Name: 쥐 유방 상피 세포 이식에 갑피 흰 지방 패드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 배우세요 쥐 유방 상피 세포 이식법으로 갑피 흰 지방 패드에 이식하는 방법을 익히세요. 이 기술은 유방암 연구에서 세포 자율성과 숙주 효과를 조사하는 데 40년 이상 사용되어 온 유일한 신뢰할 수 있는 방법입니다.

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이 작품은 홀링스 암 센터의 암 센터 지원 교부금 P30 CA138313 국립 보건원<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">(https://www.nih.gov/)의</a>파일럿 연구 자금과 사우스 캐롤라이나 의과 대학의 병리학 및 실험실 의학부의 기금에 의해 지원되었습니다. 인터뷰 진술서를 녹음해 주신 마리진 스미스에게 감사드립니다.

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜은 쥐와 함께 작동하기 위해 최적화 된 유방 상피 세포 이식 기술을 설명합니다. 기증자 쥐에서 격리 된 유방 상피 오르가노이드 (나이의 3-5 주)는 수용자 쥐의 중간 흰색 지방 패드로 접목됩니다 (또한 3-5 주). 결과는 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 이식된 조직을 검사하기 위하여 4-6 주 후에 조금으로 해석될 수 있습니다; 그러나, 이식과 희생 사이의 최적의 시간은 전체 실험을 구현하기 전에 결정되어야한다. 너무 적거나 너무 많은 시간이 경과한 경우 결과는 해석할 수 없거나 의미가 없습니다. 프로토콜을 최적화하기 위해 이식 후 6-8주 후에 작은 동물 세트에서 자생을 분석합니다. 이식 된 상피가 존재하지만 저개발인 경우 시간의 길이를 증가시킵니다. 접목이 잘 발달되었지만 상피의 기능이 겹치는 경우 분석을 방해하므로 상피 발생에 대한 주 수를 줄이는 것이 좋습니다. 시간의 양을 단축 할 수없는 경우 (예를 들어, 발암 실험에서), 결과는 개인에서 해석 될 수 없기 때문에, 두 이식 부위 (내측 혈관의 각 측면에...

