Name: 철분 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 격리 및 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 배우세요 철분 제한 조건에서 Mycobacterium tuberculosis를 배양하고 세포외 소포를 정제하는 방법을. 이 프로토콜은 BSL-2 시설에서도 적용 가능하며, 세포외 소포의 생화학적 특성 분석에 활용됩니다.

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우리는 나노 입자 추적 분석을 수행하기위한 안티 MEV 항 세라와 Navneet 도그라를 공유 라파엘 프라도스 - 로살레스에 감사드립니다.

1. 철분 고갈 정의 매체의 준비
<ol><li>KH2 PO4,L-아스파라긴 5g,글리세롤 20 mL, 덱스트로오스 2g을 플라스틱 용기에 탈이온수 900 mL에 녹여 최소 배지(MM) 1L를 준비합니다. 철분 오염을 방지하기 위해 유리를 피하십시오. pH를 5 N NaOH로 6.8로 조정하고 부피를 물로 1L로 조정합니다.</li>
	<li>금속 킬레이트 수지(MCR) 50g을 넣고 4°C에서 24시간 동안 마그네틱 교반 막대를 사용하여 부드럽게 교반합니다. 플라스틱 수신기가 있는 0.22 μm 필터 유닛을 통해 여과하여 MCR을 살균하고 제거합니다. 여과를 가속화하고 필터 막힘을 방지하기 위해, 여과 하기 전에 약 30 분 동안 수지 퇴적물을 보자. 참고: 이 배지는 원자 흡수 분광법에 의해 결정된 2 μM 잔류 철보다 적습니다.</li>
	<li>ZnCl의 0.5 mg/L,MgSO4의40 mg/L, 그리고 0.1 mg/L의 MnSO4. 별도로, 탈이온수에서 각 금속 보충제의 농축 된 주식 (1,000x)을 준비하고 MM 보충 전에 여과하여 살균하십시오. 철고갈, 금속 보충 MM은 여기서 저철 MM(LIMM)이라고 한다.</li>
	<li>10 mM HCl에 용해된 FeCl3의 50 mM 스톡에서 1 mL을 LIMM(50 μM 최종 농도)에 1mL추가하여 높은 철MM(HIMM)을 준비합니다.</li>
</ol>2. 철분 제한 조건에서 마이코박테리아 재배
<ol><li>Mtb의 냉동 15% 글리세롤 스톡 50 μL을 해동하고 10% ADN 농축(5 g/L 알부민, 2 g/L 덱스트로스, 0.85 g/L 염화나트륨, 0.2% 글리세롤 및 0.05% 트위든-80)으로 보충된 한천 플레이트를 줄무늬. 식민지가 보일 때까지 37 °C에서 접시를 배양하십시오.</li>
	<li>ADN 농축물로 보충된 진균 육수배지(재료 표)의2 mL에 Mtb10의 단일 콜로니를 접종합니다. 37 °C에서 교반으로 배양하십시오.</li>
	<li>Mtb 배양이 후기 로그 단계(OD540 ~0.8)로 성장하게 한다. 이를 확인하려면 분광광도계를 사용하여 OD540을 측정합니다.</li>
	<li>0.2% 글리세롤, 0.05% 트웬-80, 및 ADN을 보충된 진균 한천플레이트(재료표)에후기 로그학 배양물의 200 μL을 퍼뜨리고. 적어도 5 개의 접시를 접종하십시오. 박테리아 성장이 동급층으로 보일 때까지 플레이트를 37°C에서 배양합니다. 이것은 Mtb에 대 한 ~ 1 주 걸립니다.</li>
	<li>LIMM에 멸균 면봉을 적시소. 이 면봉을 사용하여 한천 접시에서 박테리아를 수집하고 LIMM의 100 mL을 접종하여 ~ 1.0의 OD540으로 농축 된 세균 현탁액을 준비하십시오.</li>
	<li>이 현탁액을 LIMM으로 10~1L로 희석하고 2L 멸균 플라스틱 병으로 나누고 각각 500 mL의 배양을 함유합니다.</li>
	<li>배양 2 mL을 꺼내 5 mL 배양 튜브로 옮김을 옮김. 10% vol/vol tyloxapol의 10 μL을 추가합니다.</li>
	<li>14일 동안 37°C에서 배양한다.</li>
</ol>3. MEV의 컬렉션
<ol><li>수집 시 2 mL 배양의OD(540)를 측정한다. ADN과 0.05 % 트웬-80한천 플레이트에 배양 및 플레이트 100 μL의 직렬 희석을 합니다.</li>
	<li>20°C에서 7분 동안 2,850 x g에서 5개의 225 mL 원원심분리기 및 원심분리기로 배양을 옮긴다.</li>
	<li>50 mL 파이펫으로 배양 상류를 수집하고 0.22 μm 필터 유닛을 통해 필터를 살균합니다.</li>
</ol>4. MEV의 격리
<ol><li>배양 여과액을 4°C에 배치한 교반 세포 초여과 시스템으로 옮기고 100 kDa 컷오프 막을 통해 <50 psi에서 농축물을 ~50 mL로 여과한다.</li>
	<li>농축배양여체를 15,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 15분 간 및 상급체를 수집한다.</li>
	<li>4 °C에서 2 시간 동안 100,000 x g에서 폴리 카보네이트 초원심분리 튜브에서 배양 여과.</li>
	<li>부드러운 파이펫팅으로 총 1 mL의 멸균 인산완충식염수(PBS)로 밀폐펠릿을 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>4.4 단계에서 얻은 펠릿 현탁액의 0.5 mL을 60 % 이오디산놀 용액의 1.5 mL로 혼합하여 최종 이오디크산놀 농도를 45 % wt / vol. 13mm x 51mm 폴리 프로필렌 박막 박막 초원각지 튜브의 바닥에서이 혼합물을 분배합니다.</li>
