Name: 다세포 3차원 스페로이드 생성을 위한 랩 온 어 CD 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 배우세요 랩 온 어 CD 플랫폼을 활용한 원심력 기반 다세포 3차원 스페로이드 생성 기법입니다. 고중력 조건에서 단일 및 다중 세포 유형의 공배양을 통해 조직 공학 및 신약 스크리닝 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 NRF의 기초 과학 연구 프로그램(2016R1D1A1A1A1B0333418)과 NRF의 바이오 및 의료 기술 개발 프로그램(2018M3A9H1023141)에 의해 지원되었으며, 한국 정부, MSIT의 지원을 받았습니다.

1. 원심 미세 유체 기반 의 스페로이드 (CMS) 배양 칩 제조
<ol><li>CNC 가공에 의해 CMS 배양 칩의 상부 및 하부 레이어용 PC 금형을 만듭니다. 칩의 자세한 치수는 그림 1에있습니다.</li>
	<li>PDMS 베이스와 PDMS 경화제를 10:1(w/w)의 비율로 5분 동안 혼합하고 기포를 제거하기 위해 1시간 동안 건조기안에 놓습니다.</li>
	<li>CMS 배양 칩의 금형에 PDMS 혼합물을 부은 후, 기포를 1시간 더 제거하고 80°C에서 2시간 동안 열 챔버에서 경화한다.</li>
	<li>면이 위로 향하도록 표면이 있는 진공 플라즈마 클리너에 놓고 30s용 18W의 힘으로 공기 보조 플라즈마에 노출시십시오.</li>
	<li>CMS 배양 칩의 두 층을 결합하고 접착 강도를 높이기 위해 30 분 동안 80 °C의 열 챔버에 놓습니다.</li>
	<li>121°C 및 15psi에서 오토클레이브 소독기에서 CMS 배양 칩을 살균합니다.</li>
</ol>2. 세포 준비
<ol><li>5× 105-1×106 hASCs 또는 MRC-5s 세포를 함유하는 바이알의 1 mL을 36.5°C에서 수조에서 2분 동안 해동한다.</li>
	<li>1 mL의 덜베코 수정 된 독수리 매체 (DMEM)를 바이알에 넣고 1,000 μL 파이펫과 부드럽게 섞습니다.</li>
	<li>36.5°C로 미리 온 DMEM의 15 mL을 파이펫을 사용하여 150 mm 직경의 페트리 접시에 넣고 바이알로부터 세포를 첨가한다.</li>
	<li>1 일 후, DMEM을 흡인하고 신선한 DMEM의 15 mL로 교체합니다. 그 후, 2 일 또는 3 일마다 미디어를 변경합니다.</li>
	<li>페트리 접시에서 세포를 분리하려면, 페트리 접시에 트립신 4 mL을 추가하고 36.5 °C에서 인큐베이터에 놓고 4 분 동안 5 %CO2.</li>
</ol>3. 단일 배양 스페로이드 형성
<ol><li>2.5 mL의 4%(w/v) 플루론성 F-127 용액을 CMS 배양 칩의 입구 구멍에넣고(그림 2A)칩을 500-1,000 rpm에서 회전한 다음 CMS 시스템을 사용하여 3분 동안 4,000 rpm에서 칩을 회전시다(그림2B). 참고: 플라우론티드 코팅은 칩이 회전하는 동안 입구 포트에 셀 부착을 방지합니다. 공기가 마이크로웰에 갇혀 있지 않은지 확인하십시오.</li>
	<li>5%CO2에서36.5°C에서 밤새 플루론액으로 채워진 CMS 배양 칩을 배양한다.</li>
	<li>pluronic 용액을 제거하고, DMEM으로 나머지 pluronic 용액을 씻어 내고, 깨끗한 벤치에서 12 시간 동안 칩을 건조시면됩니다.</li>
	<li>CMS 배양 칩에 2.5 mL의 DMEM을 추가하고 칩 내부를 예열하기 위해 3 분 동안 ~ 4,000 rpm에서 칩을 회전시다.</li>
	<li>회전을 멈추고 100 μL의 DMEM을 꺼내 셀 서스펜션을 주입할 공간을 마련합니다.</li>
	<li>5 × 105 hASCs 또는 8 × 105 MRC-5s를 포함하는 셀 서스펜션 100 μL을 파이펫팅하여 재서스펜션을 위해 3-5x를 파이펫팅하여 셀을 균일하게 분배합니다.</li>
	<li>칩을 3,000rpm에서 3분 동안 회전시켜 각 마이크로웰의 세포를 원심력으로 트랩합니다. 참고: 회전 속도가 과도하면 용액 배출 구멍을 통해 셀이 빠져나갈 수 있습니다.</li>
