Name: 재생 액소틀의 미세 외과 적 중수 절제술을 통한 타박상 척수 손상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 학습하세요 재생 액소틀에서 표준화된 타박성 척수 손상을 유도하는 미세외과적 중수절제술을 통해 척수 재생 연구를 수행하는 방법을. 이 기법은 임상 외상을 모방하여 재현성을 높입니다.

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마이클 페더슨, 오르후스 대학은 MRI 프로토콜을 개발하고 전체 프로젝트를 설정하는 데 대한 전문 지식과 시간을 가지고 있습니다. 피터 아거, MRI 프로토콜 개발에 자신의 전문 지식과 시간에 대한 오르후스 대학. 스테펜 링가드, MRI 프로토콜 개발에 자신의 전문 지식과 시간에 대한 오르후스 대학. 액솔로틀에서 SCI 모델의 개발은 A.P. Møller Maersk 재단, 리스포르트 재단, 라인스 재단, ELRO 재단에 의해 친절하게 지원되었습니다.

동물의 윤리적 사용에 관한 모든 적용 가능한 기관 및 정부 규정이 이 연구 기간 동안 준수되었습니다. 이 연구는 승인 ID에서 실시되었다: 덴마크 동물 실험 검사에 의해 2015-15-0201-0061. 동물은 멕시코 액소톨(Ambystoma 멕시카눔,평균 체질량 ± STD: 12.12 g ± 1.25 g)이었다.
1. 준비
<ol><li>
마취를 위한 액소를 준비하십시오.
	<ol>
<li>고품질의 비화학 처리 된 수돗물을 사용하십시오. 사용할 수 없는 경우 40% Holtfreter의 솔루션을 사용하십시오.</li>
		<li>아세톤의 3 mL에 에틸 4-아미노 벤조에이트 (벤조카인)의 200 mg을 용해. 이 용액을 수돗물 1L 또는 홀트프레터 용액 40%에 녹입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>스테레오 현미경 아래에 놓인 표준 페트리 접시(직경 100mm)를 수술용 테이블로 사용하십시오. 페트리 접시에 수술용 직물 천을 놓습니다. 참고: 페트리 접시를 수술 공간으로 사용하면 동물을 건드리지 않고도 움직이고 회전할 수 있으므로 수술 중 척추의 안정성을 보장할 수 있습니다.</li>
	<li>모든 멸균 미세 수술 기구 (즉, 가위 및 해부학 적 집게)를 준비하십시오.</li>
</ol>2. 마취
<ol><li>약 45 분 동안 벤조카인 용액이있는 용기에 액소틀을 놓아 깊고 안정적인 마취를 보장하십시오. 참고: 벤조카인의 주어진 농도는 축색의 모든 크기에서 마취를 일으킬 것입니다.</li>
	<li>30-45 분 이내에 전신 마취의 징후를 확인하십시오. 이들은 아가미 운동의 완전한 부족을 포함합니다, 오른쪽 반사, 또는 촉각 또는 고통스러운 자극에 대한 응답 (발가락 웹의 부드러운 꼬집기).</li>
	<li>마취를 유지하기 위해 마취용액에 적신 종이 타월에 동물을 감쌉하십시오. 피부와 아가미가 촉촉하게 유지되도록 수술 시 이 용액으로 정기적으로 적시세요.</li>
	<li>수술 후 신선한 수돗물이 들어있는 용기에 넣어 동물을 회복하십시오. 1 시간16이내에 아가미 운동 및 회복 된 오른쪽 반사와 같은 회복 의 징후를 관찰하십시오.</li>
</ol>3. 미세 외과 중수 절제술
참고: 라민 절제술은 입체 현미경으로 수행됩니다.
<ol><li>동물을 페트리 접시에 놓기 쉬운 위치에 놓습니다. 꼬리가 노출되도록 종이 타월에 싸서. 참고: 종이 타월은 절차 전반에 걸쳐 안정성을 보장하기에 우수합니다.</li>
	<li>
뒷다리를 식별합니다. 첫 번째 절개는 그들에게 그냥 꼬리를 확인합니다.
	<ol>
<li>한 쌍의 마이크로시저로 용골에서 수직 절개를 수행하여 가시 공정의 뼈가 두드러질 때까지 느껴질 때까지. 참고: 포셉으로 용골과 피부를 잡을 때 는 섬세한 피부에 쉽게 손상을 입히기 때문에 매우 조심하십시오.</li>
