Name: 포토닉 칩을 사용한 고처리량 총 내부 반사 형광 및 직접 적층 광학 재건 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-16T10:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: 배우세요 포토닉 칩 기반 TIRF 및 dSTORM 현미경법을 활용한 고처리량 형광 이미징 기술입니다. 광도파로를 이용한 조명 분리 방식으로 초해상도 영상 획득이 가능하며, 비용 효율적인 슈퍼해상도 현미경 연구에 활용됩니다.

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저자는 유럽 연구 위원회 (B.S.A.에 부여 번호 336716)를 인정하고 싶습니다. 저자는 또한 비디오 녹화 및 편집에 대한 그녀의 귀중한 도움 이라티 라그프라구아에게 감사드립니다.

1. 다디메틸실록산(PDMS) 층의 제조
<ol><li>Sylgard 184 단량체와 경화제를 10:1 믹스로 준비합니다.</li>
	<li>기포가 사라질 때까지 혼합물을 진공 챔버에 놓습니다.</li>
	<li>3.5 인치 (직경) 페트리 접시의 중앙에 PDMS 혼합물 1.7 g을 붓습니다.</li>
	<li>페트리 접시를 스핀 코터의 진공 척에 놓습니다.</li>
	<li>900rpm에서 20초동안 페트리 접시를 스핀 코팅하고 75rpm/s의 가속을 가합니다.</li>
	<li>접시를 50°C에서 2시간 이상 동안 핫플레이트에서 경화시.</li>
</ol>2. 견본 준비
<ol><li>
도파관 청소
	<ol>
<li>탈이온화(DI) 물에 세제농축액(재료표)의1% 희석100 mL을 준비한다.</li>
		<li>웨이퍼 트위저를 사용하여 유리 페트리 접시에 칩을 넣고 세제 용액으로 완전히 덮습니다.</li>
		<li>페트리 접시를 70°C에서 10분 동안 뜨거운 접시에 놓습니다.</li>
		<li>핫 플레이트에 있는 동안 클린룸 티슈브로 표면을 문지릅니다.</li>
		<li>페트리 접시에서 칩을 제거합니다. DI 물 100mL 이상을 헹구어 내소서 헹구어 보시고 자라고 합니다.</li>
		<li>이소프로판올을 100mL 이상 헹구고, 증발 얼룩을 방지하기 위해 용매가 표면에 건조되지 않도록 주의하십시오.</li>
		<li>DI 물 100mL 이상을 헹구어 내소서 헹구어 보시고 자라고 합니다. 질소 총으로 칩을 건조 날려.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
챔버 준비
	<ol>
<li>페트리 접시(섹션 1)에 150 μm 폴리디메틸실록산(PDMS)의 층을 준비한다.</li>
		<li>메스를 사용하여 PDMS 층에서 1.5 cm x 1.5 cm 프레임을 잘라냅니다.</li>
		<li>핀처로 페트리 접시에서 프레임을 들어 올립니다. 깨끗하고 광택이 나는 칩에 평평하게 보관하십시오. 이제 샘플이 셀 시딩에 사용할 준비가 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
형광 라벨링
	<ol>
<li>인산염 완충 식염수, 염료 용액, dSTORM 이미징 버퍼 : 다음과 같은 화학 물질을 준비하십시오.</li>
		<li>셀 파종 후, 매체에서 칩을 제거한다.</li>
		<li>파이펫을 사용하여 PDMS 챔버 외부에서 여분의 유체를 제거합니다.</li>
		<li>피펫으로 PDMS 챔버 내부에서 현재 유체를 제거하는 동시에 약 60 μL의 깨끗한 PBS를 추가합니다. 참고 : 챔버에 추가 된 양은 챔버 크기에 따라 변경해야합니다. 셀 표면에서 모든 용지를 제거하지 않도록 주의하십시오.</li>
		<li>깨끗한 PBS의 60 μL로 PBS를 교체하고 1 분 동안 배양시키십시오.</li>
		<li>이전 단계를 반복하여 이번에는 5 분 동안 배양합니다.</li>
		<li>PBS를 제거하고 염료 용액의 60 μL로 교체하십시오. 샘플을 약 15분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 참고: 이 단계는 사용되는 형광 염료에 따라 크게 변경해야 할 수 있습니다. 우리는 이 실험을 위해 세포막을 라벨을 붙이기 위해 CellMask 딥 레드를 사용합니다.</li>
		<li>2.3.3-2.3.5 단계에서와 같이 PBS로 샘플을 세척합니다.</li>
		<li>PBS를 제거하고 동시에 이미징 버퍼의 40 μL로 교체하십시오. 참고: 다른 형광 염료를 위한 몇몇 다른 화상 진찰 완충제가 있습니다.</li>
		<li>덮개를 위에 놓아 기포가 아래에 형성되는 것을 방지합니다. 이미징 챔버에 덮개 슬립을 가볍게 눌러 여분의 미디어를 제거합니다.</li>
		<li>파이펫을 사용하여 커버슬립 외부의 여분의 용지를 제거합니다. 말린 침지 물 잔류물에 의해 형성된 결정을 피하기 위해 물 촉촉한 면봉으로 커버 슬립 외부 영역을 청소하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 이미징 절차
<ol><li>구성 요소 설정 참고: 이 설정 버전은 현미경, 커플링 스테이지 및 샘플 단계의 세 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다. 재료 표를참조하십시오.<ol>
<li>필터 홀더, 백색 광원, 카메라 및 대물 리볼버가 있는 현미경을 사용합니다.</li>
		<li>섬유 결합 레이저와 커플링 렌즈와 3축 압전 결합 단계를 사용합니다.</li>
		<li>팁과 기울기, 진공 홀더가 있는 1축 수동 샘플 스테이지를 사용합니다.</li>
		<li>샘플 변환을 위해 커플링과 샘플 스테이지를 2축 전동 스테이지에 모두 장착합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>도파관 커플링
	<ol>
<li>결합 면이 결합 된 면과 함께 진공 척에 칩을 커플링 목표를 향하게합니다. 칩이 커플링 목표에서 약 1초점 거리떨어져 있는지 확인합니다.</li>
		<li>진공 펌프를 켭니다.</li>
		<li>레이저를 1mW로 켭니다. 빔이 가장자리에 닿을 수 있도록 칩 높이를 대략 조정합니다. 레이저를 끕니다.</li>
		<li>백색 광원을 켭니다. 저배율 대물렌즈(예: 10배)를 선택합니다. 도파관에 현미경을 집중.</li>
		<li>도파관을 따라 현미경을 변환하여 광학 경로와 잘 정렬되어 있는지 확인합니다. 현미경을 커플링 엣지로 이동합니다.</li>
		<li>1mW 이하에서 레이저를 켭니다. 커플링 엣지를 따라 현미경을 변환하여 레이저 광을 찾습니다. 빔을 칩 가장자리에 초점을 맞춥니다.</li>
		<li>레이저 빔 스폿 크기가 사라질 때까지 광학 경로를 따라 결합 단계를 조정합니다. 이제 빔이 칩 표면 위 또는 아래에 있습니다.</li>
		<li>빔 스팟이 다시 나타나고 최대화될 때까지 커플링 스테이지 높이를 조정합니다.</li>
		<li>레이저가 포커스가 집중된 지점을 형성할 때까지 이전 두 단계를 반복합니다.</li>
		<li>관심있는 도파관에 초점을 맞춘 지점을 이동합니다.</li>
		<li>초점을 맞춘 빔 스팟이 더 이상 표시되지 않도록 현미경을 가장자리에서 짧은 거리로 변환합니다. 백색광을 끕니다.</li>
		<li>대비를 조정합니다. 도파관이 안내하는 경우 도파관을 따라 산란된 빛을 명확하게 볼 수 있어야 합니다.</li>
		<li>커플링 스테이지의 축을 조정하여 산란된 광강도를 최대화합니다. 레이저를 끕니다.</li>
		<li>백색광을 켭니다. 필요한 경우 대비를 조정합니다.</li>
		<li>이미징 영역으로 이동합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>회절 제한된 이미징
	<ol>
<li>원하는 이미징 목표에 초점을 맞춥니다. 백색광을 끕니다.</li>
		<li>형광 필터를 삽입하고 레이저 전원을 1mW로 돌립니다.</li>
		<li>카메라 노출 시간을 약 100ms로 설정합니다. 커플링이 여전히 최적화되어 있는지 확인합니다.</li>
		<li>이미징에 필요한 영역을 찾습니다. 평균 아웃 모드로 반복 피조 단계를 켭니다. 참고: 50 nm의 스텝 크기의 20 μm 스캔 범위는 대부분의 도파관 구조에 적합합니다.</li>
		<li>300개 이상의 이미지를 캡처합니다.</li>
		<li>가상 스택을 사용하여 캡처된 이미지 스택을 피지로 로드합니다. 피지의 이미지 메뉴에서 스택 및 z-프로젝트를 선택합니다.</li>
		<li>투영 유형 평균 강도를 선택하여 TIRF 이미지를 계산합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>d 스톰 이미징
	<ol>
<li>레이저를 1mW로 켜고 카메라 노출 시간을 30ms로 설정합니다.</li>
		<li>대비와 초점을 조정합니다.</li>
		<li>깜박임이 관찰될 때까지 레이저 파워를 높입니다. 참고: 이 경우 필드 강도에 따라 시간이 걸릴 수 있습니다.</li>
		<li>샘플의 작은 영역을 확대합니다.</li>
		<li>대비를 조정합니다.</li>
		<li>몇 개의 이미지를 캡처하여 깜박임이 잘 구분되어 있는지 확인합니다.</li>
		<li>최적의 깜박임이 맞춰지기 위해 카메라 노출 시간을 조정합니다. 참고: 깜박임 최적화는 복잡한 작업이지만12에적합한 많은 문헌을 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>피조 스테이지 루핑을 켭니다.</li>
		<li>깜박이는 밀도에 따라 30,000프레임 이상의 이미지 스택을 기록합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>d 스톰 이미지 재구성
	<ol>
<li>피지를 열고 가상 이미지로 dSTORM 스택을로드합니다.</li>
		<li>필요한 경우 대비를 조정합니다.</li>
		<li>사각형 도구를 사용하여 재구성할 영역을 선택합니다.</li>
		<li>피지에서 뇌우13 플러그인에서 오픈 실행 분석.</li>
		<li>장치에 해당하는 뇌우의 기본 카메라 설정을 설정합니다. 나머지 기본 매개 변수는 일반적으로 만족스럽습니다.</li>
		<li>재구성을 시작합니다. 참고: 전체 보기 필드의 경우 파일 크기가 크기 때문에 데이터를 하위 스택으로 분할해야 할 수 있습니다.</li>
		<li>재구성 소프트웨어에서 제공하는 지역화 목록을 필터링하여 비특정 지역화를 제거합니다. 필요한 경우 추가 드리프트 보정애플.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).</li>
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</ol>