	<li>36.5°C, >95% 습도, 및 5%CO2에서인큐베이터에서 3일 동안 세포를 배양하고, 1,000-2,000 rpm에서 회전한다. 매일 문화 매체를 변경합니다.</li>
</ol>4. 공동 배양 스페로이드 형성
<ol><li>
동심 스페로이드 형성
	<ol>
<li>첫 번째 셀인 2.5 × 105 hASC를 추가하고 칩을 3,000 rpm에서 회전시다. 3분 후, 두 번째 세포를 4× 105 MRC-5s를 추가하고 3 분 동안 3,000 rpm에서 칩을 회전시고 파이펫팅에 의해 총 100 μL의 셀 현탁액을 주입합니다. 세포가 주입될 때, 회전 속도를 500-1,000 rpm으로 옮기.</li>
		<li>인큐베이터내세포를 36.5°C, >95% 습도%, 및 1,000-2,000 rpm에서 회전하여 5%CO2를 배양하였다. 동심 스페로이드는 24 시간 이내에 생성됩니다. 장기적인 문화의 경우, 매일 문화 매체를 변경하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
야누스 스페로이드 형성
	<ol>
<li>칩이 500-1,000 rpm에서 회전하는 동안 파이펫팅하여 첫 번째 셀을 포함하는 100 μL의 셀 현탁액을 2.5 × 105 hASC를 추가합니다. 그런 다음 칩을 3,000 rpm에서 3 분 동안 회전시면 됩니다.</li>
		<li>칩을 36.5°C, >95% 습도에서, 5%CO2를 3시간 동안 1,000-2,000 rpm에서 회전하여 배양합니다.</li>
		<li>칩이 500-1,000 rpm에서 회전하는 동안 파이펫팅하여 두 번째 셀 세트인 4 × 105 MRC-5s를 포함하는 셀 현탁액의 100 μL을 추가합니다. 그런 다음 칩을 3,000 rpm에서 3 분 동안 회전시면 됩니다.</li>
		<li>인큐베이터내 세포를 36.5°C, >95% 습도, 및 1,000-2,000 rpm에서 회전하여 5%CO2를 배양하였다. 야누스 스페로이드는 24시간 이내에 생성됩니다. 장기적인 문화의 경우, 매일 문화 매체를 변경하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샌드위치 스페로이드 형성
	<ol>
<li>칩이 500-1,000 rpm에서 회전하는 동안 파이펫팅하여 첫 번째 셀을 포함하는 100 μL의 셀 현탁액, 1.5 × 105 hASC를 추가합니다. 그런 다음 칩을 3,000 rpm에서 3 분 동안 회전시면 됩니다.</li>
		<li>칩을 36.5°C, >95% 습도에서, 5%CO2를 3시간 동안 1,000-2,000 rpm에서 회전하여 배양합니다.</li>
		<li>칩이 500-1,000 rpm에서 회전하는 동안 파이펫팅하여 두 번째 셀을 포함하는 100 μL의 셀 현탁액, 3 × 105 MRC-5를 추가합니다. 그런 다음 칩을 3,000 rpm에서 3 분 동안 회전시면 됩니다.</li>
		<li>칩을 36.5°C, >95% 습도% 및 5%CO2에서 1,000-2,000 rpm에서 3시간 동안 회전하여 배양합니다.</li>
		<li>칩이 500-1,000 rpm에서 회전하는 동안 파이펫팅하여 세 번째 셀을 포함하는 100 μL의 셀 현탁액, 1.5 × 105 hASC를 추가합니다. 그런 다음 칩을 3,000 rpm에서 3 분 동안 회전시면 됩니다.</li>
		<li>인큐베이터내세포를 36.5°C, >95% 습도%, 및 1,000-2,000 rpm에서 회전하여 5%CO2를 배양하였다. 샌드위치 스페로이드는 12 시간 이내에 생성됩니다. 장기적인 문화의 경우, 매일 문화 매체를 변경하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 세포 염색
<ol><li>세포 형광 염료를 실온 (20 °C)으로 데우다.</li>
	<li>바이알당 무수 디메틸설산화물(DMSO)의 20 μL을 첨가하여 1 mM 용액을 만듭니다.</li>
	<li>DMEM을 사용하여 1 μM의 최종 작업 농도로 형광을 희석한다.</li>
	<li>셀 현탁액에 형광을 추가하고 파이펫을 사용하여 부드럽게 다시 중단합니다.</li>
	<li>36.5 °C에서 20 분, 습도 >95 %, 및 5 %CO2에서배양하십시오.</li>
</ol>

