Name: 쥐의 원주 식도 재건을 위한 조직 공학 이식편 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 배우세요 쥐 모델에서 조직 공학적 식도 재건을 위한 이중층 하이브리드 스캐폴드 제작 및 미세혈관 문합 기법을 활용한 재생 의학 방법론입니다. 이 기술은 임상 적용 가능성을 보여줍니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 한국보건산업진흥원(KHIDI)을 통해 한국보건기술R&D 사업지원, 보건복지부(보조금 번호: HI16C0362) 및 기초과학연구 교육부의 지원을 받는 국립연구재단(NRF)을 통한 프로그램(2017R1B2011132). 이 연구에 사용된 생물표본및 데이터는 한국바이오뱅크 네트워크 회원인 서울대학교병원 바이오뱅크가 제공했다.

여기에 설명된 모든 방법은 서울대학교병원의 기관동물관리및사용위원회(IACUC No. 17-0164-S1A0)의 승인을 받았습니다.
1. 비계 제조
참고 : 2 층 식도 스캐폴드는 전기 방사 및 3D 프린팅을 결합하여 제조됩니다. 관형 스캐폴드의 내부 멤브레인은 컬렉터로서 회전하는 스테인리스 스틸 만드렐로전기방사 폴리우레탄(PU)에 의해 제조되었다.
<ol><li>관형 PU 나노 섬유의 제조를 위해, 실온에서 8 시간 동안 N,N-디메틸 포름 아미드 (DMF)에서 교반하여 PU 폴리머의 20 % (w / v) 용액을 준비하십시오.</li>
	<li>PU 용액을 무딘 금속 바늘(22G)으로 주사기 에 놓고, 바늘 끝과 회전 수집기 사이의 30cm 거리에서 회전스테인리스 맨드릴(직경 = 2 mm)에 전기 스핀을 놓습니다. 참고: 전원 공급 장치는 15kV 전위가 되는 고전압 직전류로 설정됩니다. 용액의 공급 속도는 주사기 펌프를 사용하여 0.5 mL/h로 고정됩니다.</li>
	<li>3.14 m/s에서 회전 하는 맨드렐의 표면에 관 형 나노 섬유 층을 확인 합니다.</li>
	<li>PU 나노섬유를 진공 오븐에서 40°C에서 하룻밤 동안 건조하여 잔류 용매를 완전히 제거합니다. 참고: 식도 스캐폴드의 3D 프린팅 외벽은 신속한 프로토타이핑 시스템을 사용하여 제조됩니다. 3D 프린팅 장비는 디스펜서, 노즐, 압축/열 컨트롤러, 3축 변환 단계 및 소프트웨어 시스템으로 구성됩니다.</li>
	<li>PCL 펠릿은 가열 실린더에서 100°C에서 용해된 다음 바이오플로팅 시스템의 제어 하에 고압(7 bar)에서 나노섬유의 표면에 인쇄됩니다. 노즐 크기는 300 μm이고 가닥 거리는 700 μm입니다.</li>
	<li>맨드렐에서 2층 스캐폴드를 제거한 후, 자외선 하에서 70% 에탄올을 담가 살균하였다. 참고 : 스캐폴드의 더 자세한 특성은 이전 연구에서 보고되었습니다10.</li>
</ol>2. 이식편 및 생물반응기 재배에 대한 세포 파종
참고: 회사에서 구입한 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(hMSCs)를 수정 없이 사용하였다.
<ol><li>세포 이식에 앞서 자외선 아래에서 1 시간 동안 3D 인쇄 식도 스캐폴드를 살균하고 에탄올로 10 분 동안 적시고 인산완충 식염수 (PBS)로 3 x 씻어 내다.</li>
	<li>배양 및 성장 매체에서 hMSC를 확장 (기초 매체/성장 보충). 2층 관형 스캐폴드는 비부착24웰 조직 배양판으로 옮겼다.</li>
	<li>스캐폴드의 내부 표면에 세포를 부착하려면 성장 배지를 포함하는 지하 막 매트릭스에서 1 x 106 셀/mL의 밀도로 hMSC 현탁액을 부드럽게 추가합니다.</li>
	<li>2층 관형 스캐폴드의 내부 표면에 지하 멤브레인 매트릭스 현탁액을 균일하게 증착한다.</li>
	<li>hMSC-시드 관형 스캐폴드를 맥동유동 생물반응기 시스템을 이용하여 생물반응기의 배양챔버 내아크릴 홀더에 단단히 고정한다. 참고: 맞춤형 바이오리액터 시스템은 펌프, 버블 트랩, 유량 챔버, 압력 게이지, 제어 밸브 및 중간 저수지로 구성됩니다. 배양실에서 전단 응력 적용시, 1-2분11의휴식 시간을 허용한다.</li>
	<li>배양 챔버에 성장 배지를 추가하고 5%CO210을포함하는 가습 된 분위기 하에서 0.1 dyne /cm2 유동 유도 전단 응력적용. 참고: 유동 유도 전단 응력의 값은 이전 연구10으로부터인체로부터 유래된 식도 조직의 연동동을 시뮬레이션하여 계산되었다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 LIVE/DEAD 생존 율 분석 키트를 사용하여 5일 후에 생물 반응기 재배없이 2층 관 형 스캐폴드의 내부 표면에 세포 반응을 결정합니다. Z 스택 도구를 사용하여 공초점 현미경을 통해 이미지를 가져옵니다.</li>
	<li>셋째 날에는 주사 전자 현미경 (SEM)을 통해 hMSC 시드 관 비계의 표면 형태를 관찰하십시오.<ol>
<li>hMSC로 배양된 스캐폴드를 2.5% 글루타랄데히드 및 OsO4로 24시간 동안 고정하고 에탄올로 탈수합니다.</li>
		<li>아르곤 대기 조건에서 스퍼터 코터를 사용하여 고정 된 hMSC를 백금으로 코팅하고 25 kV의 가속 전압에서 SEM 이미지를 얻습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 동물 수술을위한 외과 준비
참고 : 외과 준비는 위절제술과 식도 이식 전에 적용됩니다.