B.S. Ahluwalia는 칩 기반 광학 나노 스코피법에 대한 특허 GB1606268.9를 신청했습니다. 다른 저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

칩 기반 이미징은 기존의 dSTORM 이미징과 유사합니다. 따라서 기존 d STORM이미징과 동일한 접근 방식을 사용하여 이미지 품질을 측정할 수 있습니다. 사용자의 주요 차이점은 투명 유리 슬라이드가 불투명 한 Si-웨이퍼와 교환된다는 것입니다. 매우 다르게 보이지만 샘플 처리는 유리 슬라이드와 실질적으로 유사합니다. 칩은 매우 견고하며 웨이퍼 핀셋을 사용하여 쉽게 처리 할 수 있습니다. 이미징 절차 및 이미지 재구성은 일반 dSTORM 실험과 동일합니다. 기능성 칩 기반 현미경을 설정하면 포토닉 칩을 제외한 특별한 구성 요소가 필요하지 않습니다. 설정에 대한 자세한 내용은 전작6,7에서확인할 수 있습니다. 이 작업에 사용되는 칩은 표준 포토리소그래피8을사용하여 제작되었습니다.
시료 제제는 샘플 챔버의 제조를 포함한다. PDMS 프레임을 칩에 부착할 때 공기가 유입될 수 있는 작은 주름이나 립을 피하는 것이 중요합니다. PDMS를 부착할 때 접히면 핀처로 조심스럽게 제거하고 다시 부착하면 됩니다. 시료가 PDMS 챔버 내부에 준비되면 커버글래스를 눌러 영역을 밀봉해야 합니다. 커버글래스를 부착할 때 형성될 수 있는 기포를 피하는 것이 중요합니다. 기포가 형성되면 커버글래스를 부드럽게 제거하고 샘플 챔버에 PBS를 추가하여 샘플이 덮여 있는지 확인합니다. 커버 슬립의 준비 와 부착은 간단하게 다시 할 수 있습니다.
이 백서에 제안된 프로토콜을 사용하여 빛을 도파관에 결합하는 것이 단순화됩니다. 그러나 커플링을 제한할 수 있는 몇 가지 일반적인 문제가 있습니다. 첫째, 칩이 제대로 세척되지 않고 남은 PBS가 완전히 제거된 경우 도파관에 먼지나 결정화된 PBS가 있을 수 있습니다. 이것은 화상 진찰 지구에 있는 아주 작은 힘의 결과로 중요한 손실을 초래할 수 있습니다. 축축한 면봉을 사용하여 커버 유리 외부 영역을 청소하면 전력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 둘째, 도파관의 커플링 패싯이 손상되면(예: 부적절한 취급에 의해) 커플링 손실이 크게 증가할 수 있습니다. 가장자리의 광학 검사는 일반적으로 쉽게 손상을 공개합니다. 칩의 전체 커플링 면은 광섬유처럼 신중하게 연마 할 수 있으며 부드러운 커플링 면을 제공하여 결합 된 전력을 증가시킵니다.
빛이 결합된 후에, 화상 진찰 절차는 어떤 전통적인 dSTORM 설치에서와 동일합니다. 그림 2A에서설명한 것처럼 이미지에 불균일한 여기가 있는 경우 평균 모드가 잘 작동하지 않았을 가능성이 큽입니다. 가장 일반적인 두 가지 이유는 1) 평균 스택을 만들기 위해 캡처한 이미지가 너무 적고 2) 진동 거리가 너무 짧음/스텝 크기가 너무 크다는 것입니다. 너무 적은 이미지를 수집하면 일부 여기 패턴을 남길 수 있으며 평균은 불균일합니다. 평균 스택의 이미지 수를 늘려 쉽게 해결할 수 있습니다. 진동 거리가 너무 짧으면 모드 패턴이 충분하지 않기 때문에 비균일한 이미지가 발생할 수도 있습니다. 또한 진동 거리를 늘리거나 스텝 크기를 줄임으로써 쉽게 해결할 수 있습니다. 이 작품에서 우리는 20 μm 이상의 입력 레이저 빔을 스캔하고 적어도 300 개의 이미지를 획득하기 위해 압전 단계를 사용했습니다. 또 다른 접근법은 고속 갈보 미러를 사용하여 10-30 ms와 같은 단일 수집 시간 내에 입력 된 도파관 면을 가로 질러 빛을 스캔하는 것일 수 있습니다.이 옵션은 하위 세포 소기관이 일정한 움직임을 보이는 라이브 셀 TIRF 이미징에 적합합니다.
칩 기반 dSTORM은 전례 없는 넓은 면적의 TIRF 여기를 제공하므로 높은 처리량 이미징에 이상적입니다. 컴팩트한 특성을 통해 상용 시스템에 개조할 수 있으며, 이 경우 칩을 거꾸로 배치하여 거꾸로 설정하거나 투명 기판을 개발할 수 있습니다. 칩은 대량 제작되며 많은 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 현재, 주요 제한은 2D로 제한된다는 것입니다. 전도장은 도파관 표면에서 약 200 nm 떨어진 곳에서만 사용할 수 있으므로 이 지역 내의 형광단만 흥분할 것입니다. 통합 광학 분야는 새로운 이미징 질문을 다루고 기존 광학 에 새로운 가능성을 제공함으로써 가까운 장래에 칩 기반 현미경 검사법에 대한 많은 기회를 제공합니다.

