포토닉 칩을 사용한 고처리량 총 내부 반사 형광 및 직접 적층 광학 재건 현미경

이 원고의 주요 목표는 dSTORM과 같은 새로 개발 된 광장 칩 기반 TIRF 현미경 검사법과 단일 분자 국소화 현미경 검사법의 이미징 절차를 제시하는 것입니다. 여기에 주요 구성 요소는 광학 파파장의 시리즈로 만들어진 포토닉 칩입니다. 광 파도관 내부의 빛은 총 내부 반사에 따라 안내됩니다.

일부 빛은 에반데스름파의 형태로 표면에 존재한다. 그 에반데스센트 파도, 그들은 표면에서 기하 급수적으로 부패, 백 나노 미터의 침투 깊이와. 이것은 TIRF 조명에 적합합니다.

광학 도파관을 통한 TIRF 조명은 파도어 형상에 의해 정의되는 매우 넓은 영역에서 사용할 수 있으며, 따라서 높은 처리량 이미징에 이상적입니다. 우리의 접근 방식과 비교하여 기존의 TIRF와 dSTORM 설정의 주요 차이점은 이미징 목표 렌즈를 통해 빛을 보내는 대신 광장 칩을 사용하여 샘플을 비추는 것입니다. 우리의 접근 방식은 조명과 수집 조명 부분을 분리하여 새로운 이미징 가능성을 열어줍니다.

웨이퍼 트위저를 사용하여 유리 페트리 접시에 칩을 넣고 1 % Hellmanex 용액으로 완전히 덮습니다. 페트리 접시를 핫플레이트에 70도 10분간 놓습니다. 핫플레이트에 있는 동안 클린룸 조직 면봉으로 표면을 문지릅니다.

페트리 접시에서 칩을 제거합니다. 적어도 100 밀리리터의 탈수로 헹구는 다. 이소프로판올의 적어도 100 밀리리터로 헹구고, 용매가 증발 얼룩을 방지하기 위해 표면에서 건조하지 않도록 주의하십시오.

적어도 100 밀리리터의 탈수로 헹구는 다. 질소 총으로 칩 건조를 날려 버리십시오. 페트리 접시에 회전하여 150 마이크로미터 PDMS의 나중에 준비합니다.

메스를 사용하여 PDMS 층에서 약 1.5 cm 프레임을 잘라냅니다. 페트리 접시에서 트위저로 프레임을 들어 올립니다. 깨끗하고 세련된 칩에 평평하게 보관하십시오.

샘플은 이제 세포 시드에 대한 준비가 되었습니다. 셀 파종 후 미디어에서 칩을 제거합니다. 파이펫을 사용하여 PDMS 챔버 외부에서 과도한 유체를 제거합니다.

약 60 마이크로리터를 동시에 PBS를 세척하면서 피펫으로 PDMS 챔버 내부에서 전류 유체를 제거합니다. PBS를 60마이크로리터클린 PBS로 교체하고 1분간 배양해하십시오. 이전 단계를 반복하여 이번에는 5분 동안 배양할 수 있습니다.

PBS를 제거하고 염료 용액의 60 마이크로리터로 교체하십시오. 샘플을 15분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 이전에 설명한 절차를 사용하여 PBS로 샘플을 세척합니다.

PBS를 제거하고 동시에 이미징 버퍼의 40 마이크로리터로 교체합니다. 커버슬립을 위에 놓고 기포가 그 아래에 형성되는 것을 방지합니다. 이미징 챔버에 대한 커버슬립을 부드럽게 눌러 과도한 미디어를 제거합니다.

파이프를 사용하여 커버슬립 외부의 과잉 미디어를 제거합니다. 말린 침수 매체 잔류물로 형성된 결정을 피하기 위해 수습 면봉으로 커버슬립 외부의 영역을 청소하십시오. 이 버전의 설정은 세 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다.

필터 홀더, 백색 광원, 카메라 및 객관적인 리볼버가 있는 현미경. 섬유 결합 레이저와 커플링 렌즈가 있는 3축 압전 스테이지인 커플링 스테이지입니다. 1축 수동 단계인 샘플 스테이지는 팁과 기울기, 진공 홀더가 있습니다.

커플링 및 샘플 스테이지는 모두 샘플 번역을 위해 2축 전동 단계에 장착됩니다. 결합 면이 결합 목표를 향해 진공 트럭에 칩을 배치합니다. 칩이 커플링 목표에서 약 하나의 초점 길이인지 확인합니다.

진공 펌프를 켭니다. 레이저를 1밀리와트로 켭니다. 빔이 가장자리에 닿을 수 있도록 칩 높이를 대략 조정합니다.

레이저를 끕니다. 백색 광원을 켭니다. 예를 들어, 10배의 낮은 배율 목표 렌즈를 선택합니다.

현미경을 파도관에 집중시하십시오. 도파관을 따라 현미경을 변환하여 광학 경로와 잘 정렬되어 있는지 확인합니다. 현미경을 커플링 가장자리로 이동합니다.

1 밀리와트 이하에서 레이저를 켭니다. 결합 가장자리를 따라 현미경을 변환하여 레이저 빛을 찾습니다. 칩 가장자리에 빔을 집중합니다.

레이저 빔 스팟 크기가 사라질 때까지 크기를 줄이는 방향으로 광학 경로를 따라 커플링 스테이지를 조정합니다. 이제 빔이 칩 표면 위 또는 아래에 있습니다. 빔 스팟이 다시 나타나고 최대화될 때까지 커플링 스테이지 높이를 조정합니다.