출생 후 유방 선 발달 및 덕트 형태 형성은 사춘기의 개시에 호르몬 신호에 의해 크게 영향을 받은 프로세스입니다. 쥐와 쥐에서, 유선 생물학의 일반적으로 사용되는 모형 유기체에서는, 이 프로세스는 성숙한 자렌치종의 대형귀착되는 급속한 증식 및 분화 귀착되는 나이의 약 3 주에서 시작됩니다. 성숙한 유방 동맥은 확장과 불굴의 수많은 라운드를 겪을 수 있습니다, 초기 20세기 부터 조사를받고있다 속성. 과확산과 암 발달의 맥락에서, 유선 이식 기술은 1950년대1에개발되었고, 1977년2,3,4. 설치류에서 이식 기술의 정제는 여전히 널리 정상적인 유선 개발 및 질병 상태에 대한 다양한 치료 및 유전 조작의 효과를 연구하는 데 사용되는 정상적인 유선 생물학을 이해하는 주요 발전에 기여하고있다.
많은 가설이 생성되고 이후에 유선 이식을 사용하여 시험되었습니다, DeOme 외에 의해 처음 기술된 19591. 수십 년에 걸친 실험은 전체 지방 패드5,6,7을 다시 채우기 위해 기증자 유방 땀샘에서 절제된 덕트 조직의 성향을 보여주었고, 유선 발달의 중요한 성분이 이러한 상피 구조에 존재한다는 것을 나타냈다. 나중에 마우스에서 연구한 결과, 단일 유방 줄기 세포가 지운 지방 패드를 다시 채울 수 있고 기저 및 발광 유방 상피 세포의 단일, 일반적인 전구의 발견에 기여할 수 있음을 보여주었다8,9,10. 이러한 결론에 따라, 이식은 가소성의 결과로 다선 재채기 잠재력을 가진 세포의 풀을 증가시켜 접목 된 세포가 기능성 유선7,10,11,12,13을성장시킬 수 있도록 하는 것이 제안되었다. 중요한 것은, 설치류에서 이식 기술의 사용은 세포 배양 유발이상(14)의 한계를 극복하고 종종 단지 몇 주 만에 결과를 제공한다.
절차는 원래 마우스에 있는 preneoplastic 병변의 맥락에서 기술된 동안, 그것은 곧 쥐로 확장하고 암 감수성의 측정으로 다형성을 확립하기 위하여 발암물질 처리와 함께 이용되었습니다15,그러나 이식 기술의 대중성은 각 종에 대한 유전 공구의 발달을 따랐습니다. 이식을 통합하는 마우스 연구 결과는 많은 번역 사실 인정을 기여했더라도, 쥐 유방 선의 garenchyma는 인간을 더 밀접하게 닮은16,17 및 에스트로겐 수용체 양성 (ER+) 유방암을 공부를 위한 명백한 이점을 제안합니다. 유방 종양은 두 종에서 유도할 수 있습니다, 그러나 호르몬 감도 및 유전자 발현 단면도식으로 다릅니다. 1 차적인 다름은 쥐 유방 종양이 표현하고 난소와 뇌하수체 호르몬 수용체, 즉, 에스트로겐과 황체 호르몬 (PR)의 기능에 달려 있다는 것입니다, 인간 유방암의 발광A 특수형과 유사. 실제로, 유방 상피 세포 이식은, 본 프로토콜에 기재된 바와 같이, 유방암에 관여하는 유전적 변이체를 연구하고 유방 상피 세포에 대한 영향의 세포 자율성을 결정하는 데 사용되어 왔다18.
종양 생물학 이외에, 일반적인 래트 유방 선의 덕트 상피는 분지의 더 높은 수준을 전시하고 마우스 보다는 기의 두꺼운 층에 의해 측면됩니다. 기질의 중요성은 유방 상피 이식 연구 결과에서 잘 문서화됩니다. 유방 상피는 지방 기질과 상호 작용해야하며, 이상적으로는 그 자체의 중간엽으로 특징적인 형태 형성19,20을겪어야합니다. 수용자 유선으로 조직을 이식하는 것은 최적의 환경을 제공합니다. 그러나, 내인성 상피의 존재는 결과를 방해할 수 있습니다. 내인성 상피의 유방 선사전 클리어링은 일반적으로 마우스 이식 검사에서 수행되며 내인성 유방 조직의 외과 적 절제 및 / 또는 젖꼭지 의제거가필요합니다1,21,22. 가능하지만, 유동 후 쥐에서 유방 상피를 미리 지우는 것은 널리 수행되지 않습니다, 주로 때문에 후 weanling 쥐에서 성장하는 유방 나무를 지우기의 무효. 체내 의 지방 조직의 영역이 이식 된 유방 상피21,23,24의성장을 지원할 수 있음을 보여주었기 때문에, 조직을 중간 흰색 지방 패드로 이식하여 쥐에서 사전 지우기 과정을 쉽게 피할 수 있습니다.
이 논문에 기술된 이식 방법은 효소 해리 유방 선 오르가노이드 (유방 덕트 상피 및 형태 형성이 가능한 다른 세포 유형의 단편) 또는 실험실 쥐의 인간, 등소 성 또는 인원성 균주에서 간경질 지방 패드에 단산분리 된 세포를 주입하는 것을 포함합니다2. 간경막 지방 패드는 일반적으로 유방 조직이 없기 때문에, 내인성 상피를 미리 지울 필요없이 여러 이식 부위에 적합한 환경을 제공합니다. 그 결과, 숙주 동물의 내인성, 복부 인과 유방 땀샘은 외과 조작의 대상이 되지 않으며 정상적으로 발달하며 결과 해석을 방해할 수 없습니다. 부가적으로, 온전한 유방 땀샘은 유방 상피 발달 및 종양발생에 대한 호스트 대 공여자 효과를 평가하기 위해 비교를 위해 사용될 수있다 18,25. 단일 줄기 세포로부터 유방선의 재모집단은 마우스에 사용할 수 있지만, 쥐를 위해 아직 개발되지 않았으며, 주로 쥐 유방 줄기 세포25,26,27을선택할 항체의 가용성부족으로 인해 개발되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 재채백 전위를 정량화하기 위해 단산이 분산된 유방 상피 세포의 이식은 성공적으로 수행될 수 있고, 이들 세포는 적절한 프레임워크2,3,4로이식될 때 정상적으로 발전할 것이다. 오르가노이드는 여러 가지 용도로 양호하지만, 단산성 세포는 양적 적용을 위해 요구되며, 예를 들어, 이온화 방사선치료(28)에 이어 암 개시에 필요한 유방 상피 세포의 수를 결정하거나 세포학적으로 선택된 유방 상피 세포 집단의 특성을 비교하기 위해29.
