Name: 신진 효모 SNX-BAR 헤테로디머의 발현, 정화 및 리포솜 결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 배우세요 효모에서 SNX-BAR 헤테로디머의 발현 및 정화 방법을 통해 막 리모델링 단백질의 생물물리학적 특성을 규명하고 리포솜 결합을 분석하는 기술을 습득하세요.

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이 간행물에 보고 된 연구는 수상 번호 GM060221에서 건강의 국립 연구소의 국립 연구소에 의해 지원 되었다 그리고 부분적으로 국립 연구소의 일반 의학의 국립 연구소에 의해 수상 번호 T32GM007223에서 건강의. R.C.는 UNC-샬롯 교수 연구 보조금 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

1. 효모 변형 공사
<ol><li>TVY614(pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)11로 시작하십시오. 이 균주는 세포 용해 후 단백질 분해의 대부분에 기여하는 백공 프로테아제에 대한 결핍, 따라서 깨끗하고 보다 효율적인 정제를 허용.</li>
	<li>디자인프라이머(12)는 동형 재조합을 사용하여 Atg20(SNX-BAR ORF 1)의 C-종점(T-terminus)에서 탠덤 친화도 정제(TAP) 태그를 통합한다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 통합을 확인합니다(그림2).</li>
	<li>적절한 통합을 확인하기 위해 TAP 태그에 대해 셀 리세이트의 서쪽 블롯을수행13. 참고: SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 검증을 위해 3개의 OD(1 OD □ 1 x 107 셀)를 수확하는 것이 좋습니다. 내인성 프로모터를 GAL1 프로모터로 교체하기 전에 TAP 태그의 통합이 이루어져야 서부 블롯을 통해 보다 쉬운 TAP 태그 검증이 가능합니다.</li>
	<li>내인성 Snx4(SNX-BAR ORF1) 및 Atg20(SNX-BAR ORF 2) 프로모터를 각 개별 ORF14의순차적 상동 재조합 및 변형 단계를 사용하여 태그가 지정되지 않은 GAL1 프로모터로 교체합니다.</li>
	<li>PCR에 통합 사이트 외부의 측면 프라이머를 사용하여 성공적인 통합을 확인합니다(그림2). 이는 성장 배지에서 갈락토스의 부재 하에서 표적 SNX-BARs의 널 표현형을 초래할 것이다.</li>
</ol>2. 효모 유도 및 SNX-BAR 이량체 정제
참고: 효모 세포는 변형이 염색체적으로 통합됨에 따라 표준 YPD(효모 추출물, 펩톤 및 2% 포도당) 한천 플레이트상에 전파될 수 있다.
<ol><li>50 mL의 표준 YP (효모 추출물 및 펩톤) 배지에 50 mL의 표준 YP (효모 추출물 및 펩톤) 배지를 접종하여 2 % 라피노스 및 0.1 % 포도당을 탄소 원으로 플라스크에서 적어도 4 배의 부피를 섭취하고 적절한 폭기를 허용하기 위해 30 °C 셰이커에서 하룻밤 동안 성장합니다. 이 매체의 성장은 표준 YPD에 비해 느려질 것으로 예상됩니다.</li>
	<li>다음날 아침, 50 mL 프리컬쳐를 사용하여 2% 라피노스와 0.1% 포도당으로 표준 YP 배지 1L로 접종하고 30°C 셰이커에서 4-5시간 동안 자랍니다. 참고: 1L 배양을 접종하는 데 사용되는 프리컬쳐의 부피는 전배양의 OD600에 따라 조절될 수 있다. 접종 후 1 L 배양물의 OD600은 4-5 h 성장 동안 적어도 2개의 이중화를 허용하도록 약 0.2이어야 한다.<ol>
<li>적절한 폭기를 허용하기 위해 성장을 위해 당황 펀바흐 플라스크를 사용, 2.8 L 볼륨 플라스크는 충분하다. 적은 폭기 수확시 느린 성장과 작은 세포 펠릿 귀 착될 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>OD600을 확인하여 4-5시간 동안 성장한 후 배양액이 로그 단계(0.5-1)에 있는지 확인합니다. 균주의 성장에 따라, 적어도 두 배의 성장을 허용하기 위해 성장 시간을 조정합니다. 2% 갈락토스를 넣고 30°C 셰이커에서 하룻밤 동안 자랍니다. 참고: OD600 은 하룻밤 성장 후 다양할 수 있지만 배양은 포화되어야 합니다. 세포는이 성장 프로토콜에 대 한 2% 갈락토오스를 추가 하기 전에 0.1% 포도 당에서 제거 될 필요가 없습니다. 검증을 위해 SDS-PAGE 및 서부 블롯(그림3A, B,레인 1-2)에 대해 이 단계에서 유도되지 않은 및 유도 된 세포의 3 OD를 수확하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>15 분 동안 4500 x g에서 원심 분리에 의해 세포를 수확하십시오. 1L 볼륨 배양을 수용하는 스윙 버킷 로터를 여기에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>효모 펠릿을 50 mL 원점 튜브로 옮기십시오. 필요에 따라 제2 원심분리 단계를 수행할 수 있다. 상기 세포 펠릿은 일반적으로 졸업 표시에 의해 측정된 부피에서 약 10-15 mL일 것이며 즉시 사용되거나 -80°C에서 저장될 수 있다.<ol>
<li>펠릿을 15 mL 정제 버퍼(50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2,1 mM 디티오트레이톨(DTT), 프로테아제 억제제 칵테일)에 재중단하여 약 30 mL의 최종 부피를 확인한다.</li>
	</ol></li>
	<li>사용하기 전에 균질화기 4 °C를 식히고 정제 버퍼로 평형화하십시오. 기계식 세포 파괴자 또는 균질제를 사용하여 세포를 용해한다. 2-3 라운드에 대한 20,000-25,000 psi에서 균질화 및 용해로 샘플을로드; 세포가 용해됨에 따라 20,000-25,000 psi를 유지하기 위해 더 많은 입력 압력이 필요합니다. 얼음에 50 mL 원엽 튜브에서 세포 를 포란수집합니다. 참고: 추가 시료를 용해시켜야 하는 경우, 다음 시료를 로딩하기 전에 균질화제를 철저히 세척하고 평형화해야 합니다. 모든 세포가 얼음에 해리도록 유지하십시오.</li>