		<li>절개가 꼬리의 전체 너비를 통과할 수 있도록 컷을 측면으로 확장합니다.</li>
		<li>올바른 깊이를 보장하기 위해 집게로 가시 공정을 잡습니다.</li>
		<li>양쪽의 가시 공정 아래 수직 절개를 1mm 아래로 확장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
아래에 명시된 대로 동물을 한쪽에 놓고 복부 및 수평 절개를 수행합니다.
	<ol>
<li>한 쌍의 마이크로시저로 수직 절개의 복부 지점에서 시작하여 동물의 무게 가 10-20g의 약 15mm의 수평 절개를합니다. 더 큰 동물의 경우 절개를 더 길게 하고, 더 작은 동물의 경우 더 짧게 만듭니다.</li>
		<li>가위를 사용하여 척추 기둥이 중간선에서 느껴질 때까지 수평 절개를 통해 내측해 합니다.</li>
		<li>동물의 반대편에서 3.3, 3.3.1 및 3.3.2 단계를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
양쪽에서 깊은 내측 평면에서 해부한 후, 중간선을 통해 해부되어 두 개의 수평 절개를 연결합니다.
	<ol>
<li>꼬리와 용골의 자유 조각을 한쪽으로 이동하여 가풍 공정을 노출시합니다(그림1).</li>
		<li>젖은 종이 타월을 사용하여 꼬리 조각을 고정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
외과 의사의 비 지배적 인 측면을 향한 머리와 다시 경향이 위치에 동물을 배치합니다.
	<ol>
<li>한 쌍의 집게로, 뒤의 사지에 그냥 꼬리를 꼬리가 있는 가소성 과정을 파악하십시오. 동물의 머리 위로 그리고 머리 쪽으로 부드럽게 들어 올립니다.</li>
		<li>한 쌍의 마이크로시저 잎을 공정 주변에 수평으로 놓고 부드럽게 자릅니다. 프로세스의 리프트는 척수를 노출, 지금 제거되도록합니다.</li>
		<li>방금 제거 된 것으로 가소 성 과정을 잡고 3.5.1 및 3.5.2 단계를 반복하십시오. 참고: 이것은 2개의 척추 수준에 대응하는 노출된 척수를 남겨두어야 합니다. 라미네절제술을 수행 할 때, 흰색 거품 분비가 종종 나타납니다. 척수는 중간선을 따라 달리는 혈관과 함께 독특한 광택으로 쉽게 식별됩니다.</li>
		<li>동물의 크기에 따라 노출 된 영역이 충분히 넓지 않을 수 있습니다. 두 쌍의 집게를 사용하여 척수 양쪽에 있는 라미나(laminae)를 잡고 부드러운 움직임으로 옆으로 비틀어 보세요.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 타박상 유형 상해 소개(그림 2)
<ol><li>동물을 쉬운 위치에 두십시오.</li>
	<li>페트리 접시를 사용하여 동물을 외상 단위로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 활용한다.</li>
	<li>조수가 척수에 손전등을 비추게 하십시오.</li>
	<li>장치의 마이크로 조절기를 사용하여 노출된 척수 위에 타박상 외상 유닛 실린더를 놓습니다. 실린더를 통해 조준하십시오.</li>
	<li>라미나와 레벨이 될 때까지 실린더를 낮춥습니다.</li>
	<li>떨어지는 막대를 전자석에 부착합니다. 원하는 낙하 높이 조정 실린더를 외상 유닛에 놓습니다.</li>
	<li>떨어지는 막대를 실린더에 놓습니다. 참고: 맹인 연구를 위해, 외과 의사는 이제 동물이 부상이나 가짜 수술 그룹에 할당 될 지 모르고 방을 떠나야한다.</li>
	<li>전자석을 끕니다. 막대는 노출 된 척수에 떨어집니다.</li>
	<li>높이 조절 나사를 사용하여 척수에서 막대를 들어 올립니다.</li>
	<li>현미경을 통해 척수를 보고 부상을 확인합니다. 부상당한 부위는 더 어둡게 나타나고 중간 선 선박에서 출혈이 분명합니다.</li>
</ol>5. 날카로운 부상 소개
