아데노 관련 바이러스-Cas9 시스템을 사용하여 유전자 조작 된 뮤린 머리와 목 암 세포라인의 시험관 내 설립

이 프로토콜은 특정 게놈 수술을 가진 두경부 암 모형의 발달을 가능하게 했습니다, 신생물의 프로세스에 있는 특정 유전자 돌연변이의 역할의 우리의 이해에 크게 영향을 미칩니다. 이 기술의 주요 장점은 셀라인이 거의 모든 기관에서 개발 될 수있는 용이성입니다. 절차를 시연하는 것은 마누 프라사드 (Manu Prasad)가 내 실험실에서 졸업생이 될 것입니다.

6 주 된 남성 또는 여성 B6 형질 형 질 성 마우스에서 혀를 수확 하는 수술 가위를 사용 하 여 시작. 메스를 사용하여 조직을 매우 작은 조각으로 다진 다음 혈청없이 RPMI 일반 매체의 4.5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 조각을 수집합니다. 튜브에 200 마이크로리터의 삼중 효소 믹스를 추가하고 조직의 효소 해리를 향상시키기 위해 10 분마다 튜브를 두드리는 30 분 동안 37섭씨37도에서 샘플을 배양합니다.

인큐베이션의 끝에서, PBS에서 5%FBS로 반응을 중지하고 더 큰 조직 단편에서 세포를 분리하기 위해 70 마이크로 미터 메쉬 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 완전한 매체의 3밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 그런 다음 16mm 접시당 완전한 중간 크기의 3밀리리터로 세포를 플레이트합니다.

필터 위에 유지된 셀 응집체를 별도의 16mm 배양 접시에 전달하고 3밀리리터의 완전한 배지를 추가합니다. 뚜렷한 세포 식민지가 형성될 때까지 두 요리를 인큐베이터에 보관하십시오. 배양 1주일 후 섬유아세포 오염의 존재를 위해 1차 세포 배양을 현미경으로 검사하고, 세포를 02%EDTA에서 02%의 트립신으로 1분 동안 섭씨 37도로 치료하고 섬유아세포를 제거합니다.

배양 첫날10일 에는 섭씨 37도에서 3~5분 동안 25%의 트립신을 사용하여 세포 현탁액 또는 세포 골재 배양으로부터 세포를 수확하고 6웰 플레이트의 각 웰에 우물당 2밀리리터에서 5차 세포에 2회 10을 본다. 다음 날 세포는 밀리리터 당 10~12개의 바이러스 게놈으로 세포를 1회 변환하고 37°C에서 48시간 동안 바이러스 입자 함유 배지에서 세포를 배양한다. 인큐베이션의 끝에서, 배양 슈퍼네이터를 웰당 2밀리리터의 신선한 완전한 배지로 대체하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 보라고 한다.

배양 확장의 2 주 후, 유효성 검사 및 생체 종양 유발 실험을 위해 세포를 시드. AAV CAS9 벡터를 사용하여, 바이러스의 밀리리터 당 12개의 바이러스 게놈에 10회 10회 는 입증된 프로토콜을 사용하여 1차 메타세포를 종양성 지도로 효율적으로 변환하도록 결정되었다. 변환 된 세포 익스프레스 Cre, CAS9 및 녹색 형광 단백질.

NOD SCID 마우스의 혀, 입술 및 피부로 지도를 5회 10회 주사하면 종양을 유발하지 않는 1차 맵의 주사와 달리 이들 동물의 종양 형성이 발생한다. 1 차적인 혀 상피 세포의 종양 생성 변환은 면역 형광 및 서쪽 얼룩을 사용하여 확인할 수 있습니다. 변형된 세포로부터 분리된 DNA의 깊은 시퀀싱에 의한 유전체 분석은 AAV CAS9 시스템에 의한 종양 단백질 53 및 APC 유전자의 효과적인 유전자 편집 및 프레임 변이를 확인한다.

또한, 변형된 혀 세포는 야생형 C57 블랙 6마우스에서 종양을 효율적으로 형성한다. 신성형 종양 세포의 면역 조직 화학 적 분석은 E-Cadherin과 Keratin 14의 세포질 발현을 밝혀, 두 상피 조직 마커. 이 절차를 시도할 때, 항상 너무 많은 다진 또는 너무 많은 효소 반응이 세포의 생존가능성을 감소시켜 바이러스 트랜잭션 효율성을 감소시키는 것을 기억하십시오.

이 절차를 사용하여, 세포선은 관심있는 어떤 조직에서 암 세포의 종양 유발 및 전이성 잠재력에 대한 통찰력을 얻기 위해 유전자 변형 될 수있다.