Name: 약리학적 반응에 유전형과 돌연변이 단면도를 번역하는 공구로 전립선 오르가노이드 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 학습하세요 전립선 오르가노이드 배양을 이용한 약리학적 반응 평가 방법을. 유전형에 따른 약물 반응 차이와 약물 내성 메커니즘을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

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K.P.는 NIH 1F32CA236126-01에 의해 지원됩니다. C.L.S.는 HHMI에 의해 지원됩니다. CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; 스타 암 컨소시엄. W.R.K.는 네덜란드 암 재단 / KWF Buit 2015-7545 및 전립선 암 재단 PCF 17YOUN10에 의해 지원됩니다.

이 프로토콜에 기술된 모든 작업은 이전에 확립된 뮤린 오르가노이드 및 환자 유래 오르가노이드로 수행되었습니다. 모든 동물 작업은 기념 슬로안 케터링 암 센터의 연구 동물 자원 센터의 지침에 따라 수행되었다 (IACUC: 06-07-012). 모든 환자 유래 조직은 기념 슬로안 케터링 암 센터 (IRB: 12001)의 규칙 및 규정을 준수하여 수집되었습니다.
1. 중간 및 버퍼 준비
<ol><li>실험을 시작하기 전에 밤새 4°C에서 지하 멤브레인 매트릭스(예를 들어, 마트리겔)를 해동한다. 사용 중에 얼음에 보관하십시오.</li>
	<li>실험 전에 배양 판을 37°C에서 24시간 동안 놓습니다. 이것은 중합하기 위해 지하 멤브레인 매트릭스 돔 (이하 매트릭스 돔이라고함)을 도울 것입니다. 도금 오르가노이드는 단계 2.1.2에 기재되어 있다.</li>
	<li>확립된 프로토콜5에따라 오르가노이드 배지를 준비한다.</li>
	<li>표피 성장 인자를 첨가하지 않고 오르가노이드 배지를 준비합니다(EGF; 성분에 대한 재료 표 참조). EGF는 AR 전사 출력을 억제하고 항 안드로겐저항성 5를부여한다.</li>
	<li>10% 태아 소 혈청(FBS)으로 덜베코의 수정된 독수리 배지(DMEM)를 준비합니다. 참고: 이 매체는 섹션 2-4에서 트립신 대체와 효소 소화를 억제 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 약물 솔루션을 준비합니다. 엔잘루타미드/mdv3100(이하 2세대 항안드로겐이라고함)의 경우, 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 100 μM의 스톡 용액을 준비한다. 재고는 최대 6 개월 동안 -20 °C에서 보관할 수 있으며 신선하게 만들 필요가 없습니다.</li>
</ol>2. 분리, 효소 소화 및 오르가노이드의 확립
<ol><li>이전에 확립된 프로토콜5,7에따라 마우스 또는 인간 조직으로부터 전립선 오르가노이드를 분리한다. 간략한 설명은 아래에 제공됩니다.<ol>
<li>단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 전립선 조직을 효소적으로 다이제스트합니다. 본 실험에서, ADMEM/F12에서 5 mg/mL 콜라게나아제 타입 II의 1 mL을 전립선 조직의 50 mg의 소화에 사용하였다.</li>
		<li>5 분 동안 300 x g에서 원심 분리하여 세포를 수집하고, 세포를 계산하고, 지하 막 매트릭스에서 재중단하고, 예온 된 오르가노이드 배양 판에 매트릭스 돔에서 적절한 밀도5,7에서 플레이트 (도금) 메서드는 그림 1A에나와 있습니다.</li>
		<li>돔이 완전히 덮여 있도록 돔의 상단에 미디어를 추가하고 고체화할 수 있도록 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하류 응용 프로그램에 대 한 원하는 수량으로 오르가노이드를 성장. 셀 번호는 표준 계수 방법에 의해 결정될 수 있습니다. 밀도에 대한 자세한 내용은 프로토콜의 응용 프로그램별 섹션을 참조하십시오.</li>
	<li>P1000 파이펫을 사용하여 매체와 파이펫을 위아래로 그려 방해합니다. 지하 멤브레인 매트릭스가 완전히 중단되면 현탁액을 15 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김을 전달합니다. 단일 15 mL 원엽 튜브 당 10 개 이상의 돔을 배치하지 마십시오. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>상한을 끄고 PBS 5 mL로 셀 펠릿을 씻습니다. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>상급을 벗고 트립신 교체의 4 mL에 펠릿을 다시 일시 중단. 37 °C에서 흔들어 5-10 분 동안 소화. 트립신 대체를 억제하기 위해 동일한 부피의 오르가노이드 배지 + 10% FBS를 추가합니다. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>상급을 끄고 PBS의 1 mL에서 다시 일시 중단하십시오.</li>
	<li>40 μm 필터로 현탁액을 걸터 단일 셀 현탁액을 보장합니다. 혈세포계 또는 이에 상응하는 계수 장치를 사용하여 셀 번호를 정량화합니다. 참고: 실행 가능한 단일 셀을 얻는 것이 어려운 경우 흐름 정렬을 사용하여 단일 셀 솔루션을 얻습니다.</li>
</ol>3. 오르가노이드 형성 능력 평가