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<li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

CMS는 모든 주입 된 세포가 폐기물없이 마이크로 웰에 들어가는 폐쇄 시스템으로 기존의 마이크로 웰 기반 스페로이드 생성 방법보다 효율적이고 경제적입니다. CMS 시스템에서, 매 12-24시간마다 칩 내의 매체를 제거하도록 설계된 흡입 구멍을 통해 미디어가 교체된다(도3A). 미디어 흡입 과정에서, 거의 모든 매체는 마이크로웰의 매체와 벽 사이의 표면 장력으로 인해 마이크로웰 내부에서 빠져나오게 됩니다. PDMS로 만들어진 칩이 탄성및 유연하기 때문에 사용자는 손가락으로 칩의 마이크로웰 영역 근처를 눌러 트랩된 미디어를 쉽게 제거할 수 있습니다. 마이크로웰의 세포는 여러 개의 미디어 변경에도 불구하고 이스케이프없이 안정적으로 유지됩니다. 모든 100 마이크로웰에서 동일한 스페로이드 품질을 얻으려면 장치의 회전이 편심이 아니어야하며 칩은 축대칭이어야합니다. 그렇지 않으면, 세포의 가변 수는 각 우물을 입력할 수 있고 스페로이드의 크기 및 모양은 다를 수 있습니다. 종래의 마이크...

