Name: 레퍼런스 프리 견인력 현미경 플랫폼 제작 및 구현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 배우세요 다광자 리소그래피를 활용한 레퍼런스 프리 견인력 현미경 플랫폼 제작 방법입니다. 형광 기준 마커를 폴리에틸렌글리콜 하이드로겔에 내장하여 세포 견인력을 고속 측정하고 3D 재료 변형을 정밀 분석할 수 있습니다.

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O. A. 반다 NSF IGERT SBE2 펠로우십 (1144726), 델라웨어 대학에서 제공하는 스타트업 기금, 국립 보건 원 /국립 암 연구소 IMAT 프로그램 (R21CA214299)의 자금 지원으로 지원되었습니다. JHS는 국립 보건원/국립 암 연구소 IMAT 프로그램(R21CA214299)과 국립 과학 재단 경력 상 프로그램(1751797)의 자금 지원을 받고 있습니다. 현미경 접근은 NIH-NIGMS (P20 GM103446), NSF (IIA-1301765) 및 델라웨어 주에서 보조금에 의해 지원되었습니다. 구조화 된 조명 현미경은 델라웨어 주 연방 연구 개발 보조금 프로그램 (16A00471)의 자금으로 인수되었습니다. 2광자 레이저 스캐닝 리소그래피에 사용되는 LSM880 공초점 현미경은 공유 계측 보조금(S10 OD016361)으로 획득하였다.

<ol><li>Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+tension+inhibits+Hippo+signaling+through+an+Ajuba-Warts+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex.</a> Cell. 158 (1), 143-156 (2014).</li>
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<li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+regulation+of+stem+cell+differentiation+by+matrix+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 103(2015).</li>
<li>Tijore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Cytoskeletal+Tension+in+the+Induction+of+Cardiomyogenic+Differentiation+in+Micropatterned+Human+Mesenchymal+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).</li>
<li>Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+Dictyostelium+reveals+distinct+roles+for+myosin+II+motor+and+actin-crosslinking+activity+in+polarized+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement.</a> Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+traction+force+microscopy+reveals+out-of-plane+rotational+moments+about+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).</li>
<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+Force+Microscopy+of+Migrating+Normal+and+H-ras+Transformed+3T3+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li>
<li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-Throughput+single-cell+force+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li>
<li>Bergert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+reference+free+traction+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cellular+forces+at+focal+adhesions+using+elastic+micro-patterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates.</a> Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜의 목표는 TFM 데이터의 생성 및 분석과 관련된 많은 어려움을 완화하는 워크플로우를 제공하는 것입니다. 일단 준비되면, photopatterned 하이드로겔은 표준 조직 배양 사례 및 형광 현미경 검사법의 지식만 요구하는 사용이 간단합니다. 참조가 없는 측면은 셀 라덴 하이드로겔에서 평온한 탐색을 가능하게 하며 참조 및 변형된 이미지 간의 이미지 등록과 같은 번거로운 이미지 처리 단계를 제거합니다. 결과 분석은 거의 완전히 자동화되어 있으며 개별 COI의 데이터를 처음부터 끝까지 10분 이내에 분석할 수 있습니다.
이 프로토콜의 주요 과제는 포토패턴 하이드로겔의 제조에서 비롯됩니다. 프로토콜에 사용된 시약의 대부분은 사내에서 합성되기 때문에 합성 하이드로겔 물질을 사용한 경험이 거의 없는 사용자가 이 프로토콜을 시도하는 것을 다소 억제할 수 있을 것으로 예상됩니다. 즉, 이 프로토콜에 사용된 모든 PEGylated 구성 요소는 한 냄비 반응을 사용하여 거의 동일한 프...