참고 : 오르가노이드를 생성 할 수있는 세포의 비율을 결정하기 위해, 종자 분석은 줄기 / 전구 잠재력에 대한 프록시로 수행 될 수있다. 오르가노이드 형성 능력은 또한 생존 성 세포 에 대한 세포 파종 수를 정의하는 데 중요하다.
<ol><li>10 μM Rho 키나아제 억제제 Y-27632를 함유하는 오르가노이드 배지를 사용하여 현탁액의 10 μL당 2.7~ 100개의 세포에서 수득된 세포 현탁액을 희석시켰다.</li>
	<li>1,100 개의 세포 (현탁액 110 μL)를 새로운 원유 관으로 옮니다.</li>
	<li>지하 멤브레인 매트릭스 285 μL을 추가하고 세포를 다시 일시 중단합니다. 이것은 ~ 70 % 매트릭스 농도를 초래할 것이다. 참고 : 시딩 동안 지하 막 매트릭스의 희석은 단백질 매트릭스의 점도에 의한 돔 크기의 변화를 크게 감소시킵니다.</li>
	<li>미리 데운 24 웰 플레이트에서 매트릭스 돔의 35 μL의 종자 세포는 200 개의 세포 / 웰을 초래합니다. 플레이트 3-5는 샘플당 복제됩니다(도 1A 및 2.1.2 단계에서도 도금 방법 참조).</li>
	<li>세포가 매트릭스 돔 내에 남아 있는지 확인하려면 플레이트를 뒤집어 셀 인큐베이터에 배치하여 지하 멤브레인 매트릭스를 고형화하십시오.</li>
	<li>10분 후, 인큐베이터로부터 플레이트를 제거하고 로키나아제 억제제 함유 배지를 첨가한다.</li>
	<li>2일마다 매번 매체를 새로 고칩니다. 7 일 후, 오르가노이드의 수를 정량화하십시오. 실험 전반에 걸쳐 로키나아제 억제제들을 매체에 보관하였다.</li>
	<li>돔 당 설립 된 오르가노이드의 수를 계산하고 도금 된 세포의 총 수 (200 세포)에서 형성 된 오르가노이드의 백분율을 계산합니다. 참고 : 유기 성 설립 비율은 세포 유형과 유전자형에 따라 3 %-60 %에서 다릅니다.</li>
</ol>4. 오르가노이드의 약리학적 반응 결정
<ol><li>2.7단계에서 계속, 매트릭스 돔에서 종자 1,000-10,000 셀. 최종 세포 수를 결정하기 위한 대리자로서 오르가노이드 형성 효율 및 성장 속도를 이용한다. 참고: 권장 되는 셀 번호는 표 1에제공 됩니다. 분석당 조건당 3~5개의 복제를 사용합니다. 최종 농도 70% 지하 멤브레인 매트릭스를 사용하여 점도에 의해 유발되는 파이펫팅 오류를 줄입니다.</li>
	<li>종자 35 μL의 매트릭스 돔은 24웰 플레이트에서 및 3절에서 행해진 것처럼 돔이 고형화하게 한다(도 1A 및 2.1.2단계에서도 도금 방법 참조). 선택의 로키나아제 억제제 및 약물을 함유하는 배지를 추가한다. 이 방법은 모든 약물에 적용될 수 있지만, 이 프로토콜에서는, 2세대 항안드로겐이 예를 들어 10 μM에서 사용된다. 반 최대 억제 농도 (IC50)를 결정하려면 log10 증분을 수행하고 대조군으로 약물이 용해된 차량을 사용하십시오.</li>
	<li>배지를 2~3일마다 새로 고치고 7일째에 오르가노이드를 분석하여 약물의 약리학적 반응을 확인한다. 타임 포인트는 실험 및 약물의 선택에 따라 다를 수 있습니다. 참고 : 오르가노이드는 이러한 분석을 수행하기 위해 트립시니화 될 필요가 없습니다.</li>
	<li>오간노이드를 그대로 유지하려면 P1000 파이펫을 사용하여 중간 및 파이펫을 위아래로 그려 지하 멤브레인 매트릭스를 방해합니다.</li>
	<li>지하 멤브레인 매트릭스가 완전히 중단되면 현탁액을 15 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김을 전달합니다. 15 mL 원엽 튜브당 10개 이상의 매트릭스 돔을 전송하지 마십시오.</li>
	<li>300 x g에서 5 분 동안 원심 분리. 상류를 뽑고 PBS 5 mL로 씻으하십시오.</li>
	<li>PBS의 1 mL에 오르가노이드를 다시 중단하고 삼각과 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 오르가노이드를 방해합니다.</li>
	<li>오르가노이드 조각의 수를 정량화합니다. 시드 5는 단계 2.1.2에 기재된 바와 같이 100개의 오르가노이드 단편을 포함하는 복제한다.</li>
	<li>7항에 기재된 바와 같이 세포 생존성 분석기를 수행한다.</li>
</ol>5. 오르가노이드로부터의 RNA 분리
참고: 시판되고 있는 컬럼 기반 방법은 RNA의 양과 품질을 양호하게 산출합니다. 양호한 RNA를 보장하려면 샘플당 최소 1개의 돔을 사용하십시오. 그러나 3 개의 돔을 사용하는 것이 좋습니다.
<ol><li>ß-메르카포에탄올 추가 (1%) RNA 절연 키트에서 글루타티온 용해 완충제에.</li>
	<li>오르가노이드가 함유된 지하 멤브레인 돔에서 배지를 끄고 이 완충액의 750 μL을 추가합니다. P1000 파이펫을 사용하여 위아래로 파이펫을. 모든 지하 멤브레인 매트릭스가 용해되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>70% 에탄올 750 μL을 추가하고 파이펫팅으로 혼합합니다. 이어서 혼합물의 700 μL을 컬럼으로 옮기고, 1분 동안 12,000 x g에서 원심분리기를 넣고, 나머지 용해액을 반복한다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 스와시 및 온컬럼 DNase 처리를 수행하십시오. RNA가 없는 물 30-50 μL에서 RNA를 용출합니다.</li>
	<li>OD = 260 nm 및 280 nm에서 형광계를 사용하여 농도를 측정하고 -80 °C에서 저장하거나 다운스트림 응용 프로그램을 계속하십시오.</li>
