Name: 변동 분석으로 미생물 돌연변이 율 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 배우세요 변동 분석을 사용하여 E. coli 등 미생물의 돌연변이 율을 측정하는 방법을. 이 프로토콜은 항생제 내성 진화 연구에 비용 효율적인 병렬 평가를 제공합니다.

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RK는 BB /M020975/1 및 생물 과학의 맨체스터 대학 대학에 의해 지원되었다. HR은 BB/J014478/1에 의해 지원되었습니다. GG는 BBSRC 박사 교육 파트너십 BB / M011208 / 1에 의해 지원되었다. DRG는 UKRI 수상 번호 MR / R024936 /1에 의해 지원되었다.

1. 1일차: 문화의 예방 접종 과 적응
<ol><li>대장균 MG1655 글리세롤 스톡(글리세롤 18%, -80°C)으로부터 얼음을 긁어낸 액체 리소제니 국물(LB, 보충표 1참조)의 3 mL를 접종한다. LB 배양을 37°C에서 ~7시간 동안 120 rpm에서 흔들어. 참고: 본 실험에서, 대장균 K12 MG1655LB에서 성장하는 것이 사용되지만, 이러한 분석실험은 임의의 대장균 균주 또는 임의의 다른 컬터컬 미생물 종과 함께 수행될 수 있다. 배양 온도, 배양 시간, 및 성장 매체의 영양소 수준은 모두 종 또는 균주에 의해 변동될 수 있다.</li>
	<li>식염수 용액을 사용하여 배양을 2,000배 희석한다. 희석된 용액의 100 μL을 액체 데이비스 최소 배지 10mL(DM, 보충 표 1참조)로 3개의 50mL 스크류 캡 원추형 하단 폴리머 튜브(50 mL 튜브)에 각각 80 mg/L, 125 mg/L 또는 250 mg/L의 포도당을 함유하고 있습니다. 이것은 돌연변이 율이 추정되는 동일한 배지 (즉, 환경)입니다. 37°C에서 밤새 120 rpm에서 배양체를 흔들어 주세요. 참고: 미디어의 선택은 종, 균주 또는 연구 질문에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
</ol>2. 2일차: 병렬 배양물에서 돌연변이 생성
<ol><li>첫째, 박테리아가 배양될 환경을 준비합니다. 항상 필요 이상으로 10 % 이상 준비하십시오 (즉, 20 1 ml 배양물은 22 mL이 필요합니다). 1) DM 의 22 mL을 포도당 80 mg/L, 2) 포도당 125 mg/L의 DM, 3) 포도당 250 mg/L의 DM, 4) 포도당 80 mg/L의 DM, 5개의 50 mL 튜브에 250 mg/L의 포도당을 가진 DM을 준비하십시오. GLC-80A, GLC-125, GLC-250A, GLC-80B 및 GLC-250B로 각각 라벨을 지정합니다.</li>
	<li>환경에 대한 inocula를 준비합니다. 환경의 1mL에 대한 접종에 1,000-5,000개의 셀이 포함되어 있는지 확인합니다. 아래 단계에 따라 이 작업을 수행합니다.
	<ol>
<li>600 nm에서 하룻밤 배양 (단계 1.2에서)의 광학 밀도 (OD)를 측정합니다.</li>
		<li>포도당DML당 1,000-5,000개의 최종 밀도에 도달하기 위해 각 하룻밤 배양을 희석한다. 우리의 손에서, 2.2.1에서 측정된 OD가 0.3인 경우에, 이것은 밤새 배양된 배양물의 100배 희석(식염수 용액)을 만들고, 22 mL 환경에 이 용액의 11μl을 추가하는 것을 의미한다.</li>
	</ol></li>
	<li>병렬 문화전당을 준비합니다. 참고 : 이 프로토콜은 세 가지 환경을 사용하여 5 개의 변동 분석 (하나의 96 웰 플레이트의 최대 합리적인 수)을 수행하는 96 개의 깊은 웰 플레이트 1 개를 위해 작성되었습니다. 경험으로, 여러 개의 딥 웰 플레이트를 병렬로 실행할 수 있습니다.<ol>
<li>96개의 깊은 웰 플레이트에 대해 병렬 배분의 임의 레이아웃을 만듭니다. 보조 R 스크립트 레이아웃Generator.R(그림 1B의레이아웃 참조)을 사용할 수 있습니다. 레이아웃에 따라 96 개의 깊은 웰 플레이트에 각 병렬 배양액을 배치합니다. 참고: LayoutGenerator.R을 실행하면 첫 번째 분석이 20개의 병렬 배양어가 있고 두 번째, 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 분석에서는 각각 19개의 병렬 배스가 있는지 확인합니다.</li>
		<li>무작위 레이아웃에 따라 96 개의 깊은 웰 플레이트의 각 웰에 접종 된 매체의 1 mL을 전송합니다.</li>
		<li>테이프로 깊은 우물 판의 뚜껑을 고정합니다. 배양 재배가 폭기의 양에 민감하기 때문에 뚜껑을 단단히 고정하지 마십시오.</li>
		<li>뚜껑과 테이프로 전체 플레이트를 무게를 측정하고 37 °C에서 24 시간 동안 250rpm에서 플레이트를 흔들어 줍니다. 실험 세트 들 사이에서 증발의 양을 안정화하기 위해 인큐베이터에 증류수 2 L을 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>비선택적 테트라졸륨(TA) 한천 판상에 접종된 각각의 접종된 매체의 10 μL을 도금하여 접종 크기를 결정한다(보충표 1참조). 한천 표면이 건조할 때까지 멸균 L자 형 스프레더를 사용하십시오. 인큐베이트 TA 한천 플레이트는 37°C에서 하룻밤 동안 뚜껑을 닫습니다. 참고: TA 한천은 설탕 L-아라비노스와 수용성 염료 2,3,5-triphenyltetrazolium 염화물을 포함하는 풍부한 한천으로 산화 된 형태로 무색입니다. 박테리아가 염료를 감소시킬 때, 포르마잔의 형성으로 인해 빨간색으로 변합니다. L-아라비노스를 활용할 수 없는 TA 한천의 식민지는 진한 빨간색입니다. MG1655와 같은 다른 균주는 분홍빛이 도는 균주입니다. 색깔있는 세균성 식민지가 더 안정적이고 빨리 계산하게 하는 점두가 더 쉽기 때문에 표준 LB 한천보다는 TA 한천을 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>6 웰 플레이트에 리팜피신을 함유한 선택적 TA 한천을 준비합니다. 피펫 5 mL의 선택적 TA 한천을 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 넣는다. 항생제 리팜피신이 TA 한천에 추가되기 직전에 준비하십시오. 참고: 사이클로린을 마커로 사용할 때, 데이비스 최소한의 배지와 한천과 L-아라비노스로 보충된 포도당 250 mg/L, 그리고 2,3,5-triphenyltetrazolium 염화물을 선택적 한천으로 사용하십시오. 즉, TA 한천은 트립톤과 효모 추출물(TA agar의 필수 성분 모두)이 아미노산 D-알라닌을 함유하고 있기 때문에 사이클로린에 내성이 있는 세포만을 선택하지 않는다. 이 아미노산은 사이클로딘의 항균 효과를 길항화하고 모든 세포가 식민지를 만들 수 있게 합니다.<ol>
<li>선택적 및 나머지 비선택적 플레이트를 실온에서 어두운(예: 상자)에 둡니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 3일차: 선택적 및 비선택적 한천 판에 도금 배양
<ol><li>비선택적 한천 플레이트상에 콜로니 형성 단위(CFU)를 카운트하고 CFU를 100으로 곱하여 이노큘라의 크기를 결정합니다. 이는 병렬 배양부(1 mL = 1,000 μL)와 도금 된 부피(10 μL) 사이의 비율입니다. 참고: 비선택적 플레이트를 냉장 보관하는 경우 CFU는 나중에 계산할 수 있습니다.</li>