<ol><li>멸균 수술 기구 설정: 메스 블레이드, Weitlaner 리트랙터, 마이크로니들 홀더, 미세수압 집게, 마이크로조직 집게, 마이크로사이저, 마요-헤거 니들 홀더, 작동 가위, 홍채 가위, 드레싱 집게, 조직 집게, 스플린터 집게, 홍채 집게, 5 mL 주사기 (21 G 바늘), 10 mL 주사기 (22 G 바늘), 9-0 폴리 아미드 봉합사, 4-0 폴리 글락틴 봉합사.</li>
	<li>타일타민/졸라제팜(50 mg/g 용량)과 2% 자일라진 염산염(2 mg/kg 용량)의 근육 내 주사로 동물을 마취시다. 참고: 398-420 g의 성인 스프라그-Dawley(SD) 랫트는 식도 이식에 사용하였다.</li>
	<li>외과 용 커튼으로 옮기기 전에 꼬리를 집게로 꼬집어 동물의 적절한 마취 상태를 확인하십시오.</li>
	<li>동물을 멸균 드레이프 위에 놓고 클리퍼를 사용하여 목에서 머리카락을 제거하십시오 (식도 이식용) 또는 복부 (위장관 절제술). 그런 다음 베타딘과 70 % 에탄올로 수술 부위를 문지하십시오.</li>
	<li>절개 전에, 피하 통증 완화를 위해 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg)와 같은 진통을 주입하십시오.</li>
</ol>4. 쥐에 있는 T 관을 사용하여 위장 절제술
참고: 수정된 위장관 절제술은 모든 실험 동물에서 일시적으로 비경구 관 공급을 허용하도록 수행하였다(n=5).
<ol><li>수술 전날 쥐를 빨리 지내게 하십시오. 섹션 3에서와 같이 수술을 준비하십시오.</li>
	<li>마취 된 쥐의 피부와 복부 근육의 중간 절개를 통해 위를 노출하십시오.</li>
	<li>메스 블레이드로 전방 위벽에 3mm 오리피스를 만듭니다.</li>
	<li>실리콘 T-튜브의 팁을 결함 부위에 삽입하여 위벽에 고정시십시오.</li>
	<li>T-튜브가 위 벽에서 분리되지 않도록 제대로 봉합사.</li>
	<li>이식된 T-튜브의 말단을 피하 터널을 통해 목 뒤쪽으로 빼냅니다.</li>
	<li>헤파린 캡을 T-튜브 끝에 삽입하여 위 내용물이 뒤로 흐르는 것을 방지합니다. 참고: 협심증을 사용하여 T-튜브의 끝을 헤파린 캡과 연결합니다.</li>
	<li>4-0 폴리글락틴 봉합사를 사용하여 복벽과 피부의 모든 층을 봉합하십시오.</li>
	<li>위절제술이 완료된 후 모든 실험 쥐를 대사 케이지에 분리하십시오.</li>
</ol>5. 식도 이식
참고: 2층 관 성 스캐폴드의 식도 이식은 위장관 절제술 후 1 주일 후에 수행됩니다 (n = 5). 이식에 앞서, hMSCs(세포 밀도: 지하 막 매트릭스에서 1 x 106 세포/mL)를 각 스캐폴드의 내벽에 접종하고 생물 반응기 시스템에서 3 일 동안 배양합니다. 외과 적 절차는 다음과 같습니다.
<ol><li>모형 동물의 목털을 제거하고 무균 수술을 위한 수술 부위의 표준 드레이프를 수행한다. 참고: 동물에 대한 수술을 유지하기 위해 큰 면도 부위를 만드는 것이 좋습니다.</li>
	<li>목의 전방 중앙 절개 후, 스트랩 근육을 분리하고 기관식도 구조를 노출.</li>
	<li>세그먼트를 절제하기 전에 식도에서 미주 신경을 무뚝뚝하게 해부하면 동물의 호흡이 손상됩니다.</li>
	<li>배율하에서 식도의 왼쪽을 기관에서 분리하고 갑상선에서 상부를 조심스럽게 분리합니다.</li>
	<li>외과 용 가위를 사용하여 식도의 모든 층을 포함하는 5mm 길이의 전체 둘레 결함을 만듭니다. 참고 : 식도 이식 전에 수술 용 가위를 사용하여 준비된 스캐폴드를 이식 부위의 길이와 일치시킵니다.</li>
	<li>현미경으로, 9-0 봉합사 를 사용하여 말단 식도 결함의 양 단부에서 미세 아나스토모시스를 수행합니다. 상부 식도 잔재와 비계의 오른쪽 후추 마진 사이에 첫 번째 봉합사를 놓습니다. 상부 식도 잔해와 비계 사이에 오른쪽에서 왼쪽으로 봉합을 계속합니다. 하부 식도 잔재의 상부 마진과 동일한 방식으로 스캐폴드를 아나스토모제. 참고 : 식도 이식에 대한 임상 수술에 사용되는 미세 혈관 안합을 수행합니다. 임플란트 부위의 정밀하고 방수 봉합을 위해 현미경으로 작업하십시오.</li>
	<li>그 후, 이식 부위에 주변 갑상선 플랩을 놓고 이식 부위에 혈관 공급을 안정적으로 유지관리하십시오.</li>
	<li>이식 후 피하 근육과 피부 조직을 4-0 비릴 봉합사로 바느질하십시오.</li>
	<li>모든 실험 쥐를 신진 대사 케이지에 개별적으로 보관하십시오.</li>
</ol>6. 수술 후 절차
참고 : 수술 후 절차는 위절제술과 식도 이식 후 수행됩니다.
<ol><li>복부 상처의 폐쇄 후, 개별 대사 케이지에 쥐를 넣고 저체온증을 방지하기 위해 적외선 온난화 장치에 케이지를 배치합니다.</li>
	<li>동물들이 흉골 의식을 달성하고 유지할 때까지 동물을 모니터링하십시오 (즉, 가슴에 똑바로 누워 있음).</li>
	<li>수술 부위의 염증을 최소화하려면 항생제 젠타미신(20 mg/kg)을 쥐에게 매일 투여하십시오.</li>
	<li>연구의 끝점까지 세 번째 수술 후 날에 경구 액체 공급을 시작합니다. 전체 영양 포뮬러(20.6 g/100 ml [g%] 탄수화물, 3.8 g% 단백질, 0.2 g% 지방)을 수술 후 하루 3배의 헤파린 캡을 통해 공급하십시오.</li>
	<li>매일 동물의 외모와 체중을 확인하십시오. 자기 해의 절개 부위 또는 튜브 섭취에 대한 저항, 다양한 수술 합병증과 같은 행동을 관리하십시오. 쥐 모델의 체중이 20% 이상 급격히 감소하면CO2 흡입에 의해 안락사를 수행합니다.</li>