	<li>MEV-이오디산올 45% 서스펜션을 40%, 35%, 30%, 25%, 20%(PBS의 vol/vol) iodixanol 용액과 1 mL의 PBS 상단에 오버레이합니다.</li>
	<li>4 °C에서 18 시간 동안 100,000 x g의 원심 분리기.</li>
	<li>1 mL 해밀턴 주사기를 사용하여 상단으로부터 시작하여 1 mL 밀도 그라데이션 분획을 수집합니다.</li>
	<li>수집된 분획을 PBS 및 원심분리기로 각각 100,000 x g에서 4°C에서 2시간 동안 희석합니다.</li>
	<li>상급체를 제거하고 PBS의 0.5 mL에서 펠릿을 일시 중단합니다. 이 펠릿을 4°C에 보관하십시오.</li>
</ol>5. MEV정량화
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 브래드포드분석(재료 표)을통해 각 분획의 단백질 농도를 측정합니다.</li>
	<li>
막 지질 분석을 수행합니다.
	<ol>
<li>형광막 프로브 1-(4-트리메틸람모니우페닐)-6-페닐-1,3,5-헥사트리엔 p-톨루엔술포네이트(TMA-DPH)를 최종 농도에서 1 μg/mL의 최종 농도에서 90μg/mL의 최종 농도로 90μg/mL의 최종 농도로 각 그라데이션 분획의 배양 격판덮개.</li>
		<li>플레이트를 33°C에서 20분 동안 배양합니다.</li>
		<li>360 nm 여기 및 430 nm 방출에서 형광을 측정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. MEV의 정성적 분석
<ol><li>
단백질 전기 동동을 수행합니다.
	<ol>
<li>MEV 시료 약 1 μg를 16 μL에서 5x 시료 로딩 버퍼 4 μL(10% w/v SDS, 10 mM dithiothreitol, 20% v/v 글리세롤 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8 0.05% w/v/v 브로모펜 올 블루)에 혼합하고 샘플 샘플을 C5°C에서 가열합니다.</li>
		<li>10% 트리스/글리신 SDS-폴리아크릴아미드 젤11을 적재하고 완충완충(25mMTris 베이스, 190 mM 글리신, 0.1% SDS)에서 10V/cm에서 실행하여 청색 염료 전면이 겔의 바닥에 도달할 때까지 실행합니다.</li>
		<li>젤을 초민감성 단백질 염색 용액(재료 표)으로염색하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
도트 블롯을 수행합니다.
	<ol>
<li>약 0.5 μg/μL의 농도로 MEV 서스펜션의 2 μL을 적재하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 2중 직렬 희석을 하고 제조업체의 지침에 따라 도트 블롯을 처리합니다.</li>
		<li>1:5,000의 희석에서 MEV의 제조에 대하여 마우스에서 기르는 항세럼을 1:5,000의 1차 항체및 고추냉이 과산화증(HRP)에 결합된 염소 항마우스를 1:10,000 희석된 이차 항체로서 사용한다. 적절한 HRP 기판 블로팅 검출 시약 및 이미징 시스템으로 항원 항체 복합체를 검출합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
네거티브 염색 및 전자 현미경 검사를 수행합니다.
	<ol>
<li>250 μL의 MEV를 실온에서 0.1M 의 글루타랄데히드와 함께 2%의 글루타랄데히드를 2시간 동안 체온에서 수정하고 포름알데히드 4%, 글루타랄데히드 1%, PBS 0.1%로 밤새 배양합니다.</li>
		<li>90 분 동안 2 % 오스뮴 테트 옥사이드로 고정 된 샘플을 염색하십시오.</li>
		<li>샘플을 에탄올로 연속적으로 탈수시키고 Spurr의 에폭시 수지에 포함시다.</li>
		<li>투과 전자 현미경으로 MEV를 관찰합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li>
<li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li>
<li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li>
<li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Pst%2FSenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778(2018).</li>
<li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731(2017).</li>
<li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li>
<li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Plating+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064(2012).</li>
<li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies.+A+laboratory+manual%22">Antibodies. A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).</li>
<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
</ol>

