Name: 방광 충진 중 수부에 직접 접근할 수 있도록 제거된 분리기 근육이 있는 분권화된(Ex Vivo) 뮤린 방광 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 배우세요 분리기 근육이 제거된 생체외 뮤린 방광 모델을 이용하여 방광 충진 중 요로상피 매개체의 가용성을 연구하는 방법을. 이 기법은 요로상피와 점막하층의 신호 전달 메커니즘을 분석하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 당뇨병과 소화 및 신장 질환 보조금 DK41315의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

이 원고에 기술 된 동물과 관련된 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소와 네바다 대학의 기관 동물 사용 및 관리위원회에 따라 수행되었습니다.
참고: 여기에 제시 된 모델은 비뇨기와 SubU / LP가 그대로 남아있는 동안 detrusor 근육의 제거로 구성되어 있습니다(그림 1B)연구원은 방광 충전 과정에서 SubU / LP에 직접 액세스 할 수 있도록.
1. 분리되지 않거나 방광 제제의 해부
<ol><li>분리된 방광을 차가운(10°C)로 채워진 해부 접시에 놓고 5% CO 2/95%O2 크렙스 중탄산염 용액(KBS)으로 산소를 공급하고 다음 조성물(mM)을 사용한다: 118.5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2,23.8 NaHCO3,1.2 KH2PO4,11.0 덱스트로스, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.</li>
	<li>고립된 방광의 돔의 작은 부분을 KBS로 채워진 실가드 덮인 해부 접시에 고정합니다. 핀이 SubU/LP를 마주보고 있는 근육의 가장 안쪽 가장자리에서 멀리 떨어진 분리기 근육의 세로사 조각 또는 가장 바깥쪽 가장자리를 통과해야 합니다.</li>
	<li>현미경을 사용하여 요도 및 요관을 식별하고 해부 접시의 바닥에 각각 고정합니다.</li>
	<li>방광의 전체 본체, 요도 및 두 요관이 표시되도록 과도한 지방 및 결합 조직을 제거하십시오.</li>
	<li>요관에 6-0 나일론 봉합사를 묶습니다. 그런 다음, 제조를 확보하기 위해 해부 접시의 바닥으로 요관의 열린 끝을 고정.</li>
	<li>미세 팁 집게를 사용하여 요관과 방광 몸 사이의 모서리에있는 세로사의 조각을 부드럽게 당깁니다.</li>
	<li>투명도를 높이고 detrusor 근육 아래 의 점막의 마진을 구별하기 위해 현미경의 빛을 조정합니다.</li>
	<li>절단을 시작(박리하지 않음!) 방광 벽을 분지 근육 층의 안쪽 표면을 따라 미세 한 팁 가위로 가볍게 절단 부분을 준비에서 멀리 당깁니다. 항상 점막의 측면 가장자리를 볼 수 있는지 확인하고 만지지 마십시오.</li>
	<li>해부 접시를 돌리면 배뇨기 근육을 완전히 제거하여 준비의 위치가 편해지므로 제거기 근육을 계속 해부하십시오.</li>
	<li>프로토콜의 나머지 단계 동안 준비를 고정 할 수있는 능력을 보장하기 위해 방광 돔의 상단에 detrusor 근육의 작은 조각을 둡니다.</li>
	<li>6-0 나일론 스레드의 이중 루프를 만들고 방광 준비의 목 주위에 놓고 루프를 느슨하게 둡니다.</li>
	<li>6-0 실크 스레드의 두 번째 이중 루프를 추가하고 방광 준비의 목 주위에 놓고 루프를 잃어 버리십시오. 두 개의 봉합사를 사용하면 봉합사 주위의 누출을 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>20 PE 튜브 (카테터)의 약 2cm를 잘라, 불꽃에 가까운 팁을 천천히 이동하여 팁을 플레어.</li>
	<li>카테터를 따뜻한(37°C)로 채우고 KBS에 산소를 공급합니다.</li>
	<li>방광 요도의 오리피스에 카테터를 삽입하고 카테터 팁이 방광의 약 중간에 도달 할 때까지 카테터를 부드럽게 밀어 넣습니다.</li>
	<li>카테터와 방광 목의 주변 조직 주위에 봉합사를 묶습니다.</li>
	<li>약 50-100 μL의 따뜻한 (37 °C) 산소 로 방광을 천천히 채우고, KBS의 표면 위로 짧게 들어 올리고 봉합사및 방광 체에서 누출을 모니터링하십시오.</li>
	<li>누출이 관찰되지 않으면 실험을 위한 준비가 완료됩니다. 봉합사 주위의 누출이 관찰되면 봉합사를 제거하고 교체하십시오. 방광 체의 구멍에서 누출이 발견되면 준비를 폐기하십시오.</li>
</ol>2. 방광 제제 의 충진
<ol><li>KBS(37°C)를 실가드 바닥을 가진 3 mL 챔버(37°C)의 자켓 오르간 접시에 퍼퓨즈한다.</li>
	<li>산소와 흡입 선을 조정합니다.</li>
	<li>방광 준비를 챔버에 놓습니다.</li>
	<li>카테터를 챔버 의 측면에 고정하여 전재가 관류 용액의 표면 위에 떠오르지 않도록하십시오.</li>
	<li>방광 카테터를 동일한 크기의 피팅을 사용하여 3방향 스톱콕에 연결된 더 긴 PE20 튜브(주입 선)에 연결합니다.</li>
	<li>주입 펌프, 압력 변환기 및 방광 사이의 선이 열려 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>주입 주사기를 신선하고 따뜻한 (37 °C)와 산소화 된 KBS로 채웁니다.</li>
	<li>펌프 파라미터 를 조정합니다: 주사기의 유형/부피(즉, 1mL), 작동(즉, 주입), 유량(즉, 상수) 및 유량(즉, 15μL/min).</li>
	<li>주사기 펌프의 시작 버튼을 눌러 방광을 채웁니다.</li>
	<li>방광 충진 중 충진량과 내압력을 모니터링합니다.</li>
</ol>3. 디누디 방광 제제의 SubU/LP 측면의 중재자 검출
<ol><li>얼음 차가운 미세 원심 분리튜브 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 인서트에 목욕 용액의 알리쿼트를 수집합니다.</li>
	<li>적절한 검출 어플리케이션에 따라 샘플을 준비하고 처리합니다. purine 가용성을 검출하는 경우 형광 검출13,18로HPLC에 의해 샘플을 처리합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uroepithelial-associated+sensory+web%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).</li>
<li>Fry, C. H., Vahabi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Mucosa+in+Normal+and+Abnormal+Bladder+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+and+Clinical+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).</li>
<li>Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors%2C+channels%2C+and+signalling+in+the+urothelial+sensory+system+in+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviewes+Urology%22%5BJournal%5D)">Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder.</a> Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).</li>