2차원(2D) 세포 배양(예: 기존의 페트리 접시 세포 배양)보다 3차원(3D) 스페로이드 세포 배양으로 생체 내 미세 환경을 시뮬레이션하여 보다 생리적으로 현실적인 실험을 생성하는 것이 더 쉽습니다. 결과1. 현재 이용 가능한 스페로이드 형성 방법은 매달려 낙하 기술2,액체 오버레이 기술3,카르복시메틸 셀룰로오스 기술4,자기 힘 기반 미세 유체 기술5,및 의 사용을 포함한다 생물 반응기6. 각 방법은 고유한 이점이 있지만 재현성, 생산성 및 공동 배양 스페로이드 생성의 추가 개선이 필요합니다. 예를 들어, 자기력 기반 미세 유체 기술5는 상대적으로 저렴하지만 살아있는 세포에 대한 강한 자기장의 영향을 신중하게 고려해야합니다. 스페로이드 배양의 이점은, 특히 중간엽 줄기세포 분화 및 증식의 연구에서, 여러 연구에서7,8,9에보고되었다.
또한 실험실에 CD (컴팩트 디스크)로 알려진 원심 미세 유체 시스템은 쉽게 내부 유체를 제어하고 기판의 회전을 악용하는 데 유용하고, 따라서 면역 분석과 같은 생체 의학 응용 프로그램에 활용되고있다10, 생화학적 마커11,핵산 증폭(PCR) 분석법, 자동 혈액 분석 시스템12,올인원 원심 미세유체 장치13. 유체를 제어하는 구동력은 회전에 의해 생성되는 구심력입니다. 또한 이 단일 CD 플랫폼에서 혼합, valving 및 샘플 분할의 여러 기능을 간단하게 수행할 수 있습니다. 그러나, 전술한 생화학적 분석 방법에 비해, 배양 세포, 특히스페로이드(14)에CD 플랫폼을 적용하는 시험이 적어왔다.
본 연구에서, 우리는 인간 지방 유래 줄기 세포 (hASC) 및 인간 폐 섬유 아세포 (MRC-5)의 단일 배양 또는 공동 배양에 의한 원심 미세 유체 기반 스페로이드 (CMS) 시스템의 성능을 보여줍니다. 이 백서에서는 그룹의 연구 방법론15에대해 자세히 설명합니다. 따라서, 스페로이드 배양 실험실-온-어-CD 플랫폼은 용이하게 재현될 수 있다. CMS 배양 칩, 칩 홀더, DC 모터, 모터 마운트 및 회전 플랫폼을 포함하는 CMS 생성 시스템이 제시된다. 모터 마운트는 아크릴로니트리리 부타디엔 스티렌 (ABS)으로 3D 인쇄됩니다. 칩 홀더와 회전 플랫폼은 PC(폴리카보네이트)로 가공된 CNC(컴퓨터 수치 제어)입니다. 모터의 회전 속도는 펄스 폭 변조에 기초한 PID(비례-적분-유도체) 알고리즘을 인코딩하여 200rpm에서 4,500rpm으로 제어됩니다. 크기는 100mm x 100mm x 150mm이며 무게는 860g으로 취급이 용이합니다. CMS 시스템을 사용하여 스페로이드는 1 x g에서 521 x g까지다양한 중력 조건하에서 생성 될 수 있으므로 고중력하에서 세포 분화 촉진에 대한 연구는 2D 셀16,17에서 3D로 확장 될 수 있습니다. 스페로이드. 다양한 유형의 세포의 동배도 생체 내 환경을 효과적으로 모방하는 핵심 기술이기도합니다(18). CMS 시스템은 다양한 구조 유형(예: 동심, 야누스 및 샌드위치)의 공동 배양 스페로이드뿐만 아니라 단일 배양 스페로이드를 쉽게 생성할 수 있습니다. CMS 시스템은 간단한 스페로이드 연구뿐만 아니라 인간의 장기 구조를 고려하기 위해 3D 오르가노이드 연구에서도 활용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>3D 프린터</td><td>Cubicon</td><td>3DP-210F</td><td></td></tr><tr><td>지방 유래 중간엽 줄기세포(hASC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-011</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>완성된 배지 및 완충액 1% 함유</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>10mM</td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34552</td><td>10mM</td></tr><tr><td>컴퓨터 수치 제어(CNC) 로터리 인그레이버</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>DC 모터</td><td>Nurielectricity Inc.</td><td>MB-4385E</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>Contained 10%</td></tr> of completed medium <tr><td>human lung fibroblasts (MRC-5)</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Inventor 2019</td><td>Autodesk</td><td></td><td>3D 컴퓨터 지원 설계 프로그램</td></tr><tr><td>페트리 접시 및 Phi; 150mm</td><td>JetBiofill</td><td>CAD010150</td><td>표면 처리</td></tr><tr><td>플라즈마 세정</td>기 <td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11/6/9003</td><td>인산염 완충 식염수를 4%(w/v) 용액</td></tr><tr>으로 희석<td>폴리카보네이트(PC)</td><td>아크릴몰</td><td>AC15PC</td><td>200 x 200 x 15 mm</td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td></td></tr></tbody></table>