견인력 현미경 검사법(TFM)은 부착 및 수축 세포에 의해 생성된 신탁 마커의 보간된 변위 필드를 사용하여 셀룰러 견인을 근사화하는 과정입니다. TFM을 사용하여 증식, 분화 및 이동과 같은 중요한 세포 과정에 대한 세포 외 환경에서의 기계적 단서의 영향을1,2,3,4로 조사할 수 있습니다. 5,6,7,8,9,10,11,12. 안타깝게도 많은 기존 접근 방식은 고도로 전문화된 분석 및 계산 도구에 익숙해지기 어렵거나 경험이 없는 연구자가 TFM을 사용하기 어렵게 만들 수 있습니다. TFM 플랫폼을 생성하는 방법론을 설명하며, 이는 분석의 어려움을 제거하는 동시에 높은 처리량의 데이터 수집을 제공합니다.
기존의 TFM 접근법 중, 재료 변형을 정량화하는 데 가장 일반적으로 사용되는 것은 폴리아크릴아미드 (PAA) 또는 폴리와 같은 변형 가능한 하이드로겔에 작은 형광 마커 (일반적으로 나노 또는 마이크로 미터 크기의 형광 비드)를 통합하는 것을 포함합니다. (에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA)13,14,15. 이러한 비드 기반 접근법은 관심 셀 주위의 fiducial 마커를 조밀하게 클러스터화하여 변위 샘플링을 최대화하는 기능을 제공합니다. 불행히도, 하이드로겔 전체에 걸쳐 비드의 분포는 공간 조직이 무작위이도록 직접 제어될 수 없다. 이러한 무작위 배치는 비드가 서로 너무 가까워서 정확하게 해결하거나, 기판의 패치가 낮은 품질의 데이터를 생성하도록 확산되는 등의 문제를 초래합니다. 셀이 없는 상태에서 fiducial 마커가 있는 위치를 예측할 수 없는 것은 또한 수집된 모든 셀 견인 데이터 집합에 대해 완화된 상태의 기본 마커의 추가 참조 이미지도 캡처해야 하는 제약 조건을 만듭니다. 응력 이미지의 변위가 응력 이미지와 응력 없는 이미지의 차이로 근사화될 수 있도록 참조 이미지가 필요합니다. 완화 된 상태를 달성 하기 위해, 측정 되 고 세포는 화학적으로 이완 또는 완전히 제거. 이 프로세스는 종종 추가 실험 측정의 수집을 방지, 장기 세포 연구를 억제, 및 처리량을 제한. 또한 참조 이미지에는 실험 중에 발생할 수 있는 드리프트를 수용하기 위한 이미지 등록 기술이 필요하며, 종종 스트레스 상태 이미지를 참조하기 위해 번거로운 수동 일치를 초래합니다.
참조가 없는 것으로 간주되는 다른 TFM 방법, 고해상도 리소그래피, 마이크로 접촉 인쇄 또는 마이크로 몰딩16,17,18에 의해 fiducial 마커의 분포에 대한 제어의 일부 형태를 구현 ,19,20. 참조없는 TFM은 제조 과정에서 마커 위치가 어떻게 처방되었는지에 따라 각 신탁 마커에 대한 완화 된 상태를 예측 할 수 있다는 가정을 통해 달성됩니다. 이러한 방법을 사용하면 fiducial 마커 기하학에서 유추할 수 있는 것보다 암시적 참조와 비교하여 fiducial 마커 변위를 측정하는 단일 이미지 캡처 내에서 셀의 장력 상태를 완벽하게 캡처할 수 있습니다. 마커 배치의 일관성은 일반적으로 이러한 플랫폼을 사용하여 달성되지만, 일반적으로 다음과 같은 널리 사용되는 비드 기반 접근 방식에 비해 자신의 단점으로 고통: 1) 감소 견인 해상도; 2) 평면 외 변위의 정확도 감소(경우에 따라 측정할 수 없는 경우); 및 3) 플랫폼 기판 및 재료 (예 : 리간드 프리젠 테이션, 기계적 특성)의 사용자 정의성을 감소시다.
이러한 단점을 해결하기 위해 새로운 참조 없는 TFM 플랫폼을 설계했습니다. 이 플랫폼은 다광자 활성화 화학을 활용하여 소량의 플루오로포를 하이드로겔 내의 특정 3D 위치로 상호 연결하여 재료 변형을 측정하는 신탁 마커 역할을 합니다. 이러한 방식으로 당사는 비드 기반 접근법과 유사하게 작동하는 플랫폼을 설계했지만, 신탁 마커가 참조가 없는 재료 변형 추적을 허용하는 격자 형 배열로 구성되는 상당한 이점을 가지고 있습니다. 이 참조가없는 속성은 많은 장점을 제공합니다. 무엇보다도, 그것은 세포 견인 상태의 비 관입 모니터링을 허용합니다 (즉, 변위 된 신탁 마커의 참조 위치를 획득하기 위해 세포를 이완하거나 제거 할 필요성을 우회합니다). 이것은 파괴적인 엔드 포인트 TFM 접근 방식으로 어려울 수 있는 TFM과 함께 다른 다운스트림 분석 방법을 통합하기 위해 이 시스템을 설계하는 데 있어 우리의 주요 목표였습니다. 둘째, 격자 형 배열을 기반으로 암시적 참조를 사용하면 변위 분석을 거의 완벽하게 자동화 할 수 있습니다. 배열의 규칙성은 예외적인 경우(예기치 않은 마커 간격 또는 등록 불일치와 같은 예기치 않은 아티팩트를 포함하는 샘플 셀 데이터)의 발생을 최소한으로 유지할 수 있는 예측 가능한 워크플로우를 만듭니다. 셋째, 참조 이미지를 획득할 필요성을 간지러이한 것은 오랜 시간 동안 단일 샘플에서 많은 세포를 모니터링할 수 있는 자유를 제공한다. 이는 현미경의 자동 단계 움직임의 충실도에 따라 위치 설정의 오류가 누적되어 세포 장력에 참조 이미지를 적절하게 등록하는 어려움을 증가시킬 수 있는 기존의 비드 기반 접근법과 대조됩니다. 이미지. 전반적으로 이 플랫폼은 셀룰러 장력 데이터 수집시 더 높은 처리량을 용이하게 합니다.
이 프로토콜을 통해 우리는 이 참조가 없는 TFM 플랫폼을 생성하기 위해 구현한 2광자, 레이저 스캐닝 리소그래피 기술로 독자에게 익숙해지도록 하여 시드된 세포에 의해 생성된 평면 및 평면 외 견인 구성 요소를 측정할 수 있기를 바랍니다. 표면에. 이 프로토콜에서는 다루지 않는 일부 단일 성분의 합성입니다. 일반적으로, 이들 반응은 앞서21에설명된 거의 동일한 "원팟" 합성 반응 방식을 포함하며, 이들 제품에 대한 대안도 구매할 수 있다. 또한 시판되는 레이저 스캐닝 현미경을 3D 프린팅 도구로 사용하고 피신 마커 변위 분석을 용이하게 하기 위해 생성된 소프트웨어 기반 도구를 독자에게 숙지하는 것을 목표로 합니다.