</ol>7. 반학과 면역화학
참고 : 조직 학적 분석을 위해 안락사 된 동물의 모든 식도 조직은 외과 용 가위를 사용하여 추출됩니다. 헤마톡실린 및 에오신 염색 및 마슨의 삼색 염색은 표준 조직학적 기법을 사용하여 수행되었다. 면역성화학은 다음 프로토콜에 따라 수행되었다.
<ol><li>이식 부위를 포함하는 전체 식도를 4 % 파라 포름 알데히드에 고정하십시오. 파라핀 블록을 만들고 4 μm 두께의 단면을 잘라냅니다.</li>
	<li>조직 단면을 분리하고 에탄올 시리즈에서 탈수시. 티슈 슬라이드를 구연산완충에 담그고 전자레인지에서 10분간 가열합니다. 차가운 PBS로 세포를 20 분 동안 식히고 3 % 과산화수소에 6 분 동안 담그고 PBS로 10 분 동안 씻으십시오.</li>
	<li>3% 소 혈청 알부민 (BSA)에서 배양 1 시간 동안 실온에서 조직 섹션의 비특이적 반응을 차단합니다.</li>
	<li>5 분 동안 PBS로 3x를 씻으십시오. Desmin에 대한 기본 항체로 인큐베이션 (1 :200으로 희석), 각질 13 (1 : 100으로 희석), 폰 윌레브란트 인자 (vWF; 1 :100로 희석) 4 °C에서 밤새.</li>
	<li>15 분 동안 PBS로 3x를 씻습니다. 실온에서 Desmin 및 Keratin 13에 대해 1:500의 농도로 적절한 이차 항체로 인큐베이션합니다. 그런 다음 슬라이드를 PBS로 10 분 동안 두 번 씻습니다. 참고: vWF용 티슈 섹션은 고추냉이 과산화아제-컨쥬게이션 키트(재료 표참조)를 사용하여 배양한 다음 3,3'-다미노벤지딘(DAB)을 사용하여 시각화하였다.</li>
	<li>유리 커버 슬립 및 4',6-디아미디노-2-페놀린돌레(DAPI)를 사용하여 장착 매체를 포함합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Irino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+outcomes+after+replacement+of+the+esophagus+with+gastric%2C+colonic%2C+or+jejunal+conduits%3A+a+systematic+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases+of+the+Esophagus%22%5BJournal%5D)">Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review.</a> Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).</li>
<li>Flanagan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophagectomy+and+Gastric+Pull-through+Procedures%3A+Surgical+Techniques%2C+Imaging+Features%2C+and+Potential+Complications%5BTitle%5D)+AND+%22Radiographics%22%5BJournal%5D)">Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications.</a> Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).</li>
<li>Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+outcomes+of+different+approaches+to+esophageal+replacement+in+long-gap+esophageal+atresia%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine.+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review.</a> Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942(2017).</li>
<li>Luc, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+and+matured+esophageal+scaffold+for+circumferential+esophagus+replacement%3A+Proof+of+concept+in+a+pig+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model.</a> Biomaterials. 175, 1-18 (2018).</li>
<li>Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+oesophageal+muscle+layer+from+oesophagus+acellular+matrix+scaffold+using+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).</li>
<li>La Francesca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+regeneration+and+remodeling+of+the+pig+esophagus+after+circumferential+resection+using+a+retrievable+synthetic+scaffold+carrying+autologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4123(2018).</li>