	<li>4 °C에서 1 시간 동안 35,000 x g에서 즉시 세포 용해를 지웁히 하십시오. 조심스럽게 상급을 새 튜브로 옮김. 세포 용해에서 지질원심 분리 도중 위로 떠있을 것이고 정화에 영향을 미치지 않을 것이라는 점에 유의하십시오. 참고: SDS-PAGE 샘플에 대한 용해수액과 펠릿을 0.5-1% 절약하는 것이 좋습니다. 전형적으로, 중요한 다름은 관찰되지 않으며 추가적인 서쪽 얼룩은 TAP 단백질 용해도를 확인하기 위하여 행해질 수 있습니다(그림 4,레인 1 및 2, 각각).</li>
	<li>정제 완충제와 IgG 세파로즈 비드의 300 μL을 평형화. 클리어된 셀에 용해시키고 4°C에서 회전하여 2시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>10 mL 크로마토그래피 컬럼에서 구슬을 수집하고 언바운드 리세이트가 통과할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>세척 버퍼 (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT)를 사용하여 구슬을 한 번에 1 mL을 추가하고 완전히 통과 할 수 있도록합니다. 참고: SDS-PAGE 샘플에 대한 바인딩 된 IgG 비드의 2 %를 저장하는 것이 좋습니다. 일반적으로, 우리는 네 개의 주요 밴드를 관찰; 두 개의 SNX-BAR 단백질과 IgG 헤비 및 라이트 체인(그림 4,레인 3). TEV 절단 효율을 비교하기 위해 'eluate'와 'TEV 후 IgG 구슬'의 동등한 양을 저장하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>구슬을 수집하고 미세 원심 분리튜브로 옮김. 신선한 세척 버퍼로 총 부피 500 μL을 추가하고 10 mg/mL TEV 프로테아제 2 μL을 넣고 4 °C에서 회전하여 밤새 배양합니다.</li>
	<li>다음날 아침, 27 G 바늘을 사용하여 상급체를 완전히 제거하고 단백질 순도를 10% 폴리아크릴아미드 SDS-PAGE(도4,레인 4)로 평가한다. 참고: 우리는 전형적으로 95% 순수한 헤테로디머의 0.5-1 mg/mL의 500 μL을 얻습니다(그림 4,레인 4). calmodulin 수지사용 추가 정제는 또한 행해질 수 있습니다, 그러나 우리는 일반적으로 수율에 있는 중요한 감소를 보고 순도가 >90%인 경우에 여기에서 중지하는 것을 추천합니다. TEV는 리포솜 결합 검사를 방해하지 않지만, TEV는 Ni-NTA 아가로즈비드(15)를사용하여 추가적으로 제거될 수 있다.</li>
	<li>농축하려면 제조업체의 지침에 따라 10 KDa 컷오프 및 원심 분리기로 0.5 mL 원심 필터로 샘플을 50 μL 이하로 옮김을 옮김을 사용하십시오. 브래드포드 단백질 분석판을 사용하여 농축 된 단백질을 정량화하십시오. 4 °C에서 보관하고 1 주일 이내에 사용하십시오.</li>
</ol>3. 리포솜 준비
<ol><li>상업적으로 이용 가능한 지질을 구입: 포스파티딜세린 (PS), PI3P, 에르고스테롤, 그리고 포스파티딜콜린 (PC). 필요한 경우, 스톡 지질을 만들기 위해 권장 용매를 다시 중단하십시오. 참고: 지질은 제조업체의 권장 사항에 따라 메탄올/클로로폼 혼합물로 재중단됩니다. 사용하기 전에 지질 스톡이 깨끗하고 실온으로 데워졌는지 확인하십시오. 재중단된 지질은 아르곤 가스 하에 보관할 수 있으며 6-12개월 동안 또는 활성 손실이 관찰될 때까지 -20°C에서 왁스 필름(또는 이에 상응하는)을 사용하여 밀봉할 수 있습니다.</li>
	<li>원하는 지질 조성물을 혼합하여 만들기 위해 각 지질 스톡에 필요한 부피를 계산합니다(표 1참조). 지질 혼합물에서 총 1 두더지의 지질을 가정합니다.</li>
	<li>화학 연기 후드에서 이 단계를 수행합니다. 클로로폼의 전체 주사기를 끌어올려 폐용기에 버려서 유리 주사기를 깨끗하게 청소합니다. 두 번 더 반복합니다. 클로로폼을 전달할 때는 유리 주사기 나 파이펫만 사용하십시오. 클로로폼을 그릴 때는 주사기에 가스 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해 스토퍼를 천천히 당깁니다.</li>
	<li>유리 주사기를 사용하여 깨끗한 유리 배양 튜브로 계산된 스톡 지질을 1% PI3P, 20% 에르고스테롤, 30% PS,PC(표 1)의최종 지질 혼합물을 만든다. 각 지질이 재중단되는 용매에 따라, 혼합물은 각 지질을 첨가할 때 흐린 방향으로 변할 수 있다. 참고: PS(0-30%)의 농도를 다양하게 하기 위해 그에 따라 볼륨을 조정하고 다양한 PC로보정합니다(표 1).</li>
	<li>지질 혼합물을 균일하게 건조시키기 위해 원형 운동으로 지질 혼합물을 향하게 하는 질소 가스를 사용하여 지질 혼합물을 조심스럽게 건조시다. 낮은 가스 흐름을 사용하여 건조 과정에서 유리 튜브의 바닥에 지질을 유지하십시오. 유리 배양 튜브를 호일로 감싸고 개구부를 덮지 않은 상태로 두고 1 시간 동안 진공 상태로 더 탈수합니다.</li>
	<li>400 μL의 결합 버퍼(50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2)를추가하여 지질을 완전히 탈수하여 2.5 mM의 최종 리포좀 농도를 만듭니다. 참고: 최종 리포솜 농도는 더 많거나 적은 결합 버퍼를 첨가하여 조절될 수 있다. 예를 들어, 200 μL 결합 버퍼는 필요한 경우 5 mM의 리포솜 농도를 생성하기 위해 첨가될 수 있다(아래 참조).<ol>
<li>30 분 동안 실온에서 소용돌이에 중간 속도로 흔들어 서 지질을 다시 일시 중단. 버퍼는 지질이 다시 중단으로 흐리게 나타납니다.</li>
	</ol></li>
	<li>재중단된 리포솜을 미세원심지 튜브로 옮김. 이 시점부터, 플라스틱 파이펫 팁은 지질이 더 이상 클로로포름에서 재중단되지 않도록 사용될 수 있다. 리포솜 솔루션은 흐린 것처럼 보일 것입니다.</li>
	<li>액체 질소에 먼저 미세 원심 분리튜브를 침수시켜 7~8회 동결해한 다음 37°C 수조에 넣습니다. 리포솜 혼합물은 해동하기 전에 눈으로 완전히 얼어 붙고 단단하게 나타납니다.</li>