다세포 3차원 스페로이드 생성을 위한 랩 온 어 cd 플랫폼

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

3차원 스페로이드 세포 배양은 2차원 세포 배양보다 생체의 세포 미세 환경을 더 잘 시뮬레이션할 수 있기 때문에 세포 실험에서 더 유용한 결과를 얻을 수 있다. 이 연구에서는 높은 원심력을 구현하는 3차원(3D) 세포 스페로이드를 만들기 위해 원심 미세유체 기반 스페로이드(CMS) 배양 시스템이라고 하는 전기 모터 구동 실험실 온 어 CD(소형 디스크) 플랫폼을 제작했습니다. 이 장치는 회전 속도가 다양하여 1 x g에서 521 x g까지의 중력 조건을 생성할 수 있습니다. CMS 시스템은 직경이 6cm이며, 100 400 μm 마이크로웰을 가지고 있으며, 컴퓨터 수치 제어 기계에 의해 미리 만들어진 폴리 카보네이트 금형에서 폴리 디메틸 실록산으로 성형하여 만들어집니다. CMS 시스템의 채널 입구의 장벽은 원심력을 사용하여 칩 내부에 세포를 고르게 퍼질 수 있습니다. 채널의 끝에는 세포가 마이크로웰에 들어갈 수 있는 슬라이드 영역이 있습니다. 시연으로, 스페로이드는 시스템을 사용하여 높은 중력 조건 하에서 인간 지방 유래 줄기 세포 및 인간 폐 섬유아세포의 단일 배양 및 공동 배양에 의해 생성되었다. CMS 시스템은 동심, 야누스 및 샌드위치의 다양한 구조의 공동 배양 스페로이드를 생산하기 위해 간단한 작업 방식을 사용했습니다. CMS 시스템은 단일 또는 다중 세포 유형의 스페로이드 및 오르가노이드 배양을 필요로 하는 세포 생물학 및 조직 공학 연구에서 유용할 것입니다.

6 cm 직경 CMS 배양칩(도 2)은상기 프로토콜에 따라 성공적으로 이루어졌다. 먼저, 칩을 상부 층 및 하부 층으로부터 별도로 만든 다음 플라즈마 결합에 의해 함께 결합하였다. 생성 된 스페로이드는 칩을 분리하여 쉽게 수집 할 수 있습니다. CMS 배양 칩의 채널은 입구 포트및 중앙, 슬라이드 및 마이크로웰 영역을포함한다(도 3). 세포, 배지 및 플루로닉 솔루션은 직경 5 mm의 입구 구멍을 통해 주입됩니다. 주입된 세포는 입구 포트 영역에서 재서스펜션 3-5x에 의해 고르게 분포된다. 세포는 중앙 지역에서 원심력을 받고 바깥쪽으로 퍼질 수 있습니다. 중앙 영역은 마이크로웰보다 높기 때문에 더 많은 매체를 포함할 수 있으므로 스페로이드가 더 오래 생존할 수 있습니다. 마이크로웰의 높이는 0.4 mm이고 중앙 영역의 높이는 1.5 mm입니다. 흡입 구멍은 내부 용액을 쉽게 제거하기 위해 중앙 영역의 중심에 존재한다. 슬...

우리는 세포 스페로이드를 재배 할 수있는 모터 구동 원심 미세 유체 장치를 제시합니다. 이 장치를 사용하여, 단일 또는 다중 세포 모형의 스페로이드는 높은 중력 조건 하에서 쉽게 cocultured 될 수 있었습니다.