단일 분자 국소화 현미경의 초기 데모 이후, 많은 변화는 다른 도전을 해결하기 위해 개발되었다1,2,3. 그러나 남아있는 한 가지 과제는 넓은 시야의 dSTORM 이미징입니다. 많은 dSTORM 설정은 동일한 대물렌즈를 사용하여 샘플을 자극하고 이미지를 이미지화합니다. 시야를 높이려면 낮은 배율 렌즈가 필요합니다. 낮은 배율과 낮은 수치 조리개(NA) 대물 렌즈는 일반적으로 피사계 심도가 크므로 국소화 정밀도를 감소시키는 평면 외 신호가 증가합니다. TIRF 목표는 일반적으로 평면 외 형광을 줄여 이미지 대비를 높이는 데 사용됩니다. TIRF를 통해, 여기는 에반네센트 필드4에의해 표면으로부터 약 150 nm의 광학 두께로 제한된다. TIRF 대목적 렌즈는 큰 NA를 필요로 하여 작은 시야(FOV)(예: 50 x 50 μm2)를생성하여 처리량을 크게 제한합니다. 그러나, 에바네센트 필드를 생성하는 다른 방법이 있습니다.
광학 도파관은 구조에 결합된 경우 빛을 제한하고 안내하는 구조입니다. 가장 일반적으로 도파관은 광섬유 기반 통신에서 사용됩니다. 포토닉 집적 회로의 주성분으로 2D 통합 도파관을 개발하기 위해 많은 노력을 기울였습니다. 이 기술은 저손실 나노 구조 광학 도파관을 일상적으로5로제작 할 수있는 지점으로 발전했습니다. 오늘날 전 세계의 여러 주조소가 포토닉 집적 회로를 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 도파관은 전체 내부 반사를 통해 빛을 안내하여 표면에 전단장을 표시합니다. 도파관 구조의 신중한 설계에 의해, 높은 강도는 에바네센트 분야에서 달성 될 수있다. 따라서 도파관 표면 바로 위에 놓인 시료는 이미징 응용 분야를 비추는 데에도 사용될 수 있습니다. 전도장은 도파관의 전체 길이 및 폭을 따라 생성되며, 따라서 임의로 큰6을만들 수 있다.
우리는 임의로 넓은 시야를 제공하는 TIRF dSTORM에 대한 새로운 접근 방식을 제시합니다. 여기와 수집을 위해 TIRF 렌즈를 사용하는 대신 광학 도파관의 전경을 사용합니다. 이는 여기 및 수집 광 경로를 분리하여 도파관 칩 조명에서 제공하는 주어진 파장에 대한 광학 절편을 손상시키지 않으면서 수집 광 경로를 따라 완전한 자유를 허용합니다. 따라서 저배율 렌즈는 TIRF 모드에서 매우 큰 영역을 이미지화하는 데 사용할 수 있지만 NA가 작을수록 측면 해상도가 감소합니다. 또한 여러 파장이 시스템을 재조정하지 않고 유도 및 감지할 수 있기 때문에 도파관7을사용하여 다중 컬러 이미징도 크게 간소화됩니다. 낮은 파장이 형광 점멸을 향상시키고 다중 색상 이미징을 위해 사용될 수 있기 때문에 이는 dSTORM에 유리합니다. 이미징 절차가 수행되는 방식에는 영향을 미치지 않지만 전도장의 침투 깊이는 파장의 함수로 변경됩니다. 이 칩은 라이브 셀 이미징8과 호환되며 미세 유체의 통합과 같은 응용 분야에 이상적입니다. 각 칩에는 사용자가 서로 다른 조건에서 이미지를 만들거나 광학 트래핑9 및 라만 분광법10을적용 할 수있는 수십 개의 도파관을 포함 할 수 있습니다.
칩 기반 시스템은 회절 제한 및 초고해상도 이미징 모두에 동일하게 작동합니다. 유사한 접근법은 2005년에 프리즘을 사용하여 에반네센트 필드 여기4를생성하는 것을 소개했습니다. 포토닉 칩은 또한 에바네센트 필드를 통해 흥분하지만, 현대 도파관 제작 기술을 사용하면 도파관으로 이국적인 빛 패턴을 생성 할 수 있습니다. 현재칩 기반 나노스프i 구현은 여기 필드가 도파관 표면 내부에 잠겨 있기 때문에 2D 이미징으로만 제한됩니다. 향후 개발은 3D 애플리케이션을 목표로 합니다. 부가적으로, 구조화된 조명 현미경 검사법과 같은 그밖 초분해능 기술은 동일한 칩 기지를 둔 현미경(11)를사용하여 개발되고 있다.

<table><tbody><tr><td>1축 샘플 스테이지</td><td>Standa</td><td>7T173-20</td><td></td></tr><tr><td>2축 샘플 번역 스테이지</td><td>Mad City Labs</td><td></td><td>맞춤 주문</td></tr><tr><td>3축 NanoMax 스테이지</td><td>Thorlabs</td><td>MAX311D</td><td></td></tr><tr><td>BXFM 현미경 본체</td><td>Olympus</td><td>OLY-LSM-037018</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Deep Red, Life technologies</td><td>ThermoFisher</td><td>C10046</td><td></td></tr><tr><td>클린 룸 등급 면봉</td><td>MRC 기술</td><td>MFS-758</td><td></td></tr><tr><td>섬유 결합 레이저</td><td>코 볼트</td><td>플라멩코</td><td></td></tr><tr><td>필터 홀더</td><td>수제</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III, Hellma Gmbh</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z805939</td><td>세척 세제 농축액</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>563935-1L</td><td></td></tr><tr><td>KL 1600 LED</td><td>올림푸스</td><td>OLY-LSM-E0433314</td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 커플 링 렌즈</td><td>올림푸스</td><td>LMPLFLN 50x / 0.5</td><td></td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 V2</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td>설명에 따른 믹스</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 1.1kg 키트</td><td>Dow</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>팁 틸트 스테이지</td><td>Thorlabs</td><td>APR001</td><td></td></tr><tr><td>진공 홀더</td><td>Thorlabs</td><td>HWV001</td><td></td></tr><tr><td>웨이퍼 핀셋 유형 2W</td><td>한천 과학</td><td>AGT5051</td><td></td></tr></tbody></table>

