. W81XWH-17-1-0036 ~ M.P. 우리는 기술 지원을 위해 DFCI 흐름 세포 측정 코어를 인정합니다.

여기에 설명된 모든 방법은 다나 파버 암 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다(프로토콜 번호 16-024).
1. 실험에 필요한 솔루션 준비
<ol><li>멸균수로 10x HBSS를 희석하여 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 1회 준비합니다. 용액을 얼음에 미리 식힙니다. 각 샘플에 대해 최소 25mL의 용액이 필요합니다.</li>
	<li>10x 멸균 HBSS 1:10을 밀도 그라데이션 매미(즉, Percoll)와 혼합하여 동위 원소 퍼콜 용액(IPS)을 준비합니다. 얼음에 미리 식히세요. 참고: IPS는 4°C에서 최대 30일 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>유세포분석(FACS) 차단(BL) 용액(1% 소 혈청 알부민[BSA], 5% 태아 소 혈청 [FBS]를 인산완충식염수[PBS])에 준비한다. 얼음에 미리 식히세요.</li>
</ol>2. 심장 내 관류 및 조직 해부에 의한 동물 안락사
참고: 8주 된 C57BL/6J 마우스, 어느 성별, 실험에 사용 되었다. PBS 용액을 가진 관류는 조직 소화로 진행하기 전에 장기에서 혈액 오염을 제거하기 위해 수행됩니다.
<ol><li>케타민 /자일라진 (90-200 mg / kg 케타민, 10 mg / kg 자일라진)의 혼합물을 사용하여 마우스를 마취. 마우스를 뒷면에 놓고 각 팔다리를 지지대에 테이프로 놓습니다. 철수 반사를 확인하여 마취의 적절한 깊이를 확인합니다.</li>
	<li>흉골 입구의 수준에서 중간 선 피부 절개를 확인흉을 노출합니다. 집게를 사용하여 흉골의 끝을 잡은 다음 흉곽의 각 측면에 1cm 절개를합니다. 마지막으로 다이어프램을 잘라 심장을 시각화 할 만큼 널리 흉골을 엽니 다.</li>
	<li>우심실로 심장을 부드럽게 잡고 중간선과 가슴에서 약간 들어 올리기 위해 집게를 사용합니다.</li>
	<li>좌심실 의 끝에 23G 나비 바늘을 삽입하고 대동맥쪽으로 단단히 잡습니다.</li>
	<li>1x PBS로 관류를 시작합니다. 가위를 사용하여 오른쪽 구멍을 관통하여 향수가 순환을 종료 할 수 있도록합니다. PBS의 유량을 3 mL/min. Perfuse에서 1x PBS의 최소 15mL로 설정하여 조직이 명확하도록 합니다. 참고 : 간및 간장의 희게하는 것은 좋은 관류의 징후입니다. 필요한 경우, 심장을 빠져 나가는 유체가 혈액이 제거 될 때까지 프리퓨전의 양을 증가 시킬 수 있으며, 이 시점에서 플러시 라인을 멈출 수 있습니다.</li>
	<li>관류 후 척수에서 뇌를 분리하고 가위와 집게로 두개골에서 뇌를 제거하십시오. 해부 시 가시성과 제어력을 높이고 모발 오염 물질을 운반하는 것을 피하기 위해 모피를 제거하십시오. PBS로 채워진 3 mL 주사기를 사용하여 척수를 기둥에서 내뿜습니다.</li>
	<li>얼음 차가운 1x HBSS 2 mL로 미리 채워진 6 웰 멀티 웰 플레이트의 우물에서 각 조직을 옮기고 소화 될 때까지 얼음을 유지하십시오.</li>
	<li>세로선을 따라 뇌와 척수를 두 개의 반쪽으로 나눕니다. 참고 : 각 조직의 절반은 유세포 분석을 허용하기 위해 균질화 (아래 섹션 참조); 나머지 절반은 대체 분석을 위해 다른 처리에 할당 될 수 있습니다 (예를 들어, 조직학을위한 파라 포름 알데히드 고정 용액에 담근).</li>
</ol>3. 뇌와 척수의 효소 소화
참고: 이 섹션에 설명된 부적은 반쪽 뇌 또는 척수의 소화에 충분합니다.
<ol><li>가위를 사용하여 조직을 1−2mm 두께의 조각으로 자릅니다.</li>