	<li>배양 24 시간 후, 전체 깊은 우물 플레이트의 무게를 측정하여 증발량을 결정합니다. 이것은 약 10 %가 될 가능성이 높습니다.</li>
	<li>시작 부피 V[0h]= 1,000μl을 사용하여 마이크로리터에서 24시간 배양후병렬 배양의 평균 부피를 계산하고 플레이트의 중량을 마이크로리터로 변환하여 성장 배지의 밀도를 mg/μl로 측정합니다. 이 연구는 1 mg/μl의 밀도를 사용합니다. <img src="/files/ftp_upload/60406/60406eq1.jpg" alt="정적 평형 공식, V[24h]=V[0h]−(1/밀도)×((무게[0h]−무게[24h])/96), 계산." data-altupdatedat="1754922859000">
</li>
	<li>분석당 무작위로 선택된 3개의 문화권(총 15개, 그림 1B의레이아웃에서 검은색 원으로 강조 표시)을 표지된 미세원지 튜브로 전송합니다. 최종 모집단 크기(또는 Nt)를결정하기 위해 나중에 사용할 벤치에 두십시오(단계 3.6 참조).</li>
	<li>
리팜피신을 함유하는 선택적 TA 한천에 깊은 우물 플레이트로부터 나머지 81개의 평행 배양체를 플레이트한다. 96개의 깊은 웰 플레이트로부터 6웰 플레이트의 하나의 웰로 의 전체 병렬 배양. 6개의 웰 플레이트에 하나 이상의 변동 분석의 병렬 배스가 포함되어 있는지 확인합니다.
	<ol>
<li>선택적인 한천 접시에서 뚜껑을 제거하고 멸균 상태로 방치하십시오. 선택적 TA 한천의 표면에 있는 모든 액체를 건조시다. 참고: 한천이 완전히 건조되는 것은 매우 중요합니다. 그러나, 그것은 균열을 허용해서는 안되기 때문에, 선택적 TA 한천을 과도하게 건조하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
선택적 TA 한천 플레이트가 건조되는 동안, 이는 몇 시간까지 걸릴 수 있고, 콜로니 형성 단위(CFU)를 사용하여 단계 3.4에서 제조된 15개 배양물의 Nt를 결정한다.
	<ol>
<li>미세 원심 분리기 튜브에서 배양을 희석하여 CFU를 결정합니다. 각 단계에서 배양100 μL로 식염수 900 μL을 혼합하고 소용돌이치며 5개의 10배 희석 단계를 사용하십시오. 플레이트 40 μL의 마지막 희석(희석 인자가 105의)비선택적 TA 한천 및 인큐베이트 플레이트상에 37°C에서 하룻밤 동안 뚜껑을 닫는다. 참고: 96웰 플레이트의 희석 계열은 멀티채널 파이펫으로 수행될 수 있으며, 이 단계의 속도를 높일 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6 웰 플레이트의 모든 우물은 배양 액체가 없는 경우 뚜껑을 다시 놓고 6 개의 웰 플레이트가 모두 건조 될 때까지 벤치에 뚜껑이있는 6 개의 웰 플레이트를 놓습니다. 모두 건조되면, 44-48 시간 동안 37 °C에서 플레이트 뚜껑을 배양하십시오. 참고: 다른 마커 (nalidixic acid, 사이클로딘, 히그로 마이신 B 또는 5-FOA)를 위해 68-72 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 인큐베이터의 습도가 높은지 확인하십시오. 선택적 한천 플레이트가 잠복기 동안 건조되지 않는 것이 중요합니다.</li>
</ol>4. 4일: 배양내 세포 수 의 결정
<ol><li>비선택적 한천 플레이트에서 CFU를 계산합니다. CFU를 희석 인자(105)와마이크로리터에서 계산된 평균 부피 V[24h] 사이의 비율(단계 3.3 참조) 및 도금 부피(40 μl)와 곱하여 배양에서 생존 가능한 세포의 수를 추정합니다. <img src="/files/ftp_upload/60406/60406eq2.jpg" alt="희석 계수 및 부피 비율이 있는 콜로니 형성 단위(CFU)에 대한 Nt 계산 공식." data-altupdatedat="1754922859000">
</li>
	<li>
특정 환경에서 성장하는 특정 유전자형의 Nt는 세 배양물로부터 이들 값의 평균이다.</li>
</ol>5일차: 돌연변이율 추정
<ol><li>
선택적 TA 한천 플레이트에서 항생제에 저항하는 콜로니의 수를 계산합니다(즉, 2일2-3일에 딥 웰 플레이트에서 자발적인 돌연변이를 통해 발생한 내성 세포의 수). 특정 분석(예: 제로 카운트를 포함한 16개 또는 17개 값)에 대한 관찰된 돌연변이 수의 병렬 배양물 간의 분포를 기록한다. 참고 : 선택적 플레이트가 냉장 보관되는 경우 항생제에 내성이있는 식민지는 나중에 계산 할 수 있습니다.<ol>
<li>R-패키지플란(36)을사용하여 각 분포를 사용하여 돌연변이 이벤트 m의수를 추정합니다. 참고: 비슷한 기능을 가진 R-패키지 rSalvador도있습니다 29.</li>
		<li>텍스트 파일에서 하나의 분석에 대해 관찰된 돌연변이의 분포를 단일 열로 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샤이니플란 소프트웨어(http://shinyflan.its.manchester.ac.uk/)를 사용하여 아래에 자세히 설명된 m을 추정합니다.
	<ol>
<li>탭에서 가설 테스트는 값을 기본값(예: 알 수 없는 적합성 이시언, 추정 방법 = 최대 가능성 =ML), 돌연변이 수명 분포 = 지수형(LD 모델), Winsor 매개변수 = 1,024, 돌연변이 번호 및 피트니스 = 1, 신뢰 수준 = 0.95, 클래스 수 및 최대 값 = 100)으로 둡니다.</li>
		<li>찾아보기를 클릭하고 관찰된 돌연변이의 분포가 있는 텍스트 파일을 선택합니다. 먼저 보조 데이터 파일을 사용해 보십시오.</li>
		<li>파일을 업로드한 후 테스트 수행을 클릭합니다. 테스트 결과아래의 오른쪽에서 한 샘플 ML 테스트(LD 모델)에서 돌연변이 번호를찾습니다. 이것은 m,돌연변이 이벤트의 예상 수입니다.</li>
		<li>돌연변이 번호에 대한 95% 신뢰 구간 에서 m의상한과 하한을 찾습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>m 및 N t(CFU에 의해 결정)를 사용할 수 있게 되면 특정 환경에서 <img src="/files/ftp_upload/60406/60406eq3.jpg" alt="질량 플럭스 공식 \(\frac{m}{Nt}\) 방정식; 유체 역학 연구의 핵심 개념." data-altupdatedat="1754922859000"> 특정 유전자형의 돌연변이 율을 다음과 같이 추정합니다. m상하한계를 Nt로 나누어 돌연변이 율에 대한 신뢰 구간을 생성하는 것과 동일한 방식으로(NB 이것은 Nt의불확실성을 고려하지 않음). 참고: 결과는 세대당 rpoB 궤적당 돌연변이 율로서 제시된다. 염기쌍당 돌연변이율은 rpoB 궤적당 돌연변이율을 79로 나누어 생성되는데, 이는 rpoB 유전자 내의 얼마나 많은 포인트 돌연변이가 리팜피신(37)에 대한 저항성을 부여하는지에 대한 우리의 현재 지식이다. 염기체 당 돌연변이율을염색체(E. coli K-12 MG1655 = 4,639,675 bp)의 크기에 곱하여 게놈당 돌연변이 율을 제공합니다.</li>
	<li>나머지 4개의 변동 분석과 함께 5.1-5.3 단계를 반복합니다.</li>
</ol>