다세포 3차원 스페로이드 생성을 위한 랩 온 어 CD 플랫폼

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

이 기술은 빠른 스페로이드 생성을 위한 선구적인 시스템인 LAB-on-a-CD 플랫폼을 사용하여 개별 및 다중 세포 유형에서 셀 스페로이드를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 원심력을 사용하여 세포를 지정된 마이크로웰에 증착하여 다양한 스페로이드 생산을 위해 여러 세포 유형의 순차적 고리를 허용합니다. CMS 배양 칩 제조의 경우 먼저 컴퓨터 수치 제어 가공에 의해 배양 칩의 상단 및 하단 층에 폴리 카보네이트 금형을 만듭니다.다음 혼합 PDMS 베이스와 PDMS 경화 제는 기포를 제거하기 위해 1 시간 동안 건조기에 혼합물을 배치하기 전에 5 분 동안 10 대 1 비율로. 탈가스 PDMS 혼합물을 CMS 배양 칩 몰드에 붓고 금형을 건조기에 1시간 더 넣고 기포를 제거합니다. 두 번째 탈가싱이 끝나면, 2시간 동안 80°C의 열챔버에서 혼합물을 치료한 후, 칩을 진공 플라즈마 클리너에 넣고 표면을 향하게 한다.배양 칩을 공기 보조 플라즈마에 30초 동안 18와트의 힘으로 노출하고, 열챔버의 칩 의 두 층을 섭씨 80도에서 30분간 결합하여 접착 강도를 높입니다. 그런 다음 CMS 배양 칩을 121°C에서 15분간 소독합니다. 스페로이드 형성을 위해 세포를 준비하기 위해, 부드러운 혼합으로 세포에 DMEM의 1 밀리리터를 추가하기 전에 2 분 동안 관심있는 5 세포에 5 ~ 10 배 10 배 10 번 10 번 함유 된 1 밀리리터 바이알을 해동하십시오.다음으로 세포를 직경 150mm의 페트리 접시에 넣고 섭씨 36.5도의 15밀리리터를 함유하고 24시간 동안 세포 배양 배양 인큐베이터에 접시를 넣습니다. 다음 날, 상체를 신선한 DMEM의 15 밀리리터로 교체하고 세포를 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 세포를 분리하려면 섭씨 36.5도에서 4분간 트립신 4밀리리터와 이산화탄소 5%로 배양을 생성하여 세포가 접시 바닥에서 들어올릴 때 신선한 배지로 반응을 멈춥시다.세포에 라벨을 붙이기 위해, 1밀리알 용액을 얻기 위해 유리병에 무수성 디메틸 설산화물20 마이크로리터를 추가하기 전에 적절한 세포 형광 염료를 실온으로 데우도록 한다. DMEM에서 하나의 마이크로몰러의 최종 작동 농도로 형광을 희석하고 부드러운 혼합으로 관심있는 세포 현탁액에 염료를 추가합니다. 그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터에 20 분 동안 배치하십시오.단일문화 스페로이드 형성의 경우, CMS 배양 칩의 입구 구멍에 4%의 Pluronic F-127 용액의 2.5 밀리리터를 분당 500~1, 000 회전으로 회전하는 동안 먼저 추가하십시오. 모든 솔루션이 추가되면 CMS 시스템을 사용하여 분당 4, 000 회전에서 칩을 회전합니다. 회전이 끝나면, 이산화탄소 5%에서 섭씨 36.5도에서 하룻밤 사이에 배양 칩을 배양한다.다음 날 아침, 플로론 솔루션을 제거하고 DMEM으로 배양 칩을 세척하십시오. 깨끗한 벤치에서 12시간 동안 칩을 건조한 후, 중간 크기의 2.5밀리리터를 입구 포트에 추가하고 칩을 분당 4, 000 회전으로 3분 동안 회전합니다. 회전의 끝에서, 칩이 분당 500 에서 1, 000 회전에서 회전하는 동안 준비 된 셀 서스펜션의 100 마이크로 리터로 입구 포트에서 배지의 100 마이크로 리터를 교체합니다.그런 다음 3분 당 3, 000 회전에서 칩을 회전시켜 각 마이크로웰의 세포를 원심력으로 트랩한 후 3일 동안 세포 배양 인큐베이터에 칩을 배치하고 매일 입증된 바와 같이 배지를 새로 고침한다. 