	<li>1000 μL 파이펫의 끝을 가위 한 쌍으로 잘라서 조직 조각을 수집 할 수 있도록 충분히 크게 만듭니다. 1x HBSS로 파이펫 팁을 미리 헹구어 보시고 자합니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 다진 조직을 함유하는 HBSS 용액의 2 mL을 15 mL 원점 튜브로 이송합니다. 참고: 파이펫 팁의 사전 헹구는 것은 팁 내부의 티슈 조각의 끈적거림을 방지하는 데 중요합니다.</li>
	<li>얼음 차가운 1x HBSS의 추가 2 mL로 잘 세척하고 조직 조각을 포함하는 해당 15 mL 원추형 튜브에 용액을 옮김을 옮김.</li>
	<li>4 °C에서 250 x g에서 5 분 동안 각 샘플을 원심 분리기.</li>
	<li>신경 조직 해리 키트의 효소 믹스 1을 준비 (NTDK; 재료 표) 50 μL의 효소 P를 샘플 당 1900 μL의 버퍼 X와 혼합하여. 따뜻한 효소는 수조에서 37 °C에서 1을 혼합합니다. 효소의 완전한 활성화를 허용하기 위해 사용하기 전에 적어도 10 분 동안 37 °C에서 1을 배양 효소 혼합.</li>
	<li>15 mL 원엽 튜브에서 상류를 흡인하고 각 샘플에 1.95 mL의 효소 혼합물 1을 추가합니다. 펠릿이 다시 일시 중단되었는지 확인하기 위해 부드럽게 소용돌이.</li>
	<li>37 °C에서 15 분 동안 휠 또는 셰이커에 샘플을 인큐베이션합니다.</li>
	<li>한편, NTDK의 효소 믹스 2를 시료당 20 μL의 완충Y와 A 효소 의 10 μL과 혼합하여 준비; 수조에서 37 °C에서 용액을 미리 데우다.</li>
	<li>효소 믹스 1로 배양이 끝나면 각 샘플에 효소 믹스 2 30 μL을 추가합니다.</li>
	<li>1x HBSS로 미리 헹구는 1000 μL 파이펫 팁으로 시료를 위아래로 파이펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.</li>
	<li>37 °C에서 15 분 동안 휠 또는 셰이커에 샘플을 인큐베이션합니다.</li>
	<li>배양 후, 각 튜브에 얼음-차가운 1x HBSS 10 mL을 추가하여 효소 믹스 1과 효소 믹스 2를 비활성화합니다.</li>
	<li>4°C에서 320 x g에서 10분 동안 각 샘플을 원심분리기.</li>
	<li>상급자 폐기; 얼음으로 차가운 1x HBSS를 각 튜브에 7 mL의 최종 부피까지 추가하고 소용돌이로 펠릿을 부드럽게 다시 놓습니다.</li>
	<li>이물질 제거를 위해 섹션 5를 계속합니다.</li>
</ol>4. 뇌와 척수의 기계적 균질화
참고 : 이 섹션에 설명 된 볼륨은 반 뇌 또는 척수의 균질화에 충분합니다. 이 섹션에 설명된 프로토콜은 아래에 설명된 바와 같이 사용자 필요에 따라 섹션 3에 설명된 대안으로 사용될 수 있다.
<ol><li>얼음위에 놓인 Dounce 티슈그라인더(재료표)의유리 모르타르를 미리 식힙니다.</li>
	<li>박격포에 미리 냉각된 1x HBSS 3mL를 추가합니다.</li>
	<li>6웰 플레이트의 우물에서 유리 모르타르로 조직(뇌 또는 척수)을 옮겨 1x HBSS에 담그고 박격포 바닥에 앉습니다.</li>
	<li>부드럽게 10 스트로크의 유봉 A로 조직을 분쇄하고 유봉 B. 균질화 된 혼합물을 새로운 15 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김을 옮김.</li>
	<li>4°C에서 320 x g에서 10분 동안 미리 냉각된 1x HBSS 및 원심분리기를 사용하여 튜브를 최종 부피 10 mL로 채웁니다.</li>
	<li>상월체를 흡인하고 각 튜브에 얼음처럼 차가운 1x HBSS를 추가하여 최종 부피 인 7 mL까지 가열하여 펠릿을 부드럽게 재돌이합니다.</li>
	<li>이물질 제거를 위해 섹션 5를 계속합니다.</li>
</ol>5. 파편 제거
참고: 주로 소화되지 않은 조직과 미엘린 칼집으로 구성된 이물질을 제거하는 것은 후속 유동 세포 측정 분석을 위해 조직 균질한 조직의 효율적인 염색을 허용하는 중요한 단계입니다.
