Name: 환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 학습하세요 환자 유래 전립선암 뼈 전이 3D 오르가노이드 배양 프로토콜을. 최적화된 배양법으로 종양 이질성을 유지하며 치료 반응 연구에 활용할 수 있는 생체 외 모델을 구축합니다.

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이 연구는 레오와 앤 앨버트 자선 재단과 JM 재단에 의해 지원되었다. 우리는 캘리포니아 샌디에고 무어암 센터 회원, Jing Yang 박사 및 케이 T. Yeung 박사가 기술 전문 지식에 대한 수술학과의 마이크로토메와 랜달 프랑스어의 사용을 허용해 주신 것에 대해 감사드립니다.

이 연구는 캘리포니아 샌디에이고 대학 (UCSD) 기관 검토 위원회 (IRB)에 대한 가이드의 권고에 따라 엄격하게 수행되었다. IRB #090401 승인은 UCSD 기관 검토 위원회 (IRB)에서 연구 목적을 위해 환자에게서 외과 견본을 집합하기 위하여 수신되었습니다. 각 환자로부터 동의를 얻어 외과용 뼈 전립선암 전이 시편은 대퇴골의 병리학적 골절의 정형외과적 수리로부터 얻어졌다. 동물 프로토콜은 캘리포니아 샌디에이고 대학 (UCSD) 동물 복지 및 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 승인 된 프로토콜 #S10298 하에 수행되었습니다. 기계적 및 효소적 해리된 환자 종양 조직으로부터의 세포는 앞서설명한바와 같이 6 내지 8주 령 의 남성Rag2-/-및 γ c-/- 마우스로 내-대퇴로 주입되었다. 이종이식 종양 부피는 생체 내 생물 발광 이미징 시스템 및 캘리퍼스 측정을 사용하여 결정되었다. 종양 성장 시 최대 2.0 cm (IACUC에 의해 승인 된 최대 허용 크기), 종양은 3D 오르가노이드 확립을 위해 수확되었다.
참고: 그림 1은 실험 절차의 각 단계에 대한 3D 오가노이드 및 프로토콜 번호를 설정하기 위한 워크플로우를 보여 주며, 이에 대한 워크플로우를 보여 주다.
1. 환자 유래 이종이식(PDX) 종양 조직의 처리
참고: 이것은 이종이식 마우스 모델에서 파생된 종양에 대한 오르가노이드 확립을 위한 초기 단계이다. 이 프로토콜은 Drost et al.5에 의해 이전 간행물에서 적응하 고 우리는 organoid 매체에 혈 청 보충을 포함 하도록 미디어 조건을 수정 했습니다.
<ol><li>아래에 기재된 바와 같이 종양 시편을 처리한다.<ol>
<li>종양 샘플을 1-3 mm3 크기의 조각으로 다진 후 실온에서 45 분 동안 10 mL의 세포 해리 액으로 샘플을 소화합니다.</li>
		<li>소화를 종료하려면 샘플에 20 mL의 DMEM 완전 미디어를 추가합니다.</li>
		<li>70 μm 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 걸. 멸균 플런저 플랜지를 사용하여 남은 조직을 70 μm 세포 스트레이너 의 상단에 밀어 넣습니다.</li>
		<li>4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리기.</li>
		<li>신선한 adDMEM 완전 매체로 세포 펠릿을 세 번 세척하십시오. 세척 및 재서스펜션용 용지의 볼륨을 표 3에제시된 용지 의 양과 일치시다. 예를 들어, 24웰 플레이트 배양 조건의 경우, 세척용 부피는 500 μL이어야 한다. 참고: 표 3에나타낸 바와 같이 프로토콜은 다른 문화 조건에 적용할 수 있다.</li>
		<li>Trypan 파란색 염료와 혈세포계를 사용하여 최종 셀 수를 결정합니다.</li>
		<li>세포 수를 얻은 후, 2 x 106 종양 세포 당 PBS에서 2% FBS의 80 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단시켰다.</li>
		<li>2 x 106 종양 세포 당 마우스 세포 고갈 칵테일 20 μL을 추가하십시오. 잘 섞고 2-8 °C에서 15 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>2 x 106 종양 세포 당 PBS 완충액에서 2 % FBS로 500 μL로 볼륨을 조정하십시오. 참고: 2.5 mL의 세포 현탁액에서 최대 1 x 107 종양 세포를 하나의 LS 컬럼에서 처리할 수 있습니다.</li>
		<li>LS 컬럼을 마그네틱 컬럼 분리기위에 로드하고 15mL 원엽 튜브를 랙 아래에 배치하여 흐름을 수집합니다.</li>
		<li>PBS 버퍼에서 3 mL의 2% FBS로 각 컬럼을 헹구고 있습니다. 세척 흐름으로 원엽 튜브를 버리고 새로운 멸균 된 15mL 원엽 튜브로 교체하십시오.</li>
		<li>세포 현탁액 (1 x 107 종양 세포의 최대 2.5 mL)을 컬럼에 추가합니다. 인간 종양 세포로 농축될 흐름을 수집한다.</li>
