Name: 화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 학습하세요 화학적 그라디언트 하에서 세포 집단 이동 시 세포 힘을 정량화하는 미세유체 견인 현미경법. 이 방법은 재생 및 암 전이 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 한국 정부(MSIP)의 후원을 받은 국립연구재단(NRF)의 지원으로 지원되었다. NRF-2017R1E1A1A01075103), 고려대학교 보조금, BK 21 플러스 프로그램. 그것은 또한 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL00718, R01EY019696).

참고: 스텐실(두께 = 250 μm) 및 마이크로채널 부품(두께 = 150μm), 유리 에칭(깊이 = 100 μm) 및 주조 제작을 위한 SU-8 금형의 리소그래피는 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어를 사용하여 제조업체에 설계를 전송하여 아웃소싱되었습니다.
1. 폴리디메틸실록산(PDMS) 스텐실 및 마이크로채널 제조
<ol><li>스텐실과 마이크로채널의 마이크로패턴을 디자인합니다.</li>
	<li>실리콘 웨이퍼(직경 4")에서 SU-8 금형(스텐실의 경우 ~250μm, 마이크로채널의 경우 ~150μm)을 제작 또는 아웃소싱합니다.</li>
	<li>염기 엘라스토머 및 경화제를 10:1의 비율로 혼합하여 PDMS 혼합물을 준비한다.<ol>
<li>50 mL 원엽 튜브에 염기 엘라스토머 15 mL을 놓고 1.5 mL의 경화제를 추가합니다. 이 중 두 가지를 준비합니다.</li>
		<li>PDMS 혼합물을 5분 동안 소용돌이. 196 x g에서 PDMS 혼합물을 1분 동안 1분 동안 원심분리하여 기포를 제거한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PDMS 스텐실을 제조하기 위해, PDMS가 SU-8 기둥의 측면을 만지지만 SU-8 패턴의 상단이 아니라는 것을 않도록 SU-8 패턴 영역을 피하면서 웨이퍼에 PDMS 혼합물의 ~1 mL을 붓습니다.<ol>
<li>웨이퍼를 실온(RT)에서 30분 이상 평평한 표면에 놓습니다. 2시간 이상 80°C에서 건조 오븐에서 PDMS를 경화합니다.</li>
		<li>SU-8 몰드에서 PDMS를 조심스럽게 벗겨내고 14mm 중공 펀치를 사용하여 얇은 PDMS 멤브레인을 다듬습니다. 끈적끈적한 테이프를 사용하여 PDMS 조각표면의 먼지를 제거하고 PDMS 스텐실을 오토클레이브합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PDMS 마이크로 채널을 제조하려면 SU-8 금형위에 ~30 mL의 PDMS 혼합물을 붓습니다.<ol>
<li>진공 챔버에서 30 분 동안 탈가하고 2 시간 이상 동안 80 °C에서 건조 오븐에서 PDMS를 경화합니다.</li>
		<li>SU-8 금형에서 PDMS를 조심스럽게 벗겨내고 PDMS를 24mm x 24mm 크기로 자른다. 각 PDMS 블록에서 1mm 생검 펀치를 사용하여 콘센트 1개와 입구 3개를 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 폴리 아크릴 아미드 (PA) 젤 바닥 유리의 제조
<ol><li>직사각형 마이크로 웰(6mm x 12mm, 깊이 100μm깊이 29)을절단 및 에칭하여 직사각형 슬라이드 안경(24mm x 24mm x 1mm)을 제조 또는 아웃소싱합니다.</li>
	<li>바닥유리(30)의표면을 실라제한다.<ol>
<li>200 mL의 탈이온수(DIW), 80 μL의 아세트산 및 50 μL의 3-(트리메톡시실릴) 프로필 메타크릴레이트(TMSPMA)를 1시간 동안 혼합하여 바인드 실란 용액을 준비한다. 주의: TMSPMA는 가연성 액체입니다. 재료 안전 데이터 시트의 권장 사항을 따르십시오. 화학 연기 후드에만 사용하십시오.</li>
		<li>끈적끈적한 테이프로 유리 표면에서 먼지를 제거하고 유리를 오토클레이브합니다.</li>
		<li>바인드 시란 용액의 100 μL로 바닥 유리의 에칭 된 표면을 덮고 1 시간 동안 RT에 유리를 둡니다.</li>