포토닉 칩을 사용한 고처리량 총 내부 반사 형광 및 직접 적층 광학 재건 현미경

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

총 내부 반사 형광 (TIRF)은 광학 단면으로 인해 향상된 대비를 제공하기 때문에 단일 분자 국소화 기반의 초고해상도 현미경 검사법에 일반적으로 사용됩니다. 기존의 접근법은 여기와 수집 모두에 높은 수치 조리개 현미경 TIRF 목표를 사용하여 시야와 처리량을 심각하게 제한하는 것입니다. 우리는 칩 기반 나노 스펙타카에게 불린 광학 도파관을 가진 화상 진찰을 위한 TIRF 여기를 생성하는 새로운 접근을 제시합니다. 이 프로토콜의 목적은 이미 구축된 설정에서 칩 기반 이미징이 어떻게 수행되는지 보여주는 것입니다. 칩 기반 나노 스펙의 주요 장점은 여기 및 수집 경로가 분리된다는 것입니다. 그런 다음 저배율 렌즈로 이미징을 수행할 수 있으며, 이로 인해 TIRF 이미지가 큰 시야를 차지하고 해상도가 소폭 감소합니다. 간 정현파 내피 세포(LSECs)는 기존의 초고해상도 현미경에 필적하는 해상도를 나타내는 직접 적층 광학 재건 현미경 검사법(d STORM)을 사용하여 이미지화되었습니다. 또한 500 μm x 500 μm 영역을 저배율 렌즈로 이미징하여 76nm의 해상도를 제공하여 높은 처리량 기능을 입증합니다. 컴팩트한 특성을 통해 칩 기반 이미징은 가장 일반적인 현미경으로 개조할 수 있으며 온칩 감지, 분광법, 광학 트랩핑 등과 같은 다른 온칩 광학 기술과 결합할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 높은 처리량 2D 초고해상도 이미징에 이상적으로 적합하지만 다중 모달 분석을 위한 훌륭한 기회를 제공합니다.