<li>Ponten, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+severe+mediastinal+bleeding+after+esophagectomy%3A+a+potentially+lethal+complication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication.</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).</li>
<li>Catry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumferential+Esophageal+Replacement+by+a+Tissue-engineered+Substitute+Using+Mesenchymal+Stem+Cells%3A+An+Experimental+Study+in+Mini+Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs.</a> Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).</li>
<li>Lee, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+preparation+of+bio-tubular+scaffolds+for+fabricating+artificial+vascular+grafts+by+combining+electrospinning+and+a+3D+printing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).</li>
<li>Kim, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Engineered+Esophagus+via+Bioreactor+Cultivation+for+Circumferential+Esophageal+Reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction.</a> Tissue Engineering Part A. , (2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinational+effects+of+mechanical+forces+and+substrate+surface+characteristics+on+esophageal+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+A%22%5BJournal%5D)">Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation.</a> Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).</li>
<li>Jensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyurethane+scaffolds+seeded+with+autologous+cells+can+regenerate+long+esophageal+gaps%3A+An+esophageal+atresia+treatment+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model.</a> Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).</li>
<li>Nakase, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathoracic+esophageal+replacement+by+in+situ+tissue-engineered+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).</li>
<li>Kwiatek, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+esophagus+in+eosinophilic+esophagitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis.</a> Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).</li>
<li>Anjum, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocomposite+nanofiber+matrices+to+support+ECM+remodeling+by+human+dermal+progenitors+and+enhanced+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10291(2017).</li>
<li>Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCL+and+PCL-gelatin+nanofibers+as+esophageal+tissue+scaffolds%3A+optimization%2C+characterization+and+cell-matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions.</a> Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).</li>
</ol>