<li>Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+is+released+from+rabbit+urinary+bladder+epithelial+cells+by+hydrostatic+pressure+changes--a+possible+sensory+mechanism%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism?</a> Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).</li>
<li>Wang, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+and+purinergic+receptor-dependent+membrane+traffic+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+for+Piezo1+in+stretch-evoked+Ca%282%29%28%2B%29+influx+and+ATP+release+in+urothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).</li>
<li>Mochizuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRPV4+cation+channel+mediates+stretch-evoked+Ca2%2B+influx+and+ATP+release+in+primary+urothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).</li>
<li>McLatchie, L. M., Fry, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+release+from+freshly+isolated+guinea-pig+bladder+urothelial+cells%3A+a+quantification+and+study+of+the+mechanisms+involved%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved.</a> BJU International. 115, 987-993 (2015).</li>
<li>Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic-+and+capsaicin-evoked+nitric+oxide+release+from+urothelium+and+afferent+nerves+in+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).</li>
<li>Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO%3A+effect+on+bladder+afferent+neurons+and+nitric+oxide+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release.</a> Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).</li>
<li>Birder, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanilloid+receptor+expression+suggests+a+sensory+role+for+urinary+bladder+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).</li>
<li>Birder, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-adrenoceptor+agonists+stimulate+endothelial+nitric+oxide+synthase+in+rat+urinary+bladder+urothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells.</a> Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).</li>
<li>Durnin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+bladder+model+with+detrusor+smooth+muscle+removed+to+analyse+biologically+active+mediators+released+from+the+suburothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium.</a> Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).</li>
<li>Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neuronal+cholinergic+system+in+human+bladder+urothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium.</a> Urology. 67, 425-430 (2006).</li>
<li>Beckel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pannexin+1+channels+mediate+the+release+of+ATP+into+the+lumen+of+the+rat+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder.</a> Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).</li>
<li>Collins, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OnabotulinumtoxinA+significantly+attenuates+bladder+afferent+nerve+firing+and+inhibits+ATP+release+from+the+urothelium%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium.</a> BJU International. 112, 1018-1026 (2013).</li>
<li>Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+afferent+pathways+and+urothelial+function+in+the+male+mouse+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder.</a> Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).</li>
<li>Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+purine+release+during+filling+of+murine+and+primate+bladders%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).</li>
<li>Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+signalling+underlies+transforming+growth+factor-beta-mediated+bladder+afferent+nerve+hyperexcitability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability.</a> Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).</li>
</ol>