</ol>6. 오르가노이드로부터의 단백질 분리
참고 : 단백질 분리를 위해 인산염 및 프로테아제 억제제가 함유 된 표준 RIPA 버퍼를준비하십시오 (재료 표). 적어도 세 개의 돔을 사용하는 것이 좋습니다, 이는 하나의 12 잘시드 할 수 있습니다.
<ol><li>P1000 파이펫을 사용하여 오르가노이드와 파이펫이 포함된 지하 멤브레인 돔으로 셀에서 배지를 끌어올려 지하 멤브레인 매트릭스를 방해합니다.</li>
	<li>완전히 중단되면 현탁액을 15 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 완전히 깨뜨리십시오. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>상한을 벗고 얼음으로 차가운 PBS 5 mL로 씻으하십시오. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>상급을 벗고 트립신 교체의 4 mL에 펠릿을 다시 일시 중단. 37°C에서 흔들면서 5-10분 동안 소화합니다.</li>
	<li>트립신 교체를 억제하기 위해 동일한 부피의 오르가노이드 배지 + 10% FCS를 추가합니다. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기. 참고 : 원심 분리 후, 지하 멤브레인 매트릭스는 펠릿에 표시되어서는 안됩니다.</li>
	<li>상한을 벗고 얼음으로 차가운 PBS 5 mL로 씻으하십시오. 상온액을 뽑아 P1000 파이펫을 사용하여 300 μL의 용해 버퍼에서 세포 펠릿을 다시 중단한 다음 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브로 옮김을 옮김을 옮김.</li>
	<li>얼음에 10 분 동안 배양한 후 4 °C의 온도로 냉각수에서 각각 30 s에 대해 2 x를 초음파 처리합니다. 튜브를 다시 얼음 위에 놓고 표준 방법을 사용하여 단백질 정량화를 수행합니다.</li>
	<li>로딩 염료를 함유하는 도데실 황산나트륨(SDS)을 첨가하여 단백질을 변성시키고 95°C에서 5분간 끓인다. -80°C에서 용해하거나 다운스트림 어플리케이션을 계속 보관하십시오.</li>
</ol>7. 오르가노이드를 가진 세포 생존성 분석
참고: 시판되는 세포 생존력 분석 키트 및 발광계를 사용하여 세포 생존가능성을 평가할 수 있다. 제조업체의 지침에 따라 버퍼를 준비합니다. 조건당 5개의 복제가 권장됩니다: 1개의 복제는 24개의 웰 플레이트 의 한 웰에 35 μL 지하 막 매트릭스 돔으로 이루어져 있습니다.
<ol><li>매트릭스 돔을 그대로 두지 않도록 주의하면서 오르가노이드 배양의 매체를 빼내십시오.</li>
	<li>65 μL의 PBS와 파이펫을 위아래로 추가하여 매트릭스 돔을 방해합니다.</li>
	<li>세포 생존성 분석 키트 버퍼의 100 μL을 추가하고 파이펫팅에 의해 다시 중단합니다.</li>
	<li>실온(RT)에서 10분 동안 흔들어 서 배양합니다.</li>
	<li>100 μL의 혼합물을 발광계에 적합한 비반투명 플레이트로 옮기고 세포 생존 성 분석 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 판독을 수행합니다.</li>
</ol>8. 이종이식을 위한 오르가노이드 의 준비
참고: 오르가노이드는 면역이 손상된 동물뿐만 아니라 등인성 마우스모두에서 피하 이식을 할 수 있습니다. 주입된 오르가노이드가 생체 내에서 구별될 수 있도록, 구성적으로 플루오로포어를 발현하는오가노이드를 라벨 5. 이식 효율이 오르가노이드 라인마다 다르기 때문에 주사 당 5 x 105 세포에서 2 x 106 셀을 사용하여 이식하는 파일럿 실험을 수행하는 것이 좋습니다.
<ol><li>P1000 파이펫을 사용하여 중간 및 파이펫을 위아래로 끌어올려 지하 멤브레인 매트릭스를 방해합니다. 완전히 중단되면 현탁액을 15 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 완전히 깨뜨리십시오. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기. 참고: 원유관 당 10개 이상의 매트릭스 돔을 전송하지 마십시오.</li>
	<li>상급을 끄고 PBS 5 mL로 씻으하십시오. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>상급을 벗고 트립신 교체의 4 mL에 펠릿을 다시 일시 중단. 37°C에서 흔들면서 5-10분 동안 소화합니다.</li>
	<li>트립신 대체를 억제하기 위해 동일한 부피의 오르가노이드 배지 + 10% FBS를 추가합니다. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>상급을 끄고 PBS의 1 mL에서 다시 일시 중단하십시오. 40 μm 필터로 현탁액을 걸터 단일 셀 현탁액을 보장합니다. 표준 방법을 사용하여 셀을 정량화합니다.</li>
	<li>PBS + Rho 억제제에서 세포를 100 μL당 2 x 106 셀의 농도로 스핀 다운하고 다시 중단합니다(다양한 농도에 필요한 세포 농도 및 절대 세포 수에 대한 표 2 참조). 동일한 부피의 지하 멤브레인 매트릭스를 사용하여 1:1 서스펜션을 생성합니다. 얼음에 서스펜션을 놓습니다.</li>
	<li>표준 프로토콜에 따라 세포를 주입하고 표준 방법을 사용하여 이종이식 성장을 모니터링8.</li>
</ol>