본 연구를 위해 설계된 바이오리액터 시스템이 상용화되었습니다(모델 번호: ACBF-100).

인공 식도에 기존 동물 연구는 여전히 몇 가지 중요 한 요인에 의해 제한. 이상적인 인공 식도 스캐폴드는 생체 적합성이어야하며 우수한 물리적 특성을 가져야합니다. 그것은 해부학 누설을 방지하기 위해 초기 수술 후 기간에 점막 상피를 재생할 수 있어야합니다. 내측 원형 및 외측 세로 근육층의 재생은 기능연동동동사12,13에도중요하다.
식도의 기계적 특성은 식도가 호흡 중에 붕괴되고 삼키는 동안 열리기 때문에 필수적이며, 반동현상14와최대 스트레칭에 지속적으로 노출됩니다. 이식된 스캐폴드는 이러한 기계적 특성도 가져야 합니다. 이식된 식도의 점탄성은 식도를 통해 연동 운동의 반복적 인 램프 - 이완에 적합해야합니다. 너무 약한 스캐폴드는 파열되거나 누출되어 수령인의 심각한 상태(예: 매만염)를 유발할 수 있습니다. 대조적으로, 너무 뻣뻣...

선천성 기형 및 식도 암과 같은 식도 장애의 치료는 식도의 구조적 세그먼트 손실로 이어질 수 있습니다. 대부분의 경우, 위 풀업 도관 또는 결장 간과 같은 자가 대체 이식편이1,2로수행되었습니다. 그러나, 이러한 식도 교체는 다양한 외과적 합병증 및 재수술 위험이3. 따라서, 네이티브 식도를 모방한 조직 공학식도 비계의 사용은 궁극적으로 손실된 조직을 재생하기 위한 유망한 대안 전략이 될 수 있다4,5,6.
조직 공학식도 잠재적으로 식도 결함의 현재 치료에 대 한 대안을 제공 하지만, 그것의 생체 내 응용 프로그램에 대 한 중요 한 장벽이 있다. 이식된 식도 비계의 수술 후 해부학 적 누설 및 괴사는 필연적으로 매질7과같은 주변 무균 공간의 치명적인 감염으로 이어질 수 있습니다. 따라서 상처 및 비위 관의 음식이나 타액 오염을 방지하는 것이 매우 중요합니다. 위장관 절제술 또는 정맥 영양은 1 차적인 상처 치유가 완료될 때까지 고려되어야 합니다. 현재까지, 식도 조직 공학은 큰 동물이 스캐폴드8의이식 후 2-4 주 동안 정맥 과충에 의해서만 공급될 수 있기 때문에 큰 동물 모델에서 수행되었다. 그러나, 이러한 비oral 공급 모델은 작은 동물에서 식도 이식 후 조기 생존을 위해 확립되지 않았다. 이것은 동물이 매우 활동적이고 통제 할 수 없었기 때문에 장기간 동안 수유 튜브를 위장에 보관 할 수 없었기 때문입니다. 이러한 이유로, 작은 동물에 성공적인 식도 이식의 몇 가지 경우가 되었습니다.
식도 조직 공학의 상황을 고려하여, 우리는 전기 스펀 나노 섬유 (내부 층)로 구성된 2 층 관 형 스캐폴드를 설계했습니다. 도 1A)및 3D 프린팅 가닥(외부 층; 도 1B)변형된 위절제술 기법을 포함한다. 내부 나노 섬유는 분해되지 않는 폴리머 인 PU로 만들어졌으며 음식과 타액의 누출을 방지합니다. 외부 3D 프린팅 가닥은 기계적 유연성을 제공하고 연동 운동에 적응할 수 있는 생분해성 폴리카프로롤락톤(PCL)으로 만들어집니다. 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(hAD-MSCs)는 스캐폴드의 내부 층에 씨를 뿌리고 상피화를 촉진하였다. 나노섬유 구조는 세포 이동을 위한 구조적 세포외 매트릭스(ECM) 환경을 제공함으로써 초기 점막 재생을 용이하게 할 수 있다.
우리는 또한 생물 반응기 재배를 통해 접종 된 세포의 생존율과 생체 활성을 증가시켰습니다. 이식된 스캐폴드는 식도 점막과 근육 층의 보다 안정적인 재생을 가능하게 하기 위해 갑상선 플랩으로 덮여 있었다. 이 보고서에서는 스캐폴드 제조, 중간엽 줄기 세포 기반 생물 반응기 재배, 변형 된 위절제술을 사용한 우회 공급 기술 및 수정 된 수술을 포함한 식도 조직 공학 기술에 대한 프로토콜을 설명합니다. 쥐 모형에 있는 원주 식도 재건을 위한 해부학 기술.

<table><tbody><tr><td>대사 케이지</td><td>TEUNGDO BIO & PLANT</td><td>JD-C-66</td><td></td></tr><tr><td>Zoletil (50 mg/g 용량)</td><td>Virbac</td><td>1000000188</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>2% xylazine hydrochloride (Rumpun)</td><td>Byely</td><td>Q-0615-035</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>BIOSOLUTION</td><td>BP031</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl</td><td>ETHICON</td><td>W9443</td><td></td></tr><tr><td>9-0 Vicryl</td><td>ETHICON</td><td>W2813</td><td></td></tr><tr><td>항생제 겐타마이신(셉토팔).</td><td>Septopal</td><td>0409-1207-03</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>시그마</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>구연산염 완충액, ph6.0, 10X</td><td>시그마</td><td>C9999</td><td></td></tr><tr><td>DAB 과산화 효소 기판 키트</td><td>벡터</td><td>SK4100</td><td></td></tr><tr><td>Desmin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-23879</td><td></td></tr><tr><td>탄성 얼룩 키트</td><td>ScyTeK</td><td>ETS-1</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Merck</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serun (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>Sigma</td><td>354400</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG (H+L) 2차 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 캡</td><td>협성메디칼</td><td>HS-T-05</td><td></td></tr><tr><td>hMSC (STEMPRO) / 성장 배지 (MesenPRO RSTM)</td><td>Invitrogen</td><td>R7788-110</td><td></td></tr><tr><td>양고추냉이 과산화효소 접합 키트(Vectastain)</td><td>VECTOR</td><td>PK7800</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>JUNSEI</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>Keratin13</td><td>Novus</td><td>NBP1-97797</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 생존 분석 키트</td><td>분자 프로브</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354262</td><td></td></tr><tr><td>N,N-디메틸포름아미드(DMF)</td><td>Sigma</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Nonadherent 24웰 조직 배양 플레이트.</td><td>Corning</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>OsO4</td><td>Sigma</td><td>O5500</td><td></td></tr><tr><td>페트리 디쉬</td><td>Eppendorf</td><td>3072115</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS), 10X</td><td>BIOSOLUTION</td><td>BP007a</td><td></td></tr><tr><td>폴리카프로락톤(PCL) 폴리머</td><td>Sigma</td><td>440744</td><td></td></tr><tr><td>폴리 우레탄 (PU + A2 : A24) 폴리머</td><td>Lubrizol</td><td>2363-80AE</td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>NanoNC</td><td>HV100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade 시약 with DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Rumpun</td><td>Bayer</td><td>Q-0615-035</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 T- 튜브</td><td>Sewoon Medical</td><td>2206-005</td><td></td></tr><tr><td>Terramycin Eye Ointment</td><td>Pfizer Pharmaceutical Korea</td><td>W01890011</td><td></td></tr><tr><td>틸레타민/졸라제팜(Zoletil)</td><td>Virbac Laboratories</td><td>Q-0042-058</td><td></td></tr><tr><td>트리크롬 염색 키트</td><td>ScyTeK</td><td>TRM-1</td><td></td></tr><tr><td>von Willebrand Factor (vWF)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc 14014</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐의 원주 식도 재건을 위한 조직 공학 이식편