이 작품의 일부는 이전에 생리학의 저널에 발표 되었다 (PMCID: PMC6418748; DOI: 10.1113/JP27692413). 이 출판물의 자료 사용에 대한 와일리와 Sons, Inc.의 허가가 부여되었습니다. 저자는 공개 할 재정적 또는 기타 충돌이 없습니다.

방광에는 소변의 저장 그리고 무효화의 2개의 기능이 있습니다. 이러한 기능의 정상적인 작동은 방광 벽에 있는 세포를 통해 신호의 내발량 및 압력 및 전달의 적절한 기계적 감지를 필요로 하여 분리기 근육 흥분성을 조절합니다. 방광 점막 (urothelium)는 방광 벽에 있는 수많은 세포 모형에 영향을 미치는 SubU/LP에 있는 신호 분자의 다양한 방출해서 방광 흥분성을 통제하는 것으로 믿어집니다. 현재, 요로 테르륨 유래 매개체의 특성화에 대부분의 시도는 생리적인 방광 충진을 재생하지 않는 방광 준비 (예를 들면, 편평한 방광 벽 시트, 방광 벽 지구, 또는 배양된 세포)의 사용을 관련시킵니다. 방광 충전의 끝에 방광 루멘에서 풀어 놓이는 중재자의 측정은 비뇨기외의 반대측에서 이 매개체의 방출을 위한 표시로 자주 이용됩니다. 그러나, 최근 연구는 중재자의 내발 광 함량이 방광 벽(13)에서깊은 사용할 수있는 것을 대표하지 않는다는 것을 시사한다. 방광 충전 도중 SubU/LP에 접근을...