참고: 3.5.4 이후 이 단계를 수행합니다.
<ol><li>한 쌍의 마이크로시저로 척수를 완벽한 수직 절단으로 잘라냅니다.</li>
	<li>컷을 2mm 를 몸의 꼬리 쪽으로 반복합니다. 참고: 제거된 척수 조각의 길이는 연구 요건에 따라 조정할 수 있습니다. 그러나, 2mm 절단은10을 갱신 할 수 있습니다.</li>
	<li>절단이 완료되었는지 확인합니다. 완료되면 척추 관의 복부 부분을 따라 가위 가위의 칼날이 긁히는 것을 느낍니다.</li>
	<li>척수 2mm 조각을 척수에서 들어 올립니다.</li>
</ol>6. 외과 상처 닫기
<ol><li>동물을 수술테이블로 되돌려 보라고 합니다. 맹인 연구에서는 척수를 외과 의사에게 볼 수 없도록 용골을 재배치하십시오.</li>
	<li>
동물을 쉬운 위치에 두십시오.
	<ol>
<li>수평 절개의 가장 꼬리 부분에서 10.0 나일론 봉합사를 배치하기 시작합니다. 상처를 한 층으로 닫습니다. 참고: 괴사를 입힐 것이기 때문에 피부를 너무 단단히 잡지 마십시오.</li>
		<li>절개의 수직 부분을 향해 작업합니다.</li>
		<li>각도에 도달하면 페트리 접시를 돌리고 다른 수평 절개를 봉합합니다.</li>
		<li>수직 절개에 봉합사를 설정합니다.</li>
		<li>여기에 피부가 보유 할 수 없기 때문에 용골의 가장 위쪽에 봉합사를 두지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 동물을 마취없는 솔루션으로 되돌리기
<ol><li>동물과 함께 페트리 접시를 들어 올리고 5cm 깊이의 담수에 매우 부드럽게 담그고 동물이 미끄러지게하십시오. 참고: 얕은 수심은 동물이 숨을 쉬기 위해 수면으로 수영하지 않도록 합니다.</li>
	<li>첫 주 동안에는 물을 바꾸지 마십시오.</li>
	<li>동물에게 먹이를 주면 음식이 동물의 머리 근처에 놓여 있는지 확인하십시오. 참고: 이러한 조치의 목적은 첫 주 동안 가능한 한 많은 움직임을 피하기 위한 것입니다.</li>
</ol>8. 수술 후 초음파
<ol><li>마취가 종료되기 전에 고주파 초음파 시스템을 사용하여 SCI 부위의 3 차원 이미지 구성에 사용할 수있는 부상 이미지를 수집하십시오.</li>
	<li>트랜스듀서를 리모트 조이스틱에 의해 제어되는 마이크로 조작기에 부착하십시오.</li>
	<li>마취 된 동물을 마취 용액으로 채워진 작은 용기에 적시고 발생하기 쉬운 위치에 담급전하십시오. 참고: 스캔 시퀀스 중에 움직임을 피하기 위해 소형 샌드백 이나 기타 장비로 동물을 고정하십시오.</li>
	<li>트랜스듀서의 끝을 동물의 길이 축에 맞추고 동물의 뒷다리 뒤쪽 용골 보다 몇 밀리미터 정도 가을이 될 때까지 벤조카인 용액에 담급전시넣습니다.</li>
	<li>SCI 사이트를 식별합니다. 참고: 부상 부위는 SCI 바로 위에 누락 된 가시 공정으로 인해 쉽게 인식 할 수 있습니다.</li>
	<li>초음파 설정을 조정하여 이미지를 최적화합니다. SCI 사이트가 이미지의 가운데에 있는지 확인합니다. SCI 사이트와 인접한 정상 조직을 덮도록 시야(예: 이미지 깊이, 깊이 오프셋 및 이미지 너비)를 조정합니다. 2차원 게인을 조정하여 이미지 대비를 최적화합니다.</li>
	<li>전자작동 마이크로조작마이크로조작기로 SCI 사이트 전체에 초음파 트랜스듀서를 스위핑하여, 여러 시상 단면 슬라이스 위치에서 SCI 부위를 덮는 B 모드 이미지를 획득하고, 슬라이스 간격을 가진 연속슬라이스를 통해 50 μm. ~ 50 프레임 / s의 프레임 속도와 40 MHz의 트랜스듀서 주파수와 500 프레임을 포함하는 시네 이미지를 획득합니다. 참고: 이 설정에는 원격 조이스틱이 제어하는 전자 마이크로 매니더가 필요합니다(단계 8.2).</li>
	<li>스캐닝 시퀀스를 완료한 후 7단계로 복귀한다.</li>
</ol>