	<li>화학 연기 후드에 클로로포름과 관련된 단계를 수행합니다. 1mL 유리 주사기 2개를 제거하고 클로로폼의 전체 주사기 볼륨을 각각 3회 폐기하여 잔여 지질을 제거합니다. 두 개의 주사기 부피를 끌어서 각 유리 주사기를 초순수와 평형화한 다음 두 개의 주사기 체적을 끌어서 바인딩 버퍼와 평형을 조정합니다.</li>
	<li>제조업체의 권장 사항에 따라 미니 압출기를 조립하십시오. 결합 버퍼에서 각각을 침수하여 200 nm 멤브레인 1개와 필터 지지대 2개(재료 표참조)를 평형화합니다.</li>
	<li>필터 지지대 사이에 멤브레인을 끼쳐 미니 압출기에 놓습니다. 조립된 미니 압출기에서 죽은 부피를 줄이고 어셈블리가 기밀인지 확인하기 위해 1 mL 유리 주사기를 사용하여 미니 압출기를 통해 리포솜 혼합물의 부피에 필적하는 결합 버퍼의 부피를 전달합니다.</li>
	<li>1 mL 유리 주사기 중 하나를 사용하고 리포솜 혼합물을 그립니다. 미세원심지 튜브를 반전하여 유리 주사기로 끌어들이기 위한 튜브 캡에 리포좀 혼합물의 마지막을 수집한다.</li>
	<li>200 nm 멤브레인을 19-21회 통과하여 리포솜을 돌출하였다. 새로운 미세 원심 분리튜브에서 압출 된 리포솜을 수집합니다. 참고: 압출 된 리포솜은 압출 전에 리포좀보다 덜 흐려나타납니다. 리포솜은 같은 날 사용하고 얼음에 저장해야합니다. 마지막 압출은 시작된 것과 반대되는 주사기에 리포좀을 놓아야 합니다.</li>
</ol>4. SNX-BAR 리포솜 결합 및 튜브
<ol><li>리포솜 결합 및 침전 실험을 수행하기 전에 4°C에서 20분 동안 초원심분리기에서 100,000 x g에서 정제된 단백질을 미리 정제하였다. 상급체를 제거하고 새로운 미세 원심 분리튜브로 옮기십시오. 펠릿이 있는 경우 방해하지 마십시오.</li>
	<li>리포솜 결합 및 관화 검사를 수행하기 위해, 총 반응 량 20 μL에서 4 μM 정제 된 Snx4-Atg20 및 2.5 mM 리포솜을 배양하고, 리포솜첨가의 부피를 변화시켰다. 참고: 동일한 실험에서 동일한 양의 리포솜을 사용해야합니다.</li>
	<li>30°C에서 30분 동안 배양한다. 참고: 우리는 침전 동안 시각화를 허용하기 위해 10 μL 리포솜 이상을 사용하여 각 반응에 추가 된 2.5 mM 리포좀의 양을 최대화하는 것이 좋습니다. 2.5 mM 리포솜의 10 μL이 20 μL 반응에서 사용되는 경우, 리포솜의 최종 농도는 1.25 mM이 될 것이다. 정제된 단백질이 희석되고 4 μM 단백질에 더 많은 부피가 요구되는 경우, 지질은 리포좀의 농도를 두 배로 하기 위해 재수화 단계 동안 200 μL에서 재중단될 수 있다(단계 3.6 참조); 그러나, 이것은 리포솜을 만들기 전에 단백질 사격을 알고 있을 것입니다.</li>
	<li>
리포솜 튜브를 시각화하고 정량화합니다.
	<ol>
<li>전자 현미경 분석을 위해 리포솜 결합 반응을 즉시 처리하십시오. 1% 우라일 아세테이트(도5B)16을사용하여 탄소 코팅 된 구리 메쉬 그리드 및 네거티브 얼룩상에 샘플을 스팟.</li>
		<li>투과 전자 현미경(200 kV)에서 샘플을 분석합니다.</li>
		<li>이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 튜불 직경을 측정하고 정량화합니다. 단일 튜블의 수구 직경을 정확하게 정량화하려면 튜블의 길이와 평균을 따라 세 가지 직경을 측정합니다(그림5B). 참고: 분산의 양방향 분석은 통계적 유의성을 결정하기 위해사용되었다(도 5E). 우라벨 아세테이트는 방사성 독성이 있습니다. 이 단계를 수행하려면 적절한 실험실 안전 인증이 필요합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
리포솜 결합 및 침전.
	<ol>
<li>반응(20 μL, 4.3단계에서)을 폴리카보네이트 원심분리기로 옮기고 호환되는 로터를 사용하여 4°C에서 20분 동안 초원심분리기에서 100,000 x g으로 회전합니다. 조심스럽게 상한을 제거하고 새로운 미세 원심 분리 튜브로 옮김. 펠릿은 그대로 유지되어야 합니다.</li>
		<li>샘플 버퍼의 SDS-PAGE 40 μL에서 펠릿을 다시 중단하고 새로운 미세 원심 분리튜브로 옮김. 상급체에 20 μL의 샘플 버퍼를 추가합니다. 10% 폴리아크릴아미드 SDS-PAGE 겔에 펠렛 및 상층체에 상응하는 양의 펠릿을 적재하고, 리포솜에 결합된 SNX-BARs를 시각화하기 위해 쿠마시 염색을 수행한다(도5A).</li>
		<li>펠릿 분획에서 SNX-BAR 복합체의 양을 정량화하기 위해 밀도 측정을 사용하여 밴드 강도를 정량화하고 펠릿 분획에서 SNX-BAR 단백질의 비율을 정량화합니다. 참고: 분산의 양방향 분석은 통계적 유의성을 결정하기 위해사용되었다(도 5C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Yong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+SNX1%2FSNX6+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex.</a> Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기에서는 효모와 2개의 분석에 SNX-BAR 이분무를 정화하여 합성 리포좀에 대한 생물물리학적 특성을 평가하기 위한 최적화된 워크플로우를 시연합니다. 대장균 또는 다른 시스템에서 일반적인 재조합 단백질 발현에 비해 주요 장점은 기본 숙주에서 SNX-BAR 단백질을 고르게 발현할 수 있는 능력으로, 다른 시스템에서 SNX-BARs를 정화할 때 발견되는 독성 및 불용성 문제를 피할 수 있다는 것입니다. 또한 우리의 시스템은 분자 복제 또는 다중 발현벡터(17)의항만을 필요로 하지 않는다는 것을 주목할 만하다. 당사의 이중 SNX-BAR 효모 균주는 염색체적으로 설계된 갈락토제 프로모터에 의해 구동되므로 유도 시에도 균일한 발현을 보장합니다. 중요한 고려 사항은 갈락토스가 없는 경우 표적 SNX-BARs의 발현이 거의 또는 전혀 없을 것이고, 따라서 null 표현형을 초래한다는 것이다. 또한 SNX-BARs는 C-터미널 태그를 잘 허용하는 경향이 있으므로 C-종점에서 TAP...