<ol><li>de Vries, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+mutationstheorie%5BTitle%5D)+AND+%22Versuche+und+beobachtungen+%C3%BCber+die+entstehung+von+arten+im+pflanzenreich%22%5BJournal%5D)">Die mutationstheorie.</a> Versuche und beobachtungen über die entstehung von arten im pflanzenreich. 1, Leipzig, Veit. (1901).</li>
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저자는 공개 할 것이 없다.

돌연변이 속도의 임의의 추정은 연구34내및 사이에서 반복성 및 재현성을 보장하기 위하여 달성된 정밀도를 최대화할 필요가 있다. 변동 분석의 경우 세 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. 처음 두 프로토콜은 주어진 프로토콜에서 설정되었지만 프로토콜이 다른 균주 또는 환경에서 작동하도록 조정된 경우 문제 해결이 필요합니다(그림 3참조). 먼저 적절한 자형표 마커를 선택하는 것입니다. 박테리아의 경우, 항생제 리팜피신과 날리딕산에 대한 내성을 각각 부여하는 두 마커 로시, rpoB 또는 gyrA중 하나에서 비율을 추정하는 것이 좋습니다. 이 2개의 층에서 항생 저항에 돌연변이를 위한 표적 크기는 다르다. 리팜피신(37)과 날리딕산(40)에 대한 내성을 각각 부여하는 79개 및20개의 독특한 돌연변이가 있다. 실제로, 이것은 평균적으로, 리팜피신 저항하는 돌연변이가 더 빈번히 관찰된다는 것을 의미합니다. 따라서 첫 번째 질문(그림 3의Q1)은 변형이 돌연변이체인지 여부입니다. 많은 관찰 된 돌연변이 콜로니가 예상되는 구성 돌연변이체가 연구 될 때, 더 작은 목표 크기 (예를 들어, nalidixic acid)를 가진 마커를 사용하는 것이 좋습니다. 도 2B를참조하여, 구성 돌연변이체 대장균 의 돌연변이 율 인 대장균 K-12 BW25113 ΔmutT가 마커로서 nalidixic 산을 사용하여 추정하였다. 야생 유형 (즉, 정상) 돌연변이 율을 가진 비 돌연변이 균주와 함께 작업 할 때, 리팜피신은 더 나은 선택입니다 (그림 2A참조). 어떤 이유로 더 관찰 된 돌연변이가 필요한 경우, 관련 마커는 사이클로린에 대한 저항이다. 이 마커를 위해, 저항 돌연변이는 10개 이상의 유전자41에서나타날 수 있습니다, 표적 크기가 리팜피신을 위해 보다는 더 크다는 것을 의미하. 효모와 고고학을 공부할 때 각각 25S 리보소말 단백질과 URA3의 돌연변이 율을 추정하여, 히그로마이신 B와 5-플루오로 오로산(5-FOA)에 대한 내성을 부여하는 것이 좋습니다.
두 번째 중요한 고려 사항은 병렬 배권의 볼륨입니다. 사용할 부피는 관찰된 돌연변이의 실제 수에 따라 달라집니다. 관찰된 돌연변이의 예상 수는 선택된 자형표 마커에 대한 표적 크기, 돌연변이를 복구하고 피하는 균주의 능력(평균 돌연변이 율), 그리고 사용된 매체 및 배양 부피 모두에 의해 영향을 받는 환경의 운반 능력에 의해 영향을 받습니다. 병렬 배양이 리팜피신에 저항하는 돌연변이 식민지를 포함하지 않는 경우에, 그 때 cycloserine는 사용되어야 하거나 도금세포의 수를 증가시켜야 합니다. 이것은 최소한의 매체에 더 많은 포도당을 추가하거나 더 풍부하게 (또는 완전한) 환경에서 세포를 성장시킴으로써 달성될 수 있습니다. 그러나, 많은 경우에, 이러한 집단 밀도의 증가는 돌연변이 율의 감소와 연관되어, 그 결과 제한되고, 만약 에, 관찰된 돌연변이 콜로니의 수의 증가는10이다. 영양분을 증가시켜 용액이 아닌 경우, 각 병렬 배양의 부피를 증가시킴으로써 세포 수를 증가시키면 옵션이 있다. 환경이 탄소와 에너지의 유일한 공급원으로 설탕을 가진 최소한의 염을 포함하는 경우(즉, 그림 3의 Q2에 대한 대답은 "최소 중간") 0.5mL에서 1.5mL 사이의 부피를 사용해야 합니다. 환경이 풍부한 경우 병렬 배권의 볼륨은 0.35-1 mL 사이여야 합니다. 마지막 질문은 저항하는 식민지의 중앙값 수에 관한 것입니다. 너무 적은 돌연변이 콜로니가 관찰되는 경우(즉, 도 3의 Q3에 대한 대답은 0) 환경이 수정되지 않는 경우, 병렬 배양물의 부피가 증가되거나 더 큰 표적 크기(예를 들어, 사이클로린)를 가진 항생제를 사용해야 한다. 한편, 모든 선택적 플레이트에서 많은 돌연변이 콜로니가 관찰되는 경우(판당 ~150개 이상, 도 3참조), 도금된 세포의 수는 감소되어야 하며, 이는 일반적으로 더 낮은 부피를 사용하거나 더 작은 표적 크기(예를 들어, nalidixic acid)를 가진 항생제로 전환하는 것을 의미한다.
볼륨이 선택되면 하나의 96 딥 웰 플레이트의 모든 병렬 배양권이 동일한 볼륨을 가지는 것이 가장 좋습니다. 이를 통해 플레이트의 중량으로부터 병렬 배양의 실제 부피를 보다 정확하게 결정할 수 있습니다. 특정 유전자형의 돌연변이 율이 서로 다른 환경 간에 비교될 때, 모든 환경에서 동일한 양의 병렬 배양을 사용하는 것이 다시 가장 좋습니다. nalidixic acid가 야생 형 (즉, 정상) 돌연변이 속도 또는 다른 표현형 마커를 추정하는 데 사용되는 경우 nalidixic acid보다 훨씬 작은 표적 크기를 가지는 것이 사용되며, 부피는 더욱 증가되어야 합니다. 한 가지 옵션은 최대 15mL의 부피가 있는 50mL 튜브에서 병렬 배양을 만드는 것입니다. 예를 들어, 10 mL 병렬 배양체는 대장균 K-12 MG1655 돌연변이 율을 nalidixic acid로 추정할 때 50 mL 튜브에서 제조되었다(도 2A참조). 병렬 10 mL 배양물을 선택적 TA 한천에 도금하고 표준 90 mm 페트리 접시 대신 큰 150 mm 플레이트에 부었다. 50 mL 튜브에서 병렬 배양을 준비하는 단점은 처리량이 96 개의 깊은 웰 플레이트에서 돌연변이 율을 평가하는 것에 비해 상당히 낮다는 것입니다. 한 가지 해결책은 병렬 문화본의 수를 줄이는 것입니다. 그러나, 이것은 m의추정에 대한 정밀도에 영향을 미치며, 이는 돌연변이 이벤트의 예상 수 및 병렬 배양부수(26)에의존한다. 관찰된돌연변이를 14-17 병렬 배양물(그림 2에서 와 같이)으로 분포하는 것은 고체 처리량과 20%의 허용 가능한 정밀도수준 26 사이의 균형을 잘 유지합니다. 17.5%의 중간 정밀도 수준은 훨씬 더 큰 데이터 세트10에서계산된 16.4%(5.7%-38.9%, n = 580)의 수분 간 범위의 중간 정밀도와 유사합니다. 따라서, 96개의 딥 웰 플레이트 또는 50 mL 튜브에서 병렬 배양을 준비할 때 관찰된 돌연변이체의 분포가 적어도 14개의 병렬 배양물로 얻어지는 것이 좋습니다. 돌연변이 율이 다른 환경에서 추정될 때 한 판에 있는 모든 96개의 병렬 배양이 동일한 환경에서 성장되는 멀티플레이트 실험을 수행하여 정밀도 수준을 테스트하는 것이 좋습니다. 또한, 병렬 배양을 준비할 때, 접종기는 접종에 존재하는 내성 세포의 가능성을 감소시키기 때문에, 세포의 낮은 수를 포함하는 것이 중요하다. 기존의 내성 돌연변이는 접종에서 원하지 않으며, 숫자가 증가하고 선택적 플레이트에 잔디를 생성하고 돌연변이 율의 추정이 불가능하기 때문이다. 예를 들어, 대부분의 비돌연변이체 대장균 집단에서, 리팜피신 저항에 대한 돌연변이 속도는~10-8의순서로 이다. 따라서, 기존의 내성 돌연변이체로 배양을 접종하는 것을 피하기 위해, 10 개미만의 8 세포 (예를 들어, 103-104 세포)로 접종해야합니다. 마지막 중요한 단계는 선택적 한천 플레이트가 배양되기 전에 선택적 한천의 표면이 완전히 건조되도록하는 것입니다. 예를 들어 6웰 플레이트를 사용하고 병렬 배양의 초기 부피가 1mL인 경우 스프레더를 사용할 수 없습니다. 표면 액체가 마르도록 플레이트는 멸균 상태로 덮여 있어야 합니다. 이 걸리는 시간은 주변 조건과 플레이트의 상태에 따라 매우 가변적일 수 있습니다. 이 시간을 최소화해야 하지만 최대 몇 시간까지 가능합니다.
변동 분석에는 고유한 제약 조건이 있습니다. 그것은 게놈의 작은 부분 집합에서만 돌연변이의 현상형 마커를 해석합니다. 분석법은 이렇게 비율을 추정하기 위하여 충분한 돌연변이를 관찰하기 위하여 세대를 통과하는 큰 인구를 요구합니다. 이는 변동 분석은 박테리아,베이커효모(42)또는 액체 배양 포유류세포(30)와같이 많은 세대를 급속히 통과할 수 있는 유기체에만 사용될 수 있음을 의미한다. 또한, 돌연변이는 특정 세포의 특정 생화확적인 상황에서 발생하는 드문 사건이다. 변동 이 시제가 시간이 지남에 따라 세포의 큰 인구에 걸쳐 보이는 사실은 그 상황이 실질적으로 다를 수 있다는 것을 의미합니다. 이 분석을 사용하여, 따라서 지연 단계에서 초기 및 후기 지수 단계및 마지막으로 고정 단계에 특정 집단의 돌연변이 비율의 진행을 연구하는 것은 어렵다. 인구 내의 단 하나 세포 중 돌연변이 비율의 어떤 분화든지 변동 분석결과에서 완전히 숨겨져 있습니다. 단세포 돌연변이 역학은 DNA 복구 단백질 MutS43의 단일 분자 추적 또는 축적된 MutL 단백질44의초점을 계산하여 연구될 수 있다. 고처리량 시퀀싱의 최근 발전은 또한 부모 자손 트리오9,45 및 다세대 혈통46으로부터의돌연변이 비율을 직접 추정할 수 있게 하였다. 이러한 방법론적 진보는 단일 세대 내에서 발생하는 돌연변이의 직접적인 계수를 허용하기 시작했다. 그러나, 이 직접적인 접근은 형광 현미경 검사법, 미세 유체 공학, 또는 전체 게놈 순서와 같은 고가의 최첨단 기술을 요구합니다. 한편, 변동 분석은 상대적으로 저렴하고 표준 실험실 장비만 필요합니다. 더 많은 변동 검정을 하는 것은 또한 더 직접적인 단세포 접근으로 시험될 수 있는 새로운 가설의 생성을 촉진할 것입니다.
돌연변이의 연구 결과에 있는 오랜 관심사가 있습니다, 그래서 변동 분석결과는 확률이 널리 이용되는 방법 남아 있을 것입니다. 지난 4년(2015-2018년)에 루리아와 델브뤼크5가 인용한 정액 논문의 인용 건수는 모두 이 논문의 인용 상위 5위 안에 들였습니다. 그러나, 변동 분석기를 제대로 수행하기 위해 필요한 많은 양의 정확한 수동 작업으로 인해 대부분의 연구는 소수의 변동 분석만 수행합니다. 그러나 이것은 돌연변이 율의 환경 적 의존성을 밝히기에는 충분하지 않습니다. 이 백서에 설명된 바와 같이, 멀티웰 플레이트를 사용하여 변동 률 을 간소화함으로써, 가능한 현재 최대 처리량은 여기에 설명된 바와 같이 병렬로 11개의 딥 웰 플레이트(55 변동 성 매시스)이다. 하루에 두 세트의 변동 을 동시에 실행하면 주당 최대 110 개의 assays를 수행 할 수 있습니다. 처리량의 또 다른 단계 변화는 주어진 순전히 수동 프로토콜로부터 변동 분석의 다양한 단계를 자동화함으로써 아직 가능할 수 있다. 또한, 돌연변이 비율의 환경 의존성을 공부하기 위해, 인구 밀도는 고려될 필요가 있습니다. 이전 결과10 은 돌연변이 비율에 영향을 미치는 알려진 요인이 고려될 때, 인구 밀도를 통제하는 것은 돌연변이 비율 추정에 있는 변이를 90% 이상 감소시킬 수 있다는 것을 보여줍니다. 밀도를 제어하려면 N t(돌연변이 비율 추정에 사용)가 인구 밀도를 결정하는 데 사용되는 방법과 독립적으로 결정되는 것이 좋습니다. 박테리아에서, Nt는 CFU 및 밀도에 의해 결정될 수 있고, 예를 들어, ATP 기반 발광 분석분석(10).
높은 처리량과 밀도 조절은 유기체의 생태학적 맥락이 자발적인 돌연변이 율에 어떻게 영향을 미치는지 연구할 때 필수적입니다. 돌연변이 비율 가소성의 존재를 아는 것은 중요하지만, 돌연변이 비율 가소성이 더 넓은 생물학적 맥락으로 통합될 경우 그 원인과 효과를 이해하는 것이 중요합니다. 변동 분석법은 결과가 급속히 얻어지고, 분석실험은 다른 방법에 비해 저렴하기 때문에 많은 가설을 테스트하는 데 사용할 수있는 훌륭한 도구입니다. 단계는, 예를 들면, 세균성 지역 사회 및 microbiomes에 있는 돌연변이 비율의 환경 의존성을 공부하기 위하여 설정됩니다. 동문화에 변동 분석실험을 적응하는 것은 긴장이 작은 분자를 통해 서로의 돌연변이 비율에 영향을 미친다는 가설을 시험할 수 있습니다. 동문화에 의하여 변동 하는 해석의 수천을 하는 것은 긴장이 서로의 돌연변이 비율을 수정하는 그들의 능력에서 그리고 그들의 감수성에서 그 외에 의해 수정된 그들의 감수성 둘 다 변화하는지 결정할 수 있습니다. 돌연변이 비율 조작에 감수성에 있는 긴장 중 아마 변이는 특정 유전 변이에 기인합니다. 이것은 항균 저항이 어떻게 나타나는지와 같은 넓은 중요성의 예에서, 복잡한 지역 사회에서 진화가 어떻게 작동하는지에 대한 우리의 견해를 바꿀 수 있습니다.