TIRF 현미경 검사법은 평면 외 형광을 제거하고, 대비를 증가시키고, 따라서 이미지 품질을 향상시키고, 다른 형광 기반 현미경 기술에 비해 광독성이 적기 때문에 인기있는 기술입니다. 기존의 객관적 인 접근 방식에 비해, 칩 기반 현미경 검사는 일반적으로 TIRF 렌즈와 함께 제한된 처리량없이 TIRF 여기를 제공합니다. 제시된 설정에 대한 개요는 그림 1A에서찾을 수 있습니다. 우리는 마우스에서 추출한 회절 제한뿐만 아니라 간 정현파 내피 세포(LSEC)의 dSTORM 이미지를 제시합니다. 라벨이 부착된 마이크로투튜드린이 있는 LSE의 넓은 시야 각이미지도 제시되어 높은 처리량 의 이미징 기능을 보여줍니다. 오일 침지 TIRF 렌즈(60x 또는 100x 배율)를 사용하는 기존의 dSTORM 설정은 일반적으로 그림 2의칩 기반 이미지보다 100배 작은 50μm x 50 μm의 영역을 이미지화하며, 25x, 0.8 NA 대물렌즈로 이미지화됩니다.
이 방법에서는 여러 모드 Si3N4 도파관을 사용하여 여기를 합니다. 활용칩은 실리콘 칩의 2 μm 산화층에 증착된 150 nm Si3N4의 스트립 에칭 가이딩 층으로 구성된다. 칩의 개략은 그림 1 B에서찾을 수 있습니다. 도파관 폭은 200 ~ 1000 μm 사이에서 다를 수있습니다. 전파 모드 간의 간섭을 통해 여기 광은 균일한 강도 분포가 아니라 공간적으로 다양한 패턴을 갖습니다. 그림 2A는 명확하게 보이는 모드 패턴이 있는 이미지를 제공합니다. 이 간섭 패턴은 도파관 의 가장자리에 레이저 빔의 위치에 따라 변경됩니다. 최종 이미지에서 균일한 여기를 달성하기 위해, 우리는 결합 된 면을 따라 진동하는 압전 단계를 사용합니다. 이미징 절차 의 과정을 통해, 간섭 패턴의 충분한 변화가 존재하여 이미지의 강도 변동을 제거하여 평균화 할 수 있습니다. 이미지 스택은 그림 2A와같은 여러 이미지로 구성되지만 패턴이 다르지만 평균이 되면 스택은 그림 2B와같은 균일한 여기를 가진 이미지를 생성합니다. 다른 방법은 모드 평균화의 필요성을 제거 넓은 단일 모드 도파관8,14를달성하기 위해 단열 테이버링을 사용하는 것입니다. 그러나 100 μm 도파관 폭을 달성하기 위해 단일 모드 조건을 유지하기 위해서는 몇 밀리미터의 테이더 길이가 필요합니다. 멀티 모드 도파관은 이러한 테이버링 필요성을 우회하고 구조 폭에 제한을 두지 않습니다. 조명 패턴을 넘어, 모드의 매우 효과적인 굴절률은 구조화 된 조명 현미경 검사법11 및 변동 현미경 검사법7을향한 전례없는 가능성을 허용합니다.
이미징의 첫 번째 단계는 회절 제한된 이미지를 수집하는 것입니다. 이 실험은 약 300개의 이미지 스택을 생성하고 최종 이미지는 스택의 평균을 취하여 만들어집니다. 도 2에서는60x, 1.2 NA 수몰입 대물렌즈를 사용하여 CellMask 딥 레드로 라벨이 부착된 LSIC의 회절 제한 및 dSTORM 이미징을 제시합니다. 그림 2A는 불충분한 모드 평균화로 인한 불균일한 조명을 나타낸다. 성공적인 모드 평균화는 그림 2B에표시됩니다. 그림 2C는 동일한 영역의 dSTORM 이미지이며, 표시된 영역은 그림 2D에나와 있습니다. 간 정현파 내피 세포는 여기에서 볼 수 있는 혈장막(15)에나노 크기의 기공을 갖는다. 푸리에 링 상관 분석은 46 nm의 해상도를 제공했습니다.
그림 3은 500 μm x 500 μm 영역의 dSTORM 이미지를 보여 주며, 기술의 높은 처리량 능력을 보여줍니다. 그림 3A의확대 된 이미지, 일반적인 dSTORM 시야에 해당, 그림 3B에서회절 제한 된 이미지와 함께 제공 됩니다. 분해능을 추정하기 위한 푸리에 링 상관관계가 수행되었고, 76 nm의 값을 산출했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig1.jpg"> 그림 1: 이미징 시스템 및 도파관. (A)이미징 시스템의 사진. 샘플은 샘플 단계의 진공 척에 배치되며, 도파관의 커플링 면은 커플링 목표를 향하게 됩니다. 섬유 결합 레이저와 커플링 목표는 3D 압전 단계 위에 배치됩니다. 이미징 렌즈가 있는 렌즈 포탑은 위에서 이미지를 캡처하여 카메라에 전달합니다. (B)커플링 및 이미징 렌즈가 있는 도파관의 회로도. 커플링 렌즈는 도파관에 빛을 결합합니다. 샘플(주황색 구슬)은 밀봉된 PDMS 챔버 내에 보관됩니다. 도파관을 따라 전도필드는 샘플을 자극하고 이미징 목표는 방출 된 형광을 캡처합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig2.jpg"> 그림 2: 회절 제한 및 dSTORM 이미지. (A)간 부비동 내피 세포의 이미지 평균화 가 부족하여 명확하게 보이는 여기 패턴을 생성합니다. (B)(A)와동일한 영역이지만 평균이 충분한 모드가 있어 균일한 여기를 초래합니다. (C)(B)에서인세트의 회절 제한된 이미지; (D) d 같은지역의 스톰 이미지. (E)세포의 혈장 막에서 경유를 명확하게 나타내는(D)의인세트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig3.jpg"> 그림 3: 쥐 LSECs의 d스톰 이미지. (A)쥐 LSECs에서 알렉사 647 스테인드 튜불린의 큰 시야 dSTORM 이미지. 배율 막대 = 50 μm.(B)(A)에서더 큰 표시 영역은 회절 제한 (왼쪽 아래)과 dSTORM 이미지 (오른쪽 상단)를 비교합니다. (C)(A)에서작은 표시 영역. 배율 막대 = 1 μm. 이미지의 해상도는 76 nm입니다. 헬 레 외. 20196의허가에 따라 적응 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

칩 기반 의 초고해상도 광학 현미경 검사법은 형광 현미경 검사법에 대한 새로운 접근법이며 비용 효율성과 처리량에 이점을 제공합니다. 여기에서, 칩 준비 및 화상 진찰을 위한 프로토콜은 TIRF 현미경 검사법 및 현지화 기지를 둔 초고해상도 현미경 검사법을 위해 도시됩니다.