저자는 이해관계의 충돌이 없습니다.

진핵 세포 유래 엑소좀을 정화하는 여러 방법이12가지개발되었다. 이에 반해, 박테리아 유래 EV7을정화하는 효과적인 방법에 대한 정보는 제한적이다. Mtb 유래 전기 EV의 효율적인 격리는 이 병원성 진균을 성장에 있는 본질적인 어려움을 고려할 필요가 있습니다. Mtb는 긴 분할 시간 (~24 h)을 가지고 있으며 생물 안전 성 수준 3 (BSL-3) 조건에서 처리해야합니다. 따라서 MEV 절연 방법의 효율을 최적화하는 것이 중요합니다. 진균은 조잡한 MEV 제제를 배지로 쉽게 응집하고 쉽게 오염시키는 글리콜리파이드 및 기타 소수성 분자를 방출하기 때문에 생화학 및 기능적 연구를 수행하기 전에 MEV를 정화하고 검증하는 것이 중요합니다. Mtb가 철 제한 조건하에서 MEV의 방출을 향상시킨다는 것을 입증한 이전 관찰에 기초하여, 철 제한 진균에서 EV 정제를 위한 프로토콜이 설치되었습니다. 또한 비악성 M. 스메그마티스는 또한 ...

진균성 세포밖 소포 (MEV)는 막 결합 된 나노 입자, 60-300 nm 크기로, 빠르고 느리게 성장하는 진균에 의해 자연적으로 방출됩니다1. 병원성 진균에 의해 방출된 MEV는 면역학적 활성 단백질, 지질 및 글리콜리피드를 통해 숙주와 상호 작용하는 메커니즘을 구성하여 농축 및 보호 방식으로분비되는 2,3,4. MEV를 특성화하고 생물 발생 및 기능을 이해하려면 소포 정화 및 검증의 엄격하고 효율적인 방법이 중요합니다. 지금까지 MEV는 철분이 풍부한 배지1,5,6,7,8에서자란 진균의 배양 여과체로부터 분리되어 왔다.
그러나, 전작에서는 철 제한이 Mtb에서 소포 방출을 크게 자극한다는 것을 보여주었으며, 아마도 MEV9에서분비되는 사이드로포어인 마이코박틴을 통해 철을 포착할 수 있습니다. 높은 철 배지에서 배양된 Mtb로부터의 MEV 격리 에 대한 절차가 설명되었지만, 낮은 철 배양물에서 MEV를 얻는 효율적인 방법은 보고되지 않았다. 따라서, 이 방법의 목적은 낮은 철 배양물에서 얻은 MEV를 분리, 정화 및 정량화하여 생화학 및 기능성 분석및 진균에서 소포 생산의 유전 적 결정요인의 분석에 사용될 수 있도록 하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Amicon 교반 셀 모델 108</td><td>EMD Milipore UFSC40001</td><td></td><td>세포 한외여과 시스템</td></tr><tr><td>BD 폴리프로필렌 225mL 원뿔형 튜브</td><td>Fisher</td><td>05-538-61</td><td>원추형 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>Biomax 100kDa 컷오프 한외여과막</td><td>EMD Milipore</td><td>PBHK07610</td><td>한외여과막</td></tr><tr><td>Chelex-100 수지</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2842</td><td>금속 킬레이트 수지</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 한천</td><td>BD Difco</td><td>262710</td><td>Mycobacterial Agar 플레이트</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Broth</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>Mycobacterial