혈장막, 소포체, 골지 장치, 리소좀(yeast vacuole) 및 내막과 같은 막-결합 소기관은 진핵 세포의 내막 시스템을 포함한다. 대부분의 세포기관은 소포 수송 캐리어를 통해 다른 세포기관과 통신하고 교환할 수 있습니다. 세포가 내막 시스템 내의 소포 수송 운반체의 포장 그리고 대형을 조정하는 방법은 잘 이해되지 않습니다. 그러나, 내막 시스템의 대부분을 구성하는 단백질 및 지질은 혈장 막 (PM)에서 내분비 소포에서 유래하는 것으로 알려져 있다. endosome는 이 소포를 위한 1 차적인 수용자 소기관이고 관 성 소기관의 다중 상호 연결된 세트로 이루어져 있습니다. endosome의 주요 기능은 영양 수집을 촉진 하는, 단백질 및 지질 회전율을 조절, 병원 체 감염으로부터 보호, 플라즈마 막에 대 한 지질의 기본 보충 소스 역할을. endosome는 혈장 막에서 화물 단백질 및 지질의 대량수신으로, 관 내인체 수송 캐리어 (ETCs)로 화물을 격리해서 분류 구획으로 작동합니다. ETC로 격리되지 않은 모든 단백질은 내분비계통 시스템을 통해 분해되도록 남아 있습니다. ETC로 분류하는 화물의 역조절은 영양소 섭취, 단백질 회전율 또는 지질 항상성의 손실로 이어질 수 있으며, 이로 인해 수많은 대사, 발달 및 신경 장애1,2. 그러나, 내인성에서 ETC의 중심 역할에도 불구하고, 내인성이 관상 운반체로 이질적인 화물의 다수의 포장을 선택적으로 조정할 수 있는 방법의 근본적인 기계장치는 알려져 있지 않다.
선별된 넥신(SNX) 패밀리는 세포3,4,5에서많은 소포 수송 반응에 중요한 것으로 밝혀진 진화적으로 보존된 단백질 등급이다. 선별 넥신은 내막에 모집되고 인내막에 농축된 지질인 인산염리노시톨-3-모노포스페이트(PtdIns(3)P)를 결합하는 특징적인 인록 상동성(PX) 도메인을 통해 화물 포획을 돕습니다. 포유동물은 다른 도메인1의존재에 따라 다중 하위 패밀리로 더 분할될 수 있는 33개의 SNX 단백질을 인코딩한다. 가장 주목할 만한, SNX-BAR 하위 가족은 인간에서 열두 로 구성된 가장 큰 하위 가족이며, 신생 효모, 사카로미세세스 세레비시아에있는 동안, 하위 패밀리는 단지 7개의 SNX-BARs로 감소된다. SNX-BAR 단백질은 PX 도메인과 양성 곡률 막을 결합하는 지질 저장소를 유발하는 빈-암피히신-Rvs(BAR) 도메인을 모두 가지고 있습니다. 따라서 SNX-BAR 제품군은 내인성에 대한 자연스러운 친화력을 가지며 멤브레인 리모델링 능력을 통해 ETC 형성을 중재할 수 있습니다. 시험관내에서 SNX-BARs의 리모델링 특성은 합성 리포좀에 정제된 SNX-BARs를 첨가하여 유도될 수 있으며, 이에 따른 좁고 코팅된 튜블의 형성은 전자 현미경으로 가시화될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 연구원은 올리고머화 농도와 수축 강도 모두 그들이 ETC의 형성과 가위 모두에 도움이 될 수 제안 SNX-BAR 가족 사이에 변화하는 것으로 나타났습니다 결정했다.
SNX-BAR은 독점적인 이화 특성에 의해 추가로 분류될 수 있습니다. 시험관 내 결합 검사 및 구조 연구는 SNX-BAR 단백질이 특정 호모디머 또는 이종만 형성할 수 있음을 입증했습니다. 따라서, 원칙적으로, 각 잠재적SNX-BAR 디머-올리고머는 화물 별 인신매매 경로에 대한 튜번 코트를 제공할 수 있으며, 마찬가지로 다른 SNX-BAR 프로토머의 제한된 올리고머화는 또한 뚜렷한 수출 경로를 정의할 수 있다. 그러나 SNX 제품군 내에서 많은 수의 SNX-BARs와 다양성으로 인해 하나의 선별 된 넥신 원 화물 가설은 매우 드물다. 대신 SNX-BARs, 화물, 지질 특이성 및 기타 종속성과 같은 다양한 요인을 사용하여 조정된 노력이 더 가능성이 높습니다. 마찬가지로, 효모 SNX4 가족의 최근 연구는 PtdIns (3)P를 넘어 추가 지질 특이성에 대한 증거를 밝혀, 내분비 수송캐리어를potentiate 6. 본 연구에서, SNX-BAR 호모디머 Mvp1-Mvp1은 박테리아와 토종 이종자 Snx4-Atg20 및 Vps5-Vps17에서 정제되었으며, 효모에서 높은 수율로 정제되었으며, Snx4-Atg20만이 포스파티딜세린(PS) 및 좁은 결합 체형(PS) 및 좁은 결합 구조에서 포스파티딜세린(PS) 및 좁은 결합 체형(PS)을 우선적으로 결합하는 것으로나타났습니다. 현장에서 다른 사람들이 박테리아로부터 재조합 정제된 SNX-BAR 호모디머를 사용하여 SNX-BAR의 중요한 특성을 밝혀냈지만, 유사한 시스템에서 SNX-BAR 헤테로디머를 발현하는 것과 관련된 독성은 그들의 본래 특성화를 저해한7,8,9,10. 따라서 순수한 재조합으로 표현된 네이티브 헤테로디머를 얻기 위한 신뢰할 수 있는 시스템이 없다면, 연구자들은 이러한 조사 라인을 포기해야 한다. 도 1에서는,우리는 탠덤 친화도 정제를 위해 SNX-BAR 헤테로디머를 과발현하는 효모 균주를 구성하기 위해 4부트 워크플로우를 제시하고, 2) 네이티브 SNX-BAR 헤테로디머를 표현하고 정화하고, 3) 단층 합성 리포솜을 준비하고, 4) 리포솜 관 또는 침전검을 설정하여 연구원들이 자연에서 발견되는 넥신을 선별하는 카탈로그를 조사하는 데 중요한 도구를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>0.2 &무; m PC 멤브레인</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Poly-Prep 크로마토그래피 컬럼 (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>27 G 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 울트라 원심 필터(10K 차단 포함</td>) <td>Amicon</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Avestin EmulsiFlex-C3 균질화기</td><td>Avestin</td><td>EF-C3</td><td></td></tr><tr><td>BCA 분석</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Optima MAX-XP 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPS</td><td>Avanti</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Ergosterol (Sigma)</td><td>Sigma</td><td>47130-U</td><td></td></tr><tr><td>압출기 세트 포함 블록 0.2 &mu; L/1 mL</td><td>Avanti</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>FEI Tecnai F20 투과 전자 현미경 (200 kV)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 배양 튜브</td><td>VWR</td><td>47729-570</td><td></td></tr><tr><td>IgG 세파로스 비드 (GE Healthcare)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td></td></tr><tr><td>Microlter 유리 주사기</td><td>Hamilton</td><td>7637-01</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Excella E25</td><td>Eppendorf</td><td>M1353-0000</td><td>또는 동급 쉐이킹 30 &deg; C</td></tr><tr><td>Ni-NTA 마그네틱 아가로스 비드</td><td>피어싱</td><td>78605</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>파라필름 M</td><td>VWR</td><td>52858-076</td><td></td></tr><tr><td>PI3P</td><td>Echelon</td><td>P-3016</td><td>또는 Echelon 동급</td></tr><tr><td>폴리카보네이트 병 어셈블리</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100 고정 각도 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>유형 45 Ti 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>진공 탈착기, 하단 및 뚜껑(소켓 밸브 포함</td>) <td>VWR</td><td>75871-436</td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프 Alcatel (Pascal 2005 C1)</td><td>A& J 진공</td><td>PN07050</td><td></td></tr><tr><td>Vortex(폼 홀더 포함</td>) <td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr><tr><td>VWR 키트 마이크로튜브</td><td>VWR</td><td>12620-880</td><td></td></tr></tbody></table>