<ol><li>70 μm 세포 스트레이너를 통해 각 샘플을 필터링하여 소화되지 않은 조직 덩어리를 제거합니다. 이 견본은 후속 단계에 영향을 미칠 수 있는 소화되지 않은 신경 단편 또는 수막을 포함하기 위하여 확률이 높기 때문에 이 단계는 척수 조직으로 일할 때 특히 중요합니다.</li>
	<li>각 샘플 튜브의 최종 부피가 7mL인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 얼음 차가운 1x HBSS를 최대 7 mL로 채우소서.</li>
	<li>각 샘플에 미리 냉각된 IPS 3mL를 추가하여 최종 농도30%에서 밀도 그라데이션 매질을 함유하는 용액의 최종 부피를 10mL로 만듭니다. 샘플을 균일하게 혼합할 수 있도록 샘플을 부드럽게 소용돌이시다.</li>
	<li>원심분리기 샘플은 18°C에서 700 x g에서 15분 동안 시료를 사용하여 원심분리기의 가속을 7로 설정하고 브레이크를 0으로 설정합니다. 참고 : 원심 분리는 약 30 분이 소요됩니다.</li>
	<li>원심분리기에서 샘플을 섬세하게 제거합니다. 참고: 파편과 미엘린으로 구성된 희끄무레한 디스크는 용액 표면에 떠 있는 것을 볼 수 있어야 합니다. 펠릿 (관심있는 세포를 포함하는)은 튜브의 바닥에 표시되어야합니다.</li>
	<li>조심스럽게 파편의 모든 희끄무레한 디스크를 흡인하고 상급의 나머지는 펠릿을 빼내지 않도록합니다. 약 100 μL의 용액을 세포 펠릿 위에 두어 실수로 제거할 위험을 피하십시오.</li>
	<li>FACS BL 1mL를 추가하고, 100μL 파이펫 팁으로 위아래로 파이펫팅하여 펠릿을 다시 일시 중단하고 샘플을 1.5 mL 튜브로 옮김을 옮김을 넣습니다.</li>
	<li>실온 (RT)에서 450 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>상판을 부드럽게 흡인하고 다운스트림 분석과 호환되는 적절한 버퍼에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다(여러 세포 유형의 유동 세포 측정 평가에 사용되는 프로토콜의 섹션 6 참조).</li>
</ol>6. 여러 세포 유형의 유세포 측정 평가를위한 염색
<ol><li>FACS BL의 350 μL로 5.9 단계에서 얻은 펠릿을 다시 중단. 5 μg/mL의 최종 농도에서 각 샘플에 Fc 블록을 추가합니다. 참고: 신뢰할 수 있는 분석을 허용하기에 충분한 세포를 처리하기 위해 시료의 최소 100 μL을 하나의 염색에 사용해야 합니다.</li>
	<li>염색을 진행하기 전에 4°C에서 10분 동안 샘플을 배양하였다.</li>
	<li>표 1에따라 항체 혼합을 준비한다.</li>
	<li>각 튜브에 항체 혼합물을 추가하고, 5 s의 소용돌이를 넣고 어둠 속에서 4 °C에서 15 분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>각 튜브, 소용돌이 및 원심분리기에 1 mL의 PBS를 추가하여 RT에서 450 x g에서 5 분 동안 추가하십시오.</li>
	<li>한편 표 1에따라 스트렙타비딘 믹스를 준비한다.</li>
	<li>상급체를 버리고 6.6단계에서 제조된 스트렙타비딘 혼합물에 펠릿을 다시 놓습니다. 각 샘플에 대해 6.4단계에서 염색에 사용되는 것과 동일한 부피를 사용하십시오.</li>
	<li>소용돌이 5 s를 위해 4°C에서 10분 동안 샘플을 암흑에서 배양하였다.</li>
	<li>각 튜브, 소용돌이 및 원심분리기에 1 mL의 PBS를 추가하여 RT에서 450 x g에서 5 분 동안 추가하십시오.</li>
	<li>상급체를 버리고 FACS BL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.</li>
	<li>각 샘플에 7-아미노 액티노마이신 D(7-AAD) 용액을 첨가합니다. 6.10단계에서 제조된 시료 300μL마다 7-AAD 5 μL을 사용하십시오.</li>
	<li>세포 불소화 분석까지 어두운 4 °C에서 샘플을 저장합니다. 시료 전형에서 16시간 이내에 분석을 수행하여 >60% 세포 생존가능성을 보장합니다.</li>
</ol>