동심 스페로이드 공동 배양의 생성을 위해, 칩이 분당 500 ~ 1, 000 회전에서 회전하는 동안 칩의 입구 포트에 매체의 100 마이크로 리터에 세포의 첫 번째 인구를 추가하고 분당 3, 000 회전에서 3 분 회전. 회전의 끝에서 칩이 분당 500 ~ 1, 000 회전에서 회전하는 동안 두 번째 셀 집단의 100 마이크로 리터를 추가하고 칩을 분당 3, 000 회전에서 3 분 동안 회전합니다.두 양의 세포가 모두 주입되었을 때 칩을 세포 배양 인큐베이터에 1, 000 에서 2, 000 회전을 24 시간 동안 분당 회전하십시오. 야누스 스페로이드 형성의 경우 칩이 분당 500에서 1, 000 회전에서 회전하는 동안 세포의 첫 번째 집단의 100 마이크로리터를 추가하고 분당 3분, 000 회전에서 3분 동안 회전합니다. 회전의 끝에서, 3 시간 동안 분당 1, 000 에서 2, 000 회전에 대한 세포 배양 인큐베이터에 칩을 배치합니다.인큐베이션이 끝나면 칩이 분당 500에서 1, 000 회전에서 회전하는 동안 세포의 두 번째 집단의 100 마이크로리터를 넣고 3분 동안 분당 3, 000 회전에서 칩을 회전시합니다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에 세포를 분당 1, 000 ~ 2, 000 회전에 24시간 동안 배치합니다. 샌드위치 스페로이드 형성의 경우 칩이 분당 500 ~ 1, 000 회전에서 회전하는 동안 첫 번째 세포 집단의 100 마이크로 리터를 먼저 추가하고 분당 3, 000 회전에서 3 분 회전합니다.회전의 끝에서, 칩이 분당 500 에서 1, 000 회전에서 회전하는 동안 세포의 두 번째 집단의 100 마이크로 리터를 추가하기 전에 분당 1, 000 ~ 2, 000 회전에서 2 시간 동안 세포 배양 인큐베이터의 회전자에 칩을 배치합니다. 칩을 3, 000 RPM에서 3분간 회전하고 칩을 인큐베이터에 다시 넣고 회전시 3시간 배양을 합니다. 그런 다음 칩이 분당 500에서 1, 000 회전에서 회전하는 동안 첫 번째 세포 집단의 100 마이크로 리터를 추가하고 12 시간 동안 입증 된 대로 세포를 회전하고 배양합니다.입증된 프로토콜에 따라 직경 6cmCMS 배양 칩을 성공적으로 제작할 수 있습니다. CMS 배양 칩의 채널은 입구 포트, 중앙, 슬라이드 및 마이크로웰 영역으로 구성됩니다. 개별 CMS 칩 내에서 배양의 처음 24 시간 동안 분당 2, 000 회전에서 찍은 두 가지 유형의 세포 배양의 시간 경과 이미지는 입증 된 바와 같이, 스페로이드의 성공적인 형성을 보여줍니다.3 일간의 배양 후 마이크로웰의 이미징은 스페로이드가 우수한 균일성과 구형성을 보여 준다는 것을 보여줍니다. 코넨트리, 야누스 및 샌드위치 구조와 공동 배양 된 스페로이드도 생성 될 수 있습니다. 또한, 7일 동안 높은 중력에 노출된 세포 배양은 살아있는/죽은 염색에 이어 대부분의 세포가 칩 내에서 장기 배양에서 살아남는다는 것을 보여준다.CMS 배양 칩의 상부 및 하부 층은 결합 될 때 신중하게 정렬되어야하며, 그렇지 않으면 각 마이크로웰의 세포 수는 동일하지 않을 수 있습니다. 이 연구는 공동 문화 스페로이드 연구를위한 진입 장벽을 낮출 수 있으며, 예를 들어, 관심의 새로운 약물을 선별하기 위한 공동 문화 연구에서 널리 사용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 세포 - 세포 상호 작용의 차이를 수치 3D 조직 같은 spheroids 및 잠재적인 응용 프로그램을 생성하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다.