1901년 네덜란드식물학자 휴고 드 브리스는 돌연변이1이라는용어를 만들어 내었다. 26년 후, 헤르만 조셉 뮬러가 X선2의돌연변이 작용을 발견했을 때, 돌연변이는 이미 진화의 원동력 중 하나로 인식되었다. 그러나, 돌연변이의 본질은 명확하지 않았습니다. 돌연변이가 자발적으로 나타나는지 (즉, 자발적 돌연변이) 또는 선택 (즉, 유도 된 돌연변이)에 대한 근본적인 질문에 대답하기 위해 돌연변이 이벤트를 관찰하는 방법이 필요했습니다. 이러한 방법은 세포 분열당 예상 돌연변이 수를 측정하거나 이미 돌연변이율3,4로알려진 것을 측정할 것이다.
<img alt="돌연변이율 추정 워크플로; 접종, 배양, 세포 도금, 데이터 분석 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60406/60406fig1a.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 도 1: 96개의 깊은 웰 플레이트에서 미생물 균주를 갖는 변동 분석법을 수행하는 방법에 대한 개략적 예례. (A)5개의 다른 환경('빨강', '파랑', '녹색', '보라색', 및 '주황색' assays)을 포함하는 50 mL 튜브에서 세포를 접종하고 적응시킵니다. (B)96 개의 깊은 웰 플레이트에 소수의 민감한 세포로 병렬 배양을 준비합니다. '빨강' 분석기는 20개의 병렬 배양을 가지는 반면, '파란색', '녹색', '보라색', '주황색' 분석은 모두 19개의 병렬 배양어가 있습니다. 96 개의 깊은 웰 플레이트에 평행 배양의 위치는 무작위이다. 무작위화는 보조 LayoutGenerator.R 스크립트 또는 다른 도구로 수행할 수 있습니다. 오른쪽 상단의 레이아웃은 무작위화 결과입니다. (C)96개의 깊은 웰 플레이트를 인큐베이션하고 세포가 분열시키고 자발적으로 돌연변이할 수 있도록 한다. 깊은 우물 A1, B1, C1, E1, F1 및 G1로부터의 6개의 배양체는 돌연변이체의 수가 어떻게 변동하는지 를 보여준다: 각각 제3 세포 분열 후 4, 0, 2, 2, 1, 및 4적혈구. 돌연변이체의 수는 자발적인 돌연변이의 상이한 수(제1 적혈구에 의해 도시된 바와 같이 0, 1, 또는 2)뿐만 아니라, 또한 배양 주기 동안 저항 돌연변이가 자발적으로 나올 때 중요하기 때문에(세포 분열 1, 2, 또는 3). (D)96개의 딥 웰 플레이트의 배양 후 돌연변이의 수는 81개의 병렬 배양액을 도금하여 결정된다. 레이아웃에서 굵은 가장자리가 없는 원입니다. 전체 병렬 배양은 선택적 한천을 포함하는 6개의 웰 플레이트 중 하나의 웰에 도금된다. (e)나머지 15개의 배양체는 비선택적 한천상에서 희석 및 도금되어 평균 세포수(Nt)를결정한다. 레이아웃에서 이러한 Ntwells로 레이블이 지정 되 고 굵게 가장자리가 있습니다. 각각의 분석결과 Nt는 3개의 병렬 배양물 이상평균화된다. 오른쪽 하단에는 깊은 우물 D1 (녹색'분석의 일부)에서 자란 희석 된 배양액 25 CFUs가있는 비 선택적 한천 접시가 들어있는 페트리 접시가 있습니다. (f)선택적 6웰 플레이트의 배양 후 관찰된 돌연변이체의 수를 카운트하고 돌연변이 사건의 예상 횟수를 계산하였고, m,최대 우도 추정기를 사용하여 추정하였다. (g)돌연변이의 수를 모두 알고, m,및 분석당 세포 수, Nt,돌연변이 율은 m/Nt로추정되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/60406fig1alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1943년 살바도르 루리아와 막스 델브뤼크는 변동 분석5(그림 1참조)와 함께 이 문제에 대한 독창적인 해결책을 제공했습니다. 분석은 미생물 세포의 소수로 시작되는 다중 인구 (명명된 병렬 배양)로 시작됩니다(그림 1A,B). 양성, 비선택적 환경에서 성장한후(도 1C),병렬 배양액은 선택적 마커(파지, 항생제 등)를 함유하는 플레이트 상에 전달되며, 여기서 저항돌연변이를 가진 세포만이 생존하고 콜로니를 생성할 수 있다(도1D). 주요 기대는 저항 돌연변이가 유도되는 경우에, 돌연변이를 전송하는 세포의 수는 분산과 같은 평균을 가진 다른 인구 사이에서 분배되어야 한다는 것이었습니다. 루리아와 델브뤼크가 변동 분석으로 발견한 것은 돌연변이의 수가 급격히 변동하고 다른 집단 간의 돌연변이 체의 차이가 평균보다 상당히 크다는 것입니다. 루리아와 델브뤼크는 돌연변이가 자발적임을 입증했다. 그(것)들은 DNA가 복제될 때마다 돌연변이가 자발적으로 나타난다는 것을 보여주었습니다, 돌연변이의 수는 돌연변이가 인구의 성장 도중 생기는 때에 달려 있습니다. 도 1C를참조하십시오, 여기서 6개의 집단은 각각 미생물 세포(파란색)로 시작되고, 없음, 1 또는 2개의 단일 돌연변이를 경험한다. 인구 A1, E1 및 F1은 하나의 단일 돌연변이(첫 번째 적혈구)를 경험했지만, 배양 주기 동안 다양한 시점에서 단일 돌연변이가 자발적으로 나타나기 때문에, 집단은 관찰된 돌연변이의 매우 다른 수(각각 4개, 2개 및 1개)로 끝났다. 다른 한편으로는, 인구 C1및 G1은 1보다는 오히려 2개의 돌연변이 사건을 경험했음에도 불구하고 E1및 A1로 관찰된 돌연변이의 동일 수로 끝났습니다. 집단 중 관찰 된 돌연변이의 변동은 분석법이름을 주었을뿐만 아니라 돌연변이 빈도 (즉, 돌연변이 세포의 비율)가 돌연변이 율의 부적절한 지표임을 보여주었습니다.
변동 분석법의 전반적인 목표는 특정 액체 환경에서 성장하는 박테리아 또는 다른 단세포 유기체의 특정 유전자형의 자발적인 돌연변이 율을 추정하는 것입니다. 변동 분석법은 미생물 돌연변이 비율의 환경 의존성을 연구하기위한 가장 적합한 도구로 남아 있으며 신속하고 저렴한 돌연변이 속도 추정을 허용합니다. 최대 깊이 시퀀싱6,인구 시퀀싱7,돌연변이 축적 실험8,또는 부모9의 자손의 게놈 서열을 비교하는 것과 같은 돌연변이 속도 추정에 대한 대체 접근법은 훨씬 더 힘들고, 따라서 잠재적으로 환경 의존성을 검출하는 데 적합하지 않다. 그러나, 돌연변이의 생성 및 수리의 동적 양상은 변동 분석또는 위에 열거된 돌연변이 비율을 분석하는 방법 중 어느 것에도 크게 접근할 수 없습니다. 시간, 공간, 또는 인구 내의 개별 적인 세포 중 돌연변이의 수가 어떻게 변경되는지 연구하기 위하여는, 단세포 접근11,12는, 변동 측정법 보다는 더 힘든 이외에, 고도로 전문화된 기술 및 장비가 필요합니다.
실제로, 변동 분석은 그 마커에 대한 선택이 부족한 환경에서 발생하는 돌연변이로 인해 현상형 마커를 얻는 세포를 계수하는 것입니다. 수백 개의 출판된 분석결과10개는 적어도 39개의 상이한 현상형 마커가 1943년에 분석이 시작된 이래로 사용되었음을 보여준다. 변동 분석실험은 허용 환경에서 성장하는 실험실, 임상, 비돌연변이및 돌연변이균주 간의 돌연변이율의 평균및 환경의존성을 비교하는데 사용될 수 있다. 분석은 최소 또는 부유한 환경에서 성장하는 다른 유전 배경을 가진 세포에 있는 돌연변이 비율 추정을 허용합니다. 상기 분석은 단일배양으로 성장하는 집단뿐만 아니라 돌연변이율11에대한 세포-세포 상호작용의 효과를 연구하는데에도 사용될 수 있다. 관심균이 제2 균주와 배양되고 중립 마커가 균주를 구별하는 데 사용될 때, 돌연변이 속도는 동시에 동일한 튜브에서 두 개의 균주에 대해 분석될 수 있다.
변동 하는 검사 결과 자발적인 돌연변이 속도 세포의 유전자형과 그것의 환경 둘 다에 따라 달라 집니다12 그리고 그 자체가 진화 하는 특성13. 특정 유전자형의 돌연변이율이 환경에 따라 변할 때마다, 돌연변이율 가소성11로기술된다. 플라스틱 돌연변이 율은 스트레스 유발 돌연변이 발생(SIM)14에대해 가장 철저하게 다루어졌다. 또한, 변동 성 검사를 사용하여, 최근에 세포의 집단이 증가하는 밀도 (전형적으로 용량에서 배치 배양)가 박테리아 및 단세포 진핵생물에 걸쳐 돌연변이 속도와 밀접하게 연관되어 있음을 보여주었다. 세대당 게놈당 돌연변이율은 조밀한 집단에서 23배10,11만큼감소한다. 이러한 밀도 관련 돌연변이 율 가소성(DAMP)은 쿼럼 감지시스템(15)에 의존할 수 있으며 SIM16과독립적으로 작동할 수 있다.
여기서, 상세한 프로토콜은 글루코스 최소 미디어 환경에서 항생제 리팜피신에 대한 내성을 얻고 있는 대장균 균주 K-12를 연구하는 데 사용되는 변동 분석에 대해 제시된다. 그러나, 이 프로토콜은 단순히 돌연변이의 배양 조건 및 현상형 마커를 수정함으로써 다양한 미생물을 연구하는 데 이용될 수 있는 기본 템플릿으로 볼 수 있다. 이 프로토콜은 시작부터진화5,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 다양한 미생물및 심지어 암세포30에 대한 사용을 통해 변형되어 증가하도록 수정되었습니다. 미생물 돌연변이율10,11,16의환경 의존성을 제대로 테스트하는 데 필수적이었다. 여기서 설명된 프로토콜은 문헌에서 이미 잘 논의되어 온 변동 분석의 모든 방법론 및 분석 문제를 다루지 않으며, 특히 내성 돌연변이의 적합성효과(31,표현형 지연32,세포 사멸33,및 돌연변이율26,34)를추정할 수 있는 다양한 알고리즘의 적합성을 다루지 않는다. 이는, 예를 들어, 피트니스 효과의 환경 의존성으로 인해 돌연변이율추정치35의잘못된 변동을 야기할 수 있는 중요한 일 수 있다. 그러나, 우리는 우리가 여기에서 사용하는 분석 공구가 돌연변이 적정및 세포 죽음에 있는 변이를 취급할 수 있다는 것을 주의합니다. 노트와 토론에서 언급 된 바와 같이, 그것은 또한 동일한 환경 의존적 인 피트니스 효과를 가질 가능성이 여러 phenotypic 마커를 고려하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 사람들이 미생물 균주 및 환경의 다양성에서 돌연변이 비율의 환경 의존성을 일상적으로 분석할 수 있게 합니다. 상이한 환경에서의 변이검사는 아직 철저히 시험되지 않았으며 일단 인구 밀도가 고려되면, 변동 성 실험은 돌연변이율10의보다 정확한 추정치를 제공할 수 있다. 이 프로토콜은 돌연변이 비율을 뒷받침하는 메커니즘을 이해하는 데 필요한 바와 같이 더 많은 변동 분석이 수행 될 수 있게 할 것이며, 이는 차례로 진화, 발암, 노화 및 항균 저항을 이해하는 데 필수적입니다.