<ol><li>Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+Long-Term+Survival+After+Spinal+Cord+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Physical+Medicine+and+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury.</a> Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).</li>
<li>Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+management+and+quality+of+life+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physical+Medicine+%26+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Bladder management and quality of life after spinal cord injury.</a> American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).</li>
<li>Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stockholm+spinal+cord+injury+study%3A+1.+Medical+problems+in+a+regional+SCI+population%5BTitle%5D)+AND+%22Paraplegia%22%5BJournal%5D)">The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population.</a> Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).</li>
<li>Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+traumatic+spinal+cord+injury+in+Denmark%2C+1990-2012%3A+a+hospital-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study.</a> Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).</li>
<li>Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+and+incidence+of+traumatic+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury.</a> Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).</li>
<li>Aguayo, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degenerative+and+regenerative+responses+of+injured+neurons+in+the+central+nervous+system+of+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).</li>
<li>Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+mesencephalic+neurons+survive+and+extend+long+axons+across+peripheral+nervous+system+grafts+inserted+into+the+adult+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum.</a> Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).</li>
<li>Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+long+spinal+axons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of long spinal axons in the rat.</a> Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).</li>
<li>Butler, E. G., Ward, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+spinal+cord+following+ablation+in+urodele+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae.</a> Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).</li>
<li>Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+control+of+miR-125b+levels+is+required+to+create+a+regeneration-permissive+environment+after+spinal+cord+injury%3A+a+cross-species+comparison+between+salamander+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat.</a> Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).</li>
<li>Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+descending+axons+in+the+spinal+cord+of+the+axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl.</a> Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).</li>
<li>McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+central+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration+from+the+implanted+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres.</a> Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).</li>
<li>Thygesen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinically+relevant+blunt+spinal+cord+injury+model+in+the+regeneration+competent+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Therapeutic+Medicine%22%5BJournal%5D)">A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail.</a> Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).</li>
<li>Goss, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoss%2C+RJ+%22Principles+of+Regeneration%22">Principles of Regeneration</a>. , Academic Press. New York. (1969).</li>
<li>Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axolotl+limb%3A+a+model+for+bone+development%2C+regeneration+and+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing.</a> Bone. 40 (1), 45-56 (2007).</li>
<li>Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propofol+%282%2C6-diisopropylphenol%29+is+an+applicable+immersion+anesthetic+in+the+axolotl+with+potential+uses+in+hemodynamic+and+neurophysiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments.</a> Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).</li>
<li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Progress+of+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Progress of Physiology.</a> The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