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

이 원고의 주요 목표는 dSTORM과 같은 새로 개발 된 광장 칩 기반 TIRF 현미경 검사법과 단일 분자 국소화 현미경 검사법의 이미징 절차를 제시하는 것입니다. 여기에 주요 구성 요소는 광학 파파장의 시리즈로 만들어진 포토닉 칩입니다. 광 파도관 내부의 빛은 총 내부 반사에 따라 안내됩니다.일부 빛은 에반데스름파의 형태로 표면에 존재한다. 그 에반데스센트 파도, 그들은 표면에서 기하 급수적으로 부패, 백 나노 미터의 침투 깊이와. 이것은 TIRF 조명에 적합합니다.광학 도파관을 통한 TIRF 조명은 파도어 형상에 의해 정의되는 매우 넓은 영역에서 사용할 수 있으며, 따라서 높은 처리량 이미징에 이상적입니다. 우리의 접근 방식과 비교하여 기존의 TIRF와 dSTORM 설정의 주요 차이점은 이미징 목표 렌즈를 통해 빛을 보내는 대신 광장 칩을 사용하여 샘플을 비추는 것입니다. 우리의 접근 방식은 조명과 수집 조명 부분을 분리하여 새로운 이미징 가능성을 열어줍니다.웨이퍼 트위저를 사용하여 유리 페트리 접시에 칩을 넣고 1 % Hellmanex 용액으로 완전히 덮습니다. 페트리 접시를 핫플레이트에 70도 10분간 놓습니다. 핫플레이트에 있는 동안 클린룸 조직 면봉으로 표면을 문지릅니다.페트리 접시에서 칩을 제거합니다. 적어도 100 밀리리터의 탈수로 헹구는 다. 이소프로판올의 적어도 100 밀리리터로 헹구고, 용매가 증발 얼룩을 방지하기 위해 표면에서 건조하지 않도록 주의하십시오.적어도 100 밀리리터의 탈수로 헹구는 다. 질소 총으로 칩 건조를 날려 버리십시오. 페트리 접시에 회전하여 150 마이크로미터 PDMS의 나중에 준비합니다.메스를 사용하여 PDMS 층에서 약 1.5 cm 프레임을 잘라냅니다. 페트리 접시에서 트위저로 프레임을 들어 올립니다. 깨끗하고 세련된 칩에 평평하게 보관하십시오.샘플은 이제 세포 시드에 대한 준비가 되었습니다. 셀 파종 후 미디어에서 칩을 제거합니다. 파이펫을 사용하여 PDMS 챔버 외부에서 과도한 유체를 제거합니다.약 60 마이크로리터를 동시에 PBS를 세척하면서 피펫으로 PDMS 챔버 내부에서 전류 유체를 제거합니다. PBS를 60마이크로리터클린 PBS로 교체하고 1분간 배양해하십시오. 이전 단계를 반복하여 이번에는 5분 동안 배양할 수 있습니다.PBS를 제거하고 염료 용액의 60 마이크로리터로 교체하십시오. 샘플을 15분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 이전에 설명한 절차를 사용하여 PBS로 샘플을 세척합니다.PBS를 제거하고 동시에 이미징 버퍼의 40 마이크로리터로 교체합니다. 커버슬립을 위에 놓고 기포가 그 아래에 형성되는 것을 방지합니다. 이미징 챔버에 대한 커버슬립을 부드럽게 눌러 과도한 미디어를 제거합니다.파이프를 사용하여 커버슬립 외부의 과잉 미디어를 제거합니다. 말린 침수 매체 잔류물로 형성된 결정을 피하기 위해 수습 면봉으로 커버슬립 외부의 영역을 청소하십시오. 이 버전의 설정은 세 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다.필터 홀더, 백색 광원, 카메라 및 객관적인 리볼버가 있는 현미경. 섬유 결합 레이저와 커플링 렌즈가 있는 3축 압전 스테이지인 커플링 스테이지입니다. 1축 수동 단계인 샘플 스테이지는 팁과 기울기, 진공 홀더가 있습니다.커플링 및 샘플 스테이지는 모두 샘플 번역을 위해 2축 전동 단계에 장착됩니다. 결합 면이 결합 목표를 향해 진공 트럭에 칩을 배치합니다. 칩이 커플링 목표에서 약 하나의 초점 길이인지 확인합니다.진공 펌프를 켭니다. 레이저를 1밀리와트로 켭니다. 빔이 가장자리에 닿을 수 있도록 칩 높이를 대략 조정합니다.레이저를 끕니다. 백색 광원을 켭니다. 예를 들어, 10배의 낮은 배율 목표 렌즈를 선택합니다.현미경을 파도관에 집중시하십시오. 도파관을 따라 현미경을 변환하여 광학 경로와 잘 정렬되어 있는지 확인합니다. 현미경을 커플링 가장자리로 이동합니다.1 밀리와트 이하에서 레이저를 켭니다. 결합 가장자리를 따라 현미경을 변환하여 레이저 빛을 찾습니다. 칩 가장자리에 빔을 집중합니다.레이저 빔 스팟 크기가 사라질 때까지 크기를 줄이는 방향으로 광학 경로를 따라 커플링 스테이지를 조정합니다. 이제 빔이 칩 표면 위 또는 아래에 있습니다. 빔 스팟이 다시 나타나고 최대화될 때까지 커플링 스테이지 높이를 조정합니다.