		<li>DIW 3x로 유리를 헹구고 주변 공기 온도에서 또는 공기를 불어 건조시키십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PA겔(31)을위한 겔 용액을 준비한다.<ol>
<li>DIW 1 mL에 5 mg의 APS를 용해시킴으로써 0.5 %(v) 황산 암모늄 (APS)의 신선한 용액을 준비하십시오.</li>
		<li>40% 아크릴아미드 용액 138 μL, 2% 비스 아크릴아미드 용액 101 μL, 형광 입자 용액 5 μL (0.2 μm), 및 655μL의 DIW로 구성된 PA 겔 용액을 준비합니다. 주의: 아크릴아미드 및 비사크릴아미드 솔루션은 독성이 있습니다. 보호 장갑, 의류 및 눈 보호 착용하십시오. 빛으로부터 형광 입자를 함유한 PA 젤 용액을 보호하십시오. 참고 : 배피하기 전에 형광 비드 용액을 소용돌이하여 배치 당 균일 한 수의 형광 비드를 얻습니다.</li>
		<li>APS 용액 100 μL과 테트라메틸레틸렌디아민 1 μL(TEMED)을 첨가한 후, 혼합 겔 용액을 10 μL을 직사각형 마이크로웰 에 옮기고 원형 커버슬립(18 mm)을 위에 놓습니다. 참고 : 거품없이 PA 젤로 바닥 유리를 채우려면 바닥 유리의 홈에 충분한 젤 용액을 놓고 커버 슬립을 젤 용액 위에 조심스럽게 밀어 넣고 여분의 젤 용액을 제거하십시오. 주의: 젤을 약 40분 동안 천천히 경화시. 원심 분리 젤에 대한 다음 절차는 가능한 한 빨리 수행되어야합니다.</li>
		<li>맞춤형 유리, 젤 용액 및 커버슬립의 조립을 뒤집은 다음 96 x g에서 10 분 동안 원심 분리기를 사용하여 PA 젤의 상단 층에 형광 입자를 가져옵니다.</li>
		<li>원심분리기에서 어셈블리를 제거하고 커버슬립이 아래를 향하여 평평한 표면에 놓습니다. 참고: 2.3.6단계부터 바이오 안전 성 캐비닛에서 샘플을 처리합니다.</li>
		<li>30 분 후, 조립체를 뒤집어 35mm 페트리 접시에 놓고 2 mL의 DIW로 채우고 (집게를 사용하여) 한쪽으로 밀어 커버 슬립을 부드럽게 제거합니다. 참고 : 경화 PA 젤은 1 개월 동안 DIW에 보관 할 수 있습니다. 그러나, 일단 콜라겐이 PA 젤에 코팅되면, 1 일 이내에 실험에 사용해야합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PA 젤에 콜라겐을 코팅합니다.<ol>
<li>따뜻한 50 mM HEPES 완충액에 1 mg/mL 설포수치니미딜 6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노) 헥사노에이트(설포-SANPAH)를 녹입니다. 용액의 200 μL을 겔 표면에 떨어뜨리고 UV 광(365 nm 파장)에 의해 10분 동안 활성화합니다. 참고 : 빛으로부터 설포 - SANPAH를 보호하십시오.</li>
		<li>겔을 0.1M[4-(2-하이드록세틸)-1-피페라진에탄설포닉산으로 헹구고; HEPES] 버퍼 2x 및 PBS 1x.</li>
		<li>PA 겔을 콜라겐 용액(PBS에서 100 μg/mL, 래트 테일 콜라겐 유형 I)으로 밤새 4°C에서 코팅합니다. 다음 날, PBS 3x로 씻으소서.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 세포 섬의 미세 패턴
<ol><li>F-127(재료표)용액 [PBS에서 2% (w/v)]을 준비하고 오토클레이브 된 PDMS 스텐실을 F-127 용액에 담급니다. 1 시간 동안 37 °C 인큐베이터에 보관하십시오.</li>
	<li>세포 용액 (2 x 106 세포 / mL)을 세포 배양 배지에서 준비 : Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)와 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 항생제 항 균제 (AA).</li>
	<li>PDMS 스텐실을 PBS 3x로 세척하고 PDMS 스텐실과 PA 겔 모두에서 액체를 제거합니다. PDMS 스텐실을 PA 겔위에 놓고 스텐실에 PBS를 추가합니다.</li>
	<li>부드럽게 파이펫팅하여 PDMS 스텐실 구멍의 거품을 제거합니다. 기포를 제거한 후 PDMS 스텐실 표면에서 PBS를 제거합니다.</li>