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<li>Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+for+Drug+Delivery+to+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System.</a> Nanomaterials. 9 (3), 371(2019).</li>
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<li>Alves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy+as+a+novel+tool+to+unravel+the+tropism+of+AAV+gene+therapy+vectors+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain.</a> Scientific Reports. 6 (1), 28272(2016).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

본 명세서에서 우리는 마우스 뇌 및 척수로부터 가장 관련성이 높은 CNS 세포의 일부의 동시 정제 및 동시 유동 세포측정 분석을 위한 프로토콜을 기술한다. 전통적으로, 조직학 분석은 CNS5,13에서바이러스 벡터의 나노입자 또는 트랜스덕션 효율의 분포를 설명하거나, 병리학 또는 약리학적 치료 시 특정 세포 유형에서 발생하는 형태학적 및 분자 변화에 대한 통찰력을 제공하기 위해 적용되었다14. 그러나 조직학은 처리성이 결여되어 있으며 동시에 분석할 수 있는 마커의 수가 제한되어 있기 때문에 동일한 조직학적 샘플에서 여러 특징을 포괄적으로 검사할 수 없습니다. 우리의 접근 방식은 전통적인 장기학적 분석에 보완될 수 있으며, 개별 샘플에서 얻을 수 있는 정보의 컴파일을 확장하기 위해 여러 다운스트림 애플리케이션(분류, 1차 문화, 생화학 적 또는 차세대 시퀀싱 분석)과 결합될 수 있습니다...

유전자 및 약물 전달 기술(예: 바이러스 벡터 및 나노입자)은 신경 퇴행성 질환에서 변경된 특정 분자 경로에 대한 더 나은 통찰력을 얻고 혁신적인 치료 접근법의개발을 위해 적용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다1,2,3. 이러한 도구의 최적화는 정량화에 의존합니다: (1) 다른 투여 경로에 대한 CNS의 침투 범위 및 (2) 특정 세포 집단의 표적화. 조직학적 분석은 일반적으로 특정 세포마커4,5에대한 면역 염색에 의해 확인된 다른 CNS 지역 및 상이한 세포 모형에 있는 형광 리포터 유전자 또는 형광 태그나노입자를 구상하기 위하여 적용됩니다. 이 접근법은 투여된 유전자 또는 약물 전달 도구의 생체 분포에 대한 귀중한 정보를 제공하지만, 이 기술은 (1) 조직 고정, 동결 보존 또는 파라핀 삽입 및 슬라이스를 필요로 하기 때문에 시간이 많이 걸리고 노동이 강렬할 수 있다; (2) 때로는 항원 검색을 필요로 하는 특정 세포 마커에 대한 염색; (3) 형광 현미경 검사법에 의한 획득, 이는 일반적으로 동일한 실험 내에서 제한된 수의 다른 마커의 분석을 가능하게 한다; (4) 관심 있는 신호를 적절히 정량화할 수 있도록 이미지 처리.
유세포 분석은 표면 또는 세포 내 항원의 발현에 기초하여 세포 현탁액에서 다른 세포 표현형의 신속한 정량적 평가뿐만 아니라 기능적 측정 (예를 들어, 세포 사멸의 속도, 증식, 세포 주기 분석 등)를 허용하기 위해 매우 특이적 형광 마커를 활용하는 널리 사용되는 기술이되었습니다. 형광 활성화 세포 선별을 통한 세포의 물리적 분리도 가능하여 추가다운스트림 응용(예: 세포 배양, RNAeq, 생화학 적 분석 등)을 허용합니다. 6,7,8.
조직 균질화는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 하류 유동 세포 측정 평가를 허용하기 위해 단일 세포 현탁액을 얻는 데 필요한 중요한 단계입니다. 다른 방법은 성인 뇌 조직 균질화를 위해 설명되었으며, 주로 미세 글리아 세포를 분리하는 것을 목표로9,10,11; 그들은 전반적으로 두 가지 주요 범주로 분류 될 수있다 : (1) Dounce 균질화 (DH)를 통해 연삭 또는 전단력을 사용하여 틈새 에서 세포를 찢어 상대적으로 균질화 된 단일 세포 현탁액을 형성하는 기계적 해리, 및 (2) 효소 소화는 37°C에서 다진 조직 덩어리의 인큐베이션에 의존하며, 트립신 또는 파파인과 같은 단백질 분해 효소의 존재, 상당히 균질화된 세포현탁액(12)을생성하기 위해 세포외 매트릭스의 분해를 선호한다.
어떤 방법을 활용하든, 정화 단계는 조직 균질화 후 밀도 구배 또는 자기 선택9,12에의해 원심분리를 통해 미엘린을 제거하기 위해 하류 응용 프로그램으로 이동하기 전에 권장됩니다.
여기서, 우리는 파파인 소화(PD)에 기초한 조직 처리 방법을 설명하고 밀도 구도에 대한 정제를 거쳐, 시간 민감성 방식으로 마우스 뇌 또는 척수로부터 생존 가능한 이기종 세포 현탁액을 얻기 위해 최적화되고 유세포 분석에 적합하다. 또한, 우리는 녹색 형광 단백질 또는 로다민 염료와 같은 형광 기자를 위한 다른 CNS 인구, 살아있는/죽은 세포 또는 양성의 동시 적인 차별을 허용하기 위하여 실험실에서 채택한 9 색 교류 세포 측정 위원회 및 게이팅 전략을 기술합니다. 이 유동 세포 측정 분석을 적용함으로써, 우리는 조직 처리의 다른 방법을 비교할 수 있습니다, 즉, PD 대 DH, 세포 생존력과 다른 세포 유형의 수율의 보존측면에서.
본 명세서에서 당사가 제공하는 세부 사항은 관심 있는 특정 세포 유형 및 다운스트림 분석(예를 들어, 온도 민감성)에 기초하여 유세포측정 패널에서 사용하는 균질화 프로토콜 및 항체 조합에 대한 결정을 지시할 수 있다. 특정 형광 마커 추적, 시험관 내 배양, 기능 분석).