레이저가 집중 된 지점을 형성 할 때까지 두 개의 이전 단계를 반복합니다. 관심의 도파로 초점을 맞춘 지점을 이동합니다. 초점 빔 스팟이 더 이상 보이지 않도록 현미경을 가장자리에서 짧은 거리에 변환합니다.

백색 광을 끕니다. 대비를 조정합니다. 도파가 안내하는 경우, 도파관을 따라 흩어진 빛을 명확하게 표시해야합니다.

결합 단계의 축을 조정하여 산란된 광 강도를 최대화합니다. 레이저를 끕니다. 백색 광을 켭니다.

필요한 경우 대비를 조정합니다. 이미징 영역으로 이동합니다. 원하는 상상 의 목표에 초점을 맞춥니다.

흰색 표시등을 끕니다. 형광 필터를 삽입하고 레이저 전력을 1밀리와트로 바꿔보십시오. 카메라 노출 시간을 약 100밀리초로 설정합니다.

필요에 따라 대비를 조정합니다. 커플링이 여전히 최적화되어 있는지 확인합니다. 이미징에 대한 관심 영역을 찾습니다.

평균 노드로 반복되는 압전 스테이지를 켭니다. 300개 이상의 이미지를 캡처합니다. 가상 스택을 사용하여 캡처된 이미지 스택을 피지에 로드합니다.

피지의 이미지 메뉴에서 스택 및 Z 프로젝트를 선택합니다. 투영 유형, 평균 강도를 선택하여 TIRF 이미지를 계산합니다. 레이저를 1밀리와트로 켜고 카메라 노출 시간을 30밀리초로 설정합니다.

대비와 초점을 조정합니다. 깜박임이 관찰될 때까지 레이저 전력을 늘립니다. 샘플의 작은 영역을 확대합니다.

대비를 조정합니다. 몇 개의 이미지를 캡처하여 깜박임이 잘 분리되었는지 확인합니다. 최적의 깜박임에 맞게 카메라 노출 시간을 조정합니다.

압압 스테이지 루프를 켭니다. 깜박이는 밀도에 따라 최소 30, 000 프레임의 이미지 스택을 기록합니다. 피지를 열고 dSTORM 스택을 가상 이미지로 로드합니다.

필요한 경우 대비를 조정합니다. 사각형 도구를 사용하여 재구성할 영역을 선택합니다. 피지의 썬더 스톰 플러그인에서 오픈 런 분석.

장치에 해당하는 썬더스톰의 기본 카메라 설정을 설정합니다. 나머지 기본 매개 변수는 일반적으로 만족스럽습니다. 재구성을 시작합니다.

재구성 소프트웨어에서 제공하는 지역화 목록은 비특이적 지역화를 제거하기 위해 필터링됩니다. 필요한 경우 추가 드리프트 보정이 적용됩니다. 칩 기반 이미징과 기존 이미징의 주요 차이점은 계측 및 데이터 수집에 있습니다.

따라서 재구성된 이미지의 품질은 상업적 초해상도 현미경의 이미지와 동일한 방식으로 평가될 수 있습니다. 다중 모드 파도가이드가 사용되기 때문에 결과 이미지는 이미지가 너무 적으면 불균일한 흥분을 나타낼 수 있습니다. 패널 a에 표시됩니다.

여기 패턴의 양을 늘리면 패널 b에 나와 같이 불균일한 흥분이 발생합니다. 여기서 우리는 형광표지 플라즈마 막을 가진 간 부비동성 내피 세포를 심화했습니다. 패널 a와 b는 회절 제한 이미지입니다.

패널 c는 패널 b의 인셋의 회절 제한 이미지를 보여 주어 있다. 패널 d는 동일한 영역의 dSTORM 이미지를 표시합니다. 간 부비동성 내피 세포는 패널 D의 초해상도 이미지에서 명확하게 볼 수있는 혈장 막에 나노 크기의 회향을 갖는다.

칩 기반 슈퍼 해상도 이미징의 주요 장점 중 하나는 달성 가능한 넓은 시야입니다. 패널은 형광 라벨 마이크로 튜룰린간 부비동 내피 세포의 500 미크론 대형 dSTORM 이미지에 의해 500 미크론을 나타낸다. 패널 b는 비교를 위해 회절 제한 및 초해상도 이미지를 모두 갖춘 패널 a에서 마젠타 인셋을 표시합니다.

패널 c는 패널 a에서 녹색 인세트를 표시합니다. 캡처된 이미지의 해상도는 77나노미터입니다. 이 비디오에서는 광장 칩을 사용하여 간 부비동 내피 세포의 넓은 시야 TIRF 및 dSTORM 이미징을 수행했습니다.

우리의 방법은 미리 결정된 수치 조리개와 낮은 시야의 현미경 목표를 사용하여 TIRF를 수행하는 기존의 방법보다 덜 복잡하고, 더 컴팩트하며, 더 유연합니다. dSTORM과 같은 국소화 현미경 검사는 포토닉 칩을 사용하여 탐구한 여러 초해상도 이미징 기술 중 하나입니다. 예를 들어, 빛은 이미징 객관적인 렌즈를 사용하여 가능한 것보다 고굴절률 광학 파도어 재료 내부에 훨씬 더 단단히 고정될 수 있다.

칩 조명의 이 속성은 강도 변동 기반 광학 현미경 검사법과 구조화 된 조명 현미경 검사법의 해상도를 증가에 응용 프로그램을 발견했다. 또한 포토닉 칩은 소형화, 비용 효율성 및 간단한 광학 설정의 이점을 누릴 수 있습니다. 통합 된 기술이되면 다른 온칩 광학 기능과 호환됩니다.

이를 통해 기존의 회절 제한 현미경으로 개조하여 저렴한 비용으로 슈퍼 분해능을 할 수 있습니다.