<table><tbody><tr><td>1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Starlab International GmbH</td><td>S1615-5550</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877-10g</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>REF 657102</td><td></td></tr><tr><td>90mm 페트리 접시 트리플 벤트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>REF 120189</td><td></td></tr><tr><td>96 딥웰 플레이트(마스터블록 2mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>REF 780270</td><td></td></tr><tr><td>황산암모늄</td><td>Fisher Chemical</td><td>A/6440/53</td><td></td></tr><tr><td>Bacto</td><td>Agar Becton, Dickinson and Company</td><td>REF 214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 효모 추출물</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>REF 212750</td><td></td></tr><tr><td>Cycloserine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1158005-250MG</td><td>대체 표현형 마커 분석 전용</td></tr><tr><td>D-Glucose 무수</td><td>Fisher Chemical</td><td>G/0500/61</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>REF 430828</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256-500g</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘 헵타하이드레이트</td><td>Fisher Chemical</td><td>M/1050/53</td><td></td></tr><tr><td>Nalidixic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878-5G</td><td>대안 분석 전용 표현형 마커</td></tr> 인<tr><td>산칼륨 이염기성 삼수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504-500g</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td><td>성 Sigma-Aldrich</td><td>P0662-500g</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>EMD Millipore Corp, USA</td><td>557303-1GM</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>피셔 화학 S</td><td>/3160/60</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Jenway</td><td>6320D</td><td></td></tr><tr><td>티아민 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>T4625-25g</td><td></td></tr><tr><td>트리소듐 시트레이트 이수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>S1804-500g</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>피셔 케미컬</td><td>1278-7099</td><td></td></tr></tbody></table>