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

원주 식도 재건을 위한 생체 적합성 물질의 사용은 쥐에서 기술적으로 도전적인 작업이며 영양 지원을 지원하는 최적의 임플란트 기술이 필요합니다. 최근에는 식도 조직 공학에 많은 시도가 있었지만 연석의 특별한 환경에서 초기 상피화의 어려움으로 인해 성공률이 제한되었습니다. 여기서, 우리는 2층 관 성 비계, 중간 엽 줄기 세포 기반 생물 반응기 시스템 및 변형된 바이패스 공급 기술을 통해 식도 점막과 근육 층의 재생을 향상시킬 수 있는 인공 식도를 개발했습니다. 위장관 절제술. 스캐폴드는 외벽을 감싸는 3차원(3D) 인쇄 폴리카프롤락톤 가닥을 가진 원통형 형태의 폴리우레탄(PU) 나노섬유로 이루어진다. 이식에 앞서, 인간 유래 중간엽 줄기 세포를 스캐폴드의 내루에 파종하고, 세포 반응성을 향상시키기 위해 생물반응기 재배를 수행하였다. 우리는 외과 적 해부학을 적용하고 갑상선 플랩으로 이식 된 보철을 덮고 일시적인 비내구 위절제술 을 통해 이식 생존율을 향상시켰습니다. 이 접목은 조직학 분석에 의해 입증된 바와 같이 이식된 부위 의 주위에 초기 상피화 그리고 근육 재생의 사실 인정을 되풀이할 수 있었습니다. 또한, 엘라스틴 섬유 증가 및 혈관 신생은 이식편 주변에서 관찰되었다. 따라서,이 모델은 원주 식도 재건을위한 잠재적 인 새로운 기술을 제시한다.

도 1은 PU-PCL 2층 관형 스캐폴드의 제조 공정에 대한 개략적 도표를 나타낸다. 상기 PU 용액은 두께 200 μm의 원통형 내부 구조를 만들기 위해 18 G 바늘로부터 전기스펀을 하였다. 이어서, 용융된 PCL을 PU 나노섬유의 외벽에 일정한 간격으로 인쇄하였다. 완성된 관성 스캐폴드의 내벽및 외벽의 표면 형태는 주사 전자 현미경 이미지에서 볼 수 있다.
도 2는 외부 영양 공급을 위해 쥐에 위장관튜브를 삽입하는 과정을나타낸다(도 2A). T자형 실리콘 튜브를 위벽에 삽입하고 봉합하였다(도2B).</s...

식도 재건은 도전적인 절차이며, 식도 점막과 근육의 재생을 가능하게하고 인공 이식으로 이식 할 수있는 조직 공학 식도의 개발이 필요합니다. 여기에서는 스캐폴드 제조, 생물 반응기 재배 및 다양한 수술 기법을 포함한 인공 식도를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