현재까지, 여기에 설명 된 절차는 유방 선 개발 및 유방암 발달의 기본 메커니즘을 연구하는 전반적인 목표를 가진 쥐에서 유선 이식을 수행하는 가장 강력한 방법입니다. 종종, 기증자 및/또는 수용자 동물은 상피 이식 전, 도중 또는 후에 다른 변수에 드러릅니다. 예로는 화학발암 발생30,방사선28,31,32,호스트/공여자 게놈18의유전자 조작 및 호르몬 조작12를포함하는 단일 유전자 연구가 있다. 이 프로토콜에 기술된 효소 해리의 주요 장점은 유세포 분석, 3-D 배양, 유전자 편집 등을 포함하는 상피 오르가노이드 또는 단산성 세포를 분리할 수 있는 기회입니다. 이 기술의 미래 응용 프로그램은 유전 공학기증자 및 / 또는 호스트 조직의 추가 조작을 포함 할 것이다. 예를 들어, 공여자 세포는 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템을 사용하여 임의의 선택된 게놈 궤적에서 생체 외 를 유전적으로 변경할 수 있다. 유사하게, 수신자 쥐는 또한 기증자와 수령인 공학한 유전 요인 사이 상호 작용을 공부하기 위하여 유전으로 변경될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.2 & 마이크로; M 주사기 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-715G</td><td>멸균 필터링 콜라겐 분해 효소 소화 매체</td></tr><tr><td>1.5 - 2.0 mL 마이크로 원심 분리 튜브 (멸균)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>함유 재현 유 세포 및 / 또는 뇌 균질 화합물</td></tr><tr><td>100 &micro; M 세포 스트레이너</td><td>Corning</td><td>431752</td><td>필터링 뇌 균질화</td></tr><tr><td>25게이지 바늘이 있는 100uL 기밀 주사기</td><td>Hamilton</td><td>81001 & 90525</td><td>이식 동물에 이식편 혼합물 주입용(공여자 유전자형/조건당 1개)</td></tr><tr><td>1000uL 피펫 팁 + 피펫</td><td></td>-<td>-</td><td>세포/혼합물/조직 전달</td></tr><tr><td>15mL 폴리프로필렌 튜브</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352196</td><td>뇌 균질화 혼합물 저장 또는 세포 : 이식을위한 균질화 혼합물</td></tr><tr><td>40 &micro; M 세포 스트레이너</td><td>Corning</td><td>431750</td><td>세포 펠렛 세척 후 오가노이드</td></tr><tr><td>필터링 50mL 폴리프로필렌 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-6</td><td>기증자 유선 조직의 콜라겐분해</td></tr>효소 <tr><td>분해 60mm 접시</td><td>Thermo Scientific</td><td>조직 다진 조직을 위한</td><td>130181</td></tr><tr><td>명반 황산칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>243361/237086</td><td>염색 유선, 전체 마운트 슬라이드</td></tr><tr><td>수의학용 마취 기화기</td><td>-</td><td>-</td><td>기관 프로토콜 준수</td></tr><tr><td>베타 다인 또는 요오드</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>균질화를 위한 붕규산 유리 배양 튜브</td> 뇌 균질화를 위한 <td>Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td>(<td>균질화기에 적합한 튜브 사용)</td></tr><tr><td>Carmine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6152/1022</td><td>염색 유선 전체 마운트 슬라이드</td></tr><tr><td>세포 계수 장치</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>회복을위한 깨끗한 동물 케이지</td> <td>-</td><td></td> <td>기관 프로토콜 Collagenase</td></tr><tr><td>Type 3</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td>를 따릅니다.