		<li>PBS 버퍼에서 2% FBS의 1 mL로 컬럼을 두 번 세척합니다. 참고: 열이 비어 있는 즉시 세척 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 또한 기포가 형성되지 않도록하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원하는 배양 설정에 대한 1.5 mL 튜브에 적절한 양의 세포 현탁액을 Aliquot(표3).</li>
	<li>1.5 mL 튜브를 300 x g및 4°C에서 5분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>조심스럽게 제거하고 상급을 폐기.</li>
</ol>2. 환자 원발성 종양 조직의 처리
참고 : 이것은 오르가노이드 설립을위한 초기 단계입니다.
<ol><li>환자 1 차적인 종양 조직의 처리를 위해 필요하지 않은 마우스 세포 고갈 과정을 제외하고 1단계의 전부를 따르십시오.</li>
</ol>3. 플레이트에 부착 된 둥근 돔 형성
참고: 이 원고는 그림 1 및 그림 2에 나타낸 바와 같이 세포 펠릿과 지하 막(예를 들어, 마트리겔)의 혼합물로부터 돔을 만드는 세 가지 방법을 설명합니다. 단계 2-4에서, 세포와 지하 막은 지하 막의 응고를 방지하기 위해 얼음에 보관되어야한다.
<ol><li>24웰 플레이트셋에 대해 적절한 부피의 지하막(예를 들어, 40 μL)으로 세포 펠릿을 재중단한다(표3).</li>
	<li>피펫을 위아래로 부드럽게 하여 세포가 지하 막에 잘 다시 매달려 있는지 확인합니다.</li>
	<li>세포-지하 막 혼합물의 적절한 부피(표3)를피펫(및 adDMEM 완전 배지의 선택적 10 μL)을 예열된 조직 배양 판의 중심으로 한다.</li>
	<li>플레이트를 반전시키고 즉시 플레이트를CO2 세포 배양 인큐베이터에 거꾸로 놓고 5%CO2,37°C에서 15분 동안 설정하였다. 이것은 지하실 막이 고형화하는 것을 허용하면서 세포가 침전되고 플레이트 바닥에 고수하는 것을 방지합니다.</li>
	<li>10 μM Y-27632 디하이드로클로라이드를 함유하는 미리 온난화배지의 적정 부피(표3)를각 웰내로 피펫한다.</li>
	<li>플레이트를CO2 세포 배양 인큐베이터 내부에 오른쪽으로 놓습니다(5%CO2,37°C).</li>
	<li>3-4일마다 미디어를 변경합니다. 5-7일 후, 배양배지를 10 μM Y-27632 디하이드로클로라이드 없이 사용하여 배양을 유지하였다.</li>
</ol>4. 플레이트에 부착 된 둥근 돔에서 부동 돔 형성
<ol><li>3.7단계 후, 셀 스크레이퍼를 사용하여 돔을 분리한다.</li>
</ol>5. 부동 구슬 형성
참고 : 이 프로토콜은 지하 막, 미디어 및 오르가노이드의 혼합물이 구슬처럼 보이기 때문에 부동 구슬로 명명됩니다.
<ol><li>파라핀 필름 의 2 인치 x 4 인치 조각을 잘라.</li>
	<li>1000 μL 플라스틱 파이펫 팁 박스에서 빈 팁 홀딩 랙의 디봇 상단에 파라핀 필름을 놓습니다.</li>
	<li>부드럽게 장갑 검지 손가락을 사용하여 디봇을 추적하기 위해 파라핀 필름을 아래로 누릅니다하지만 파라핀 필름을 뚫지 않고.</li>
	<li>파라핀 필름을 70% 에탄올로 분무하고 세포 배양 후드에 UV 램프를 켜서 제조된 파라핀 필름을 30분 이상 살균하였다.</li>
	<li>세포와 20 μL의 지하 막을 혼합하여 준비합니다. 파종 밀도는 돔당 50,000 - 250,000 셀일 수 있습니다.</li>
	<li>피펫은 제조된 파라핀 막에서 형성된 디봇의 몰드 내로 1단계 또는 2단계, 및 20 μL의 지하막으로부터 처리된 세포의 혼합물이다.</li>
	<li>지하 막에 세포 펠렛을 다시 중단하고 제조된 파라핀 촬영 디봇에서 세포 현탁액을 피펫한다.</li>
	<li>고형 비즈와 파라핀 필름을 6웰 플레이트에 넣습니다. 6 웰 플레이트에 하나의 우물은 5 구슬까지 들어갈 수 있습니다.</li>
	<li>10 μM Y-27632 디하이드로클로라이드를 함유하는 미리 가열된 배지의 피펫 3-5 mL을 각 우물에 넣고 파라핀 필름에서 구슬을 부드럽게 닦아냅니다. 참고: 최소 볼륨으로 3mL를 권장합니다. 웰당 최대 비드 수(N=5)의 경우 중간 크기 5mL를 권장합니다.</li>
	<li>플레이트를CO2 인큐베이터(5%CO2,37°C) 내부에 놓습니다.</li>
	<li>3-4 일마다 오르가노이드 매체를 변경하십시오. 5-7일 후, 배양배지를 10 μM Y-27632 디하이드로클로라이드 없이 사용하여 배양을 유지하였다.</li>
</ol>6. 현미경을 사용하여 생체 내 오르가노이드 이미지 스티치8
참고 : 특정 현미경은 세포 판 (가장자리 벽)의 외부 둘레에 도달 할 수 없습니다; 따라서 이미지 스티칭 할 때 셀 플레이트의 둘레에 가까운 웰을 사용하는 것이 좋습니다.
<ol><li>키ence 현미경의 플레이트 홀더에 세포 배양 판을 위쪽으로 놓습니다.</li>
	<li>렌즈를 대상 돔의 중앙에 놓습니다.</li>