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<li>Schutgens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubuloids+derived+from+human+adult+kidney+and+urine+for+personalized+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling.</a> Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. , 1-25 (2017).</li>
</ol>

C.L.S는 노바티스 의 이사회에서 활동하고 있습니다. ORIC 제약의 공동 창립자이며 엔잘루타미드와 아팔루타미드의 공동 발명가입니다. Agios, 베이진, 블루프린트, 컬럼 그룹, 포그혼, 하우스 제약, 넥스트에치, KSQ, 페트라 및 PMV에 대한 과학 고문입니다. 2014년 제넨텍/로슈가 인수한 세라곤의 공동 창업자입니다. W.R.K.는 오르가노이드 기술의 공동 발명가이자 특허 보유자입니다.

항 안드로겐 저항의 근본적인 분자 기계장치를 이해하고 잠재적인 치료 취약성을 발견하려면 전립선암을 모방한 모델 시스템에서 약리학적 반응을 테스트해야 합니다. 여기서 설명된 상세한 프로토콜은 환자 유래 및 유전자 조작 전립선 오르가노이드및 다운스트림 애플리케이션을 위한 이러한 오르가노이드 샘플의 제조에서 약리학적 반응의 신뢰할 수 있는 분석을 위한 상세한 프로토콜이다.
이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 오르가노이드의 종자 효율 및 성장 속도를 결정하는 것입니다. 오르가노이드 성장 속도는 크게 다릅니다. 이것은 인간 유래 오르가노이드보다는 약 2 배 빨리 성장하기 때문에, 종에 의존합니다. 종을 제외하고 성장 속도는 유전자형과 표현형에 달려 있습니다. 그러나, 시딩 효율 및 성장 속도가 결정되면, 이 프로토콜은 모든 전립선 오르가노이드 유형에 적응될 수 있다.
두 번째 중요한 단계는 후속 다운스트림 애플리케...

약물 내성은 암 치료의 주요 임상 문제 중 하나입니다. 전이성 전립선암 (PCa) 치료는 주로 안드로겐 신호 전달 축을 지향한다. 차세대 항안드로겐 치료법(예: 엔잘루타미드 및 아비라테론)은 임상적으로 큰 성공을 보였지만, 사실상 모든 PCa는 결국 안드로겐 독립 국가 또는 거세 저항성 전립선암(CRPC)으로 진행됩니다.
CRPC의 최근 게놈 및 전사체 프로파일링은 전립선암에 내성의 세 가지 일반적인 메커니즘이 밝혀: 1) 안드로겐 수용체 (AR) 신호의 복원의 결과로 돌연변이를 활성화1; 2) 글루코코르티코이드 수용체(GR)의 활성화가 AR 신호전달의 손실을 보상할 수 있는 차세대 항안드로겐 치료 저항에 대한 전임상 모델에서 예시된 바와 같이 바이패스 신호전달의활성화2; 및 3) 종양 세포가 약물 표적에 의존하는 세포 유형에서 이에 의존하지 않는 다른 세포 유형으로 혈통을 전환하여 내성을 획득하는 계보 가소성의 최근 확인된 과정 (PCa에서 AR 음성으로 표현됩니다). 및/또는 신경 내분비 질환 [NEPC])3,4. 그러나 약물 내성을 유발하는 분자 메커니즘은 이해되지 않습니다. 더욱이, 취득한 반대로 안드로겐 저항은 악용될 수 있는 치료 취약점으로 이끌어 낼 수 있습니다. 따라서 환자 표현형 및 유전자형을 모방하는 모델 시스템에서 약물 반응을 평가하는 것이 필수적입니다.
전립선 오르가노이드는 정의된 배지를 가진 3D 단백질 매트릭스에서 성장한 오르가노티컬 배양체이다. 중요한 것은, 전립선 오르가노이드는 뮤린 또는 인간 기원의 양성 및 암 조직에서 확립 될 수 있으며, 그들은생체5,6에서발견되는 자형질 및 지질 학적 특징을 유지한다. 중요한 것은, 항안드로겐 에 민감한 PCa 및 CRPC 세포는 모두 오르가노이드의 현재 보상에서 표현된다. 또한, 전립선 오르가노이드는 CRISPR/Cas9 및 shRNA5를사용하여 쉽게 유전자 조작됩니다. 따라서, 전립선 오르가노이드는 약물 반응을 테스트하고 내성 메커니즘을 해명하기 위한 적합한 모델 시스템이다. 여기서, 상세한 프로토콜은 약물 검사를 수행하고 전립선 오르가노이드를 사용하여 약리학적 반응을 분석하기 위해 기술된다.