<table><tbody><tr><td>10X HBSS(칼슘, 염화마그네슘 및 황산마그네슘)</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>70mm 세포 여과기</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>ACSA/ACSA2 항마우스 항체</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-117-535</td><td>APC 접합</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A9647-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CD11b 쥐 항마우스 항체</td><td>Invitrogen</td><td>47-0112-82</td><td>APC-eFluor 780 복합</td></tr><tr><td>CD31 쥐 항 마우스 항체</td><td>BD Bioscience</td><td>562939</td><td>BV421 결합</td></tr><tr><td>CD45 쥐 항 마우스 항체</td><td>Biolegend</td><td>103138</td><td>Brilliant Violet 510 결합</td></tr><tr><td>CD90.1/Thy1.1 쥐 항 마우스 항체</td><td>Biolegend</td><td>202518</td><td>PE/Cy7 결합</td></tr><tr><td>CD90.2/Thy1.2 쥐 항 마우스 항체</td><td>Biolegend</td><td>1005325</td><td>PE/Cy7 활용</td></tr><tr><td>원뿔형 튜브(15mL)</td><td>CellTreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브(50mL)</td><td>CellTreat</td><td>229422</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 조직 분쇄기 세트(모르타르와 유봉 A 및 B 포함)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9063-1SET</td><td></td></tr><tr><td>Fc(CD16/CD32) 블록 랫트 안티 마우스 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Benchmark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>신경 조직 해리 키트 (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>O4 안티 마우스/랫트/인간 항체</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-895</td><td>비오틴 접합</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE 헬스케어</td><td>10266569</td><td>비멸균 시약으로 판매</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>65455529</td><td>멸균 시약(멸균이 필요한 응용 분야에 사용)</td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>Sigma</td><td>GE17-5445-01</td><td>미량의 내독소를 함유</td></tr>한 시약<tr><td>Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>S3258</td><td>Alexa Fluor 680 conjugated</td></tr></tbody></table>

다른 균질화 방법을 통해 마우스 뇌 / 척수에서 검색 된 여러 세포 유형의 동시 유량 세포 측정 특성 분석

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

바이러스 벡터 및 나노 물질 과학의 최근 발전은 중추 신경계를 조사하거나 조작하는 새로운 최첨단 접근법 (CNS)의 길을 열었습니다. 그러나, 이러한 기술의 추가 최적화는 체내에서 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 투여 시 CNS 및 세포 별 표적화의 정도를 신속하고 능률적인 측정을 허용하는 방법의 혜택을 누릴 것입니다. 여기에서, 우리는 마우스 두뇌 또는 척수, 즉 microglia/대식세포, 림프세포, 성상세포, 올리고덴드로세포, 올리고덴드로소이트, 내피 세포에서 분리된 상이한 세포 아류형의 간단한 정량화를 허용하기 위해 유세포분석의 높은 처리량 및 다중화 기능을 활용하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 세포 수율, 생존력 및 조성의 관점에서 두 조직 균질화 방법 사이의 중요한 차이점을 강조하기 위해이 방법을 적용합니다. 이렇게 하면 사용자가 관심 있는 셀 유형 및 특정 응용 프로그램에 따라 최상의 방법을 선택하도록 지시할 수 있습니다. 이 방법은 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 조직이 균질화되기 때문에 해부학 적 분포의 분석에 적합하지 않습니다. 그러나, 그것은 가능한 세포로 작동할 수 있고, 순수한 세포 인구에서 파생된 1 차적인 배양의 설치에서, 신경 퇴행성 질병의 맥락에서 잘 정의된 세포 특수학 또는 기능적인 분석, 신경 퇴행성 질병의 맥락에서 잘 정의된 세포 특수학 또는 기능적인 분석학에 구역 수색하는 신경과학자의 손에 있는 공구의 레퍼토리를 확장할 수 있는 몇몇 응용을 위한 방법을 여는 세포 분류와 결합될 수 있습니다.