	<li>프레임 수를 선택하여 자동 스티칭 프로세스를 설정합니다. 예를 들어 3 x 3 또는 5 x 5를 선택하여 총 9개의 이미지 또는 25개의 이미지를 생성할 수 있습니다.</li>
	<li>캡처 버튼을 눌러 이미징 프로세스를 시작합니다.</li>
	<li>이미지 뷰어 소프트웨어를 열고 4단계로 촬영한 이미지 그룹을 로드합니다.</li>
	<li>이미지 스티칭을 클릭하여 고해상도 스티치 이미지를 만듭니다. 참고: 직렬 9 또는 25개의 이미지 캡처는 셀에 초점을 맞추도록 수동 또는 자동 설정으로 수행할 수 있습니다.</li>
</ol>7. 조직학을위한 오르가노이드 처리 : 아가로스 스핀 다운 방법
참고 :이 프로토콜은 블라코기아니스 외7에의해 이전 출판물에서 적응된다 . 우리는 성공적으로 오르가노이드의 모든 인구를 포함하기 위해 아가로즈 포함과 관련된 단계를 추가했습니다.
<ol><li>웰에서 기존 미디어를 제거합니다. 지하 멤브레인 돔을 흡인하지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>동일한(1단계에서 제거된 용지의 부피와 동일)을 추가하고 4°C에서 60분 동안 배양합니다.</li>
	<li>파이펫을 사용하여 지하 멤브레인 돔을 빼내고 파이펫 팁을 사용하여 지하 멤브레인 돔을 분쇄합니다. 1.5 mL 튜브에서 해리 된 돔 및 세포 회수 용액을 수집합니다.</li>
	<li>300 x g및 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>상급 (세포 복구 용액)을 제거하십시오. 최종 펠릿 단계에서 오르가노이드의 존재가 확인될 때까지 모든 상수체를 별도의 튜브에 저장합니다.</li>
	<li>차가운 PBS의 원하는 부피(표3)를추가하고 기계적으로 펠릿을 방해하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫을 피펫합니다.</li>
	<li>300 x g및 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>상급체(PBS)를 제거합니다.</li>
	<li>펠렛을 상온에서 60분 동안 4% PFA의 24웰 플레이트 배양 조건, 표 3으로부터1개의 펠렛에 대해 일치하는 부피(예를 들어, 500 μL)로 고정한다.</li>
	<li>고정 후, 300 x g및 4°C에서 5분 동안 원심분리기를.</li>
	<li>상급체(PFA)를 제거합니다.</li>
	<li>일치하는 부피(예를 들어, 24웰 플레이트 배양 조건, 표 3)에서1개의 펠릿에 대해 300 x g 및 4°C에서 5분 동안 세척한다.</li>
	<li>따뜻한 아가로즈 (PBS에서 2 % 아가로즈)를 준비하십시오. 참고: 여기서, 동결된 단면도에 대한 세포 펠릿은 프로토콜 7에서 추가단계 없이 OCT 화합물의 200 μL에서 직접 재부유될 수 있다.</li>
	<li>아가로스의 200 μL에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단 (PBS에서 2 %).<ol>
<li>아가로스를 첨가한 직후, 1mL 주사기에 부착된 25G 바늘을 사용하여 1.5 mL 튜브의 벽에서 세포 펠릿을 부드럽게 분리합니다. 도 3에도시된 바와 같이, 세포 펠릿이 1.5 mL 튜브의 벽으로부터 물리적으로 분리되지 않은 경우, 아가로스 임베딩 공정 동안 세포 펠릿의 전부 또는 일부를 잃을 위험이 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS에서 2 % 아가로즈가 완전히 응고 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브로부터 고형화된 아가로즈 블록을 1 mL 주사기에 부착된 25 G 바늘을 사용하여 분리한다.</li>
	<li>세포 펠릿을 함유하는 분리된 아가로즈 블록을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮김을 전달한다.</li>
	<li>튜브를 70% EtOH로 채우고 조직 탈수 및 파라핀 삽입을 위한 종래의 프로토콜을 사용하여 추가로 진행한다.</li>
</ol>8. 오르가노이드의 조직학 및 면역형광 세포화학(IFC)
<ol><li>역학 또는 IFC에 대한 슬라이드를 선택합니다.</li>
	<li>염색 과정을 시작하기 전에 슬라이드에 있는 셀의 위치를 알아내고 마커를 사용하여 슬라이드의 셀 주위에 원을 그립니다.</li>
	<li>슬라이드의 가장자리 또는 보더 주위와 실험실 노트북의 슬라이드에 원이 있는 위치를 그려 위치를 기록합니다.</li>
	<li>원하는 염색을 수행합니다. 참고 : 이 과정에서 일반 제조업체가 화학 물질에 내성이 없기 때문에 표시된 원이 사라집니다. 심지어 일부 반학 영구 마커는 염색 과정에서 지워질 수 있습니다.</li>
	<li>염색 과정을 마친 후 실험실 노트북의 도면 위에 슬라이드를 놓아 슬라이드의 셀 위치를 찾습니다.</li>
</ol>