	<li>PDMS 스텐실에 200 μL의 세포 용액을 넣은 후, 세포가 PA 겔에 부착되도록 PA 겔을 1 시간 동안 인큐베이터에 보관하십시오.</li>
	<li>세포 배양 배지로 세포 용액을 부드럽게 씻어 내고 PDMS 스텐실을 제거하고 더 많은 세포 배양 배지를 추가하십시오. 현미경으로 세포 섬의 형성을 확인하십시오.</li>
</ol>4. PDMS 마이크로 채널을 가진 PA 젤의 조립
<ol><li>끈적끈적한 테이프를 사용하여 PDMS 마이크로채널의 먼지를 제거한 다음 오토클레이브를 제거합니다.</li>
	<li>PDMS 마이크로채널의 표면을 산소 플라즈마(80W, 50kHz)로 30초 동안 처리합니다.</li>
	<li>PA 젤 충전 바닥 유리에 액체를 제거 한 후, 하단 유리의 상단에 PDMS 마이크로 채널을 놓고 사용자 정의 유리 홀더에 어셈블리를 넣어.</li>
	<li>마이크로채널을 세포 배양 배지로 채웁니다. 주의: 피펫으로 따뜻한 매체를 부드럽게 플러시하여 채널에 갇힌 모든 거품을 제거하십시오. 또한, 거품을 제거하는 동안, 마이크로 패턴 세포 섬을 분리하지 않도록하십시오.</li>
</ol>5. 통합 미세 유체 시스템
<ol><li>튜브를 연결합니다.<ol>
<li>바늘 끝(18G)을 다듬고 90°로 구부려 커넥터를 준비합니다.</li>
		<li>3개의 입구와 1개의 콘센트에 대한 튜브 라인을 준비합니다.<ol>
<li>입구 튜빙의 경우 트리밍 된 바늘과 30cm 미니 볼륨 라인을 3 방향 스톱콕과 연결하십시오. 이 중 세 가지를 준비한다.</li>
			<li>콘센트 튜빙의 경우 트리밍 된 바늘과 75cm 미니 볼륨 라인을 3 방향 스톱콕과 연결하십시오. 이 중 하나를 준비합니다.</li>
			<li>1 시간 동안 예열 된 매체로 튜브 라인을 채웁니다. 주의: 주사기로 따뜻한 매체를 부드럽게 플러시하여 튜브 라인에 갇힌 모든 거품을 제거하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>주사기에서 플런더를 제거하고 입구 튜브 라인을 연결하여 저수지를 준비합니다.</li>
		<li>각 튜빙 라인의 바늘 커넥터를 미세 유체 장치의 3개의 입구와 하나의 콘센트에 연결합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>저수지에 신선한 배지 또는 컨디셔닝 된 매체가 각각 3 mL로 채웁니다.<ol>
<li>그라데이션 시험을 위해, 세포 배양 배지에서 좌측 입구 저장소를 20 ng/mL HGF로 채웁니다.</li>
		<li>농도 구배의 시각화를 위해 왼쪽 입구 저장소에 200 μg/mL 형광 염료(로다민 B-dextran, 70 kDa)를 추가합니다.</li>
		<li>출구 튜브 라인을 주사기 펌프에 연결합니다. 참고 : 주사기 펌프의 작동 모드는 "철수"입니다. 유량은 주사기 펌프의 용량 및 작동 속도에 따라 변경됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>기존의 에피플루오닉 현미경의 단계에 통합된 미세유체 시스템을 배치합니다. 주의: 미세 유체 채널에서 HGF의 완만한 구배를 생성하려면 유속이 0.1 μL/min만큼 느려야 합니다. 이것은 2 시간 동안 안정화가 필요하도록 충분히 민감하며 실험 중에 물리적 인 장애를 피하기 위해주의를 기울여야합니다.</li>
</ol>6. 이미지 수집
<ol><li>인큐베이터에 보관된 자동화된 현미경을 사용하여 최대 24시간 동안 10분마다 이미지를 찍습니다. 각 시점에서, 세포 이동을 시각화하는 위상 이미지, PA 젤에 내장 된 형광 구슬을 시각화하는 녹색 형광 이미지, 빨간색 형광 이미지를 시각화하는 등 세 가지 채널에서 4배 대물 렌즈를 사용하여 이미지 세트를 가져 가라. 화학 물질의 농도 구배.</li>
	<li>시간 경과 이미지를 복용 한 후, PA 젤에서 세포를 분리하기 위해 마이크로 채널에 0.25 % 트립신 -EDTA 솔루션을 주입하십시오. 젤에서 세포를 완전히 제거한 후 녹색 형광 이미지를 가져 가서 견인 현미경 검사법 용 참조 이미지로 사용하십시오.</li>
</ol>7. 데이터 분석
참고 : 데이터 분석을위한 사용자 정의 코드는 MATLAB을 사용하여 개발되었으며, 세부 사항은 다른 곳에서 설명되어32,33,34,35,36.