<td></td><td>LS004183 기증자 쥐의 다진 유선 조직의 효소 분해</td></tr><tr><td>탈 이온수</td><td></td> - <td></td><td>화학 용액</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>GIBCO</td><td>11320033</td><td>조직, 콜라겐 분해 효소 소화 매체 및 상피 세포 혼합물 재현 탁</td></tr>유를 위한 <tr><td>EDTA</td> <td>-</td><td></td> <td>단분산 혼합물</td></tr><tr><td>에탄올, 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2705/2701</td><td>유방 전체 마운트 슬라이드 고정제, 유방 전체 마운트 슬라이드 세척, 외과 절개 부위 청소(희석)</td></tr><tr><td>태아 소 혈청(FBS)</td><td>하이클론</td><td></td> <td>불활성화 용액</td></tr><tr><td>거즈</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>유방 전체 마운트 슬라이드 고정제(100% 에탄올의 1:4 빙초산)</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO</td><td>-</td><td>단분산 혼합물</td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>-</td><td>-</td><td>기관 프로토콜</td></tr><tr><td>얼음 양동이 (x2)</td><td>를</td> 따르십시오-<td>-</td><td></td></tr><tr><td>궤도 회전이 있는 인큐베이터</td><td>-</td><td>-</td><td>37°C를 유지할 수 있어야 합니다; C, 220-225 RPM에서 흔들기 (유방 조직의 콜라겐 분해 효소 용)</td></tr> <tr><td>이소 플루란 마취</td> <td>-</td><td></td> <td>기관 프로토콜</td></tr><tr><td>준수 광학 현미경 또는 디지털 카메라</td> <td>-</td><td></td> <td>전체 장착 유방 상피 시각화 및 / 또는 이미지 획득</td></tr><tr><td>기계 균질화 기</td><td>Fisher Scientific</td> <td>-</td> <td>조직Miser 또는 대체 모델</td></tr><tr><td>미네랄 오일, 순수</td><td>Sigma-Aldrich/ ACROS Organics</td><td>8042-47-5</td> 세척된 유선의 <td>장기 보관 전체 마운트</td></tr><tr><td>마취 기화기용 산소 탱크</td><td>-</td><td>-</td><td>기관 프로토콜 준수</td></tr><tr><td>종이 타월 또는 섬세한 작업용 물티슈</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>양전하 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>P4981-001</td> 유선조직 <td>전체 마운트</td></tr><tr><td>수술 후 진통제</td><td>-</td><td>-</td><td>기관 프로토콜</td></tr><tr><td>동물의 체중 측정</td><td></td><td></td><td></td>, 진통제의 적절한 투여</tr><tr><td>면도기</td><td>-</td><td>-</td><td>전기 이발기 또는 기타</td></tr><tr><td>염색 용기</td><td>-</td><td>-</td><td>화학 세척당 최소 1개, 슬라이드 수에 적합한 크기, 유리 선호</td></tr><tr><td>멸균 필드 드레이프</td><td>IMCO</td><td>4410-IMC</td><td>이식 중 사용</td></tr><tr><td>멸균 가위 및 겸자 x3 (오토 클레이브)</td> <td>-</td><td></td> <td>기증자 및 수혜자에 사용되는 오토 클레이브 수술 도구</td></tr><tr><td>주사기 : 5mL (또는 그 이상)</td> <td>-</td><td></td> <td>콜라겐 분해 매체의 멸균 여과</td></tr><tr><td>용 트립신</td><td>Worthington</td><td></td><td>단분산 혼합물</td></tr><tr><td>액체 용 폐기물 수집 용기 (붓기 또는 흡인)</td><td>- </td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>상처 클립 어플리어, 클립 및 제거 도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td>견갑간 흰색 패드 패드 위에 피부 절개 닫기</td></tr><tr><td>자일렌</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>클리어링 유방 전체 마운트 슬라이드 염색 후</td></tr></tbody></table>