이 모형의 목적은 방광 충진의 다른 단계 도중 방광 점막의 점막 측에 직접 접근을 가능하게 하기 위한 것입니다.
방광은 중요한 부피와 압력에 도달할 때 충전하는 동안 조기 수축을 자제하고 비어 있어야합니다. 소변의 이상한 요실금 또는 무효화는 방광 충진 의 과정에서 분리 평활근 (DSM)의 비정상적인 흥분성과 자주 연관됩니다. DSM의 흥분성은 평활근 세포에 내재된 요인과 방광 벽 내의 다른 세포 유형에 의해 생성된 영향에 의해 결정됩니다. 오줌 방광의 벽은 요로 외(점막), suburi(SubU)/라미나 프로피아(LP), 방파제 평활근(DSM) 및 세로사(그림1A)로구성됩니다. 요로 테륨은 우산 세포 (즉, 요로 류의 가장 바깥쪽 층), 중간 세포 및 기저 세포 (즉, 요로 의 가장 안쪽 층)로 구성됩니다. 간질 세포, 섬유아세포, 구심성 신경 말단, 작은 혈관 및 면역 세포를 포함한 다양한 유형의 세포가 SubU/LP에 있습니다. 방광 요로는 SubU/LP 및 DSM1,2,3의세포에 영향을 미치는 점막내로 매개체를 방출함으로써 반사 배뇨 및 요실금을 개시하는 감각 기관이라고 널리 가정됩니다. 대부분의 경우, 이러한 가정은 중재자의 방출을 입증 한 연구를 기반으로합니다 : 점막의 조각에서 정수압의 변화에 노출4,5; 배양 된 비뇨기 세포에서 스트레칭 에 노출6,7,hypotonicity 유도 세포 팽윤7 또는 드래그 힘8; 수용체 또는 신경 활성화 시 고립 된 방광 벽 스트립에서9,10,11,12,13,14; 그리고 방광 의 끝에 루멘15,16,17,18,19. 그 같은 연구 결과는 방광 벽 세그먼트 또는 배양된 비뇨기과 세포의 기계적인 자극에 중재자의 방출을 설명하는 중요한 동안, 방광 충전을 재생하는 생리적 자극에 의해 유도되는 submucosa에 있는 중재자의 방출을 위한 직접적인 증거에 의해 지원될 필요가 있습니다. 이것은 SubU/LP가 방광 충전 도중 SubU/LP의 부근에 간단한 접근을 방해하는 방광 벽의 깊은 곳에 있다는 것을 주어진 도전적인 작업입니다.
여기서, 우리는 방광 요로, DSM 및 방광 벽에 있는 그밖 세포 모형 사이 신호에 참여하는 메카노트랜스덕션의 국소 기계장치에 대한 연구를 촉진하기 위하여 개발된 detrusor 근육제거된 13를 가진 분권화된 (ex vivo) 뮤린 방광 모형을 예시합니다. 이 접근법은 방광의 생리적 압력 과 부피에 반응하여 방출되거나 형성되는 비뇨기과 유래 매개체의 SubU/LP 부근에서 직접 측정을 허용하고 세포 배양에서 잠재적인 현상학적 변화를 피하기 때문에 평평한 방광 벽 시트, 방광 벽 스트립 또는 배양 된 비뇨 기 세포를 사용하는 것이 우수합니다. 방광 충진의 상이한 단계에서 SubU/LP의 중재자의 가용성, 방출, 대사 및 경부 수송을 측정하는데 사용될 수있다(그림 1B). 준비는 또한 과민성 및 저활동 방광 증후군의 모형에 있는 비뇨기과 신호 및 mechanotransduction를 검토하기 위하여 이용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td>소스 플렉시블</td></tr><tr><td>덱스트로스</td><td>Fisher</td><td>D16</td><td>소스 플렉시블</td></tr><tr><td>해부 핀</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>소스 플렉시블</td></tr><tr><td>주입 펌프</td><td>Kent Scientific</td><td>GenieTouch</td><td>소스 플렉시블</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td>소스 플렉시블</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P284</td><td>소스 유연한</td></tr><tr><td>광원</td><td>SCHOTT ACEI</td><td></td><td>소스 유연한</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus SZX7</td><td></td><td>모든 스코프를 사용할 수 있는 유연한</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>M33</td><td>소스 플렉시블</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S671</td><td>소스 플렉시블</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>S233</td><td>소스 유연한</td></tr><tr><td>바늘 25G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>소스 유연한</td></tr><tr><td>오르간 욕조</td><td>맞춤형</td><td></td><td>유연한 소스; 우리는 Radnoti 해부 접시</td></tr><tr><td>PE-20 튜빙</td><td>Intramedic</td><td>427405</td><td>Source 유연한</td></tr><tr><td>압력 변환기</td><td>AD 기기</td><td></td><td>Source 유연한</td></tr><tr><td>S & T 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>00632-11</td><td>Source flexible</td></tr><tr><td>Software pressure-volume</td><td>AD Instruments</td><td>Power lab</td><td></td></tr><tr><td>Suture Nylon, 6-0</td><td>AD surgical</td><td>S-N618R13</td><td>Source flexible</td></tr><tr><td>Suture Silk, 6-0</td><td>Deknatel via Braintree Scientific, Inc.</td><td>07J1500190</td><td>소스 플렉시블</td></tr><tr><td>주사기 1 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>소스 플렉시블</td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>소스 플렉시블</td></tr><tr><td>물 순환기</td><td>Baxter</td><td>K-MOD 100</td><td>소스 플렉시블</td></tr></tbody></table>