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>오가노이드 배지 성분: 최종 농도 200nM</td></tr><tr><td>ADMEM/F12</td><td>Gibco/Life technologies</td><td>12634028</td><td>오가노이드 배지 성분</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco/Life technologies</td><td>17504-044</td><td>오가노이드 배지 성분</td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트</td><td>Fisher</td><td>657185</td><td></td></tr><tr><td>Cell Titer Glo</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>DHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-073</td><td>오가노이드 배지 성분: 최종 농도 1 nM</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>오가노이드 배지 성분: 최종 농도 마우스의 경우 50ng/ml, 인간의 경우 5ng/nl</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>인간 특이적 오가노이드 배지 성분: 최종 농도 10 ng/ ml</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>인간 특이적 오가노이드 배지 성분: 최종 농도 5ng/ml</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco/Life technologies</td><td>35050079</td><td>오가노이드 배지 성분</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>made in-house</td><td>n/a</td><td>오가노이드 배지 성분: 최종 농도 10mM</td></tr><tr><td>Matrigel (Growth factor reduced & Phenol Red free)</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td>오가노이드 배지 성분</td></tr><tr><td>N-아세틸시스테인</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9165</td><td>오가노이드 배지 성분: 최종 농도 1.25mM</td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>N0636</td><td>인간 특이적 오가노이드 배지 성분: 최종 농도 10mM</td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>Peprotech 또는 Noggin 구조체로 안정적인 형질 주입된 293t 세포(Karthaus et al. 2014)</td><td>120-10C</td><td>오가노이드 배지 성분 : 최종 농도 10 % 조절 배지 또는 100 ng / ml</td></tr><tr><td>페니실린 / 스트렙타비딘</td><td>제미니 바이오 제품</td><td>400-109</td><td>오가노이드 배지</td></tr><tr><td>성분 포스 파타제 억제제</td><td>Merck Millipore</td><td>524629</td><td></td></tr><tr><td>프로스타글란딘 E2</td><td>Tocris</td><td>3632464</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제</td><td>Merck Millipore</td><td>539131</td><td></td></tr><tr><td>R-SPONDIN</td><td>Peprotech 또는 R-Spondin1 구조체를 사용한 안정적인 형질 주입 293t 세포(Karthaus et al. 2014)</td><td>120-38</td><td>오가노이드 배지 성분: 최종 농도 10% 조건 배지 또는 500ng/ml</td></tr><tr><td>RIPA 완충액</td><td>Merck</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>RNA-easy minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=152121-30-7&amp; 인터페이스=CAS%20No.& 언어=ko& 지역=US& focus=product">152121-30-7</a></td><td>인간 특이적 오가노이드 배지 성분: 최종 농도 10 &mu; M</td></tr><tr><td>TryplE</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td>오가노이드 매체 성분: 최종 농도 10 &mu; 미디엄</td></tr></tbody></table>

약리학적 반응에 유전형과 돌연변이 단면도를 번역하는 공구로 전립선 오르가노이드 문화

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

여기에 제시된 프로토콜은 전립선 상피 오르가노이드에서 약력학, 줄기 세포 전위 및 암 분화를 연구하는 프로토콜이다. 전립선 오르가노이드는 안드로겐 반응형 3차원(3D) 배양체로 전립선 피상과 유사한 정의된 배지에서 성장합니다. 전립선 오르가노이드는 야생 형 및 유전자 조작 마우스 모델, 양성 인간 조직 및 고급 전립선 암에서 확립 될 수 있습니다. 중요한 것은, 환자 유래 오르가노이드는 유전학과 생체 내 종양 생물학에 있는 종양을 밀접하게 닮습니다. 또한, 오르가노이드는 CRISPR/Cas9 및 shRNA 시스템을 사용하여 유전자 조작이 가능합니다. 이 통제된 유전학은 약리학적인 반응에 유전형 그리고 돌연변이 단면도의 효력을 급속하게 시험하기 위한 단장으로 오르가노이드 문화를 매력적으로 만듭니다. 그러나, 실험 프로토콜은 재현 가능한 결과를 얻기 위하여 오르가노이드 문화의 3D 본질에 구체적으로 적응되어야 합니다. 여기서 설명된 것은 오르가노이드 형성 능력을 결정하기 위한 시딩 분석을 수행하기 위한 상세한 프로토콜이다. 그 후, 이 보고는 생존력 측정, 단백질 격리 및 RNA 격리를 통해 약물 치료를 수행하고 약리학적 반응을 분석하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 프로토콜은 피하 이식을 사용하여 이종이식 및 후속 생체 내 성장 분석에 대한 오르가노이드를 준비하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 매우 재현 가능한 데이터를 생성하며 3D 문화 시스템에 널리 적용됩니다.