쥐 유방 상피 세포 이식에 갑피 흰 지방 패드

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

1970년대 초, 연구자들은 유방 상피 세포를 쥐의 중간 절단 된 흰색 지방 패드로 성공적으로 이식했습니다. 이식 기술을 사용하여 유방 상피를 이식하는 것은 사춘기 설치류 호스트가 제공하는 호르몬 환경을 이용합니다. 이 연구 결과는 이상적으로 유선 발달에 각종 생물학 조작의 충격을 탐구하고 유선 생물학의 많은 양상을 해부하기 위하여 적당합니다. 일반적인, 그러나 제한, 특징은 이식된 상피 세포가 강하게 주변 기질에 의해 영향을 받고 내인성 상피에 의해 경쟁된다는 것입니다; 네이티브 유방 조직을 이용하기 위하여는, 복부 inguinal 백색 지방 패드는 이식의 앞에 호스트 유방 상피를 제거하기 위하여 삭제되어야 합니다. 쥐 모형 유기체를 사용할 때 중요한 장애물은 포스트 위들링 한 쥐에서 개발 유방 나무를 지우는 것이 효율적이지 않다는 것입니다. 선 없는 지방 패드로 이식 하는 경우, 기증자 상피 세포 는 삭제 된 호스트 지방 패드를 다시 채우고 기능성 유선을 형성 할 수 있습니다. 중간 지방 패드는 이러한 접목에 대 한 대체 위치. 주요 장점은 그것은 덕트 구조부족 아직 상피 성장을 촉진하는 데 필요한 정상 기질을 제공하고 쥐에서 쉽게 접근 할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 또 다른 주요 장점은 최소 침습적이라는 것입니다. 추가적으로, 중간 지방 패드는 접목을 위한 사이트를 분리하기 위하여 이용될 수 있는 내측 혈관을 포함합니다. 내 인 성 동맥 그대로 남아 있기 때문에, 이 기술은 또한 이식 된 동맥에 내 인 성 유선 비교 연구에 사용할 수 있습니다. 이 논문은 쥐의 간경엽 백색 지방 패드로 유방 상피 세포 이식의 방법을 설명합니다.

기증자 및 수령인 유방 땀샘 이식용 쥐 유방 상피 세포를 분리하고 준비하는 단계는 도 1A에나타내고 있다. 나이 4 주에, 기증자 쥐의 내인성 유방 동맥은 성숙을 시작하고 상피는 명반 카민으로 얼룩진 전체 장착 된 슬라이드에 시각화 될 수있다(그림 1B). 이 나이에 1명의 기증자 쥐는 이식을 위한 대략 1 x 106 세포를 제공할 것입니다. 수집된 공여자 조직의 양이 부족하거나 후속 다듬기의 양이 불충분하면, 콜라게나아제 소화 후 세포의 수율이 낮을 수 있다. 따라서 기증자로부터 가능한 한 많은 유선 조직을 수집하는 것이 중요합니다. 완전히 소화 된 유방 선 조직은 현탁액에 눈에 보이는 조직의 조각...