척수 손상의 위험이 중요하기 때문에 프로토콜의 중요한 단계는 가시 과정을 제거하고 필요한 경우 척추 관에 대한 뼈 접근을 넓히는 것입니다. 프로토콜에서 언급했듯이 가장 두개골 프로세스를 먼저 제거하는 것이 좋습니다. 이것은 더 많은 꼬리 프로세스가 척수에 의해 명중되는 것을 보호한다는 것을 의미합니다. 그것은 충분한 수술 접근을 보장하는 것이 좋습니다, 너무 작은 기본 절개를하지 않는 것을 의미. 또한 집게로 무엇이든 잡을 때 적용된 당김의 방향을 항상 고려해야 합니다. 척수에서 부드럽게 당겨도 손아귀가 고장나고 기기가 미끄러질 경우 척수를 보호합니다.
액소로틀의 외과 적 수술은 다른 동물과 다르지 않습니다. 그러나, 특정 중요한 다름은 주로 동물의 조직 조성 및 크기에 기인하는 존재한다. 축색용 골 피부는 매우 연약하며 역설적으로 절개 중에 입은 작은 손상으로 치유되지 않습니다. 손상이 실질적으로 봉합을 복잡하게하기 때문에 특히 1 차 절개에주의를 기울여야합니다. 아주 어린 축...