방광 충진 중 수부에 직접 접근할 수 있도록 제거된 분리기 근육이 있는 분권화된(ex vivo) 뮤린 방광 모델

A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling

이전 연구는 Ussing 챔버에 부착 된 평평한 방광 점막 시트에서 화학 물질의 방출을 확립하고 정수압 변화, 스트레칭, 세포 부종 또는 항력, 충전 말기의 방광 루멘에 따라 정수압 또는 기계적 스트레칭 및 배양 된 비뇨기 세포에서 변화에 노출되었습니다. 그 같은 사실 인정은 이 매개체가 또한 방광 충전 도중 suburothelium (SubU)/lamina propria (LP)에서 풀어 놓인다는 가정으로 이끌어 냈습니다, 어디 그(것)들은 궁극적으로 방광 흥분성을 통제하기 위하여 방광 벽에 깊은 세포에 영향을 미칩니다. 그러한 연구 결과에 있는 적어도 2개의 명백한 한계가 있습니다: 1) 이 접근의 아무도는 SubU/LP에 있는 중재자의 존재에 관하여 직접적인 정보를 제공하지 않으며, 2) 사용된 자극은 생리적이지 않으며 방광의 본격적인 충진을 되풀이하지 않습니다. 여기에서는 방광 을 채우는 과정에서 방광 점막의 지하 표면에 직접 접근 할 수있는 절차에 대해 논의합니다. 우리가 만든 뮤린 detrusor-free 준비는 그대로 방광의 채우기와 밀접하게 유사하고 척추 반사 및 detrusor 평활근에서 혼란스러운 신호가없는 방광에 압력 볼륨 연구를 수행 할 수 있습니다. 새로운 detrusor 자유로운 방광 모형을 사용하여, 우리는 최근에 방광 충전 도중 SubU/LP에서 풀어 놓인 무슨에 대리인으로 중재자의 내측정을 사용할 수 없다는 것을 보여주었습니다. 이 모델은 방광 충전 과정에서 신진 대사에 의해 생성되거나 SubU/LP로 이송되어 방광의 뉴런과 평활근에 정보를 전달하고 요실금 및 분뇨 중 흥분성을 조절하는 비뇨생식기 유래 신호 분자를 검사할 수 있습니다.

뮤린 detrusor 없는 방광 준비의 벽은 손상되지 않으며 DSM과 serosa를 제외한 모든 층을 포함합니다. 원리 증명 연구는 DSM이없는 방광 벽이 투로 신경과 수U / LP를 포함하고 튜니카 근육질및 혈청이 없는 것으로 입증되었습니다(그림 2)13.
방광이 없는 방광을 채우는 것은 정상적인 방광 충진에 가착됩니다. 도 3은 상이한 충진속도, 부피 및 내발광압력에서 생체내 방광 제제를 충진하기 위한 실험 적 설정의 회로도를 나타낸다. 뮤린 ex vivo 그대로 및 디누이드 방광 제제는 무효 압력13에도달하기 위해 충진 부피의 넓은 범위를 필요로한다. ...

detrusor-free 방광 모형은 소변의 저장 그리고 무효화 도중 suburothem/lamina propria에 있는 생물학적으로 활성 매개체 가용성의 규칙에 대한 지역 기계장치를 공부하기 위하여 suburothem에 직접 접근할 수 있습니다. 준비는 밀접하게 손상되지 않은 방광의 채우기를 닮은 및 압력 볼륨 연구는 전신 영향없이 수행 할 수 있습니다.

방광 충진 중 수부에 직접 접근할 수 있도록 제거된 분리기 근육이 있는 분권화된(Ex Vivo) 뮤린 방광 모델

Previous studies have established the release of chemical substances from flat bladder mucosa sheets affixed in Ussing chambers and exposed to changes in ...