본 문서는 수용자 동물의 중간 절단 된 흰색 지방 패드로 기증자 쥐 유방 상피 세포를 이식하는 이식 방법을 설명합니다. 이 방법은 유방 상피 발달에 호스트 및/또는 기증자 효력을 검토하기 위하여 이용될 수 있고 사전 정리를 위한 필요를 제거하여, 이 기술의 유용성을 확장합니다.

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

이 프로토콜은 40 년 이상 사용되어 왔으며 쥐의 유방 세포 이식 분석법을위한 유일한 신뢰할 수있는 방법입니다. 이 방법은 유방암 감수성 연구에서 숙주 효과 대 유방 세포 자율을 심문하는 데 널리 사용됩니다. 대용량 지방 패드에 이식함으로써,이 방법은 쥐에 효과적이지 않은 내인성 막 상피를 지울 필요가 우회.따라서 방법은 덜 침습적이며 내인성 유방 땀샘은 내부 제어로 사용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 안락사 된 여성 쥐를 등에 놓고 핀으로 고정하십시오. 70%에탄올로 전체 복부 표면을 스프레이합니다.흉부, 복부 및 잉게인 유방 땀샘에 접근할 수 있는 처진 Y자형 절개를 만듭니다. 가위를 사용하여 기증자 쥐의 모든 유방 선 조직을 해부하고 모든 눈에 보이는 림프절을 제거하십시오. 다음으로, 매머 조직을 추출하기 위해 집게를 사용합니다.세럼이 없는 DMEM F12 미디어 500마이크로리터가 포함된 60mm 크기의 접시에 담아 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 가위를 사용하여 유방 조직을 잘게 다진다. 첫째, 조심스럽게 기증자 동물의 몸을 뒤집어 경향이있는 위치에 놓고 핀으로 고정하십시오.머리와 위쪽 을 70%에탄올로 스프레이합니다. 두개골의 기초를 찾아 목막 응다 아래 절개를하고, 피부 아래에 날카로운 가위를 삽입하고 머리의 측면을 포함하여 두개골에서 피부를 잘라. 다음으로, 뼈 커터 또는 강한 가위를 사용하여 후두에서 전두엽 뼈까지 중간선을 따라 두개골을 자르고 블레이드를 가능한 한 피상적으로 유지하고 기본 뇌 조직의 파괴를 방지하기 위해 위쪽으로 기울어져 있는지 확인하십시오.Rongeurs 또는 강한 집게를 사용하여 뼈를 벗겨냅니다. 도구를 소뇌에 측면 삽입하여 양쪽의 뼈를 부러뜨린다. 청각 운하를 완전히 노출하여 수뇌에 대한 연결을 끊습니다.곡선미세 한 집게를 사용하여 두개골에서 뇌를 들어 올리고 무게를 기록하십시오. 추가 기증자 두뇌를 위한 공급의 새로운 시작을 사용하십시오. 얼음에 저장된 동일한 양의 미디어를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 즉시 전송합니다.저속으로 10~15초 동안 뇌를 균질화합니다. 그런 다음 동형모를 필터링하여 큰 조각을 제거합니다. 필요할 때까지 얼음 위에 액체를 보관하십시오.먼저 1, 000 마이크로리터 파이펫 팁끝에서 1센티미터를 자르고 수동으로 파이펫에 놓습니다. 각 60mm 접시에서 콜라게나아제 소화 튜브로 다진 기증자 조직을 전송하기 위해 절단 파이펫 팁을 사용합니다. 다진 조직을 1~2회 위아래로 배관하여 부드럽게 섞는다.그런 다음 흔들리는 인큐베이터에서 수평 위치에 샘플을 고정합니다. 200~220RPM 의 속도로 흔들리는 동안 시료를 섭씨 37도에서 1.5~2시간 동안 소화할 수 있습니다. 