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</ol>

이상희와 크리스티나 A.M. 제이미슨은 조브 메소드 컬렉션의 게스트 편집자입니다.

환자 뼈 전이 전립선 암 세포에서 파생 된 3D 오르가노이드는 여전히 상대적으로 드뭅니다. 여기서는 BMPC의 직렬 3D 환자 유래 오르가노이드(PSO)를 성공적으로 확립하기 위한 전략과 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 또한, 프로토콜은 IFC 및 IHC 분석을 위해 더 낮은 세포 밀도를 가진 샘플에서 오르가노이드를 고정하기 위해 설명된다. 낭종, 스페로이드 및 더 복잡한 오르가노이드의 형태로 차동 표현형은이 프로토콜이 환자에서 이종 종양 세포 집단이 세포 표현형 과 구조를 유지할 수있는 배양 조건을 제공한다는 것을 나타냅니다. 따라서, 여기에 기술된 배양 조건은, Drost et al.5로부터 FBS 혈청 보충으로 변형된, 환자 BMPC 유래 세포의 배양에 최적인 것으로 나타났으며, 이들이 그들의 주제 내 및 주제 간 이질성을 유지하도록 하였다(제조중인 원고).
당사의 최적화된 프로토콜은 3D 오르가노이드 배양을 설정하기 위해 1차 또...

3차원 배양 오르가노이드는 생체 내 아키텍처, 세포 기능 및 그들의 원래 조직의 유전적 서명을 되풀이할 수 있는 잠재력에 대해 관심을 끌고 있다1,2,3,4,5. 가장 중요한 것은, 환자 종양 조직 또는 환자 유래 이종이식 (PDX) 모델에서 설립 된 3D organoids는 종양 발생시 세포 신호의 메커니즘을 이해하고 각 세포집단6, 7,8,9,10,11,12,13에대한 약물 치료의 효과를 결정하는 귀중한 기회를 제공한다. Drost 등 5 는 비뇨기과 분야에서 널리 채택된 인간 및 마우스 전립선 오르가노이드의 확립을위한 표준 프로토콜을 개발했습니다. 또한, 3D 오르가노이드의 추가 특성화및 종양발생 및 전이의 상세한 기전을 이해하기 위해상당한 노력이 전념되어 왔다4,12,14,15. 3D 오르가노이드 배양에 대한 이전에 확립되고 널리 인정된 프로토콜 외에도 최적화된 배양 조건에서 세 가지 다른 도밍 방법을 사용하여 PDO의 3D 배양에 대한 단계별 프로토콜을 설명합니다.
이 원고에서, 3D 오르가노이드는 뼈 전이성 전립선암 (BMPC)의 ex vivo 모형으로 설치되었습니다. 이러한 배양에 사용되는 세포는 전립선암 샌디에이고(PCSD) 계열로부터 유래되었으며 환자 전립선암 뼈 전이성 종양 조직(PCSD18 및 PCSD22) 또는 환자 유래 이종이식(PDX) 종양 모델(PCSD1, PCSD13 및 PCSD17)으로부터 직접 유래하였다. 전립선암 세포의 자발적인 골 전이는 유전자 조작 마우스모델(16)에서드물기 때문에, 우리는 인간 종양 세포를 남성Rag2-/-γc-/- 마우스로 직접 대퇴내 주사하여 뼈 전이성 전립선암의 PDX 모델을확립하였다 17.
일단 3D 오르가노이드가 이질적인 환자 종양 세포 또는 환자 유래 이종이식에서 확립되면, 전립선 종양 세포로서의 그들의 정체성을 확인하고 3D 오르가노이드 배양에서 그들의 표현형을 결정하는 것이 필수적이다. 면역형광 화학(IFC)은 각 세포에서 의 단백질 발현을 시각화할 수 있게 하며, 종종 특정 세포 집단에 대한 잠재적인 기능을 나타내는2,4. 일반적으로 조직 및 세포를 포함한 대부분의 시료에 대한 IFC 프로토콜은 간단하고 완전히 최적화되어 있습니다. 그러나, 세포 밀도 및 오르가노이드의 수는 종래의 배양보다 현저히 낮을 수 있다. 따라서, 오르가노이드에 대한 IFC 프로토콜은 샘플의 모든 오르가노이드에 대해 파라핀에 적절한 처리 및 포함을 보장하기 위한 추가 단계가 필요합니다. 우리는 특히 오르가노이드의 샘플이 원하는 것보다 낮은 세포 밀도가있을 때 오르가노이드에 IFC의 성공률을 증가 슬라이드에 단면 오르가노이드의 위치를 표시하는 아가로스 사전 포함 과정에 대한 추가 단계를 설명하고.