외경 식도 수리는 쥐 모델에서 기술적으로 도전적이며, 식도 점막과 근육의 재생을 식도 해부학 누출없이 재생할 수 있도록 조직 으로 설계된 식도의 개발이 필요합니다. 우리는 이식 후 타액 누출을 최소화하기 위해 미세 혈관 해부학과 함께 내부 나노 섬유 및 외부 3D 프린팅 가닥으로 구성된 파일럿 모델로서 2 층 관 비계를 구현했습니다. 기존의 표준 식도 재건은 광범위한 합병증 및 이환율과 관련이 있습니다.따라서 식도 조직 공학은 토착 환자 식도 모델을 개발하기위한 유망한 대체 전략일 수 있습니다. 하이브리드 스캐폴드, 생물 반응기 재배 및 경구 영양 시스템의 조합은 지속적인 기계적 압력으로 유사한 오염 된 환경을 가진 모든 시스템에 적용 할 수 있습니다. 자외선에 1시간 노출된 3D 프린팅 식도 스캐폴드, 에탄올에 10분 담그고 PBS를 사용하여 세 개의 세가지 를 살균하는 것으로 시작합니다.마지막 세척 후, 2층 관 비계 비계 비부착 24-웰 조직 배양 판에 배치하고, 부드럽게 하지만 균일하게 비계의 내부 표면에 성장 배지로 보충 지하 막 매트릭스의 밀리리터 당 여섯 지방 유래 인간 중간 엽 줄기 세포에 1 배 10을 추가합니다. 맥동 유량 생물 반응기 시스템을 사용하여 세포 종자 관 비계를 생물 반응기의 배양 챔버의 아크릴 홀더에 단단히 고정하고 챔버에 500 밀리리터의 성장 배지를 추가합니다. 그런 다음, 5%의 이산화탄소를 함유한 습한 대기 하에서 유동유도 전단 응력의 1cm 제곱을 적용한다.5일 후, LIVE/DEAD 생존가능성 분석 키트를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 스캐폴드의 내부 표면에 세포 반응을 결정하고, 공초점 현미경검사법에 의한 세포를 이미지한다. 수술 을 시작하기 전에 마취 된 쥐의 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인하고, 멸균 드레이프에 척추 위치에 동물을 배치합니다. 클리퍼를 사용하여 수술 부위에서 머리카락을 제거하고 순차적인 BETADINE 및 70 % 에탄올 스크럽으로 노출된 피부를 소독하십시오.T-튜브 배치의 경우, 쥐의 복부에 중간 피부와 근육 절개를 하고 메스 블레이드를 사용하여 전방 위벽에 3mm 오리피스를 만듭니다. 실리콘 T 튜브의 끝을 결함 부위에 삽입하여 위벽에 고정하고 튜브를 위 근육 조직에 조심스럽게 봉합합니다. 4-0 VICRYL 봉합사와 복벽을 봉합.이식된 T-튜브의 단부 끝을 목 뒤쪽으로 조심스럽게 삽입하고, 앙고카테터를 사용하여 위 내용물이 뒤로 흐르는 것을 방지하기 위해 하이파린 캡을 T 튜브 끝에 연결합니다. 캡이 제자리에 있을 때, 4-0 폴리글락틴 봉합사를 사용하여 복부 피부의 모든 층을 닫고 쥐를 완전한 자제할 때까지 모니터링하여 신진 대사 케이지에 넣습니다. T-튜브 배치 후 1 주일, 입증 된 대로 수술을 위해 쥐를 준비.쥐를 현미경 아래에 놓고 노출된 소독 된 피부에 전방 중앙목 절개를 합니다. 스트랩 근육을 분리하여 기관식도 구조를 노출시합니다. 기관에서 식도의 왼쪽을 분리합니다.식도의 상부를 갑상선과 조심스럽게 분리하고 외과 가위를 사용하여 식도의 모든 층을 포함하는 5mm 길이의 전체 둘레 결함을 만듭니다. 다음으로, 상부 식도 잔재 및 비계의 오른쪽 추론 마진 사이에 9-0 봉합사를 삽입하고, 상층식도와 비계 사이에 오른쪽에서 왼쪽으로 봉합을 계속하여 말단 식도 결함의 상부 끝에 미세아나스토모사를 생성한다. 이어서, 하부 식도 잔재의 상한마진과 동일한 방식으로 비계를 마취한다.해부학이 완료되면 이식 부위에 주변 갑상선 플랩을 놓아 이식편에 혈관 공급과 안정적인 유지 보수를 보장합니다. 그런 다음 피하 근육및 피부 조직을 4-0 VICRYL 봉합사로 스티치하고, 완전한 복종까지 모니터링하여 적외선 온난화 장치에 쥐를 대사 케이지에 넣습니다. 주입을 통해 비계의 내벽에 균일한 적용 후, 인간 중간엽 줄기 세포 에 내장된 지하 막 매트릭스는 전자 현미경 검사를 스캔하여 평가한 것으로 예상되는 중간엽 줄기 세포 형태를 입증한다.식도 이식 후 전체 정황 식도 결함을 가진 쥐로 이식 한 후, 이식된 부위에 안정적인 고정 및 혈관 공급을 위해 갑상선 플랩으로 접목이 덮여 있습니다. 식도 이식 된 쥐는 시술 후 약 9 일까지 340 그램에 남아 있으며, 이 시점에서 동물은 다양한 원인으로 인해 체중이 급격히 감소하여 15 일째까지 사망합니다. 대부분의 쥐는 털공에 의한 비 식도 방해를 개발하지만, 전반적으로 공수, 혈청 축적, 농양 형성 또는 실험 동물에서 주변 연조직 괴사의 총 증거가 없다.이식 부위의 재상화는 케라틴에 대한 면역형광 염색에 의해 확인될 수 있으며, 재생된 콜라겐 층 및 엘라스틴 섬유는 Masson의 삼색 염색에 의해 명확하게 관찰될 수 있다. 식도 근육 층의 재생은 또한 desmin 면역 조직 화학 분석에 의해 평가된 풍부한 신생 혈관화에 의해 입증된다. 이 절차의 성공은 식도 재건 중에 영양을 제공하기 위해 목 뒤에 고정을 통해 T 튜브의 안정적인 유지 보수에 의존합니다.이 절차의 전형적인 초기 사망률을 극복하기 위하여는, 오르가노이드 또는 초기 혈관화 기술은 기능적인 식도 재건을 돕기 위하여 식도 이식 에 따라 적용될 수 있었습니다.

tissue-engineered-graft-for-circumferential-esophageal-reconstruction

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

여기, 우리는 방실 (AV) - 홈 성인 루이스 쥐에서 설계 조직을 이식하는 심장 수술을 설명합니다.