변동 분석으로 미생물 돌연변이 율 측정

Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay

변동 성 검사에서는 액체 환경에서 성장하는 미생물의 돌연변이 비율을 추정하는 데 널리 사용됩니다. 많은 배양체는 각각 수천 개의 세포로 접종되고, 각각은 현상상으로 분석될 수 있는 선택적 마커에 민감하다. 이러한 병렬 문화는 자형표의 부재에서 많은 세대에 대 한 성장. 배양의 서브세트는 돌연변이의 위험에 처한 세포의 총 수를 추정하는 데 사용된다(즉, 성장 기간의 끝에 있는 집단 크기, 또는 Nt). 나머지 문화는 선택적 한천에 도금됩니다. 병렬 배양물 들 사이에서 관찰된 저항하는 돌연변이의 분포는 그 때 수학 모형을 사용하여 돌연변이 사건의 예상된 수를 추정하기 위하여, m,이용됩니다. m을 Nt로 나누어 세대당 궤적당 돌연변이율의 추정치를 제공한다. 이 분석에는 세 가지 중요한 측면이 있습니다: 선택된 표현형 마커, 선택한 병렬 배양 부피, 및 선택적 한천의 표면이 배양 전에 완전히 건조되도록 하는 것입니다. 이 분석은 비교적 저렴하며 표준 실험실 장비만 필요합니다. It is also less laborious than alternative approaches, such as mutation accumulation and single-cell assays. 이 분석은 여러 세대를 거치면서 빠르게 작용하는 유기체에서 작동하며 마커와 세포 사멸의 적합성 효과에 대한 가정에 달려 있습니다. 그러나 최근에 개발된 도구와 이론적 연구는 이러한 문제를 이제 는 타있게 해결할 수 있다는 것을 의미합니다. 분석법은 격리에서 또는 지역 사회에서 성장하는 다른 유전자형을 가진 세포에 있는 다른 표현형 마커의 돌연변이 비율 추정을 허용합니다. 여러 분석법을 병렬로 수행함으로써, 분석은 유기체의 환경 적 맥락이 항균 저항, 발암, 노화 및 진화를 이해하는 데 중요한 자발적인 돌연변이 속도에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