<table><tbody><tr><td>Acrodisc 주사기 필터, 0.2 &mu; m Supor Membrane, Low Protein Binding</td><td>Pall</td><td>PN 4602</td><td>염기 겔 합성 및 후속 리소그래피 단계 전에 거량체 용액을 여과할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>아크릴레이트-실란 기능성 #1.5 커버슬립<</td><td>em>in-house</td><td>in-house</td><td>아크릴레이트는 염기 하이드로겔을 유리 표면에 결합하여 하이드로겔을 고정시킬 수 있습니다. 참조 참조: 21-24</td></tr><tr><td>Axio-Observer Z1 w/Apotome</td><td>Zeiss</td><td>Widefield microscope with structured illumination module은 TFM용 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다.</td><td></td></tr><tr><td>카멜레온 비전 II</td><td>코히런트 Inc.</td><td></td><td>다광자 리소그래피에 사용되는 레이저 스캐닝 현미경이 장착되어 있습니다.</td></tr><tr><td>양면 코팅 테이프, 9500PC, 6.0 mil</td><td>3M</td><td></td><td>은 아크릴레이트 실란 기능성 커버 슬립을 페트리 접시에 결합합니다.</td></tr><tr><td>Flexmark90 PFW 라이너</td><td>FLEXcon</td><td>FLX000620</td><td>양면 코팅 테이프를 라이닝할 수 있어 플로터에 테이프를 공급할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>다광자 리소그래피에 사용되는</td> <td>LSM-880</td><td>Zeiss</td><td></td> 레이저 스캐닝 현미경.</tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2018a</td><td>: 현미경 및 TFM 데이터 분석을 위한 리소그래피 명령을 생성하기 위해 사용자 지정 스크립트를 실행합니다.</td></tr><tr><td>모델 SC 플로터</td><td>USCutter</td><td>SC631E</td><td>양면 코팅 테이프를 링으로 잘라 커버 슬립을 페트리 접시에 바인딩합니다.</td></tr><tr><td>Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27</td><td>Zeiss</td><td></td><td>광시야 현미경과 레이저 스캐닝 현미경이 모두 장착되어 리소그래피와 TFM에 모두 사용됩니다.</td></tr><tr>기준 마커 생성을 위한 <td>PEG-AF633</td><td>in-house<</td><td>em>in-house</td><td>Fluorophore-labeled acrylate PEG variant. 참조 참조: 21</td></tr><tr><td>PEG-DA</td><<td>em>in-house</td><td>in-house</td><td>Base material for hydrogels. 참조 문헌 참조: 세포 접착 촉진을 위한 21</td></tr><tr><td>PEG-RGDS</td><td>in-house</td><td>><emin-house</td><td>RGDS 펩타이드 표지 모노아크릴레이트 PEG 변형체. 참조 참조: 21</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>CELLTREAT</td><td>229638</td><td>8mm 구멍은 베이스 하이드로겔에 맞게 코어링 비트를 사용하여 각 접시의 중앙에 절단됩니다.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>염기 하이드로겔 두께(PDMS라고도 함)를 제어하기 위한 스페이서를 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Syringe, Leur-Lok, 1 mL</td><td>BD</td><td>309628</td><td>염기 겔 합성 및 후속 리소그래피 단계 전에 단량체 용액을 필터링할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>UV 램프</td><td>UVP</td><td>Blak-Ray&reg; B-100AP</td><td>염기 하이드로겔을 중합합니다.</td></tr><tr><td>1-비닐-2-피롤리디논(NVP)</td><td>시그마-알드리치</td><td>V3409-5G</td><td>라디칼 촉진제 및 공단량체. 리소그래피 중 pegylated fluorophore information을 개선합니다.</td></tr></tbody></table>