<ol><li>위상 이미지 분석의 경우 입자 이미지 속도측정36을사용하여 두 개의 연속상 이미지에서 변위를 계산합니다.</li>
	<li>Fourier 변환 견인 현미경 검사법의 경우 각 녹색 형광 이미지를 참조 이미지와 비교하고 입자 이미지 속도계36을사용하여 각 이미지의 변위를 계산합니다. 변위에서, 푸리에 변환 견인 현미경33,34,37을사용하여 PA 젤에 세포에 의해 만들어진 견인력을 복구합니다.</li>
	<li>견인 데이터에서 유한 요소 방법32,34,38에기초하여 단층 응력 현미경을 사용하여 세포 섬의 단층 내의 응력을 계산합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+from+tissue+culture+to+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell migration: from tissue culture to embryos.</a> Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).</li>
<li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+migration+in+inflammation%3A+present+and+future+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Mayor, R., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+front+and+rear+of+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The front and rear of collective cell migration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).</li>
<li>DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+forces%3A+architectural+control+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Balancing forces: architectural control of mechanotransduction.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).</li>
<li>Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+involving+multimodular+proteins%3A+converting+force+into+biochemical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).</li>
<li>Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+guidance+of+cell+migration%3A+lessons+from+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).</li>
<li>Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanoresponsive+cadherin-keratin+complex+directs+polarized+protrusive+behavior+and+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration.</a> Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanotransduction%3A+putting+all+the+pieces+together+again%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again.</a> FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).</li>
<li>Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+traction+forces+of+motile+dendritic+cells+on+micropost+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays.</a> Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).</li>
<li>Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+orthogonal+gradients+of+chemical+concentration+and+substrate+stiffness+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+Multiplexed+Drug-Combination+Screening+Platforms+Using+3D+Microtumor+Model+for+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine.</a> Small. 14 (42), 1703617(2018).</li>
<li>Ayuso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+Chemotactic+Response+of+Multicellular+Spheroids+in+a+Microfluidic+Device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device.</a> PLoS ONE. 10 (10), 0139515(2015).</li>
<li>McCutcheon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+formation+of+neuroclusters+in+microfluidic+devices+and+cell+migration+as+a+function+of+stromal-derived+growth+factor+1+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients.</a> Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Ellison, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+enhances+the+capacity+of+cell+ensembles+to+sense+shallow+gradients+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).</li>
<li>Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+self-organization+based+on+collective+cell+migration+by+contact+activation+of+locomotion+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).</li>
<li>Li Jeon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).</li>
<li>Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parallel-gradient+microfluidic+chamber+for+quantitative+analysis+of+breast+cancer+cell+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis.</a> Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).</li>
<li>Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+membrane-based+gradient+generator+for+use+in+cell-signaling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies.</a> Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).</li>
<li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+3D+in+vitro+model+for+specificity+of+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone.</a> Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).</li>
<li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whence+directionality%3A+guidance+mechanisms+in+solitary+and+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration.</a> Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).</li>
<li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+guidance+of+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective guidance of collective cell migration.</a> Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).</li>