3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

스페로이드는 2D 세포 배양 단층 모델에 비해 세포의 환경을 보다 정확하게 표현하는 데 사용되는 3D 세포 배양 모델의 한 유형입니다. 예시 프로토콜에서는 과학자들이 결장직장암 세포주에서 스페로이드를 생성하고 라이브 셀 이미징을 적용하여 스페로이드의 성장을 추적하는 것을 볼 수 있습니다.

세포주에서 스페로이드 생성: 3차원(3D) 세포 배양 방법

여기에서는 세포 응집을 통해 3D 세포 스페로이드를 형성하기 위한 빠르고 유연한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 여러 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있으며 세포 이동, 침습 또는 아노이키스 분석을 포함한 다양한 응용 분야와 세포-매트릭스 상호 작용의 이미징 및 정량화에 적합합니다.

3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

여기에서는 세포 현탁액을 시드하기 위해 자동화 된 피펫팅 시스템을 사용하여 지방 유래 기질 / 줄기 세포 (ASC) 구상체의 대규모 생산을 설명하므로 스페로이드 크기와 모양의 균질성을 보장합니다. 이 ASC 구상체는 3D 바이오 프린팅 접근법의 빌딩 블록으로 사용할 수 있습니다.

3D 바이오프린팅을 위한 지방유래 줄기세포 구상체의 대규모, 자동화 생산

이 프로토콜은 대규모 고함량 스크리닝 및 분석에 적합한 방식으로 세 가지 유형의 구상체를 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이들이 스페로이드 및 개별 세포 수준에서 어떻게 분석될 수 있는지를 보여주는 예들이 제시된다.

고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법

본 프로토콜은 3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 사용하여 비용 효율적으로 조직 스페로이드를 대규모로 생산하는 기술을 설명합니다.

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

이 연구는 스탬프 기반 시스템을 사용하여 아가로스 주형에 마이크로웰을 생성함으로써 3D 세포 구조를 생성하는 비용 효율적이고 효율적인 방법론을 제시합니다. 이 시스템은 균일한 스페로이드/오가노이드의 형성을 촉진하여 세포 상호 작용을 개선합니다. 이 접근 방식은 실험 변동성을 줄이고 약물 테스트 및 조직 공학의 응용 분야를 지원합니다.

Novel Stamp Device를 사용한 2차원 세포 배양에서 3차원 스페로이드/오가노이드 생성

암 전이를 연구하기 위해 이세포성 누화를 캡처하는 3D 암 모델이 매우 필요합니다. 우리의 연구는 침입 및 세포 공간 분포를 연구하는 데 사용할 수 있는 골격 및 골격이 없는 환경에서 이종 다세포 기질-상피의 생성을 제시합니다.

상피암 세포의 스캐폴드가 없는 3D 배양에서 이종다세포 기질 세포(Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion)

배우세요 랩 온 어 CD 플랫폼을 활용한 원심력 기반 다세포 3차원 스페로이드 생성 기법입니다. 고중력 조건에서 단일 및 다중 세포 유형의 공배양을 통해 조직 공학 및 신약 스크리닝 연구에 활용할 수 있습니다.

다세포 3차원 스페로이드 생성을 위한 랩 온 어 CD 플랫폼

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