레퍼런스 프리 견인력 현미경 플랫폼 제작 및 구현

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

세포 유도 물질 변형을 정량화하면 세포가 미세 환경의 물리적 특성을 감지하고 반응하는 방법에 관한 유용한 정보를 제공합니다. 세포 유도 물질 변형을 측정하기 위한 많은 접근법이 존재하지만, 여기서는 참조가 없는 방식으로 서브 미론 분해능으로 균주를 모니터링하는 방법을 제공합니다. 2 광자 활성화 포토리소그래피 패터닝 공정을 사용하여 형광 피공 마커의 내장 된 배열을 포함하는 기계적 및 생체 능동 적으로 조정 가능한 합성 기판을 생성하여 3 차원을 쉽게 측정하는 방법을 보여줍니다. 3D) 표면 견인에 대한 응답으로 재료 변형 프로파일. 이러한 기판을 사용하여, 세포 장력 프로파일은 관심 셀의 단일 3D 이미지 스택을 사용하여 매핑될 수 있다. 이 방법론을 가진 우리의 목표는 견인력 현미경 검사법을 세포 mechanotransduction 프로세스를 공부하는 연구원을 위한 공구를, 특히 필드에 이민자를 위한 공구를 실행하기 위하여 더 접근하고 쉽게 만드는 것입니다.

프로토콜 전체에 걸쳐 패터닝 프로시저의 품질을 평가하기 위한 피드백을 제공하는 여러 체크포인트가 있습니다. 이러한 각 검사점의 진행 상황을 평가하는 방법에 대한 몇 가지 통찰력을 제공하기 위해 실제 실험의 대표적인 결과를 제공합니다. 결과는 인간 배꼽 내피 세포(HUVECs)의 TFM 분석을 위해 제조된 포토패턴 하이드로겔상에서 수행된 이 프로토콜의 적용을 강조한다. 결과는 원시 이미지 데이터뿐만 아니라 각 중요한 단계에서 처리 된 데이터 출력을 포함한다.
첫 번째 체크포인트는 하이드로겔에서 피덕실 마커 어레이가 포토패턴화되면 4단계에서 발생합니다. 이미지 스택을 수집할 때 결과 이미지는 이미지 스택 내의 z 위치 함수로 강도로 진동하는 패턴피처(그림1A-C)의일반 배열을 표시해야 합니다. 패턴 표면이 완벽하게 평평하지 않은 경우 각 이미지 조각의 다른 영역이 이러한 진동과 관련하여 서로 위상을 ...

이 프로토콜은 참조가 없는 견인력 현미경으로 사용하기 위해 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 하이드로겔에 내장된 형광 선한 마커의 3차원 배열을 제작하기 위해 다광자 리소그래피를 구현하기 위한 지침을 제공합니다. 플랫폼. 이 지침을 사용하여 3D 재료 변형률 측정 및 셀룰러 견인 계산이 단순화되어 고처리량 견인력 측정을 촉진합니다.