랫 중심에 엔지니어링된 조직의 주입

이 문서와 함께 비디오 organoid 단위 온 발판 접근법을 사용하여 마우스에 조직 - 엔지니어링 소장을 생성하기 위해 우리의 프로토콜을 제시한다.

손쥐 모델에서 창자의 조직 공학

이 비디오에서는 조직 공학 응용 분야를 위해 생화학적 구조와 구성이 보존된 탈세포화된 돼지 식도 골격을 준비하는 방법을 보여줍니다.

Decellularized Porcine Esophageal Scaffold Preparation: A Technique: A Techniques to Generate Acellular Scaffold from a Pig Esophagus (탈세포화된 돼지 식도 골격 준비: 돼지 식도에서 무세포 골격을 생성하는 기술)

여기, 우리는 두 번 시드를 부분적으로 유도 만능 줄기 세포로 쥐에 이식을위한 기능적인 조직 설계 혈관 이식을 생성하는 프로토콜을 제시 (PiPSC은) - 탈세 포화 선박 발판 생물 반응기에서 유래 내피 세포 - 평활근 세포 및 PiPSC 산출했다.

마우스 모델에서 조직 공학 혈관의 생성 및 손톱 확장

이 원고는 생산, 특성화 및 일반 차 인간의 식도 섬유 아세포와 드 cellularized 돼지 비계 내에서 시드 편평 상피 세포로부터 제조 된 조직 설계 3D 식도 구조의 사용 가능성에 대해 설명합니다. 결과 정상적인 인간 식도 유사한 성숙한 상피 성층의 형성을 입증한다.

3 차원 조직 공학 인간의 식도 점막 모델의 제조, 특성 및 사용 가능성

현재까지 두꺼운 조직 결손은 일반적으로 자가 조직 플랩 또는 엔지니어링 조직을 적용하여 재구성됩니다. 이 프로토콜에서는 자가 피판을 대체하기 위해 자가 척추경을 지닌 혈관 조직 피판을 엔지니어링하는 새로운 방법을 제시합니다.

엔지니어링 혈관을 근육 플랩

여기, 우리는 PCL 두꺼운 섬유와 큰 모 공, 혈관 이식 조작 및 복 부 대동맥 교체의 쥐 모델에서 vivo에서 성능을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 하는 수정 된 전기 방법을 제시.

쥐 모델에 최적화 된 구조를 가진 Electrospun 혈관 이식 술의 이식

이식 협 조직 설계 기도 교체에서 중요 한 장애물을 포즈. 협 기본 셀룰러 메커니즘을 조사, 우리 시드 골 단 세포 (BM-MNC)와 조직 설계 tracheal 교체의 murine 모델을 활용 합니다. 여기, 우리가 우리의 프로토콜을 비 계 제조, BM MNC 절연, 이식 시드, 및 주입을 포함 하 여 선발.

시드 및 마우스 모델에서 생 합성 조직 설계 Tracheal 이식의 이식

본 프로토콜에서는 Wistar 쥐에서 요도 협착 유도가 개발되었고, 협측 점막 이식편을 통한 요도 재건이 뒤따랐습니다. 역행성 요도 조영술 및 레이저 도플러 평가를 수행하여 요도 재건(협착 형성 후) 및 이식편 배치를 검증했습니다.

쥐 모델에서 협측 점막 이식편 요도 성형술에 이은 요도 협착 유도

이 연구는 중증 대동맥 협착증 또는 저형성 좌심 증후군과 같은 선천성 심장 결함에서 볼 수 있는 내피에서 중간엽으로의 전이 유도 섬유증의 동물 모델을 제시하여 상세한 조직학적 조직 평가, 조절 신호 경로 식별 및 치료 옵션 테스트를 가능하게 합니다.

내피에서 중간엽으로의 전환 연구를 위한 신생아 이종성 쥐 심장 이식 모델

이 프로토콜은 이식 거부 반응에 대한 약물 개입의 시간 경과 평가를 위해 회장루를 사용한 쥐 기반 장 이식 모델을 설명합니다.

종단 예후 평가를 위한 외부 회장루를 사용한 장 이식의 쥐 이식 거부 반응 모델

배우세요 쥐 모델에서 조직 공학적 식도 재건을 위한 이중층 하이브리드 스캐폴드 제작 및 미세혈관 문합 기법을 활용한 재생 의학 방법론입니다. 이 기술은 임상 적용 가능성을 보여줍니다.

쥐의 원주 식도 재건을 위한 조직 공학 이식편

더 많은 동영상 탐색