우리는 마우스 뇌와 척수에 적용된 두 가지 균질화 방법(DH 대 PD)을 비교하여 다운스트림 애플리케이션에 적합한 다양한 생존 세포 유형을 검색하는 효율성을 테스트했습니다. 이를 위해, 우리는 마이크로글리아, 림프구, 뉴런, 성상 세포, 올리고덴드로시테 및 내피를 포함한 다른 CNS 세포 유형을 특성화하도록 설계된 9 색 유동 세포 분석 패널을 이용했습니다.
뇌 및 척수 조직은 상이한 마우스로부터 회수되었고(n ≥ 6), 세로로 두 개의 반으로 분할, 계량 및 Dounce 균질화(DH 방법)를 사용하여 기계적 중단을 적용하여 병렬로 처리되거나, 파파인(PD 방법)에 기초한 상용 NTDK를 사용하여 효소적으로 부드럽게 다듬고 소화하였다(그림1A). 파편 제거 후, 뇌 또는 척수로부터의 세포를 각각 1/10 또는 1/2-1/5로 희석하여, 트리판 블루에서 Neubauer 챔버로 세포 수율 및 생존가능...

우리는 마우스 두뇌 또는 척수에서 검색된 동시에 다른 세포 모형을 확인하기 위하여 교류 세포측정 방법을 제시합니다. 이 방법은 신경 퇴행성 질환에서 순수 한 세포 집단을 분리하거나 특성화하거나 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 생체 내 투여 시 세포 표적화의 정도를 정량화하기 위해 악용 될 수 있습니다.