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

견인력 현미경 검사는 세포 생성 힘을 측정하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 경험이 부족한 사용자가 더 쉽게 액세스할 수 있도록 견인력 데이터의 수집 분석을 단순화합니다. 기존 레퍼런스 리스필 포스 현미경 플랫폼에 비해 이 기술의 주요 장점은 다광 석판 소그래피가 개별 실험 요구에 따라 빠르고 쉬운 패터닝 설정을 재설계할 수 있다는 것입니다.텍스트만으로는 시각적 표현을 통해 이해하기 쉬운 이 새로운 참조 없는 견인 플랫폼의 제작 및 구현에 많은 주요 단계가 있습니다. 염기 하이드로겔의 광중합화를 위해 먼저 퍼플루오로알록시 알칸의 얇고 평평한 시트에 프리 폴리머 용액의 3마이크로리터를 추가하고, 평평한 150 마이크로미터 두께의 PDMS 스트립을 둘러싸고 있지만 접촉하지 않고 사전 폴리머 용액의 낙하한다. PDMS에 아크릴 사일란화 커버슬립을 배치하고, 표지 슬립 아래에 중앙에 미리 폴리머 방울을 배치하여 PDMS 스페이서의 두께로 전폴리머 액적액을 평평하게 한다.끼워진 프리 폴리머 용액을 약 1분 동안 UV 광에 노출시다. 하이드로겔이 완전히 형성되면 PDMS 스페이서에서 커버슬립을 조심스럽게 분리하십시오. 고성능 양면 아크릴 접착제를 사용하여 커버슬립에 오픈 바텀 페트리 접시를 부착합니다.하이드로겔이 함유된 커버슬립을 페트리 접시에 고수할 때 는 특별한 주의를 기울이십시오. 젖은 접시 또는 응용 프로그램 동안 너무 적은 압력은 샘플을 파괴, 형성 누출을 허용합니다. 접착 접착 접착 표면에 압력을 가하여 커버슬립, 접착제 및 페트리 접시 사이에 완전한 씰을 만들어 유리를 깨지 않도록 주의하십시오.멸균 여과 된 PBS를 사용하여 하이드로겔을 헹구는다. 그런 다음 하이드로겔 합성을 위해 준비된 실험실 용액의 800 마이크로리터에 NVP8 마이크로리터를 추가합니다. 이진 이미지를 디지털 마스크로 변환하려면 MATLAB을 열고 실행 스크립트를 열고 실행합니다.m MATLAB 스크립트. 변환을 위해 바이너리 TIF 파일을 선택하고 폴더를 선택하여 지역의 파일을 저장합니다. 선택한 이미지의 미크론에 원하는 최종 크기를 입력합니다.입력 이미지는 이러한 매개 변수와 일치하도록 배율이 조정되고 차원이 조정됩니다. 관심 있는 생성기 옵션 영역에서 단일 픽셀 배열을 만들려면 작은 영역/단일 픽셀 에서 틱 제거 상자를 선택 해제하려면 사각형 틱 박스를 확인하고 수평 중단 선 에서 사용을 선택 취소합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. OVL 파일은 이전에 지정된 폴더에서 찾을 수 있습니다.현미경 소프트웨어에서 파일을 열고 두 개의 광자 레이저 스캐닝 리소그래피 동안 레이저 셔터를 제어하는 원하는 영역을 로드합니다. 다음 단계는 최소한의 조명으로 조건에서 수행해야 합니다. 저조도 조건에서 fiducial 마커 어레이의 제조를 위해 이전에 준비된 NVP 실험실 용액의 200 마이크로리터를 알렉사 플루어 6332와 철저히 혼합하고 하이드로겔을 함유한 접시에서 모든 PBS를 제거합니다.기저 하이드로겔을 완전히 포괄하는 액적으로 HYDROgel에 PEG-633 혼합물을 추가하고 페트리 접시를 현미경 스테이지의 샘플 홀더에 적재합니다. 그런 다음 접시를 덮고 패턴 화액이 빛으로부터 보호되는 최소 30 분 동안 하이드로겔에 담가 두도록 합니다. 이미징용 현미경을 구성하려면 Alexa Fluor 488을 시각화하기 위한 적절한 레이저 및 필터를 선택합니다.PEG-488 신호를 사용하여 하이드로겔을 찾아 검출기에서 더 긴 방출 파장의 수집을 차단한다. 