Broth 배지</td></tr><tr><td>니트로 셀룰로오스 블로팅 멤브레인</td><td>GE Healthcare</td><td>10600001</td><td>블로팅 멤브레인</td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>요오딕사놀</td></tr><tr><td>폴리카보네이트 초원심분리 튜브 25 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td>폴리카보네이트 초원심분리 튜브 25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 박막 원심분리 튜브 13 mm x 15 mm</td><td>벡크만 쿨터</td><td>344059</td><td>폴리프로필렌 박막 원심분리 튜브 13 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>단백질 분석 염료</td><td>BioRad</td><td>5000006</td><td>Bradford 단백질 염색</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby Molecular</td><td>Probes</td><td>S12000</td><td>초고감도 단백질 염색</td></tr><tr><td>TMA-DPH</td><td>분자 프로브</td><td>T204</td><td>1-(4-트리메틸암모늄페닐)-6-페닐-1,3,5-헥사트리엔p-Toluenesulfonate</td></tr><tr><td>진공 여과 플라스크</td><td>CellPro</td><td>V50022</td><td>필터 장치</td></tr></tbody></table>

철분 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 격리 및 특성화

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

인간 결핵의 원인원인 인균인 결핵 균(Mtb)을 포함한 마이코박테리아는 면역학적 활성 분자를 함유하는 세포외 소포(EV)를 자연적으로 방출합니다. 소포 생물 발생의 분자 메커니즘, 소포의 함량 및 병원체 숙주 인터페이스에서의 기능에 관한 지식은 매우 제한적입니다. 이러한 문제를 해결하려면 EV의 격리, 정화 및 검증을 위한 엄격한 절차가 필요합니다. 이전에는 M. 결핵이 숙주 환경에서 Mtb에 의해 발생하는 조건인 철제한에 노출되었을 때 소포 생산이 강화되는 것으로 나타났습니다. 여기에 제시된 완전하고 상세한 프로토콜은 철결핍 균으로부터 전기자동차를 분리하고 정화하는 것입니다. 정제 된 전기 를 검증하기 위해 정량적 및 질적 방법이 적용됩니다.

MEV는 밀도 구배에서 차등 침전물을 정제하였다(도1, 도 2). 설명된 조건하에서, MEV는 대부분 25% 이오디산올에 해당하는 그라데이션 분획 3(F3)으로 분리되었다. 이러한 결론은 단백질, 막 지질, 손상되지 않은 MEV의 현미경 시각화, 나노입자 크기 분포, 및 항베제 항혈전을 통한 양성 반응성의 검출에 기초한다(도2, 도 3). 콜로니 형성 단위(CFUs)로 정규화된 단백질 및 지질 농도는 높은 철 조건에 비해 낮은 철분에서 MEV 수율의 약 8배 증가를 보였다(50 μM FeCl3)(그림 3). 한 가지 대표적인 실험의 결과가 제시되었지만, 이는 MEV의 다중(&gt;10) ...