<table><tbody><tr><td>1mL Pipettman</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>1mL 주사기</td><td>BD 주사기</td><td>329654</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 튜브</td><td>스펙트럼 실험실 제품</td><td>941-11326-ATP083</td><td></td></tr><tr><td>25G 바늘</td><td>BD PrecisionGlide 바늘</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드(PFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올(EtOH)</td><td>VWR</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>혁신적인 세포 기술, Inc.</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>adDMEM</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50000</td><td></td></tr><tr><td>항체 -Cytokeratin 5</td><td>Biolegend</td><td>905901</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin 8</td><td>Biolegend</td><td>904801</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Bioluminescence 이미징 시스템, IVIS 200</td><td>Perkin Elmer Inc</td><td>IVIS 200</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트 - 24웰</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트 - 48</td>웰 <td>Costar</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트 - 6</td>웰 <td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>세포 해리 솔루션, Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>세포 회수 솔루션</td><td>Corning</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>Sarstedt</td><td>83.180</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>3546</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>벡터 벡타실드</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DHT</td><td>시그마-알드리치</td><td>D-073-1ML</td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Corning/Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>포셉스</td><td>Denville Scientific</td><td>S728696</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi</td><td>130-0420401</td><td></td></tr><tr><td>자기 컬럼 분리기 : QuadroMACS 분리기</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>마커</td><td>VWR</td><td>52877-355</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (성장 인자 감소)</td> <td>Mediatech Inc. (코닝)</td><td></td><td></td>356231</tr><tr><td>Matrigel (High Concentration)</td> <td>BD (Fisher Scientific)</td> <td>CB354248</td><td></td></tr><tr><td>현미경 이미징 소프트웨어, Keyence</td><td>BZ-X800 (최신 소프트웨어) BZ-X700 (구형 소프트웨어)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>현미경, Keyence</td><td>BZ-X700 (모델 2016-2017) / BZ-X710 (모델 2018-2019)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>마우스 세포 고갈 키트</td><td>Miltenyi</td><td>130-104-694</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸시스테인</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>노긴</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>OCT 복합</td><td>티슈-텍</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>아메리칸 내셔널 캔</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Mediatech Inc. (코닝)</td><td>30-002-CI-1</td><td></td></tr><tr><td>1 mL용 피펫 팁(파란색 팁)</td><td>Fisherbrand Redi-Tip</td><td>21-197-85</td><td></td></tr><tr><td>플런저(3 mL 주사기에서)</td><td>BD 주사기</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>프로스타글란딘 E2</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin 1</td><td>Trevigen</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>SB2021190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7076-25MG</td><td></td></tr><tr><td>소형 테이블 상판 원심분리기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002426</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Fisher Sci</td><td>2320</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochloride</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3d) 오르가노이드의 설립 및 분석