시딩 효율 유기체 형성 능력은 표현형 및 유전자형에 의해 결정됩니다. 야생형(WT) 전립선 기저세포는 우수한 오르가노이드 형성 능력(30%-40%)을 보였다. 발광 세포 (3%)에 비해 (그림1A). 오르가노이드 설립 후, 형성 능력이 급격히 증가했습니다. 전형적으로, WT 오르가노이드로부터 유래된 세포의 25%-30%는 새로운 오르가노이드를 형성할 수있다(도 1B). CRISPR/Cas9 매개 Pten (PtenΔ/Δ)또는 p53 (p53Δ/Δ)의손실은 오르가노이드 형성 능력의 경미한 증가를 초래했다. p53 및 Pten의 손실은 더 증가된 형성 용량을 증가시킵니다(도1<str...

여기에 제시된 것은 전립선 상피 오르가노이드의 약리학적 반응을 연구하는 프로토콜이다. 오르가노이드는 생체 생물학과 밀접하게 유사하며 환자 유전학을 재현하여 매력적인 모델 시스템을 만듭니다. 전립선 오르가노이드는 야생형 전립선, 유전자 조작 마우스 모델, 양성 인간 조직 및 고급 전립선암에서 확립될 수 있습니다.

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

이 프로토콜은 전립선 오르가노이드 배양에서 약리학적 반응을 평가하는 표준적이고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 전립선 오르가노이드 배양은 세포가 지하 막 매트릭스에서 3차원 구조를 채택할 수 있도록 함으로써 생체 내 생물학 및 약리학적 반응의 많은 측면을 보존하는 체외 시스템을 제공합니다. 우리는 특히 유전자형이 전립선에서 약리학적 반응을 지시하는 방법을 평가하고 약물 내성을 모델링하기 위해 이러한 방법을 사용하는 것에 대해 매우 기쁘게 생각하고 있습니다.이러한 방법은 돔 도금 방법을 사용하는 오가노이드 배양 시스템에 적용될 수 있다. 그러나, 성장인자 등의 매체의 성분은 조직 유형에 따라 다를 수 있다. 시각적 데모는 프로토콜 단계와 연구자가 사용할 수있는 다른 많은 출판 된 오르가노이드 문화 시스템과 어떻게 다른지에 대한 보다 구체적이고 상세한 토론을 할 수 있습니다.오르가노이드 배양은 전형적으로 2차원 세포 배양보다 시간이 더 많이 소요된다. 이러한 메서드에 대한 추가 시간을 할당해야 합니다. 마우스 또는 인간 조직에서 전립선 오르가노이드를 분리하여 시작합니다.단 하나 세포 현탁액을 생성하기 위하여 조직을 mince 및 효소로 소화한 다음 5 분 동안 300 배 g에서 원심분리에 의해 세포를 수집합니다. 세포를 계산하고 지하 막 매트릭스에서 다시 중단합니다. 그런 다음 미리 따뜻워진 오르가노이드 배양 판에 매트릭스 돔에서 적절한 밀도로 플레이트를 놓습니다.돔은 서로 떨어져 있고 우물의 측면에서 2 밀리미터여야합니다. 일단 고형화되면 매트릭스를 방해하지 않도록 우물 옆에서 미디어를 부드럽게 추가합니다. 돔이 굳어진 후 돔 위에 미디어를 추가하여 완전히 덮어두게 합니다.표준 계수 방법으로 셀 수를 결정하는 다운스트림 응용 프로그램에 대해 원하는 수량으로 오르가노이드를 증가시면 됩니다. 오르가노이드를 사용할 준비가 되면 Pten00 파이펫으로 매체를 작성하고 파이펫을 위아래로 사용하여 지하 막 매트릭스를 방해합니다. 서스펜션을 15밀리리터 원물 튜브와 원심분리기로 5분 간 300배 g로 옮긴다.슈퍼 나티퍼를 흡인하고 PBS의 5 밀리리터로 셀 펠릿을 씻으십시오. 원심분리를 반복한 다음, 펠릿을 트립신 교체의 4밀리리터로 재연한 다음 섭씨 37도에서 흔들면서 5~10분 동안 소화할 수 있도록 합니다. 10%의 FBS로 동일한 양의 오르가노이드 배지를 추가하여 트립신 교체를 억제하고 5분 동안 300배 g의 원심분리기를 사용한다.슈퍼 나티퍼를 흡인하고 PBS의 1 밀리리터에서 세포를 재일시 중단합니다. 그런 다음 세포를 40 마이크로미터 필터로 변형하여 단일 세포 현탁액을 보장하고 혈종계를 사용하여 셀을 계산합니다. 10 마이크로몰러 로 키나제 억제제 Y27632와 함께 오르가노이드 배지를 사용하여 10 마이크로리터 당 100 세포로 세포 현탁액을 희석시 희석시.새로운 원물 튜브에 1, 100 세포를 전송하고 70 %의 매트릭스 농도를 초래할 것이다 지하 막 매트릭스의 285 마이크로 리터를 추가합니다. 다음으로, 미리 따뜻진 24웰 플레이트에서 매트릭스 돔의 35 마이크로리터에 세포를 시드하여 샘플당 3~5개의 복제를 플레이트에 플레이트에 놓습니다. 