결핵 균은 낮은 철 조건에 응하여 세포외 소포의 증가된 생산 그리고 방출을 보여줍니다. 이 작품은 철 결핍에 응하여 풀어 놓인 진균 세포외 소포의 정제 그리고 특성화를 위한 낮은 철 조건 및 방법을 생성하기 위한 프로토콜을 상세히 기술합니다.

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

이 방법은 엄격한 낮은 철 조건에서 균균 결핵을 배양하고 낮은 철 배양 여과에서 막 소포를 정화할 수 있습니다. 철 제한은 막 소포 생산을 자극하는 것으로 알려져 있기 때문에,이 프로토콜은 추가 생화학적 또는 기능적 분석을 위해 활용할 수있는 순수한 멤브레인 소포의 높은 풍부를 산출한다. 우리는 진균 세균염, 비룰런트 균주를 사용하여 프로토콜을 시연 할 때, 이 프로토콜은 진균 결핵, 악성 균주를 사용하여 BSL-2 시설에서 수행 될 수있다.우선, 5그램의 모노포타슘 인산염, L-아스파라진 5그램, 글리세롤 20밀리리터, 플라스틱 용기에 900밀리리터의 덱스트로스 2그램을 용해하여 최소 배지 1리터를 준비한다. 5개의 일반 수산화나트륨으로 pH를 6.8로 조정하고 탈온화된 물로 1리터로 부피를 조절한다. 그런 다음 50그램의 금속 킬라팅 수지와 자기 저어바를 사용하여 섭씨 4도에서 24시간 동안 부드럽게 교반합니다.다음 날, 교반을 멈추고 수지 퇴적물을 약 30 분 동안 놓습니다. 플라스틱 수신기가 있는 22 미크론 필터 장치를 통해 여과하여 용액에서 남은 수지물을 살균하고 제거합니다. 이제 염화 아연 리터당 0.5 밀리그램, 황산 마그네슘 리터당 40밀리그램, 망간 황산염 리터당 0.1밀리그램으로 최소 배지를 보충하십시오.ADN 농축액으로 보충된 진균 국물 배지의 2밀리리터에 MTB의 단일 콜로니를 접종합니다. 섭씨 37도에서 동요로 배양하십시오. 눈에 보이는 성장이있을 때, 문화의 두 밀리리터를 추출하고 분광계에 OD 540을 측정합니다.OD 540이 0.8에 도달하면 배양을 중지하여 후기 로그산스믹 단계를 나타냅니다. 0.2 글리세롤, 0.5%Tween 80 및 ADN으로 보충된 진균 식천 접시에 후기 로고산계 배양 200마이크로리터를 확산시켰다. 적어도 5 개의 플레이트를 접종하십시오.섭씨 37도에서 접시를 배양합니다. 그리고 1 주일 후, 세균 성장은 수렴 층으로 볼 수 있습니다. 그런 다음 멸균 면봉을 낮은 철에 최소한의 매체로 적시어.이 면봉을 사용하여 한천 접시에서 박테리아를 수집하십시오. 튜브에 낮은 철 최소 매체의 100 밀리리터에 박테리아를 접종. OD 540으로 현탁액을 준비하기에 충분한 박테리아를 수집합니다.서스펜션을 1리터에서 1리터로 낮게 희석하고 중간 크기로 희석하고 멸균 플라스틱 병 2개로 나눕니다. 다음으로, 문화의 2 밀리리터를 5밀리리터 배양 튜브로 옮는다. 볼륨 타이록사폴에 의해 10% 볼륨의 마이크로리터 10을 추가합니다.14일 동안 섭씨 37도에서 문화를 배양합니다. 