이 연구의 전반적인 목표는 축색에 무딘 날카로운 SCI를 가하기 위한 제어되고 재현 가능한 미세 수술 방법을 확립하는 것이었습니다(Ambystoma 멕시카눔),재생 척수 손상 모델을 생성.
SCI는 수준과 정도에 따라 방광 및 대장 조절장애와함께 사지에 신경 장애를 가하는 심각한 상태이며1,2,3. 대부분의 SCI는 교통사고와 같은 고에너지 무딘 외상의 결과이며4,5. 날카로운 부상은 매우 드뭅니다. 따라서 가장 일반적인 거시적 상해 유형은 타박상입니다.
포유류 중추 신경계(CNS)는 재생되지 않는 조직이므로 SCI에 따른 신경 조직의 복원이없음은 6,7,8. 다른 한편으로는, 몇몇 동물은 CNS 조직을 포함하여 조직을 재생하는 흥미로운 기능이 있습니다. 이 동물 들 중 하나는 축 색으로 틀. 그것은 널리 재생 생물학의 연구에 사용되며 척수 재생에 관심이, 그것은 척추 동물이기 때문에9,10,11,12.
액소로틀에서의 대부분의 SCI 연구는 전체 꼬리의 절단 또는 척수의 큰 부분의 절제로서 수행된다9,10,11,12. 최근, 새로운 연구는 무딘 부상에 발표 되었다13 그 더 나은 임상 상황을 모방. 액소로틀에서완전한 부속절단이 완전한 재생을 초래하는 반면, 일부 비절단기반 재생현상은 임계크기 결손(CSD)14,15에의존한다. 즉, 임계 임계값을 초과하는 부상은 재생되지 않습니다. 더 높은 임상 번역 값을 가진 재생 모델을 개발하기 위하여, 이 연구 결과는 2 mm 무딘 외상이 CSD 한계를 초과할 지 여부를 조사했습니다.
이 방법은 작은 동물 모델에서 척수 재생에 종사하는 연구원, 특히 액소로틀에서 관련이 있습니다. 더욱이, 그것은 일반적인 관심사일 지도 모릅니다, 일반적인 작은 동물에서 사용하기에 적합한 무딘 외상 기계장치를 개발하기 위하여 표준 실험실 장비를 사용하는 쪽을 전시하기 때문에.

<table><tbody><tr><td>25g 맞춤형 떨어지는 막대</td><td>맞춤형 홈 메이드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30mm PVC 파이프</td><td>맞춤형 홈 메이드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-64-1</td><td>Propanone</td></tr><tr><td>Axolotl (Ambystoma mexicanum)</td><td>Exoterra GmbH</td><td>N/A</td><td>12-22cm 및 10g - 80g, 모든 균주(와일드타입, 멜라노이드, 화이트, 알비노, GFP가 있는 형질전환 화이트)</td></tr><tr><td>벤조카인</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>94-09-7</td><td>에틸 4- 아미노 벤조 에이</td></tr>트 <tr><td>Electromaget</td><td>사용자 정의 홈 메이드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td>Microsoft</td><td>N / A</td><td>Excel 2010 이상</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>ImageJ 1.5e 이상. Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>미세 수술 기구</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>집게 및 가위</td></tr><tr><td>MS550s</td><td>후지필름, 비주얼소닉스</td><td>MS550s</td><td>40MHz 중심 주파수, 트랜스듀서</td></tr><tr><td>MS700</td><td>후지필름, 비주얼소닉스</td><td>MS700</td><td>50MHz 중심 주파수, 트랜스듀서</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소프트 천</td><td>해당 사항</td><td>없음 N/A</td><td>약 70 x 55cm 크기의 부드러운 천 조각2 예: 행주</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100</td><td>Fujifilm, Visualsonics</td><td>Vevo 2100</td><td>고주파 초음파 시스템</td></tr></tbody></table>

재생 액소틀의 미세 외과 적 중수 절제술을 통한 타박상 척수 손상

Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl

이 연구의 목적은 액소로틀(Ambystoma 멕시코)에서표준화되고 재현 가능한 재생 성 무딘 척수 손상 모델을 확립하는 것입니다. 대부분의 임상 척수 손상은 높은 에너지 무딘 외상으로 발생, 타박상 부상을 유도. 그러나, axolotl 척수에 있는 대부분의 연구 결과는 날카로운 외상으로 실시되었습니다. 따라서, 이 연구는 더 임상적으로 관련 있는 재생 모델을 생산 하는 것을 목표로. 거의 모든 조직을 재생하는 인상적인 능력으로 인해 액소로톨은 재생 연구에서 모델로 널리 사용되며 척수 손상 (SCI) 연구에서 광범위하게 사용되었습니다. 이 프로토콜에서, 액소로틀은 벤조카인 용액에 침수시킴으로써 마취된다. 현미경의 밑에, 각 절개는 뒷다리에 다만 꼬리치는 수준에서 양측으로 만들어집니다. 이 절개에서 가소 성 프로세스를 해부하고 노출 할 수 있습니다. 집게와 가위를 사용하여 척수를 노출하는 2 단계 의 라민 절제술이 수행됩니다. 실린더에 떨어지는 막대로 구성된 사용자 정의 외상 장치가 구성되며,이 장치는 척수에 타박상 부상을 유발하는 데 사용됩니다. 절개는 그 때 봉합되고, 동물은 마취에서 복구됩니다. 외과 접근은 척수를 드러내는 에서 성공적입니다. 외상 메커니즘은 조직학, MRI 및 신경 학적 검사에 의해 확인 된 바와 같이 척수에 타박상 부상을 일으킬 수 있습니다. 마지막으로 척수는 부상에서 재생됩니다. 프로토콜의 중요한 단계는 척수에 손상을 입히지 않고 가시 과정을 제거하는 것입니다. 이 단계에서는 안전한 절차를 보장하기 위한 교육이 필요합니다. 또한, 상처 폐쇄는 절개 중에 피부에 불필요한 손상을 입히지 않는 것에 크게 의존합니다. 프로토콜은 12마리의 동물을 무작위로 연구하여 수행되었다.