기증자 유방 선조직이 완전히 소화되면 서스펜션을 1, 200 배, 섭씨 4도에서 10 분 동안 원심 분리하십시오.펠릿이 형성되었는지 확인 한 후 파이펫을 사용하여 지방 층을 제거하거나 조심스럽게 상체를 부어 넣습니다. 신선한 DMEM F12 미디어의 10 밀리리터에서 펠릿을 부드럽게 재중단합니다. 이 과정을 반복하여 세포를 철저히 세척하십시오.모든 기증자 동물을 위한 40 마이크로미터 여과기를 갖춘 50 밀리리터 튜브 를 준비하십시오. DMEM F12 미디어의 적어도 1 밀리리터로 스트레이너를 미리 적시하십시오. 그런 다음 파이펫을 사용하여 필터를 통해 세포 현탁액을 전달하여 덕트 단편 이나 오르가노이드를 수집합니다.오르가노이드의 경우 필터에 남아 있는 세포만 유지합니다. 새로운 50 밀리리터 튜브를 통해 세포 여과기를 반전하고 모든 세포를 수집하는 데 필요한 멸균 매체의 모든 볼륨으로 헹구십시오. 그 후, 세포를 다시 한 번 펠릿하고 계산을 위한 소량의 미디어에서 다시 중단합니다.이식의 모든 부위에 대해 50%의 뇌 동종과 세포 현탁액의 동일한 양을 결합하여 모든 이식 수령인을 위한 단일 공여자 물질을 준비한다. 첫째, 두개골의 기초를 식별하고 받는 동물에 척추 컬럼의 시작을 확인합니다. 척추를 내려가는 길의 약 1/3은 뒤쪽의 상부 흉부 부분에 2센티미터 정도 3센티미터 를 면도합니다.다음으로, 수술에 사용될 멸균 필드를 준비하고 필요한 모든 소모품을 준비합니다. 해밀턴 주사기를 멸균 DMEM F12 미디어로 플러시하여 세포 손실을 방지합니다. 기증자 물질의 전체 부피를 각 조건에 대해 별도의 주사기에 적재합니다.주사기가 완전히 적재된 후, 그것을 뒤집어 서 플런저를 약간 눌러 바늘 끝에서 기포를 제거하십시오. 시술 내내 주사기를 얼음 위에 보관하십시오. 동물이 단단한 발가락 핀치로 깊은 자극에 응답하지 않는 상태로 유지되도록하십시오.그런 다음 날카로운 수술 블레이드를 사용하여 작은 상호 절개를 합니다. 방향에 대한 내측 혈관을 찾아 서 집게를 사용하여 절개 한쪽에 피부를 들어 올립니다. 지방 패드에서 피부를 잡고 이식이 수행되는 동안 기본 갈색 지방을 피하십시오.다음으로, 접목 부위에 바늘을 삽입한다. 조심스럽게 중간 백색 지방 패드 조직에 세포 혼합물의 40 마이크로 리터를 주입. 바늘을 천천히 제거합니다.조직을 제자리에 잡고 이식된 세포가 3~5초 동안 정착할 수 있도록 합니다. 이식의 두 번째 부위에 이전에 설명된 대로 전체 주사 절차를 반복한다. 그 후 상처 클립이나 봉합사를 사용하여 수술 상처를 닫은 다음 마취를 중단하십시오.동물을 희생한 후 해부를 준비하십시오. 늑갑 지방 패드의 이식 부위를 분리하는 내측 혈관을 식별합니다. 전체 패드를 하나의 조직으로 소비합니다.조직을 양전하 현미경 슬라이드에 놓고 전체 마운트를 위한 것입니다. 7~10일 동안 슬라이드를 70%에탄올에 놓아 조직을 탈지방으로 정합니다. 그런 다음 명반 카민 얼룩을 준비하고 조직이 충분히 불투명할 때 슬라이드를 처리합니다.처리가 완료되고 슬라이드의 조직이 지워지면 저전력 광 현미경 검사법 또는 고해상도 디지털 사진을 사용하여 분석을 위해 슬라이드 이미지를 수집합니다. 이 연구에서는, 유방 상피 세포는 기증자 쥐에서 고립된 유방 상피 오르간이 수신자 쥐의 중간 카피 백지방 패드로 이식되는 쥐와 함께 작동하기 위해 최적화된 기술을 사용하여 이식됩니다. 