결과는 3명의 다른 개별 적인 연구원에 의해 4 개의 다른 주에 보고된 프로토콜로 집합되었습니다, 매주 96개의 깊은 우물 격판덮개는 5개의 돌연변이 비율 견적을 생성하기 위하여 이용되었습니다. 3개의 96개의 깊은 웰 플레이트는 대장균 K-12 MG1655(도2A,프로토콜에 사용된 경우)에서 15개의 돌연변이 율 추정치(±95% 신뢰 구간, CI)를 생성했으며, 1개의 96개의 딥 웰 플레이트는 대장균 K-12 BW25113의 5가지 추정치(±95% CI)를 위해 사용하였다(그림 2). 도 2에서 추정 m의 사분위수 범위의 중간 정밀도는 17.5%(1.00%-28.9%, n = 20)입니다. 정밀도는 σm/m x 100%로 계산된 예상 돌연변이 이벤트수(m)의변동계수입니다(여기서 σ는 이전에 도시된 바와 같이계산됩니다 38). 그림 2의 원시 데이터는 보조 데이터 파일 "Krasovec_etal_JoVE_data.csv"에서 사용할 수 있습니다. 보조 데이터 파일에는 그림 2를생성하는 R 스크립트가 함께 제공됩니다. 세균 균주에 대한 자세한 내용은 보충 표 2및 데이터 파일의 열에 대한 설명이 있는 보충 표 3을참조하십시오. 리팜피신과 날리딕산으로 획득한 데이터 포인트는 이전에 Krašovec 등10에 게시되었으며 처음 출판되었을 때와 동일한 아이디를 가지고 있습니다.
도 2에서3개의 상이한 페노티픽 마커, 사이클로딘, 리팜피신 및 나리딕산의 MG1655 돌연변이 비율이 제시된다. 여기에서, 돌연변이 비율은 프로토콜에서 설명한 바와 같이 80, 125 및 250 mg/L의 포도당을 가진 데이비스 최소 배지에서 평가되었다. 한 경우 1,000 mg/L의 포도당을 사용하였다(도1B). 실제로, 모든 초기 포도 당 농도 사용할 수 있습니다. 예상대로, 돌연변이 율은 cycloserine 저항을 위해 더 높았고, nalidixic 산 저항을 위해 가장 낮았고, 리팜피신 저항의 비율은 중간에 있었습니다. 이것은 이 3개의 저항에 대한 공지된 표적 크기에 따라, 여기서 가장 큰 것은 사이클로딘과 나일리딕산에 대한 가장 작은 것이다. 토론 및 그림 3은 변동 분석법을 사용하여 미생물 돌연변이 비율의 측정을 최적화하기 위해 환경에서 목표 크기, 병렬 배양량 및 영양소 수준을 활용하는 방법에 대한 세부 사항을 제공합니다.
변동 분석은 어떤 긴장이 구성 돌연변이인지 및 일반적인 돌연변이 비율이 있는 명확하게 보여줍니다. ΔmutT 균주는 MG1655(도2A)로서nalidixic 산내성(도2B)에대한 약 50배 더 높은 돌연변이율을 가졌다. 그러나, 다른 환경에서 특정 유전자형의 돌연변이 율을 결정하기 위하여는, 단지 1개의 표현형 마커를 사용하여 환경 당 유전자형 당 적어도 5개의 복제를 하는 것이 좋습니다. 이러한 유형의 실험을 분석하기 위해 이전에 사용했던 통계 적 방법에 대한 자세한 개요는 Krašovec 외10의보충 정보를 참조하십시오.
<img alt="돌연변이율 대 포도당 농도 그래프; 산점도 및 기호를 사용한 데이터 비교." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60406/60406fig2a.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 도 2: 대장균 집단의 변동 분석에 의해 추정된 돌연변이 율의 대표적인 수치. (a)야생형 MG1655(circles)에서 보고된 프로토콜에 의해 결정된 돌연변이율. 이 그림은 리팜피신(연한 청색 원), 나리딕산(빨간 원), 사이클로린(진한 청색 원) 저항이 있는 경우의 돌연변이 율을 나타낸다. nalidixic 산의 경우, 10 mL의 더 큰 배양 부피가 사용되었습니다 (보충 데이터 파일참조). 리팜피신과 날리딕산에 대한 데이터는 크라쇼벡 외10에서 도 2에서 다시 플롯됩니다. (B)게이오39 Δ뮤트 돌연변이체(적색 삼각형)에서 nalidixic 산내성돌연변이율. 돌연변이 속도 축의 로그 축에 유의하십시오. 오류 막대 = 프로토콜에 설명된 대로 계산된 95% 신뢰 구간입니다. 데이터는 그림 4에서 다시 플롯됩니다 Krašovec 외10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/60406fig2alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="변동 분석 과정의 순서도; 돌연변이자, 환경 구성, 콜로니 중앙값 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60406/60406fig3a.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: 변동 분석 문제를 해결하기 위한 순서도입니다. 순서도는 상단에서 따라야 하며, 노란색 다이아몬드의 세 가지 질문을 차례로 해결하고, 결과 녹색 상자의 내용에 따라 프로토콜을 조정하고, 빨간색 타원형에 표시된 프로토콜을 구현합니다. 문제 해결 방법에 대한 자세한 내용은 토론의 처음 세 단락을 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/60406fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 프로토콜에 사용되는 미디어에 대한 수식입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/supptable1.xlsx" target="_blank">이 표를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 단추로 클릭하십시오).</a>
보충 표 2: 세균성 균주. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/supptable2.xlsx" target="_blank">이 표를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 단추로 클릭하십시오).</a>
보충 표 3: 원시 데이터 파일 Krasovec_etal_JoVE_data.csv의 열에 대한 자세한 설명입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/supptable3.xlsx" target="_blank">이 표를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 단추로 클릭하십시오).</a>
보조 데이터 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/Supplemental_Data_Files.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서, 프로토콜은 현상형 마커를 사용하여 변동 분석 및 미생물 돌연변이 율을 추정하기 위해 제시된다. 이 프로토콜은 연구원이 다양한 미생물 및 환경에서 돌연변이를 분석하여 유전자형과 생태학적 맥락이 자발적인 돌연변이 율에 미치는 영향을 결정할 수 있게 합니다.

Fluctuation assays are widely used for estimating mutation rates in microbes growing in liquid environments. Many cultures are each inoculated with a few ...

이 프로토콜은 미생물의 돌연변이 추정을 허용합니다. 그것은 유기체가 자연 돌연변이의 확률을 환경 컨텍스트에 미치는 방법을 입증 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 저렴하고 효율적이라는 것입니다.돌연변이 율의 많은 추정은 병렬로 만들어질 수 있습니다. 이 프로토콜 측정이 항생제에 저항을 따를 수 있는 돌연변이. 그래서이 프로토콜은 세계에서 가장 큰 도전 중 하나를 연구하는 데 사용할 수 있습니다, 항균 성 저항.이 방법은 세포 생태학적 맥락이 항균 저항의 진화에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜은 실험실 긴장의 단배문화에서 돌연변이 비율을 추정합니다, 그러나 우리는 생물 중성 분자를 구별하기 위하여 2개의 긴장의 임상 긴장 및 공동 배양에 그것을 적용했습니다. 이 프로토콜에 사용되는 가장 위험한 반응은 항생제 리팜피신과 메탄올입니다.그래서 리팜피신이 메탄올에 용해 될 때 보호 장갑과 고글을 사용해야합니다. 이 절차를 시작하려면 E.coli K12 글리세롤 스톡에서 얼음 조각으로 액체 리조겐성 국물의 3mL을 접종합니다. LB 문화를 120rpm에서 약 7시간 동안 섭씨 37도에서 흔들어 주세요.그 후 식염수 용액으로 배양 2000배를 희석시하십시오. 여기에 표시된 바와 같이 각 튜브에 10mL의 액체 데이비스 최소 배지를 첨가하십시오. 희석 배양물 100마이크로리터를 50mL 스크린 캡 원내 폴리머 튜브 3개에 추가합니다.텍스트 프로토콜의 윤곽선으로 50mL 튜브에 각각 포도당으로 5가지 액체 데이비스 최소 배지의 5가지 용액22mL을 준비합니다. 환경에 대한 접종을 준비하기 위해 먼저 600 나노미터에서 야간 배양의 광학 밀도를 측정합니다. 식염수 용액으로 배양을 희석하고 각 환경에 2200에서 110000 사이의 세포를 추가합니다.이렇게 하면 환경의 1mL에 대한 접종이 1000에서 5000 세포 사이에 포함되어 있는지 확인합니다. 다음으로, 196 깊은 우물 판에 대한 병렬 문화의 임의의 레이아웃을 만들 수 있습니다. 레이아웃에 따라 접종된 매체의 1mL를 플레이트의 각 웰로 전송합니다.그런 다음 접시 뚜껑을 테이프로 고정하고 뚜껑과 테이프로 전체 플레이트의 무게를 측정합니다. 250 rpm에서 24 시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 흔들어. 그 후, 인큐베이터에 증류수 2L을 배치하여 실험 세트 중 증발량을 안정화한다.비선택적 TA 마고 플레이트에 접종된 각 매체의 10 마이크로리터를 도금하여 접종 크기를 결정합니다. 한천 표면이 건조할 때까지 멸균 L자 형 스프레더를 사용하십시오. 그런 다음, 6개의 웰 플레이트에 리팜피신을 함유한 선택적 TA 화루를 준비한다.선택적인 TA 마고의 파이펫 5mL은 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 들어갑니다. 비선택적 한천 플레이트에 식민지 형성 단위를 계산하고, 크기 inocula를 결정합니다. 24시간 동안 배양한 후, 전체 깊은 우물 판의 무게를 측정하여 증발량을 결정하며, 이는 분석당 무작위로 선택된 3개의 배양을 마이크로센심분리기 튜브로 옮기는 것입니다.리팜피신을 함유한 선택적 TA 화루에 깊은 우물 판에서 나머지 81개의 평행 배양을 플레이트. 다음으로, 선택적 한천 판에서 뚜껑을 제거하고 식기 표면의 모든 액체를 건조하기 위해 멸균 조건에서 발견 됩니다. 희석 단계당 배양100 마이크로리터를 혼합하여 식염수 용액의 900 마이크로리터를 혼합하고 소용돌이시켜 5개의 10배 희석 단계를 사용하여 마이크로센심분리기 튜브로부터의 배양을 희석하여 콜로니 형성 단위의 수를 결정한다.비선택적 TA 한고에 최종 희석제 40 마이크로리터를 플레이트하고 뚜껑을 플레이트에 놓습니다. 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 6개의 웰 플레이트에 있는 모든 우물이 배양 액체가 없는 후 뚜껑을 다시 놓습니다.그런 다음 44-48 시간 동안 섭씨 37도에서 뚜껑으로 접시를 배양합니다. 4일째에는 비선택적 식고 플레이트에 식민지 형성 유닛을 세어보세요. 5일째에는 선택적 TA 천 플레이트에서 항생제에 내성이 있는 콜로니수를 계산합니다.특정 분석에 대해 관찰된 돌연변이 수의 병렬 배양 간의 분포를 기록합니다. 컴퓨터에서 적절한 소프트웨어를 엽니다. 가설 테스트 탭에서 값을 기본값에 둡니다.관찰된 돌연변이체를 배포하여 찾아보기를 클릭하고 텍스트 파일을 선택합니다. 파일을 업로드한 후 수행된 테스트를 클릭합니다. 오른쪽에서, 테스트의 결과에서, 하나의 샘플 ML 테스트에서, 돌연변이 번호를 찾을 수 있습니다.이것은 m, 돌연변이 이벤트의 예상 된 수입니다. 이어서, 특정 환경에서 특정 유전자형의 돌연변이율을 텍스트 프로토콜의 윤곽으로 추정한다. MG1655 돌연변이율은 3가지 상이한 표피마커, 시클로핀, 리팜피신 및 나리딕산의 돌연변이율이 여기에 도시된다.돌연변이 율은 80 mg/L, 125 mg/L, 및 250 mg/L의 포도당 농도를 가진 데이비스 최소 배지에서 평가됩니다. 한 경우, 포도 당 농도 1000 mg/L 사용. 예상대로, 종신균 내성, 나리딕산 저항에 대한 돌연변이율이 높고, 리팜피신 저항의 비율은 중간에 있다.변동 분석은 어떤 변형이 구성 돌연변이제이며 정상적인 돌연변이율을 갖는지 명확하게 보여줍니다. mutT 절제균은 대조군 MG1655 균주보다 약 50배 높은 나리딕산 저항에 대한 돌연변이율을 가졌다. 이 프로토콜을 미리 형성하는 동안 세포가 잘 성장하고 있는지 확인하십시오.동일한 환경의 병렬 배양권에서 균일한 밀도로 성장해야 합니다. 이 절차에 대한 1가지 후속 조치는 저항하는 식민지에서 rpoB 유전자의 DNA 서열을 결정하는 것이다. 리팜피신 저항에 돌연변이의 스펙트럼이 환경 미생물 유전자형에 어떻게 다른지 결정하기 위해.20 세기의 변동 적 해석은 돌연변이가 환경에 대한 존중과 함께 자발적이고 무작위인 방법을 보여 주었다. 지금, 그(것)들은 돌연변이 비율이 유전적으로, 생태학적으로, 사회적으로 어떻게 변화하는지에 새로운 빛을 흘리고 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