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

인간 환자의 종양 표본과 환자 유래 이종이식(PDX) 전립선암 모델에서 오가노이드의 3차원(3D) 배양, 환자 유래 오르가노이드(PDO)로 지칭되는, 종양 발생 과 전립선 암의 전이. 그들의 주요 장점은 기존의 세포주와 비교하여 본래 조직의 독특한 게놈 및 기능적 이질성을 유지한다는 것이다. 더욱이, PDO의 3D 배양은 개별 적인 환자에 대한 약물 치료의 효력을 예측하기 위하여 이용될 수 있고 개인화한 약을 향한 단계입니다. 이러한 장점에도 불구하고, 몇몇 단은 다른 참을성 있는 견본을 위해 요구될 수 있는 PDO 문화 조건의 광대한 최적화 때문에 부분적으로 이 방법을 일상적으로 이용합니다. 우리는 이전에 우리의 전립선암 뼈 전이 PDX 모델, PCSD1, 항 안드로겐 치료에 기증자 환자의 뼈 전이의 저항을 재입증했다. 우리는 항 안드로겐 저항의 메커니즘을 더 특성화하기 위해 PCSD1 3D 오르가노이드를 사용했습니다. PDX 및 PDO 모델에 대한 현재 발표된 연구에 대한 개요에 따라 최적화된 배양 조건에서 돔형 또는 부동 지하 멤브레인(예: Matrigel) 구를 사용하여 PDO의 3D 배양에 대한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 생체 내 스티치 이미징 및 세포 가입은 세포학에 대해서도 설명되어 있다. 이 프로토콜은 웨스턴 블롯, 공동 배양 등을 포함한 다른 응용 분야에 더욱 최적화될 수 있으며 약물 내성, 종양발생, 전이 및 치료법과 관련된 3D 배양 PDO의 특성을 탐구하는데 사용될 수 있다.

3D 오르가노이드는 환자 유래 이종이식(PDX) 모델인 골전이성 전립선암(BMPC)뿐만 아니라 환자 골전이성 전립선암 조직으로부터 직접 적으로 확립되었다(그림4). 간단히, BMPC의 우리의 PDX 모델은 남성 Rag2-/- c-/- 마우스로 종양 세포의 대퇴 내 (IF) 주입에 의해 설립된 다음 PDX 종양을 수확하고 이 원고에 기술된 대로 처리하였다. 그림 4에도시된 바와 같이, PCSD 시리즈의 PDX 종양 조직은 이 프로토콜을 사용하여 형성된 낭종, 스페로이드 및 더 높은 복잡성 오르가노이드로서 나타나는 차동 표현형을 가진 3D 오르가노이드를 초래했다.
25 개의 고해상도 10 x 배율 이미지에서 스티치 이미지는 지하 막과 오르가노이드의 전체 돔을 보여 주었다(그림 5). 이...

환자 BMPC 견본및 뼈 전이성 전립선암의 이종이식의 3차원 배양은 낭종, 스페로이드 및 복잡한, 종양 같이 organoids의 결과로 그들의 본래 종양의 기능적인 이질성을 유지합니다. 이 원고는 IFC를 사용하여 이기종 환자 유래 샘플 및 이들의 분석의 3D 배양에 대한 최적화 전략 및 프로토콜을 제공한다.