실험 변수와 관련된 효과의 자율성뿐만 아니라 실험의 성공여부를 결정하기 위해 상피의 존재, 부재 또는 풍부를 평가할 수 있다.각 인자가 야생 유형 대 녹아웃과 같은 두 가지 수준이 있는 상호 이식 실험은 가설 테스트를 위해 4개의 이식 그룹을 생성합니다. 여기에 표시된 대표적인 전체 장착 된 늑간 지방 패드는 이식의 두 부위에서 긍정적 인 상피 아웃 성장을 포함합니다. 슬라이드를 분석할 때, 많은 견본에 걸쳐 늑갑 지방 패드에 있는 상피의 부족은 절차에 기술적인 문제를 표시할 수 있고 부정적인 결과로 취급되어야 합니다.기증자 상피 아웃성장은 또한 내인성 유방 선에 비교될 수 있고 추가 결론을 촉진할 수 있습니다. 여기에 나타난 예에서, 야생형 및 CDKN1B 녹아웃 쥐를 이용한 상호 이식의 결과는 유방선 발달에 비유방 세포 자율효과를 제안했다. 기증자 상피 세포와 오르가노이드는 신중하게 준비하고 받는 동물에 주입 될 때까지 살아 있어야합니다 기억하십시오.미리 계획하고 중단없이 신중하게 절차를 수행하는 것이 필수적입니다. 1 차적인 발암성 분석은 유방암의 병인학 또는 처리에 있는 유방 세포 자율성을 심문하기 위하여 이식 다음 수행될 수 있습니다. 유전자 편집은 또한 기증자 세포 또는 수령쥐를 유전적으로 설계하기 위하여 통합될 수 있습니다.쥐에서 유방 상피 세포 이식을 수행하는 유일한 방법으로, 이 절차는 유방 선 발달뿐만 아니라 발암 성 연구를 용이하게합니다. 이 기술은 호스트 마이크로 환경과 유방암 세포 및/또는 유방 상피 세포 사이 상호 작용을 연구하기 위해 특히 중요합니다. 그것은 유방 선 발달뿐만 아니라 유방암 연구에 있는 연구 결과를 가능하게 합니다.처음으로 이 기술을 시도하는 사람들은 최대 세포 수율과 생존력을 보장하기 위해 기증자 세포 준비를 최적화한 다음 수술 절차를 연습하고 세포 수를 결정하고 실험에 필요한 수술 후 잠복기를 결정해야합니다.

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여기, 우리는 간단 하 고, 침략, 그리고 쉽게 처리 방법, 더 적은에서 유 방 지방 패드에 유방암 세포를 이식 하는 프로토콜을 제시 하 고이 마우스 orthotopic 유 방 암 모델 적절 한 유 방 지방 패드 환경으로 사용할 수 있습니다의 다양 한 측면을 조사 하 암입니다.

Orthotopic 쥐 유 방 지방 패드 유방암 세포의 주입

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유방암 전이를 목표로하는 보조 요법을 평가하는 전임상 모델이 부족합니다. 이를 해결하기 위해, 우리는 de novo 폐 유방 선암 전이의 마우스 모델을 개발했는데, adjuvant setting (원발 종양의 수술 후 절제술)에서 투여 된 치료법은 이전에 파종 된 폐 전이에 영향을 미치는 효능을 평가할 수 있습니다.

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배우세요 쥐 유방 상피 세포 이식법으로 갑피 흰 지방 패드에 이식하는 방법을 익히세요. 이 기술은 유방암 연구에서 세포 자율성과 숙주 효과를 조사하는 데 40년 이상 사용되어 온 유일한 신뢰할 수 있는 방법입니다.

쥐 유방 상피 세포 이식에 갑피 흰 지방 패드

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