플레이트를 뒤집어 셀 인큐베이터에 배치하여 지하 매트릭스를 고화시합니다.10분 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 로 키나아제 억제제가 함유된 배지를 추가합니다. 2일마다 배지를 새로 고치고 7일 후에돔에 설정된 오르가노이드의 수를 계산하고 총 세포 수에서 형성된 오르가노이드의 백분율을 계산합니다. 앞서 설명한 바와 같이 오르가노이드를 격리한 후, 종자 1, 000 에서 100, 000 세포는 최종 세포 수를 결정하기 위한 프록시로서 오르가노이드 형성 효율 및 성장 속도를 사용하여 매트릭스 돔에서 종자 1, 000 에서 100 세포.그런 다음 24 웰 플레이트에 매트릭스 돔의 35 마이크로 리터를 씨앗과 돔이 고화하자. 로 키나제 억제제 및 선택 약물을 함유하는 배지를 추가합니다. 로그(10)를 증분하여 약물이 대조군으로 용해된 차량을 사용하여 반 최대 억제 농도를 결정한다.매 2~3일마다 배지를 새로 고치고 7일째에 오르가노이드를 분석하여 원고에 설명된 바와 같이 세포 생존성 분석을 수행하여 약물에 대한 약리학적 반응을 결정한다. 트립시화 없이 오르가노이드 조각을 플레이트하려면 Pten00 파이펫을 사용하여 중간 및 파이펫을 위아래로 흡인하여 지하 막 매트릭스를 방해합니다. 매트릭스가 완전히 중단되면 서스펜션을 15 밀리리터 원물 튜브및 원심분리기로 5분 동안 300배 g로 옮긴다.슈퍼네티를 흡인하고 PBS의 5 밀리리터를 추가합니다. 세척 후, PBS의 1 밀리리터로 오르가노이드를 다시 중단하고 유리 파스퇴르 파이펫으로 트리튜레이션으로 오르가노이드를 방해합니다. 이전에 설명한 바와 같이 100개의 조각으로 복제된 오르가노이드 조각과 종자 5의 수를 정량화한다.7 일 후, 원고 방향에 따라 세포 생존 성 분석작업을 수행한다. 야생형 전립선기세포는 발광세포에 비해 우수한 오르간구형성을 보였다. 바구지 형성의 사소한 증가는 CRISPR-Cas9 매개 펜 또는 P53의 손실과 추가 증가 된 형성 용량의 손실로 달성되었다.성장에 항 안드로겐 분자의 효과 다른 유전자형을 가진 뮤린 오르가노이드에서 테스트 되었다. P53의 손실은 항 안드로겐 분자에 저항을 일으키지 않았다, 하지만 Pten의 손실 증가 저항. 그러나 P53과 Pten의 이중 손실은 완전한 저항을 초래했습니다.안드로겐 수용체 억제는 또한 표현형을 변경했습니다. 야생형 Pten 삭제 및 P53 삭제 된 오르가노이드는 오르가노이드 루멘 크기의 감소를 입증했으며 Pten과 P53모두의 손실을 입은 오르가노이드는 일반적으로 영향을받지 않았습니다. 예상대로, 이 세포가 측면에 피하로 이식되었을 때, 이중 삭제 된 Pten 및 P53 오르가노이드만 증가했습니다.2개의 명백한 인간적인 전립선암 오르간성 MSKPCA2 및 MSKPCA3는 항 안드로겐 분자에 그들의 반응을 위해 시험되었습니다. MSKPCA2 오르가노이드의 증식은 MSKPCA3 오르가노이드가 영향을 받지 않은 반면 강하게 억제되었습니다. MSKPCA2는 안드로겐 수용체와 FKBP5뿐만 아니라 특징 발광 단백질의 높은 수준을 표현했다.MSKPCA3는 또한 기저 및 중간엽 마커를 표현하고 FKBP5의 아무 표현도 보여주지 않으며, 이러한 오르가노이드가 비 발광 안드로겐 독립적 표현형을 모델링한다는 것을 시사한다. 오르가노이드는 실행 가능한 유지하기 위해 유리 파이펫으로 트립시화 또는 트리튜팅에 의해 주기적으로 중단될 필요가 있습니다. 주파수는 종 기원과 유전자형에 따라 달라집니다.모든 유형의 차세대 염기서열 분석 또는 프로테오믹스 실험은 설명된 절차에 따라 수행될 수 있다. 이 실험은 표현형 및 약리학적 반응의 분자 기초를 조사할 것입니다. 이 3 차원 오르가노이드 배양 기술은 연구원이 체외에서 고도로 통제된 유전 적 맥락에서 약리학적 반응을 연구할 수 있게 합니다.이것은 생체 내 연구에서 긴 에 대한 신뢰할 수있는 대안이 될 수 있습니다.

prostate-organoid-cultures-as-tools-to-translate-genotypes-mutational

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

여기, 우리 인간의 기본 전립선 organoid 처리 안내 다음 끝점 표현 형을 평가 하는 것이 좋습니다 프로토콜을 제시. 시드, 문화 유지 보수, 매트릭스 젤에서 복구 형태 론 적 정량화, 포함 및 단면, FFPE 단면, 전체 마운트 얼룩, 및 상업적인 분석의 응용 프로그램 설명 합니다.