레이저가 집중 된 지점을 형성 할 때까지 두 개의 이전 단계를 반복합니다. 관심의 도파로 초점을 맞춘 지점을 이동합니다. 초점 빔 스팟이 더 이상 보이지 않도록 현미경을 가장자리에서 짧은 거리에 변환합니다.백색 광을 끕니다. 대비를 조정합니다. 도파가 안내하는 경우, 도파관을 따라 흩어진 빛을 명확하게 표시해야합니다.결합 단계의 축을 조정하여 산란된 광 강도를 최대화합니다. 레이저를 끕니다. 백색 광을 켭니다.필요한 경우 대비를 조정합니다. 이미징 영역으로 이동합니다. 원하는 상상 의 목표에 초점을 맞춥니다.흰색 표시등을 끕니다. 형광 필터를 삽입하고 레이저 전력을 1밀리와트로 바꿔보십시오. 카메라 노출 시간을 약 100밀리초로 설정합니다.필요에 따라 대비를 조정합니다. 커플링이 여전히 최적화되어 있는지 확인합니다. 이미징에 대한 관심 영역을 찾습니다.평균 노드로 반복되는 압전 스테이지를 켭니다. 300개 이상의 이미지를 캡처합니다. 가상 스택을 사용하여 캡처된 이미지 스택을 피지에 로드합니다.피지의 이미지 메뉴에서 스택 및 Z 프로젝트를 선택합니다. 투영 유형, 평균 강도를 선택하여 TIRF 이미지를 계산합니다. 레이저를 1밀리와트로 켜고 카메라 노출 시간을 30밀리초로 설정합니다.대비와 초점을 조정합니다. 깜박임이 관찰될 때까지 레이저 전력을 늘립니다. 샘플의 작은 영역을 확대합니다.대비를 조정합니다. 몇 개의 이미지를 캡처하여 깜박임이 잘 분리되었는지 확인합니다. 최적의 깜박임에 맞게 카메라 노출 시간을 조정합니다.압압 스테이지 루프를 켭니다. 깜박이는 밀도에 따라 최소 30, 000 프레임의 이미지 스택을 기록합니다. 피지를 열고 dSTORM 스택을 가상 이미지로 로드합니다.필요한 경우 대비를 조정합니다. 사각형 도구를 사용하여 재구성할 영역을 선택합니다. 피지의 썬더 스톰 플러그인에서 오픈 런 분석.장치에 해당하는 썬더스톰의 기본 카메라 설정을 설정합니다. 나머지 기본 매개 변수는 일반적으로 만족스럽습니다. 재구성을 시작합니다.재구성 소프트웨어에서 제공하는 지역화 목록은 비특이적 지역화를 제거하기 위해 필터링됩니다. 필요한 경우 추가 드리프트 보정이 적용됩니다. 칩 기반 이미징과 기존 이미징의 주요 차이점은 계측 및 데이터 수집에 있습니다.따라서 재구성된 이미지의 품질은 상업적 초해상도 현미경의 이미지와 동일한 방식으로 평가될 수 있습니다. 다중 모드 파도가이드가 사용되기 때문에 결과 이미지는 이미지가 너무 적으면 불균일한 흥분을 나타낼 수 있습니다. 패널 a에 표시됩니다.여기 패턴의 양을 늘리면 패널 b에 나와 같이 불균일한 흥분이 발생합니다. 여기서 우리는 형광표지 플라즈마 막을 가진 간 부비동성 내피 세포를 심화했습니다. 패널 a와 b는 회절 제한 이미지입니다.패널 c는 패널 b의 인셋의 회절 제한 이미지를 보여 주어 있다. 패널 d는 동일한 영역의 dSTORM 이미지를 표시합니다. 간 부비동성 내피 세포는 패널 D의 초해상도 이미지에서 명확하게 볼 수있는 혈장 막에 나노 크기의 회향을 갖는다.칩 기반 슈퍼 해상도 이미징의 주요 장점 중 하나는 달성 가능한 넓은 시야입니다. 패널은 형광 라벨 마이크로 튜룰린간 부비동 내피 세포의 500 미크론 대형 dSTORM 이미지에 의해 500 미크론을 나타낸다. 패널 b는 비교를 위해 회절 제한 및 초해상도 이미지를 모두 갖춘 패널 a에서 마젠타 인셋을 표시합니다.패널 c는 패널 a에서 녹색 인세트를 표시합니다. 캡처된 이미지의 해상도는 77나노미터입니다. 이 비디오에서는 광장 칩을 사용하여 간 부비동 내피 세포의 넓은 시야 TIRF 및 dSTORM 이미징을 수행했습니다.우리의 방법은 미리 결정된 수치 조리개와 낮은 시야의 현미경 목표를 사용하여 TIRF를 수행하는 기존의 방법보다 덜 복잡하고, 더 컴팩트하며, 더 유연합니다. dSTORM과 같은 국소화 현미경 검사는 포토닉 칩을 사용하여 탐구한 여러 초해상도 이미징 기술 중 하나입니다. 예를 들어, 빛은 이미징 객관적인 렌즈를 사용하여 가능한 것보다 고굴절률 광학 파도어 재료 내부에 훨씬 더 단단히 고정될 수 있다.칩 조명의 이 속성은 강도 변동 기반 광학 현미경 검사법과 구조화 된 조명 현미경 검사법의 해상도를 증가에 응용 프로그램을 발견했다. 또한 포토닉 칩은 소형화, 비용 효율성 및 간단한 광학 설정의 이점을 누릴 수 있습니다. 통합 된 기술이되면 다른 온칩 광학 기능과 호환됩니다.이를 통해 기존의 회절 제한 현미경으로 개조하여 저렴한 비용으로 슈퍼 분해능을 할 수 있습니다.