프로토콜의 목적은 부상에 모터 및 감각 기능을 마비시킬 SCI를 생성하는 것입니다. axolotl는 재생 유능한 이기 때문에 그것은 주 안에 기능을 복원, 연구원이 짧은 시간 범위 동안 CNS 재생을 공부 할 수 있도록.
마취는 모든 동물에게 45 분 동안 제공되었으며 조기 회복의 에피소드는 경험되지 않았습니다. 모든 동물은 1 시간 이내에 회복하고 다음 주13,16에서마취에서 손상의 흔적을 보여주지 않았다.
라미네크 절제술은 모든 동물에서 성공적이었습니다. 그러나, 척추 운하의 폭에 있는 해부학적인 변이는 몇몇 개별에 있는 집게 그리고 트위스트를 사용하여 운하의 확대를 요구했습니다. 또한, 일부 개인의 잔류 라미네이트는 떨어지는 막대가 목표에 도달하는 것을 막았기 때문에 외과 의사가 잔여 뼈와 돌출부에서 필드를 청소하는 것이...

이 원고는 외과적으로 제어 된 무딘 날카로운 척수 손상을 재생 성 축술(Ambystoma 멕시코)에가하는 프로토콜을 제공합니다.

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma ...

이 프로토콜은 축소척수척수 재생 연구에서 표준화된 타박상 형 상해를 최초로 도입한 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 일상적인 클리닉에서 볼 수있는 외상을 모방하여 미래의 발견이 번역 될 가능성을 향상시키는 것입니다. 타박상 부상 장치는 척수 손상의 다른 작은 동물 모델에서 활용할 수 있습니다.수술 기술은 어렵습니다, 특히 laminectomy. 따라서 생체 내 수술로 진행하기 전에 많은 수의 동물 ex vivo에서 절차를 훈련하는 것이 좋습니다. 먼저, 스테레오 현미경 아래에 표준 페트리 접시를 수술 용 섬유 천 위에 올려 놓아 수술 테이블을 설정하십시오.마취된 축축산틀을 페트리 접시의 경향이 있는 위치에 놓고 꼬리가 노출되도록 종이 타월로 감쌉니다. 뒷다리를 식별하고 마이크로 가위 쌍을 사용하여 첫 번째 절개만 하는 것을 만듭니다. 가시 공정의 뼈가 두드러질 때까지 용골에서 수직 절개를 합니다.절단을 측면으로 확장하여 절개는 꼬리의 전체 너비를 통과하고 적절한 깊이를 보장하기 위해 집게로 가시 공정을 파악합니다. 그런 다음 양쪽의 가시 공정 보다 수직 절개를 1밀리미터 연장합니다. 한쪽에 동물을 놓고 수직 절개의 복부 지점에서 시작하여 무게가 10~20g인 동물의 경우 약 15밀리미터의 수평 절개를 합니다.가위를 사용하여 중간선에서 척추 기둥이 느껴질 때까지 수평 절개를 통해 즉시 해부합니다. 그런 다음 동물을 다른 쪽으로 켜고 과정을 반복합니다. 양쪽에서 깊은 내측 평면에서 해부 한 후, 두 개의 수평 절개를 연결하기 위해 중간선을 통해 해부.그런 다음, 꼬리와 용골의 자유 조각을 한쪽으로 이동하여 가시 공정을 노출시합니다. 머리를 외과 의사의 지배적 인 측면을 향한 경향이있는 위치에 동물을 놓고, 가시 적인 과정을 파악하기 위해 집게 한 쌍을 사용하여 뒷다리에 단지 caudal. 부드럽게 들어 올려 동물의 머리쪽으로 바하십시오.마이크로 가위 한 쌍의 블레이드를 가공 과정 주위에 수평으로 놓고 부드럽게 잘라 척수를 노출시십시오. 방금 제거한 것으로 가시프로세스 를 파악하고 프로세스를 반복합니다. 제거시 척수에 손상을 입히지 않도록 가시 적 과정에 일정한 리프트를 유지하는 것이 필수적입니다.노출된 부위가 충분히 넓지 않은 경우 두 쌍의 포셉을 사용하여 척수 양쪽의 라미네를 파악하고 부드러운 움직임으로 측면으로 비틀어 보냅니다. 가시 프로세스를 제거할 때 여러 단계에서 이 작업을 수행해야 할 수 있습니다. 따라서 척수를 노출하는 데 몇 분이 걸릴 수 있습니다.타박상 형 부상을 소개하려면 페트리 접시를 사용하여 동물을 외상 유닛으로 옮기고 척수에 손전등을 비춥춥춥습니다. 그런 다음, 마이크로 조절기를 사용하여 노출된 척수 위에 타박상 외상 단위 실린더를 놓고 라미네와 수평이 될 때까지 실린더를 낮춥타민을 낮춥시다. 낙하막대를 전자 자석에 부착하고 원하는 낙하 높이 조정 실린더를 외상 장치에 놓습니다.다음으로, 실린더에 떨어지는 막대를 놓고 전자석을 끄고 노출된 척수에 막대를 떨어뜨리고, 높이 조정 나사를 사용하여 막대를 다시 들어 올립니다. 날카로운 부상을 도입하는 경우, 완벽한 수직 절단에 척수를 잘라, 다음 신체의 caudal 측면에 2 밀리그램 컷을 반복합니다. 척수관의 복부 부분을 따라 긁어내는 가위의 칼날을 느끼고 절단이 완료되었는지 확인하고 운하에서 척수 조각을 들어 올립니다.수술 상처를 닫기 위해, 1층으로 상처를 닫고 절개의 수직 부분을 향해 작업하는 수평 절개의 가장 caudal 부분에서 10 점 O 나일론 봉합사를 배치합니다. 각도에 도달하면 페트리 접시를 돌리고 다른 수평 절개를 봉합한 다음 수직 절개에 봉합사를 설정합니다. 마취를 종료하기 전에 고주파 초음파를 사용하여 부상 이미지를 얻습니다.트랜스듀서의 끝을 동물의 길이 축과 정렬하고 동물의 뒷다리 뒤에 있는 용골 보다 몇 밀리미터 위에 도달할 때까지 벤조카인 용액에 담급됩니다. 상해 부위를 식별하고 원고 의 지시에 따라 이미지를 수집합니다. 완료되면, 5 센티미터 깊은 담수에 Petri 접시를 잠그고 동물이 미끄러지게함으로써 무모탈 용액에 도끼를 반환합니다.이 프로토콜을 사용하여 생성된 척수 손상은 헤마톡시린과 에신을 사용하여 부상과 가짜 액졸로틀에 염색하여 검증되었습니다. 재생을 확인하기 위해 조직학적 섹션은 부상 후 9주 동안 준비되었습니다. 이미지는 부상당한 동물에서 다시 확립 된 척수 연결을 보여 주었다.부상과 재생은 또한 신경 기능을 검사에 따라. 꼬리의 자극에 동물의 반응은 높은 촉각과 향각 감각 기능을 나타내는 높은 점수로 득점되었다. 부상당한 동물 중, 3 주 후 신경 기능의 손실, 그리고 9 주 이내에 점진적 복원.척수 손상은 또한 혈관 무결성의 마커로 등동맥의 시각화를 허용 초음파 그래픽 이미징을 사용하여 시각화되었다. 하이필드 MRI 스캔은 부상 직후3주, 6주, 9주 후에 수행되었습니다. 이 검사는 척수 무결성의 부종 과 복원을 시각화 할 수 있었다.검사는 즉시 부상을 게시, 소음하는 경향이 있었다. 환자와 세심한 수술은 척수에 조기 손상없이 laminectomy 후 성공적인 결과를위한 길을 열 것입니다. 이 절차에 따라 이미징 및 전기 생리학적 기술과 같은 여러 생체 내 방법을 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

신경 전구체 이식은 보호 및 / 또는 척수 상해 (SCI)과 모터 신경 장애, amyotrophic 패스 경화증 (ALS)에 분실 / 역기능 자궁 phrenic 모터 뉴런을 교체 유망 전략이다. 우리는 ALS와 SCI의 쥐 모델에서 자궁 경부 척수 복부 혼까지 셀 전송을위한 프로토콜을 제공합니다.