환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

우리는 뼈 전이성 전립선암의 직렬 3D 환자 파생 오르가노이드를 확립하기 위한 전략및 단계별 프로토콜을 기술합니다. 당사의 최적화된 프로토콜은 환자 또는 환자 유래 xenograft 종양 조직에서 직접 제한된 시작 물질을 사용하여 실험을 위한 3D 배양을 설정하는 것이 실용적입니다. 이 프로토콜에서 3D 오르간로이드는 뼈 전이성 전립선 암 병리학의 기본 메커니즘을 이해하고 치료를 테스트하기 위해 ex vivo 모델로 사용될 수 있습니다.이 프로토콜의 3D 오르간구배기 배지는 전립선 유래 세포에 특이적이다. 우리의 프로토콜의 그밖 부분은 종양 조직 및 전이성 사이트의 다른 모형에 적용됩니다. 도밍 기술은 이 과정에서 가장 어려운 부분일 수 있습니다.도밍 기술을 연습하면 오르가노이드, 미디어 및 마모젤의 돔 혼합물의 일관된 크기를 보장하고 샘플 서스펜션 동안 거품 형성을 최소화합니다. 시각적으로이 방법을 시연하는 것은 성공적으로 세포의 낮은 수에서 낮은 밀도 오르가노이드를 배양하기 위한 점성 마트리겔을 처리하는 방법의 더 나은 이해를 제공합니다. 24웰 플레이트 설정을 위해 지하 멤브레인의 적절한 부피에서 세포 펠릿을 다시 중단하여 시작합니다.피펫은 세포가 다시 중단되도록 부드럽게 위아래로, 다음 사전 따뜻하게 조직 배양 플레이트의 중심으로 세포 현탁액의 적절한 볼륨을 피펫. 플레이트를 반전시키고 즉시 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정된 세포 배양 배양에 거꾸로 놓습니다. 피펫은 각각의 우물에 10 마이크로몰러 Y-27632 디하이드로염화물을 포함하는 미리 데워진 배지의 적절한 부피이다.연결된 둥근 돔에서 부동 돔을 형성하려면 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 돔을 분리합니다. 파라핀 필름을 2x 4인치 자르고 1밀리리터 플라스틱 파이펫 팁 박스에서 선반을 들고 있는 빈 팁의 디봇 위에 놓습니다. 장갑을 낀 검지 손가락을 사용하여 파라핀 필름을 부드럽게 눌러 영화를 돌파하지 않도록 주의를 기울이는 디봇을 추적합니다.파라핀 필름을 70% 에탄올로 분무하고 세포 배양 후드의 UV 램프를 켜서 준비된 필름을 30분 이상 살균한다. 한편, 지하 막의 20 마이크로 리터에서 미리 처리 된 세포를 다시 중단. 그런 다음 파라핀 필름에 형성된 디봇으로 서스펜션을 피펫합니다.고체 구슬과 파라핀 필름을 6웰 플레이트에 넣고 파라핀 필름에서 구슬을 부드럽게 닦으면서 10개의 마이크로몰러 Y-27632 디하이드로클로라이드를 각각 양호에 담아 온전한 매체의 파이펫 3~5밀리리터를 넣습니다. 조직학에 대한 오르가노이드를 처리하려면 지하 멤브레인 돔을 흡인하지 않도록주의하는 우물에서 기존 미디어를 제거하십시오. 동일한 양의 세포 회수 용액을 추가하고 섭씨 4도에서 60 분 동안 플레이트를 배양하십시오.인큐베이션 후 파이펫을 사용하여 지하 멤브레인 돔을 빼내고 파이펫 끝으로 분쇄합니다. 해리된 돔과 세포 회수 용액을 1.5 밀리리터 튜브로 수집합니다. 5 분 동안 섭씨 4도에서 300 배 g에서 튜브를 원심 분리 한 다음 상체를 제거하고 따로 둡니다.오르가노이드의 존재가 차가운 PBS의 원하는 부피에서 확인될 때까지 모든 초월제를 저장하고 부드럽게 피펫 위아래로 오르가노이드를 방해하지 않고 펠릿을 기계적으로 제거합니다. 원심분리를 반복하고 상체를 제거합니다. 펠릿을 4%PFA의 일치하는 부피로 실온에서 60분 동안 수정합니다.고정 후 원심분리 단계와 PBS 세척을 반복합니다. 그런 다음 천천히 200 마이크로 리터의 따뜻한 2 % 아가로즈를 추가하고 즉시 하지만 부드럽게 1 밀리리터 주사기에 부착 된 25 게이지 바늘을 사용하여 방해하지 않고 튜브 벽에서 세포 펠릿을 분리. 아가로즈 스핀 다운 방법의 경우, 25 게이지 바늘을 사용하여 아가로즈를 첨가한 직후 튜브의 벽에서 세포 펠릿을 분리하는 것이 중요합니다.아가로즈가 완전히 굳어지면, 1밀리리터 주사기에 부착된 25 게이지 바늘로 튜브에서 분리하여 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮겨냅니다. 튜브를 70%에탄올로 채우고 조직 탈수 및 파라핀 포함을 위한 기존의 프로토콜을 진행한다. 이 프로토콜은 성공적으로 암 조직에서 직접뿐만 아니라 뼈 전이성 전립선암의 환자 파생 된 xenograft 모델에서 3D 오르가노이드를 확립하는 데 사용되었다.오르가노이드는 낭종, 스페로이드 및 더 높은 복잡성 오르간노이드로 나타나는 다른 표현형을 표시했습니다. 지하 멤브레인과 오르가노이드의 전체 돔은 25 개의 고해상도 10 배율 이미지에서 스티치 된 이미지에서 볼 수 있습니다. 종양 조직을 더욱 조사하기 위해, 면역형광 세포화학은 기저 상피 세포 마커 시토케라틴-5, 발광 상피 세포 마커 시토케라틴-8 및 DAPI를 대상으로 하는 오르가노이드의 5마이크로미터 두께의 파라핀 섹션에서 수행되었다.이 프로토콜은 3D 오르가노이드의 특성과 약물 치료의 효과를 탐구하기 위해 서양 블로팅, 공동 배양 및 유동 세포측정과 같은 다른 응용 분야에 최적화 될 수 있습니다. 이 실험은 약물 저항의 기계장치 및 새로운 치료의 효험을 단독으로 또는 현재 치료와 조합하여 해결할 수 있었습니다. 이 기술의 3D 오르간노이드는 주제 간 및 주제 내 이질성을 유지하므로 환자에서 질병의 보다 정확한 모델입니다.이 기술은 연구원이 환자에서 질병 진행과 치료에 대한 반응의 더 예측 가능 할 수있는 약물 내성, 종양 발생, 전이 및 치료의 메커니즘을 탐구하는 방법을 포장합니다.

establishment-analysis-three-dimensional-3d-organoids-derived-from

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

종양에서 유래한 오가노이드는 종양의 병리학적 특징과 장기 특이적 세포 계통을 유지할 수 있는 일종의 3D 세포 배양 모델입니다. 예시 프로토콜에서는 과학자들이 유전자 조작 마우스 모델로부터 전립선 종양으로부터 오가노이드를 생성하는 것을 볼 수 있습니다.