신진 효모 snx-bar 헤테로디머의 발현, 정화 및 리포솜 결합

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

SNX-BAR 단백질은 내분비증 중 단백질과 지질의 분류 및 인신 매매, 내인성 시스템 내에서 선별 및 자가 포식에 중요한 역할을하는 세포 리모델링 단백질의 진화적으로 보존 된 클래스입니다. SNX-BAR 단백질 기능의 핵심은 고도로 보존된 포크스 상동성(PX) 및 BAR(빈/암피히신/Rvs) 도메인을 사용하여 멤브레인을 결합하는 호모디머 또는 이종자를 형성하는 능력입니다. 또한, 막에 SNX-BAR 이체의 올리고머는 막 tubules 및 소포의 형성을 유도할 수 있고 이 활동은 endosome 파생된 수송 운반체를 위한 외투 단백질로 그들의 기능을 반영하는 것으로 생각됩니다. 연구원은 합성 리포좀 또는 거 대 한 unilamellar 소포에 재조합 SNX-BAR 단백질을 사용 하 여 생체 외 바인딩 연구에서 오랫동안 활용 (GUVs) 막 리모델링을 구동 하는 데 필요한 지질의 정확한 메이크업을 공개, 따라서 행동의 그들의 메커니즘을 공개. 그러나, 이중 발현 시스템과 기술적 인 도전으로 인해, 박테리아에서 SNX-BAR 단백질 발현의 독성, 개별 SNX-BAR 단백질의 가난한 용해도, 현재까지 대부분의 연구는 박테리아에서 발현 중에 형성 비 생리 적 이형제를 포함하여 SNX-BAR 호모디머를 검사했다. 최근에는 일반적인 세균 발현 시스템의 주요 단점을 극복하기 위해 프로토콜을 최적화했습니다. 이 워크플로우를 사용하여 다량의 SNX-BAR 헤테로디머를 성공적으로 표현하고 정화하는 방법과 결합 및 튜브 배관 법을 위해 합성 리포좀에서 재구성하는 방법을 보여줍니다.

이 프로토콜은 다운스트림 멤브레인 리모델링 분석에 사용될 수 있는 내인성 효모 SNX-BAR 복합체의 재현 가능하고 견고한 생산을 위한 방법을설명한다(도 1). 정제에 사용되는 효모 균주의 구성은 신생 효모에서 상동 재조합의 효율을 활용하여 표적 SNX-BARs의 게놈 성소에서 변형을 허용합니다(그림 2). 이러한 설계는 두 가지 장점을 가지며, (i) 변형을 유지하기 위해 선택이 필요하지 않기 때문에, 표준 YP 배지가 사용될 수 있고, 더 높은 세포 밀도로 성장을 허용하고 따라서 단백질의 더 높은 생산및 (ii) 표적 SNX-BARs의 발현 수준이 균등하게 될 것이며, 이종 복합체의 생산을 최적화할 것이다. 갈락토스를 첨가하기 전에, 표적 SNX-BARs는 널 표현형을 나타내며, 따라서 표적 SNX-BARs에 특이적인 성장 결함 또는 기타 알려진 결함을 초래할 ...

여기서, 우리는 효모에서 SNX-BAR 헤테로디머의 발현, 정제 및 리포좀 결합에 대한 워크플로우를 제시한다.