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 선택적 유전자 및 약물 전달 도구의 개발은, 세포 표적화의 정량화 및 특성화를 요구하며, 재투여 시, 또는 바이러스 벡터, 또는 나노입자. 그들은 유세포 측정의 처리량 및 멀티플렉스 기능을 가지고 있으며, 마우스 뇌와 척수에서 여러 세포 유형을 간단하고 동시에 식별할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 알렉산더 연구소의 포스트 닥터인 프란시스코 하비에르 몰리나 에스테베스입니다.8주된 C57 Black 6 마우스에서 뇌와 척수를 수확한 후, 얼음 위에 잘 얼음으로 차가운 HPSS 2밀리리터가 들어 있는 6웰 플레이트의 개별 우물에 조직을 배치합니다. 수확한 각 조직을 두 개의 동등한 조각으로 나눕니다. 가위를 사용하여 각 조직 샘플의 절반을 1~2밀리미터 두께의 조각으로 다진다.모든 조직이 단편화되면 HPSS에서 수정된 1, 000 마이크로리터 파이펫 팁을 미리 헹구고 파이펫을 사용하여 각 조직 현탁액을 개별 15 밀리리터 원문 튜브로 옮기습니다. 우물당 2밀리리터를 추가로 헹구면 우물을 헹구어 보입니다. 그리고 해당 15 밀리리터 원판 튜브에서 세초를 당깁니다.원심분리에 의한 샘플을 퇴적시합니다. 그리고 신경 조직 해리 키트에서 효소 P 50 마이크로리터를 샘플 당 키트에서 버퍼 X 1, 900 마이크로리터와 혼합합니다. 효소 믹스를 섭씨 37도에서 적어도 10분간 데우습니다.그리고 각 조직 수집 튜브에서 슈퍼 나티를 흡인. 효소 혼합물이 준비되면 각 샘플에 1.95 밀리리터의 용액을 추가하십시오. 그리고 부드럽게 소용돌이가 다시 펠릿을 중단합니다.다음으로, 휠의 샘플을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하고 효소 A의 마이크로리터 10을 샘플당 버퍼 Y 20 마이크로리터와 혼합합니다. 두 번째 효소 용액을 섭씨 37도에서 미리 떼어내면 흔들리는 배양 끝에 각 조직 용액에 30 마이크로리터를 추가합니다. 1, 000 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 HPSS로 미리 헹구어 각 샘플을 부드럽게 혼합합니다.그리고 37섭씨에서 15분 동안 시편을 휠로 되돌려 보입니다. 인큐베이션이 끝나면 얼음처럼 차가운 HPSS 10밀리리터로 효소 반응을 체포합니다. 그리고 원심분리에 의한 샘플을 퇴적시한다.원심분리가 끝나면 튜브당 7밀리리터의 얼음-차가운 HPSS로 펠릿을 다시 중단합니다. 그리고 얼음에 튜브를 들고 전에, 부드럽게 각 샘플을 소용돌이. 조직 균질화를 위해, 미리 냉각된 HPSS의 3밀리리터를 투온스 조직 분쇄기의 미리 차가운 유리 박격포에 추가하고 수확한 뇌 또는 척수 조직 샘플 중 하나의 후반을 박격포로 옮긴다.부드럽게 페슬 A의 10 스트로크로 조직을 메이케레이트, 다음 10 페슬 B.의 스트로크와 새로운 15 밀리리터 원판 튜브로 균질화 혼합물을 전송. 원심분리를 위해 미리 냉각된 HPSS로 10밀리리터의 최종 부피로 튜브를 채웁니다. 그리고 얼음에 샘플을 개최하기 전에, 소용돌이와 신선한 HPSS의 일곱 밀리리터에 펠릿을 다시 중단합니다.이물질 제거의 경우, 소화된 각 시료 또는 균질화된 각 시료에 미리 냉각된 동위원 용액 3밀리리터를 추가합니다. 그리고 샘플을 부드럽게 소용돌이쳐 균일하게 혼합되어 있는지 확인합니다. 다음으로, 샘플을 원심 분리하고, 조심스럽게 용액의 표면에 떠있는 파편과 myelin의 희끄무레한 디스크를 제거합니다.파편이 버려지면 펠릿을 방해하지 않고 각 튜브에서 수퍼나티의 마지막 100 마이크로리터를 제외한 모든 것을 수집하십시오. 개별 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 전송하기 위해 FACS BL 솔루션의 1 밀리리터로 각 펠릿을 다시 중단합니다. Percoll 솔루션과의 통합 후, 샘플 손실을 피하기 위해 셀 펠릿을 손상시키지 않고 파편 디스크와 상체를 매우 신중하게 제거하는 것이 중요합니다.원심 분리 후 각 튜브에서 상류체를 조심스럽게 흡인하고 튜브 당 350 마이크로 리터의 펠릿을 다시 중단하십시오. 격리된 세포 유형의 유량 세포 측정 분석을 위해, 표에 설명된 서 프로토콜에 따라 각 튜브에 적절한 항체를 추가하기 전에 튜브당 FC 블록당 5마이크로그램의 샘플을 4도에서 10분 동안 배양한다. 혼합하는 5 초 동안 각 튜브를 소용돌이.그리고 빛으로부터 보호 15 분 동안 섭씨 4도에 샘플을 배치합니다. 인큐베이션의 끝에서, 튜브 당 PBS의 1 밀리리터와 원심 분리기로 샘플을 씻어. 튜브 당 스트렙타비딘의 적절한 부피에서 펠릿을 다시 중단합니다.소용돌이가 섞인 후, 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 그리고 입증 된 바와 같이 튜브 당 PBS의 1 밀리리터로 세포를 씻어. 수퍼네이츠를 폐기한 후, 튜브당 300마이크로리터의 펠릿을 다시 중단한다.그리고 7-AAD의 5 개의 마이크로 리터로 각 샘플을 라벨. 그런 다음 시토플루오로메트릭 분석까지 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에 샘플을 저장합니다. 균질화 방법은 전체적으로 뇌와 척수 모두에서 더 높은 세포 수율을 생성하지만, 검색 된 세포의 대부분은 일반적으로 죽었으며 뇌에서 실행 가능한 세포의 약 14 %가 치유되고 척수에서 약 10 %가 치유됩니다.대조적으로, 파팡 소화 방법은 세포 생존성의 전반적인 더 나은 보존귀착됩니다. 9색 이중유 세포측정을 가진 뇌 및 척수 세포 현탁액을 분석하면 CD45+CD11b+microglia 및 대식세포의 존재를 알 수 있습니다. 그리고 두 조직에서 CD45+CD11b-림프구.CD45 세포 인구는 성상세포, 또는 올리고덴드로시테 마커, 또는 야피및 내피 표면 마커 발현에 대한 양성에 따라 차별될 수 있다. 균질화 방법을 사용하여, 실행 가능한 세포의 32 ~38%는 조혈 기원이다. 효소 소화 방법은 비 조혈 CD45 세포의 매우 큰 분수의 획득을 초래하는 동안.놀랍게도, CD45+CD11b+마이크로글리아 및 대식세포는 균질화 방법을 사용하여 가장 풍부한 실행 가능한 세포 분획을 나타냅니다. 그러나 소화 방법은 성상세포, 올리고덴드로키테, 내피 세포 및 뉴런을 포함한 세포 유형의 보다 이질적인 표현을 생성합니다. 이 프로토콜은 다재다능하며 특정 세포 하위 집단, 1차 배양 또는 생화학적 또는 RNA 염기분석과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에 대해 악용될 수 있다.우리는 이 진행 도중 또는 내위축성 측삭 경화증의 마우스 모형에 있는 처리 후에, 또는 다른 CNS 인구의 유전자 발현 그리고 기능적인 서명을 평가하기 위하여 이 프로토콜을 실행했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

현재 문서는 효율적으로 효과적으로 흐름 cytometric 분석을 위해 활용할 수 뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

유동세포계측법로 부상 / 병적인 CNS에 염증 세포의 부량는 감도 / 정확도를 감소, 유사한 크기 및 과립 세포를 가질 수 지질 / myelin 파편에 의해 복잡합니다. 우리는 myelin 파편을 제거하고 피해를 입은 척수에 유동세포계측법에 의해 세포 검출을 향상시킬 수있는 세포 준비 방법을 고급 있습니다.