high-throughput-total-internal-reflection-fluorescence-direct

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

lensless 온칩 형광 현미경 플랫폼 시연입니다 예의 울트라 와이드 뷰 필드 이상의 이미지를 형광 물체 수, 디코딩 알고리즘을 기반으로 압축 샘플링을 사용하여 &lt;4μm 해상도&gt; 0.6-8 cm2. 이러한 작고 넓은 분야 형광 온 칩 영상 양상은 높은 처리량 cytometry, 희귀 세포 연구와 microarray 분석을 위해 도움이 될 수 있습니다.

칩에 Lensless 형광 현미경

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

Lensfree 광학 tomography은 &lt;1 μm의의 공간적 해상도를 제공하는 입체 현미경 기법이다 × &lt;1 μm의 × 15~1백밀리미터의 큰 이미지 볼륨여 각각 X, Y 및 Z 크기에서 &lt;3...

멀티 앵글 조명 및 픽셀 슈퍼 해상도를 채용 Lensfree 온칩 단층 현미경

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

이 기사는 여러 색상의 광학 초해상도로 동적 생물학적 과정을 이미지화하기 위해 TIRF-SIM(Total Internal Reflection Fluorescence Illumination)으로 작동하는 구조화 조명 현미경의 조립 및 작동에 대한 심층 가이드를 제공합니다.

여러 색상과 고속에서 구조화 조명 TIRF 현미경에 가이드

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사파이어와 OPO 레이저 기반 표준 레이저 스캐닝 현미경 :에 Ti에 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 시스템의 구현

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