수직 및 수평 타일 스캔을 사용하여 XY 평면의 하이드로겔 의 중심을 찾고 이 위치에서 스테이지를 0으로 설정합니다. Z 스택 함수의 선 스캔을 사용하여 하이드로겔의 표면을 찾고 이 위치에서 초점을 0으로 설정합니다.XY 센터에서 멀리 스캔하는 라인을 반복하여 하이드로겔을 레벨화하여 표면 위치를 식별하고 필요에 따라 현미경 단계에 대한 세트 나사를 조정합니다. 현미경 소프트웨어 작업 공간 내에서 광패팅을 위한 별도의 실험 파일을 만들고 다중 광자 전력을 1.8%로 설정하고 스캔 속도를 6으로 설정합니다. 이미지 프레임과 픽셀의 크기를 조정하여 픽셀당 픽셀 크기0.1 마이크로미터, 가로세로 비율이 100대 1로 조정되고 영역 파일을 지역 탭에 로드합니다.매크로를 사용하여 모든 영역을 설정하여 Z 스택 함수를 획득하고 켭니다. 총 깊이 28마이크로미터및 총 9개의 Z 슬라이스 수에 대해 간격을 3.5 마이크로미터로 설정합니다. 그런 다음 위치 함수를 사용하여 수압 마커 어레이가 포토패턴이 되는 하이드로겔의 특정 위치를 설정합니다.흡수 시간이 30분 마크에 도달하면 5분마다 하이드로겔 표면의 연속 Z-스택 라인 스캔을 획득하여 제로 포커스 위치에 비해 표면의 위치 변화에 따라 부종을 확인합니다. 5분 간격동안 표면 위치의 변화가 발생하지 않은 경우, 패터닝 설정을 실행하고 488 나노미터 레이저를 사용하여 수로겔의 표면이 패터닝 중에 움직이지 않았는지 확인한다. 그런 다음 현미경에서 하이드로겔을 제거하고 페트리 접시에서 PEG-633 용액을 흡인하고 멸균 여과 된 PBS로 접시를 헹구는다.셀 및 수탁 마커 이미지를 획득하려면 Petri 접시를 샘플 홀더로 돌려 보내 패턴 영역을 찾습니다. 관심 있는 세포를 찾아 세포의 전달 되거나 형광성 영상을 습득한다. 그런 다음 입증된 바와 같이 세포 아래에 패턴 배열의 Z 스택을 획득하고, 세포의 전송 또는 형광 이미지의 두 번째 세트를 획득한다.이미지 스택을 수집할 때 결과 이미지는 이미지 스택 내에서 Z 위치의 함수로서 강도가 진동하는 패턴 피처의 정기적인 배열을 표시해야 합니다. 추적. m 스크립트는 전처리 품질을 평가하기 위해 형광 선량 마커의 Z 프로젝션, 검출된 센트로이드의 플롯, 물체 감지 품질을 평가하기 위한 Z 위치의 함수로 코딩된 색상, Z 방향으로 열에 연결된 검출된 마커 중심을 나타내는 트랙의 플롯 을 포함하여 여러 가지 진단 이미지를 제공합니다.DISP 3D.m 스크립트는 지정된 이미지 스택에서 감지된 각 피처의 각 열에 대한 Z 위치의 함수로서 강도 플롯을 제공하여 선량마커 강도 프로파일의 품질을 평가합니다. 두 DISP 3D.m 및 DISP 전단. m함께 각 카르테시안 좌표 치수에서 측정된 변위 소음의 히스토그램과 변위의 보간 된 열지도를 제공합니다. 또한 인터프 final3D_2.m은 아웃소싱 코드를 사용하여 계산된 표면 견인력의 열지도를 제공합니다. 이 절차 에서 기억해야 할 가장 중요한 점은 LAP가 포함된 솔루션이 빛에 민감하며 주변 광원으로부터 가능한 한 많이 보호되어야 한다는 것입니다. NVP는 휘발성 유기 화합물이며 항상 화학 적 흐름 후드에서 처리되어야한다는 것을 기억하십시오.

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연구

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Bioengineering

생명공학

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