문화를 섭씨 20도에서 7분간 225밀리리터 원심분리기 튜브와 원심분리기 5개로 옮기십시오. 50 밀리리터 파이펫으로 배양 상체를 수집하고 필터는 0.22 미크론 필터를 통해 살균합니다.MEV를 분리하기 위해 배양 여과를 섭씨 4도에 배치한 교반세포 초여과 시스템으로 옮기고 100킬로달톤 차단막을 통해 50PSI 미만의 압력으로 농축물을 필터링한다. 그런 다음 농축 배양 여과를 섭씨 4도에서 15분 동안 15배, 000배에서 원심분리하고 폴리카보네이트 극심분리관에서 상퍼탄을 수집한다. 상심분리는 섭씨 4도에서 2시간 동안 100, 000배g에서 상피합니다.그 후, 상체를 제거하고 부드러운 파이펫팅에 의해 멸균 PBS의 총 1 밀리리터에서 음골 펠릿을 다시 중단합니다. 폴리프로필렌 얇은 벽초센심분리기 튜브 의 바닥에 60%의 iodixanol 용액의 1.5 밀리리터와 펠릿 서스펜션의 0.5 밀리리터를 혼합합니다. 이 MVE iodixanol 45% 서스펜션과 40%35%30%25%,20%의 iodixanol 솔루션과 1밀리리터의 PBS를 상단에 오버레이합니다.원심분리기는 섭씨 4도에서 18시간 동안 100g, 000배. 다음으로, 1 밀리리터 해밀턴 주사기를 사용하여 상단에서 시작하여 밀리리터 밀도 그라데이션 분획1개를 수집합니다. 수집된 각 분획을 PBS와 원심분리기로 20밀리리터로 희석하고 섭씨 4도에서 2시간 동안 000배 씩 PBS와 원심분리기를 희석합니다.PBS의 0.5 밀리리터에서 상체를 제거하고 다시 중단하십시오. 튜브를 섭씨 4도에 보관하십시오. 멤브레인 지질 분석을 수행하기 위해 각 그라데이션 분획의 10 마이크로리터를 형광막 프로브 TMA-DPH와 결합하여 96웰 블랙 플레이트의 각 웰에 있는 PBS의 50 마이크로리터에 밀리리터당 1마이크로그램의 최종 농도를 결합합니다.플레이트를 섭씨 33도에서 20분간 배양합니다. 발광을 위해 360 나노미터및 430 나노미터의 방출을 측정합니다. 이 프로토콜에서 MEV는 밀도 그라데이션에서 차동 침전에 의해 정제되었다.설명된 조건하에서, MEV는 25%iodixanol에 대응하는 그라데이션 분획 3에서 주로 분리되었다. 소포 관련 단백질은 도트 블롯 분석에 의해 표시된 분획 3개에 집중되었다. 부정적인 염색은 또한 3분분및 나노입자 분석에서 MEV의 존재를 확인했으며 MEV의 크기는 약 100 나노미터였다.콜로니 성형 단위로 정규화된 단백질 및 지질 농도는 높은 철 조건에 비해 낮은 철에서 MEV 수율의 약 8배 증가를 나타냈다. 도트 블롯 분석은 철에 충분한 MTB 배양보다 철 제한된 MTB 배양에서 밀도 그라데이션 분획에 있는 MEV 관련 마커로부터 보다 강렬한 신호를 보였다. 최소 배지의 준비 지침은 철 제한 조건을 보장하고 지단백질 골재로 막 소포의 오염을 방지합니다.이러한 방식으로 정제된 진균막 소포는 생화학적 특성화 및 기능분석에 사용될 수 있다.