신진 효모 SNX-BAR 헤테로디머의 발현, 정화 및 리포솜 결합

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

SNX-BaRs는 인간 질병에서 중요한 역할을 하는 막 리모델링 단백질입니다. 우리의 방법을 사용하여, 우리는 지질 결합 및 막 리모델링을 용이하게하기 위해 정확한 생물 학적 특성을 결정할 수 있습니다. 효모 세포로부터 SNB-BAR 단백질을 정화하면 네이티브 호모 및 이테로 SNX-BAR 디머를 획득하는 동시에 비네이티브 발현 시스템과 자주 발생하는 독성 및 불용성을 최소화할 수 있습니다.우리의 방법은 모든 효모 SNX-BAR의 지질 특이성을 이해하거나 다른 유기체에서 재조합 SNX-BAR 단백질을 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 압출 공정 중 리포솜 손실을 방지하는 데 올바른 압출기 조립이 필수적입니다. 초등학생이나 현장에 새로 오신 학생의 경우 가장 중요한 단계를 시각적으로 관찰하면 성공 가능성이 크게 향상됩니다.먼저 큰 효모 세포를 플라스크로 접종하여 표준 YP 배지의 50 밀리리터를 함유한 배양물의 부피의 4배 이상을 탄소원으로 보충하고 30°C로 하룻밤 문화를 성장시키는 것으로 시작한다. 다음 날 아침, 50 밀리리터 프리 배양을 표준 YP 배지 1리터에 2%라피노스와 0.1%의 포도당을 2.8리터 부피로 접종하여 펀바흐 플라스크를 흔들어 서배양한 배양기에서 4~5시간 배양하였다. 600 나노미터의 광학 밀도가 0.2에 도달하면, 흔들리는 인큐베이터에서 하룻밤 배양을 위해 세포에 2%의 최종 농도에 갈라토스를 추가합니다.다음 아침, 원심 분리에 의해 세포를 수확하고 효모 펠릿을 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮긴다. 정제 버퍼의 15 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 약 30 밀리리터의 최종 부피를 달성하고 세포 현탁액을 섭씨 4도로 냉각된 균질화에 적재한다. 샘플을 20~25개, 평방 인치당 000파운드로 2~3라운드로 끌어들이고, 얼음 위에 50밀리리터 원피스 튜브로 라이세이트를 옮킨다.즉시 원심분리에 의해 세포 용양을 지우고 상체를 새로운 튜브로 조심스럽게 옮긴다. 다음으로, 4°C에서 회전하는 2시간 동안 구슬을 클리어셀 용액에 넣기 전에 정제 버퍼에 3개의 재서스펜션을 가진 IgG Sepharose 구슬 300마이크로리터를 평형화합니다. 인큐베이션의 끝에서 10 밀리리터 크로마토그래피 컬럼에 구슬을 추가하고 언바운드 라이세이터가 흐르도록 합니다.구슬을 세척당 1밀리리터의 세척 버퍼로 10회 세척하여 다음 볼륨을 추가하기 전에 각 세척이 완전히 흐르도록 합니다. 마지막 세척 후 파이펫과 신선한 버퍼를 사용하여 구슬을 미세 원심 분리기 튜브로 옮겨 넣습니다. 구슬의 총 부피를 신선한 세척 버퍼로 500 마이크로리터에 가져와 서술에서 구슬을 제거하고 밀리리터 TEV 프로테아제 당 10 밀리그램의 두 마이크로리터로 lysate에서 구슬을 제거하여 섭씨 4도에서 회전하여 하룻밤 동안 배양할 수 있습니다.다음 날 아침, 27 게이지 바늘을 사용하여 상체를 완전히 제거하고 단백질 순도를 10% 폴리아크릴아미드 SDS 페이지로 평가합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 브래드포드 단백질 분석기를 사용하여 농축 된 단백질을 정량화하고 섭씨 4도에서 최대 1 주일 동안 단백질을 저장합니다. 리포솜을 준비하려면 유리 주사기를 사용하여 스톡 지질을 깨끗한 유리 배양 튜브로 옮기면 1%인산염-3-인산염, 20%에르고스테롤, 30%의 포스파디딜세린, 인산다이딜린의 최종 지질 혼합물을 얻을 수 있습니다.각 지질이 재장매되는 용매에 따라 각 지질을 첨가하면 혼합물이 흐리게 될 수 있다. 유리 튜브의 바닥에서 지질을 균일하게 취급하기 위해 원형 모션으로 혼합물에서 저유량 질소 가스를 지시하여 지질 혼합물을 조심스럽게 건조시다. 그런 다음 유리 배양 튜브를 호일로 감싸서 개구부를 발견하고 1 시간 동안 진공 상태에서 지질을 더 탈수합니다.인큐베이션이 끝나면 각 유리병에 400 마이크로리터의 결합 버퍼를 추가하여 2.5 밀리몰러의 최종 립약 농도에서 지질을 완전히 재수화한 후 실온에서 소용돌이의 중간 속도로 지질을 30 분 동안 재연합니다. 