제거된 detrusor 근육을 가진 우리의 방광 모형은 방광 보충 도중 lamia propria 및 방광 루멘에 있는 비뇨기과 중재자의 가용성을 동시에 공부하는 새로운 실험적인 접근입니다. 이 모델은 비뇨기운, suburothelium 및 충전 하는 동안 방광 흥분성을 조절 하는 detrusor 근육 사이 신호 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 10섭씨 KBS를 함유한 해부 현미경으로 그대로 소명방 표본을 해부 접시에 넣고 방광 주변의 결합 및 지방 조직을 청소하는 것으로 시작하십시오.외식방의 돔의 작은 부분을 염기부근육의 가장 바깥쪽 가장자리를 통해 SUBurothelium lamia propria를 마주보고 있는 근육의 가장 안쪽 가장자리를 통해 KBS로 채워진 실가드 덮인 해부 접시에 고정하고, 요관과 방광목을 고정하여 방광 준비를 그대로 표시합니다. 미세 한 포셉을 사용하여, 부드럽게 요관과 방광 몸 사이의 모서리에 세로사의 조각을 당기고 투명성을 높이고 detrusor 근육 아래 의 부막의 마진을 구별하기 위해 현미경의 빛을 조절합니다. 준비 벽을 천공하지 않으려면 방광 점막의 측면 가장자리가 명확하게 보이는 동안에만 분리근을 잘라야합니다.미세 기울어진 가위를 사용하여, 조직의 가장자리를 만지는 것을 피하면서 점막의 측면 가장자리를 관찰 할 수있는 준비를 통해 절단 된 부분을 부드럽게 당기면서 분리근 층의 내부 표면을 따라 방광 벽을 자르기 시작합니다. 방광 돔 위에 작은 조각의 분리근을 남겨 서 프로토콜의 나머지 단계에서 고정 될 수 있도록 하 고 37 섭씨 37 섭씨 산소로 20 폴리에틸렌 튜브의 2 센티미터 조각을 채우기 위해. 카테터를 방광 요도의 오리피스에 삽입한 후 카테터 팁이 방광의 대략적인 중앙에 도달할 때까지 카테터를 부드럽게 밀어 넣습니다.그런 다음 이중 루프 6.0 나일론 봉합사로 방광 목의 주변 조직에서 카테터를 고정하십시오. 누출 조직을 확인한 후, 실가드 바닥으로 37도의 물자 켓 오르간 접시에 방광 을 넣고 카테터를 챔버 의 측면에 고정하여 관류 용액의 표면 위로 부동하지 않도록하십시오. 방광 카테터를 3방향 스톱콕과 37°C의 산소로 채워진 주입 주사기에 연결된 폴리에틸렌 20 튜브 조각에 연결하고, 충전 중 내막 압력의 충진량을 모니터링하기 위해 KBS를 돌보는 것으로 방광을 채우기 위해 주입 펌프를 시작합니다.제제의 서브우로테리움 라미나 프로프리아 양내 중재자를 검출하기 위해, 다양한 적절한 실험 시점에서 목욕 용액의 알리쿼트를 수집하고 계획된 다운스트림 분석에 따라 샘플을 처리한다. 방광 준비 벽은 비뇨기과 서브로텔륨을 포함하지만, 분리 부드러운 근육은 없습니다. 압력 볼륨 관계는 손상되지 않고 비설된 준비에서 현저하게 유사합니다.충전 중 서브우루알 라미나 프로프리아 측에서 방출되는 비뇨기류 유래 중재자를 측정하는 모델의 적합성은 퓨린 중재자의 방출을 용액으로 측정하여 시험할 수 있다. 입증된 바와 같이, 그대로 분리된 방광 제제를 함유한 욕조에서 무시할 수 있는 양의 퓨린을 검출할 수 있으며, 이러한 퓨린의 양은 방광 제제를 함유한 욕조에서 수집된 샘플에서 훨씬 더 높습니다. 특히, 충진의 끝에 루멘과 suburothelium lamina propria에서 수집된 견본에 있는 purines 및 대사산물의 분포는 현저하게 다릅니다.ATP의 높은 형광 아날로그아테노 ATP를 첨가하여, 분리기 없는 제제의 서브우로살리알 측에 아테노 ATP의 감소와 아테노 ATP 제품, 아테노 ADP, 아테노 AMP 및 아테노 ADO의 증가를 초래한다. 마찬가지로, 루멘 제제에 아테노 ATP를 첨가하면 아테노 ATP의 감소와 아테노 ADP, 아테노 AMP 및 아테노 아도의 증가가 루멘에서 발생한다. 또한, 아테노 ATP를 서브우로텔륨 라미나 프로프리아 측에 첨가하면 루멘 내의 아테노 AMP 및 아테노 ADO의 출현이 초래되었다.마찬가지로, 루멘에 아테노 ATP를 추가하면 아테노 AMP와 아테노 ADO가 서브로테륨 라미나 프로프리아에 나타난다. 이 절차에 따라, 흥분 및 억제 중재자의 가용성은 방광 충진의 다른 단계에서 라미나 프로프리아와 방광 루멘에서 측정 될 수있다. 중재자의 양자 간 트랜스우레컬 운송 및 중재자의 대사또한이 모델을 사용하여 연구 할 수 있습니다.이 새로운 방광 모형을 사용하여 건강과 질병에서 방광 흥분성을 통제하는 비뇨기과 분리기 평활근 사이 본질적인, 현지 mechanosensitive 신호의 새로운 이해 귀착될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

방광 종양은 catheterization, 지역 소작하고, 화상 사이트에 암종 세포의 후속 유착을 통해 법으로서 방식으로 여성의 생쥐에 설립되었습니다.