처리 및 인간의 기본 전립선 Organoid 문화에 대 한 평가

우리는 전립선 종양 해부에 초점을 맞춘 마우스 전립선 암 모델의 부검 및 해부를위한 방법을 보여줍니다. 마우스 전립선 종양 오르가노이드의 생성을 위한 단계별 프로토콜도 제시된다.

전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성

마우스 전립선 오르가노이드는 분화를 조절하는 메커니즘을 평가하는 유망한 맥락을 나타낸다. 이 논문은 전립선 오르가노이드를 확립하기 위한 개선된 접근법을 설명하고, (1) 오르가노이드로부터 단백질 용해액을 수집하고, (2) 전체 마운트 공초점 현미경검사법에 대한 수정 및 얼룩 오르가노이드를 수집하는 방법을 소개합니다.

유기체 배양을 사용하여 마우스 전립선 상피 세포의 분화 능력 평가

환자 BMPC 견본및 뼈 전이성 전립선암의 이종이식의 3차원 배양은 낭종, 스페로이드 및 복잡한, 종양 같이 organoids의 결과로 그들의 본래 종양의 기능적인 이질성을 유지합니다. 이 원고는 IFC를 사용하여 이기종 환자 유래 샘플 및 이들의 분석의 3D 배양에 대한 최적화 전략 및 프로토콜을 제공한다.

환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석

이 프로토콜은 NSCLC 환자 유래 오가노이드 모델에서 표적화된 신호전달 억제제에 대한 약물 민감성의 표준화된 평가를 기술한다.

EGFR 돌연변이 NSCLC 환자 유래 오가노이드에서 표적 치료법에 대한 민감도 프로파일링

이 프로토콜은 종양 내 이질성을 포착하기 위해 다중 매개변수, 단일 오가노이드 약물 반응을 정량화하고 시각화하기 위한 중간 및 고처리량 오가노이드 약물 스크리닝 및 현미경에 구애받지 않는 자동 이미지 분석 소프트웨어를 위한 반자동 방법을 설명합니다.

벌크 및 단일 오가노이드 분석을 위한 광시야 라이브 셀 이미징을 사용한 다중 파라미터 종양 오가노이드 약물 스크리닝

환자 유래 유방 종양 절제술 또는 정상 유방 조직에서 인간 유방 오가노이드를 확립하기 위한 자세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 이 프로토콜은 인간 환자 유래 유방 오가노이드의 배양, 동결 및 해동에 대한 포괄적인 단계별 지침을 제공합니다.

환자 유래 유방 오가노이드의 확립 및 배양

종양 오가노이드는 암 연구와 개인 맞춤형 의학에 대한 접근 방식에 혁명을 일으켰습니다. 이는 임상적으로 관련성이 높은 종양 모델을 나타내며 이를 통해 연구자들은 임상에서 종양보다 한 발 앞서 나갈 수 있습니다. 이 프로토콜은 신선한 췌장 종양 조직 샘플과 췌장 선암 기원의 환자 유래 이종이식에서 종양 오가노이드를 확립합니다.

췌장암 유래 종양 오가노이드 및 섬유아세포를 신선한 조직에서 확립

전립선암 이질성과 치료 저항성은 여전히 과제로 남아 있습니다. 우리는 주요 부모 종양 특성을 보존하는 환자 유래 오가노이드(PDO)를 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 표준화된 모델은 약물 스크리닝 및 정밀 의학 발전을 지원합니다.

환자 유래 전립선암 오가노이드의 확립 및 유지: 상세한 실험 프로토콜

이 프로토콜은 2D에서 성장된 쥐 전립선 오가노이드 기반 모델 생성을 설명합니다. 이 과정에는 오가노이드 해리, 세포 시딩, 분화, 상피 완전성 평가, 그리고 요로병원성 대장균에 의한 시험관 내 감염이 포함됩니다. 이 모델은 끝부분 접근성을 제공하며 숙주-병원체 상호작용 연구에 적합하여 전통적인 3D 오르가노이드 시스템의 한계를 극복합니다.

숙주-병원체 상호작용 연구를 위한 마우스 전립선 오가노이드 기반 모델 생성

학습하세요 전립선 오르가노이드 배양을 이용한 약리학적 반응 평가 방법을. 유전형에 따른 약물 반응 차이와 약물 내성 메커니즘을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

약리학적 반응에 유전형과 돌연변이 단면도를 번역하는 공구로 전립선 오르가노이드 문화

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