현재 문서는 RNA 바이러스 및 조직 문화의 충실도 변경 사항을 확인하는 돌연변이 주파수 데이터를 사용하는의 RNA 중합 효소의 충실도 변종을 분리하고 특징하는 데 필요한 단계를 설명합니다.

바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

여기 노화 동안 규제 또는 게놈 DNA의 불안정성에 기여하는 유전자 / 경로를 연구하기 위해 효모 연대기 수명 모델과 결합 수의 DNA 돌연변이의 assays 집합을 설명합니다.

를 사용하여 연령에 의존 게놈의 불안정성 유학 S. cerevisiae 연대기 수명 모델

출처: Stefan, A., et al. 대 장균에서 단백질 공동 발현의 다각적인 이점. J. Vis. 경험. (96), (2015).이 비디오는 베타-글루코시다제 분석을 사용하여 박테리아의 돌연변이 빈도를 평가하는 방법을 보여줍니다. 교정 결핍 DNA 중합효소를 발현하는 박테리아 배양은 연속적인 세대에 걸쳐 수집됩니다. 교정 감소로 인한 복제 오류는 억제된 베타-글루코시다제 유전자를 활성화할 수 있습니다. 원심분리 및 투과화 후 기질을 첨가하고 효소 활성을 측정하여 샘플 전체의 돌연변이 빈도를 정량화합니다.

베타-글루코시다제 분석을 사용한 박테리아의 돌연변이 빈도 평가

우리는 endomembrane 파열을 추적하는 방법을 설명하면 세포 내 박테리아에 의해...

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

남성 생식계열의 새로운 돌연변이는 다음 세대에서 건강에 해로운 결과에 기여할 수 있습니다. 여기에서는 환경 인자에 의해 유도된 수컷 생식 세포의 돌연변이를 정량화하기 위한 형질전환 설치류 모델의 사용 프로토콜에 대해 설명합니다.

형질 전환 쥐 분석 정량화 남성 생식 세포 돌연변이 주파수에 대한

변동 테스트를 통해 측정 된 사카로 미세스 세 레비 시아 젊은 세포에서 돌연변이 비율이 상이한 연령의 증식 및 모 세포의 돌연변이 빈도를 예측하는데 사용된다. 자기 정렬 및 유동 세포 계측법은 다음 예측 돌연변이 주파수에서 모든 편차를 식별하기 위해 실제 돌연변이 주파수와 어머니 세포의 나이를 측정하는 데 사용됩니다.

어머니 세포 및 변동 시험의 자기 정렬을 결합에서 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성을 분석합니다 사카로 미세스 세 레비 시아

여기에서는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의한 단백질 분해의 상대적 속도를 정량화하기 위한 강력한 생물학적 분석법을 설명합니다. 분석 판독은 액체 배양에서의 효모 성장 속도이며, 이는 필수 대사 마커에 융합된 분해 신호로 구성된 리포터 단백질의 세포 수준에 따라 달라집니다.

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

Ribonucleotides는 가장 풍부한 비정규 뉴클레오티드 핵 핵 DNA 복제 중 게놈으로 통합 중 이다. 제대로 제거, DNA 손상과 mutagenesis ribonucleotides 발생할 수 있습니다. 여기, 우리가 DNA와 그 변이 원 성 영향으로 ribonucleotide 설립의 풍부를 평가 하는 데 사용 되는 두 가지 실험 방법을 제시.

Ribonucleotides 효 모 게놈에 Ribonucleotide 유도 된 Mutagenesis 측정의 공부 Ribonucleotide 법인: 물가 관련 검색

이 기사에서는 함수의 이득 리포터 시스템을 사용 하 여 모형 진 균, 마이 박테리아 smegmatis에서 번역 오류 및 오 변환의 특정 비율을 측정 하는 두 가지 보완적인 방법을 제시 합니다. 이 방법은 더 높은 처리량 설정에서 낮은 처리량 또는 상대 오류율로 정확한 오류율을 측정 하는 데 사용 될 수 있습니다.

기능 리포터 시스템으로 특정 진 균의 오 번역 비율 측정

효모 성장 표현형은 마이크로콜로 성장하는 고정 된 세포의 매우 병렬 시간 경과 이미징을 통해 정확하게 측정됩니다. 동시에, 스트레스 내성, 단백질 발현 및 단백질 국소화를 모니터링할 수 있고, 통합된 데이터 세트를 생성하여 환경 및 유전적 차이뿐만 아니라 동종 세포 간의 유전자 발현 이질성, 변조 성장을 연구할 수 있습니다.

성장과 유전자 발현의 이질성을 측정하는 마이크로콜로니의 높은 처리량 라이브 이미징

우리는 실험적 진화 동결 아카이브에 쉽게 적응할 수 있는 비단일 뉴클레오티드 다형성 대립유전자 역학을 추적하는 비용 효율적인 방법을 개발했습니다. 삼중항 PCR 기술은 실험적 진화 과정에서 삽입 대립 유전자의 상대적 빈도를 정량화하기 위해 자동화된 병렬 모세관 전기영동과 결합되었습니다.

실험적으로 진화한 개체군에서 구조적 변이의 역학을 따릅니다.

배우세요 변동 분석을 사용하여 E. coli 등 미생물의 돌연변이 율을 측정하는 방법을. 이 프로토콜은 항생제 내성 진화 연구에 비용 효율적인 병렬 평가를 제공합니다.

변동 분석으로 미생물 돌연변이 율 측정

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