지질이 다시 중단되면 버퍼가 흐리게 됩니다. 재중단 된 리포솜을 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 액체 질소로 튜브를 얼리고 37도 의 수증기에서 7 ~ 8 번 해동합니다.화학 연기 후드에서, 어떤 잔류 지질을 제거하고 초순수 물과 바인딩 버퍼의 두 볼륨각 주사기를 평형각 주사기를 제거하기 위해 주사기 당 세 번 클로로 폼의 전체 볼륨과 두 밀리리터 유리 주사기를 청소. 제조업체의 권장 사항에 따라 미니 압출기를 조립합니다. 그런 다음 결합 버퍼에 있는 1개의 200 나노미터 막에 필터 지지의 2개의 조각을 잠급니다.미니 압출기를 조립하여 완전히 밀폐되도록 하는 것이 중요합니다. 그리고 누출을 확인하는 좋은 방법은 장치를 통해 버퍼를 전달하는 것입니다. 필터 지지 사이에 멤브레인을 끼쳐 미니 압출기에 멤브레인을 배치합니다.평형 1 밀리리터 주사기 중 하나를 사용하여, 미니 압출기를 통해 리포솜 혼합물의 부피와 유사한 결합 버퍼의 볼륨을 전달하고 다른 주사기를 사용하여 미량 원심 분리튜브를 반전시키는 리포솜 혼합물을 떨어뜨려 리포솜의 마지막 을 튜브 캡으로 수집합니다. 그런 다음 200 나노미터 멤브레인을 19~21회 제거하고 압출된 리포솜을 새로운 미세원심분리기 튜브로 수집한다. SNX-BAR 리포솜 결합 및 관제 소심을 수행하기 전에, 초원심분리에 의한 정제된 단백질을 미리 지우고 펠릿을 방해하지 않고 새로운 미세원심분리기 튜브로 상체를 전달한다.다음으로, 정제된 SNX4-ATG20의 4개의 마이크로몰라와 2.5 밀리올러의 총 반응 부피에서 30분 동안 30분 동안 잠복할 수 있습니다. 리포솜 튜브를 시각화하고 정량화하려면 인큐베이션 끝에 즉시 샘플을 탄소 코팅 구리 메쉬 그리드에 발견하고 1%의 우란 아세테이트로 부정적인 얼룩을 발견합니다. 그런 다음 200킬로볼트에서 전염 전자 현미경의 샘플을 분석합니다.리포솜 결합 및 침전물의 경우, 폴리카보네이트 원심분리기 튜브에 반응의 20 마이크로리터를 전송하고 초원심분리기에서 호환 라우터로 샘플을 회전시. 원심분리가 끝나면, 상체를 새로운 미세원심분리기 튜브로 조심스럽게 이송하고 SDS 페이지 샘플 버퍼의 40 마이크로리터에서 펠릿을 재차판으로 재차한다. 펠릿 서스펜션을 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기고 20마이크로리터의 샘플 버퍼를 상퍼에 추가합니다.그런 다음 10% 폴리아크릴아미드 SDS 페이지 젤에 동등한 샘플 볼륨과 상피물을 적재하고 쿠마시 염색을 수행하여 리포솜에 결합된 SNX-BAR을 시각화합니다. SNX-BAR 발현의 적절한 유도를 확인하기 위해, 탠덤 친화 합리 태그에 대한 서쪽 블롯은 SNX-BAR의 단백질 수준으로 쿠마시 얼룩을 통해 검출되지 않을 수 있다. SNX-BAR 이종수의 정화 후, 두 SNX-BAR의 밴드는 일대일 스토이치오메트릭 비율로 나타나야하며 오염 밴드가 거의 또는 전혀 없어야합니다.본 대표적인 분석에서, SNX-BAR 이종성기는 입증된 바와 같이 합성 리포솜에 발현, 정제 및 결합되었다. MVP1은 호모를 형성하고 예상대로 박테리아로 표현되었다는 점에 유의하십시오. 다양한 리포솜 조성물에 결합하는 SNX-BAR는 예를 들어 리포솜 결합에 대한 인산화균제의 효과를 평가하기 위해 밀도에 의해 정량화될 수 있다.전자 현미경 이미징을 통해 SNX4-ATG20 리포솜 튜블을 측정할 수 있으며, 대부분의 튜벌레는 일반적으로 14~26나노미터 사이의 직경을 소유합니다. 정제된 SNX-BAR은 리포솜의 화물 포획 단지로 재구성하여 전체 어셈블리가 멤브레인 리모델링에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해할 수 있습니다. 정제된 SNX-BAR 디머의 다른 조합의 결합을 다른 지질으로 구성된 합성 지질에 비교할 때, SNX-BAR 단백질은 뚜렷한 지질 결합 선호도를 가지고 있는 것으로 나타났습니다.클로로폼을 취급할 때항상 후드에서 작업하고 날카로운 또는 유리 재료를 취급할 때 적절한 PPE를 착용하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