isolation-characterization-extracellular-vesicles-produced-iron

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Gupta, S., et al. 철 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 분리 및 특성화. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 철분 제한 조건에서 결핵균 을 배양하여 철분 스트레스를 유도하고 박테리아 생존을 지원하는 시데로포어의 분비를 촉진하는 절차를 보여줍니다.

철분 제한 조건에서 결핵균 배양

출처: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. 철 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 분리 및 특성화. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 숙주 환경을 모방하는 철분 제한 조건에서 배양된 Mycobacterium tuberculosis 에서 세포외 소포(EV)를 단계적으로 분리하는 방법을 보여줍니다. EV 함유 분획을 농축하고 식별하기 위해 한외여과, 차등 원심분리 및 밀도 구배 분리를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.

Mycobacterium tuberculosis에서 Siderophore 함유 세포외 소포의 분리

출처: 왓슨, DC, et.al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 유전자 조작 박테리아의 외막에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 농축을 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아를 배양하여 EV를 방출한 다음 세포와 잔해물을 제거하기 위한 순차적 원심분리 및 여과 단계가 포함됩니다. 마지막으로, 한외여과는 다운스트림 분석을 위해 EV를 농축하는 데 사용됩니다.

박테리아로부터 외막 유래 세포외 소포의 분리 및 농축

이 동영상은 뇌 면역 세포인 미세아교세포에서 유래한 세포외 소포체 또는 EV를 분리하기 위해 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 기반으로 하는 방법을 설명합니다. EV는 면역 반응을 조절하는 매개체를 전달하는 분자 화물 역할을 합니다. 따라서 분리된 EV는 뉴런 면역 반응 중 미세아교세포-뉴런 누화를 연구하기 위한 체외 모델로 사용할 수 있습니다.

SEC 기반 Microglia 유래 세포 외 소포의 분리: Microglia Conditioned Culture Media에서 세포 외 소포를 분리하는 기술

이 동영상은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)의 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포체(EV)를 정제하기 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술을 보여줍니다. 이 기술은 다공성 수지 충전 컬럼을 사용하여 EV의 정제된 분획을 얻습니다. 다공성 입자는 더 작은 단백질이 기공으로 들어가도록 선택적으로 허용하여 용리 속도를 늦춥니다. 동시에 EV는 크기가 크기 때문에 모공으로 들어가는 것이 배제되고 먼저 용출됩니다.

Mycobacterial Extracellular Vesicles를 정제하기 위한 크기 배제 크로마토그래피 기술

혈액에 존재하는 세포외 소포체는 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커로 제안되었습니다. 여기에서는 말초 혈액 샘플에서 대형 원형질막 유래 미세소포를 분리하고 기존 유세포 분석 및 웨스턴 블로팅(Western Blotting)을 통한 후속 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다.

말초 혈액에서 마이크로 소포의 분리 및 특성

본 프로토콜은 시아노박테리아 배양물로부터의 세포밖 소포의 분리, 농도 및 특성화에 대한 상세한 설명을 제공한다. 서로 다른 규모의 문화에서 소포를 정화하기위한 접근법, 방법론 간의 절충점 및 현장 샘플 작업을위한 고려 사항도 논의됩니다.

시아 노 박테리아 세포 밖 소포의 분리 및 특성 분석

이 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피, 배양 상청액으로부터 Mycobacterium tuberculosis 세포밖 소포를 풍부하게하기 위한 용이하고 재현 가능한 기술을 기술한다.

마이코박테리움 결핵 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포밖 소포 농축

제안된 프로토콜에는 세포 배양 상층액에서 세포외 소포를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

암 세포주에서 유래한 낮은 내독소 함량 세포외 소포의 분리

이 프로토콜은 Mycobacterium smegmatis(Msm)의 액센 배양에서 천연 마이코박테리아 세포외 소포체(mEV)의 농축과 mCherry(적색 형광 리포터) 함유 재조합 MsmEV를 설계하고 농축할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 EsxA 단백질을 함유한 MsmEV의 농축을 통해 새로운 접근법을 검증합니다.

마이코박테리아의 native and recombinant extracellular vesicles 농축

이 프로토콜은 효소 소화 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 소변 골격근과 골수에서 작은 세포외 소포를 분리하여 구조적으로 복잡하고 저수율 조직에서 소포 농축 분획을 재현 가능하게 회수하여 하위 분자 분석에 활용할 수 있도록 합니다.

크기 배제 크로마토그래피를 이용한 쥐 골격근 및 골수에서 작은 세포외 소포 분리

배우세요 철분 제한 조건에서 Mycobacterium tuberculosis를 배양하고 세포외 소포를 정제하는 방법을. 이 프로토콜은 BSL-2 시설에서도 적용 가능하며, 세포외 소포의 생화학적 특성 분석에 활용됩니다.

철분 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 격리 및 특성화

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