Murine 방광 암의 Orthotopic 모델

초음파와 발광 생물 이미징에 의한 intravesically 전달 saRNA 및 모니터링 종양 성장의 antitumor 효과를 평가하는 orthotopic 방광 종양 모델을 수립.

Orthotopic 방광 종양 모델 및 Intravesical saRNA 트리 트먼트의 평가

출처: O'Brien, V. P. 외, 쥐에서 Gardnerella vaginalis의 방광 노출로 유발된 재발성 대장균 요로 감염. J. Vis. Exp. (2020)이 영상은 감염 전 생쥐 모델의 방광 상피에서 박테리아 정착과 숙주-병원체 상호작용을 시각화하기 위해 주사 전자현미경을 사용해 시연합니다.

박테리아 감염 시각화를 위한 마우스 방광 조직 준비

이 비디오에서는 종양 발생에 대한 장기 환경의 역할을 연구하기 위해 배양된 방광 종양 오가노이드를 쥐 방광에 정소성 이식하는 방법을 설명합니다.

방광 종양 오가노이드 모델: 방광 오가노이드를 수용자 쥐 방광에 정소성 이식하는 방법

이 비디오에서는 2단계 순차적 효소 처리를 사용하여 인간 방광 표본에서 배뇨근 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

Detrusor Smooth Muscle Cell Isolation: An Enzymatic Digestion Procedure to Obtain DSM Cells from Human Urinary Bladder Specimens(배뇨근 평활근 세포 분리: 인간 방광 표본에서 DSM 세포를 얻기 위한 효소 소화 절차)

차 침략 동 소성 방광 암 이종 이식을 접종하는 설치 방법은 개복 수술과 방광의 동원을 필요로한다. 이 절차는, 마우스에 상당한 이환율을 입히고 기술적으로 어렵고 시간 소모적이다. 따라서 우리는 경피적 접근 방식은 초음파 안내를 이용하는, 높은 정밀도를 개발했다.

쥐과 동 소성 방광 이종 이식의 최소 침습 설립

미국에서 약 3~8,000,000명은 간질 성 방광염 / 방광 통증 증후군 (IC / BPS), 골반 통증에 의해 부분적으로 특징 쇠약 상태에서 고통. 조건 신경계 기여를 연구하기 위해, 방광 통증의 생리 학적 모델은 생쥐와 쥐에 사용됩니다.

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이 프로토콜의 목표는 척수 손상의 마우스 모델에 최적화된 조직 해리 프로토콜을 적용하고 유동 세포측정에 의한 단일 세포 분석 접근법을 검증하는 것입니다.

척수 손상 다음 마우스에 있는 오줌 방광의 분자 분석을 위한 단 하나 세포 해리 접근

우리는 쥐에서 원추 수질 절개에 의한 배뇨근 과소 활동 모델을 확립하는 방법을 제시합니다. 배뇨근 기능 저하는이 동물들에서 성공적으로 자극되었습니다. 이 모델은 요로 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

원추 수질 절개에 의한 쥐의 배뇨근 과소 모델

이 프로토콜은 관심있는 유전자에 결실을 품고 있는 마우스 비뇨생식기 오가노이드의 생성 및 특성화의 과정을 기술한다. 상기 방법은 마우스 비뇨생식기 세포 수확, CMV 프로모터로 Cre 발현을 유도하는 아데노바이러스를 이용한 생체외 형질도입, 및 시험관내 및 생체외 특성화를 포함한다.

Ex Vivo 마우스 자궁 세포에서 아데노바이러스-Cre 매개 유전자 결실의 오가노이드 모델

배우세요 분리기 근육이 제거된 생체외 뮤린 방광 모델을 이용하여 방광 충진 중 요로상피 매개체의 가용성을 연구하는 방법을. 이 기법은 요로상피와 점막하층의 신호 전달 메커니즘을 분석하는 데 활용됩니다.

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