신화는 모델 유기체 Saccharomyces cerevisiae의 표현 단백질 사이의 과도 안정적인 상호 작용의 민감한 감지 수 있습니다. 그것은 성공적으로 높은 처리량 방법으로 상호 작용하는 파트너를 식별하기 위해 외인성 및 효모 필수 막 단백질 연구에 적용되었습니다.

분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구

높은 품질의 효모 세포 추출물의 준비를 개별 단백질 또는 전체 프로테옴의 분석에 필요한 첫 번째 단계입니다. 여기에서 우리는 단백질의 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하기 위해 최적화 된 신진 효모 세포에 대한 빠르고, 효율적이며 신뢰성있는 균질화 프로토콜을 설명합니다.

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우리는 핵분열 효모 성 수명 주기의 장기 현미경을 위한 재현 가능한 기본 방법을 제공합니다. 설명된 사소한 조정과 함께 제시된 프로토콜은 생식 과정의 여러 단계에 대한 연구의 초점을 맞출 수 있도록 합니다.

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이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.

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Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

여기 우리가 제시 익스프레스, solubilize, 누 룩을 사용 하 여 SLC4 운송업 자 가족에 상 동으로 여러 진 핵 borate 전송기를 정화 하는 프로토콜. 우리는 또한 multimeric 어셈블리에 대 한 정화 homomeric 단백질을 평가 하기 위해 화학 가교 분석 결과 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 다른 도전 막 단백질에 대 한 적용할 수 있습니다.

표현, 가용 화, 그리고 진 핵 Borate 전송기의 정화

여기서는 크로스링커가 있는 글리세롤 그라데이션 원심분리인 그라픽스(Gradient Fixation)의 활용을 설명하여 쌍향적인 복합체에 일시적으로 결합하는 접합 요인 간의 상호 작용을 식별합니다.

사카로미세스 세레비시아스 스플리케소터 서브콤플렉스의 과도성 행위자 검출을 위한 그라픽스의 활용

구리 성장 분석인 ACT1-CUP1 분석은 전구체 메신저 RNA(pre-mRNA) 스플라이싱과 돌연변이 스플라이싱 인자가 스플라이세오솜 기능에 미치는 영향에 대한 빠른 판독을 제공합니다. 이 연구는 프로토콜을 제공하고 관심 있는 접합 문제를 해결하기 위해 가능한 사용자 정의를 강조합니다.

ACT1-CUP1 분석은 신진 효모에서 스플라이세오솜 돌연변이체의 기질 특이적 민감도를 결정합니다.

이 프로토콜은 관심 항원에 결합하는 단백질 변이체를 풍부하게 하기 위해 효모 표면 디스플레이 선택 캠페인을 수행하기 위한 필수 단계를 설명합니다.

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

배우세요 효모에서 SNX-BAR 헤테로디머의 발현 및 정화 방법을 통해 막 리모델링 단백질의 생물물리학적 특성을 규명하고 리포솜 결합을 분석하는 기술을 습득하세요.

신진 효모 SNX-BAR 헤테로디머의 발현, 정화 및 리포솜 결합

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