종양에서 오가노이드 준비: 3D 체외 종양 모델

이 원고는 순환 종양 세포(CTC)에서 전립선암 환자 유래 이종이식편(PDX)을 생성하는 데 사용되는 방법을 자세히 설명합니다. CTC에서 PDX 모델을 생성하면 전립선암을 연구하기 위한 대체 실험 모델을 제공합니다. 가장 흔하게 진단되는 종양이며 남성의 암으로 인한 사망 원인이 빈번합니다.

전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생

전립선암은 미국에서 암 관련 사망의 두 번째로 흔한 원인입니다. 정소성 암 모델은 전립선암의 생물학을 이해하고 치료 요법의 효능을 평가하는 데 유용한 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜은 정형소 전립선암 마우스 모델을 확립하는 데 필요한 자세한 단계를 설명합니다.

인간의 전립선 암의 전 임상 동소 이식 쥐 모델

여기, 우리 인간의 기본 전립선 organoid 처리 안내 다음 끝점 표현 형을 평가 하는 것이 좋습니다 프로토콜을 제시. 시드, 문화 유지 보수, 매트릭스 젤에서 복구 형태 론 적 정량화, 포함 및 단면, FFPE 단면, 전체 마운트 얼룩, 및 상업적인 분석의 응용 프로그램 설명 합니다.

처리 및 인간의 기본 전립선 Organoid 문화에 대 한 평가

우리는 전립선 종양 해부에 초점을 맞춘 마우스 전립선 암 모델의 부검 및 해부를위한 방법을 보여줍니다. 마우스 전립선 종양 오르가노이드의 생성을 위한 단계별 프로토콜도 제시된다.

전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성

여기에 제시된 것은 전립선 상피 오르가노이드의 약리학적 반응을 연구하는 프로토콜이다. 오르가노이드는 생체 생물학과 밀접하게 유사하며 환자 유전학을 재현하여 매력적인 모델 시스템을 만듭니다. 전립선 오르가노이드는 야생형 전립선, 유전자 조작 마우스 모델, 양성 인간 조직 및 고급 전립선암에서 확립될 수 있습니다.

약리학적 반응에 유전형과 돌연변이 단면도를 번역하는 공구로 전립선 오르가노이드 문화

시험관 내 스크리닝을 위해 환자 유래 제노이식(PDX)을 사용하여 오가노이드를 생성하여 생체내/생체 외 모델의 쌍을 매칭하는 방법을 설명합니다. PDX 종양은 기계적 또는 효소적으로 작은 조각으로 수확/처리되었으며, 원래 PDX에 대해 처리, 냉동 보존 및 특징인 종양 오르가노이드를 성장시키는 영리한 방법.

암 약리학 연구를 위한 PDX 및 PDX 유래 오르가노이드의 생체내/생체외 환자 유래 모델 쌍 생성

환자 유래 오가노이드 (PDO)는 질병의 유전 적 및 표현형 이질성과 개인화 된 항암 요법에 대한 반응을 모두 반영하는 번역 암 연구의 강력한 도구입니다. 여기서, 표현형 분석 및 약물 반응의 평가를 위한 준비로 인간 원발성 방광암 PDOs를 생성하기 위한 통합 프로토콜이 상세히 설명된다.

정밀 의학 도구로서의 방광암 오가노이드의 문화

환자 유래 유방 종양 절제술 또는 정상 유방 조직에서 인간 유방 오가노이드를 확립하기 위한 자세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 이 프로토콜은 인간 환자 유래 유방 오가노이드의 배양, 동결 및 해동에 대한 포괄적인 단계별 지침을 제공합니다.

환자 유래 유방 오가노이드의 확립 및 배양

종양 오가노이드는 암 연구와 개인 맞춤형 의학에 대한 접근 방식에 혁명을 일으켰습니다. 이는 임상적으로 관련성이 높은 종양 모델을 나타내며 이를 통해 연구자들은 임상에서 종양보다 한 발 앞서 나갈 수 있습니다. 이 프로토콜은 신선한 췌장 종양 조직 샘플과 췌장 선암 기원의 환자 유래 이종이식에서 종양 오가노이드를 확립합니다.

췌장암 유래 종양 오가노이드 및 섬유아세포를 신선한 조직에서 확립

전립선암 이질성과 치료 저항성은 여전히 과제로 남아 있습니다. 우리는 주요 부모 종양 특성을 보존하는 환자 유래 오가노이드(PDO)를 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 표준화된 모델은 약물 스크리닝 및 정밀 의학 발전을 지원합니다.

환자 유래 전립선암 오가노이드의 확립 및 유지: 상세한 실험 프로토콜

학습하세요 환자 유래 전립선암 뼈 전이 3D 오르가노이드 배양 프로토콜을. 최적화된 배양법으로 종양 이질성을 유지하며 치료 반응 연구에 활용할 수 있는 생체 외 모델을 구축합니다.

환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석

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