유동세포계측법에 의해 피해를 입은 척수 조직에서 면역 세포의 양적 평가 : 세포 정제 방법에 대한 소설을 사용

이 비디오는 쥐의 뇌 조직에서 여러 유형의 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 조직은 삼투압 균형을 유지하기 위해 먼저 소금 용액에서 조직 분쇄기를 사용하여 기계적으로 절단됩니다. 그런 다음 조직 균질화는 밀도 구배 원심분리를 거쳐 세포 파편을 제거합니다. 그런 다음 추가 분석을 위해 세포를 용액에 재현탁시킵니다.

기계적 균질화에 의한 마우스 뇌에서 여러 세포 유형 격리(Isolation of Multiple Cell Types from a Mouse Brain by Mechanical Homogenization)

다음 스트로크 뇌 골수 세포 특성화 광학 분별 법을 이용하여 수행 Stereology를, 뇌의 유세포 분석에 의해 현탁액 백혈구 수있다. 둘 허혈성 뇌에서 발견되는 주된 서브 세트 골수 세포 표현형의 정확한 구별을 수행하는 유용한 기술이다.

일시적 또는 영구적 인 뇌허혈 모델에서 백혈구 부분 집단의 Stereological 및 유동 세포 계측법 특성

염증은 허혈성 뇌졸중의 발병기전에서 중심적인 역할을 합니다. 점점 더 많은 증거에 따르면 그것은 초기 뇌 손상을 악화시키는 양날의 검으로 작용하지만 나중에 회복하는 데에도 기여합니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌에서 면역 세포를 분리하고 그에 따른 유세포 분석 표현형을 설명합니다.

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

이 프로토콜은 유행 세포 계측법에 의한 성체 마우스 중추 신경계에서 대 식세포 모집단의 분석을 제공하며, 이들 세포에 의해 표현되는 다중 마커의 연구에 도움이됩니다.

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

정량 분석 murine 좌 골 신경 내에서 셀 내용의 조직의 부족으로 인해 어렵습니다. 이 프로토콜 조직 소화와 개별 쥐의 신경에서 면역 세포 인구의 흐름 cytometry 분석에 대 한 충분 한 세포를 제공 하는 준비 하는 방법을 설명 합니다.

단일 좌 골 신경 및 Cytometry 사용 하 여 단일 마우스에서 지 루트 신경 절에 면역 세포의 분석

이 신경세포 해리 프로토콜은 출발 물질의 양이 적은 샘플을 대상으로 하며, 선택적 고정 및 염색 단계를 통해 다운스트림 분석을 위해 매우 실행 가능한 단일 세포 현탁액을 생성합니다.

마우스 뇌 해마 조직의 기계적 및 효소적 해리 결합

현재까지 동일한 마우스에서 모든 주요 중추 신경계 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 프로토콜은 충족되지 않은 수요입니다. 이 프로토콜은 신경 염증 중에 복잡한 세포 네트워크를 조사하고 동시에 필요한 마우스 수를 줄이기 위해 순진하고 실험적인 자가면역 뇌척수염 마우스에 적용할 수 있는 절차를 보여줍니다.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

뇌 질환에 대한 면역 반응을 조사하기 위한 한 가지 일반적인 접근법은 면역 세포의 변화를 분석하는 것입니다. 여기에서는 쥐 뇌 조직과 두개골 골수에서 면역 세포를 분리하기 위한 두 가지 간단하고 효과적인 프로토콜이 제공됩니다.

생쥐의 뇌와 두개골에서 면역 세포 분리

이 프로토콜은 유세포 분석과 단일 세포 RNA 시퀀싱을 결합하여 출생 후 초기 마우스 뇌의 소뇌에서 미세아교세포 상태를 분리하고 특성화합니다. 효소 해리, Percoll 원심분리 및 면역염색을 사용하여 미세아교세포의 이질성을 밝히고 소뇌 발달 및 질병에서의 역할에 대한 이해를 향상시킵니다.

출생 후 초기 마우스 뇌 발달에서 미세아교세포 활성화를 특성화하기 위한 유세포 분석 및 단일 세포 분석

배우세요 마우스 뇌와 척수에서 다양한 세포 유형을 동시에 식별하는 유량 세포 측정법을. 이 방법은 신경퇴행성 질환 연구와 세포 표적화 평가에 활용됩니다.

다른 균질화 방법을 통해 마우스 뇌 / 척수에서 검색 된 여러 세포 유형의 동시 유량 세포 측정 특성 분석

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