루게릭병과 외상 척수 상해에서 자궁암 복부 호른를 타겟팅하는 Intraspinal 세포 이식

출처: Elzat, E. Y. Y., et al., 최소 침습 기법을 기반으로 한 마우스 타박상 척수 손상 모델 구축. J. Vis. 특급 (2022). 이 비디오는 척수 손상 동축 플랫폼을 사용하여 마우스 모델에서 T9 수준의 척수에 타박상 부상을 유발하는 방법을 보여줍니다. T9 수준의 척수에 체중이 가해져 타박상이 발생하여 즉시 조직이 변색되고 부어오릅니다.

척수 손상 동축 플랫폼을 이용한 마우스 모델에서 척수 타박상 유도

척수 손상은 심각한 이환율과 사망률이 높은 원인 외상 조건이다. 본 연구에서 우리는 구체적으로 신경 줄기 세포를 이식 하였다 마우스 척수 손상의 타박상 모델을 설명한다.

척수 손상의 실험 Contusive 모델에서 신경 줄기 세포 이식

이 기사에서는 신생아 마우스에서 재현 가능한 척수 압박 손상(SCI)을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 이 모델은 자발적인 기능 회복의 기초가 되는 적응 가소성의 메커니즘을 연구하는 데 유리한 플랫폼을 제공합니다.

신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

여기, 예비 중앙 운하 틈새 주택 내 인 성 신경 줄기 세포 (NSCs) 성인 마우스에서 최소한의 척수 상해 모델의 성능을 보여 줍니다. 우리는 활성화 및 마이그레이션 고 원시적인 NSCs 부상 다음의 척도를 neurosphere 분석 실험을 사용 하는 방법을 보여줍니다.

최소한의 척수 상해의 마우스 모델에서 내 인 성 신경 줄기 세포 활성화 평가 Neurosphere 분석 결과

여기에 제시된 프로토콜은 CAS9-gRNA 복합체를 척수 중앙 운하에 주입하고 전기 포공에 의해 액소로틀 척수에서 시간 및 공간 제한 유전자 녹아웃을 수행하는 프로토콜입니다.

CAS9 단백질-gRNA 복합체의 전기 포출을 통해 악소로틀 척수 신경 줄기 세포의 직접 유전자 녹아웃

Xenopus laevis 올챙이 척수 transection은 흉부 수준에서 척수를 완전히 절단하는 횡단 절단을 만들어 척수 손상 및 재생을 연구하는 관련 손상 방법입니다.

Xenopus laevis Tadpoles의 척수 Transection

여기에서는 후궁 절제술을 제거하는 쥐의 개방성 척수 손상을 모델링하는 새롭고 빠른 기술에 대해 설명합니다. 측면 반절부는 현미경을 통해 보면서 수행됩니다. 이 기술은 다재다능하며 다른 동물의 척수의 경추, 흉부 및 요추 영역에도 사용할 수 있습니다.

쥐의 개방성 척수 손상 모델링을 위한 최소 침습적이고 빠른 척수 측면 반절제 기술

최소 침습 기술과 간단한 실험실 장치는 실험 동물에 대한 수술 손상을 줄이고 해부학적 형태 유지를 허용하여 척수 손상 모델의 재현성을 향상시킵니다. 이 방법은 신뢰할 수있는 결과와 재현 가능한 절차가 질병 배상 메커니즘의 조사를 용이하게하기 때문에 가치가 있습니다.

최소 침습 기술을 기반으로 한 마우스 타박상 척수 손상 모델 설정

본 연구의 목적은 두개안면 조직 재생 연구를 위해 Ambystoma mexicanum 에서 완전 횡단적 하악 절단술을 안전하고 재현 가능한 수술법을 표준화하는 것이었습니다.

Ambystoma mexicanum 모델에서 두개안면 조직 재생 연구를 위한 하악 손상 모델 설계 및 표준화

학습하세요 재생 액소틀에서 표준화된 타박성 척수 손상을 유도하는 미세외과적 중수절제술을 통해 척수 재생 연구를 수행하는 방법을. 이 기법은 임상 외상을 모방하여 재현성을 높입니다.

재생 액소틀의 미세 외과 적 중수 절제술을 통한 타박상 척수 손상

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