<li>McCutcheon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+formation+of+neuroclusters+in+microfluidic+devices+and+cell+migration+as+a+function+of+stromal-derived+growth+factor+1+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients.</a> Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whence+directionality%3A+guidance+mechanisms+in+solitary+and+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration.</a> Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).</li>
<li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+guidance+of+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective guidance of collective cell migration.</a> Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).</li>
<li>Farrell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HGF+induces+epithelial-to-mesenchymal+transition+by+modulating+the+mammalian+hippo%2FMST2+and+ISG15+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways.</a> Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).</li>
<li>Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor+acts+as+a+mitogen+and+chemoattractant+for+postnatal+subventricular+zone-olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+of+substrate+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review.+E%2C+Statistical%2C+Nonlinear+and+Soft+matter+Physics%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing of substrate thickness.</a> Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 4 Pt 1 041918(2010).</li>
<li>Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+forces+and+kinematics+during+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping forces and kinematics during collective cell migration.</a> Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).</li>
<li>Denisin, A. K., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+Range+of+Polyacrylamide+Gel+Stiffness+for+Mechanobiology+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).</li>
<li>Jang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+microscopy+with+integrated+microfluidics%3A+responses+of+the+multi-cellular+island+to+gradients+of+HGF%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF.</a> Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li>
<li>Jang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogenizing+cellular+tension+by+hepatocyte+growth+factor+in+expanding+epithelial+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer.</a> Scientific Reports. 8, 45844(2017).</li>
<li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+forces+during+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5 (6), 426(2009).</li>
<li>Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+traction+response+in+human+airway+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).</li>
<li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+stress+microscopy%3A+limitations%2C+artifacts%2C+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS ONE. 8 (2), 55172(2013).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+prestress.+I.+Stiffness+and+prestress+are+closely+associated+in+adherent+contractile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).</li>
<li>Notbohm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Contraction+and+Polarization+Drive+Collective+Cellular+Motion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion.</a> Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).</li>
<li>Sunyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+durotaxis+emerges+from+long-range+intercellular+force+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission.</a> Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propulsion+and+navigation+within+the+advancing+monolayer+sheet%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet.</a> Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).</li>
</ol>

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

구성 세포의 집단 이동은 개발 및 재생 중에 중요한 과정이며, 이동 방향은 종종 성장 인자의 화학구배4,23에의해 유도된다. 집단 마이그레이션 중에 셀은 인접한 셀 및 기본 기판과 계속 상호 작용합니다. 이러한 기계적 상호 작용은듀로탁시스(42,plithotaxis33,및 kenotaxis43)와같은 새로운 현상을 야기한다. 그러나, 이 연구는 성장 인자의 단일 농도를 사용 하 여 수행 되었다, 태아 소 혈 청에 그 등. 간격을 채우기 위해 이 프로토콜은 화학 적 구배 하에서 집단 세포 이동 중에 기계적 상호 작용을 측정 할 수있는 새로운 실험 플랫폼을 설명합니다.
이 새로운 플랫폼은 마이크로패터닝, 견인력 현미경 및 미세 유체학적 의 세 가지 실험...

생물학적 시스템에서의 세포 이동은 조직 형성, 면역 반응 및 상처 치유1,2,3에관여하는 근본적인 현상이다. 세포 이동은 또한 암 같은 일부 질병에 중요 한 과정4. 셀은 종종 집단 세포 마이그레이션4,5로알려진 개별이 아닌 그룹으로 마이그레이션됩니다. 세포가 집합적으로 이동하려면 미세 환경의 감지가 필수적입니다6. 예를 들어, 세포는 물리화학적 자극을 인식하고 운동성, 세포-기질 상호 작용 및 세포-세포 상호 작용을 변경하여 반응하여 화학 적 구배를 따라 방향 이동을초래하는 7,8, 9,10. 이러한 연결을 바탕으로, 화학력 체11,12,13의 그라데이션과 같은 잘 제어 된 화학 미세 환경을 만들 수있는 실험실 온 칩 기술에서 급속한 발전이 이루어졌습니다. . 이 실험실에 칩 기지를 둔 미세 유체학은 이전에 세포 앙상블 또는 세포 구형의 화학요법을 공부하기 위하여 이용된 동안14,15,16,17, 단일 셀 마이그레이션18,19,20,21의맥락에서 주로 사용되었습니다. 화학 구배에 대한 세포 집단 반응의 기초가되는 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않습니다14,22,23,24,25,26 . 따라서, 수용성 인자의 침실성 제어뿐만 아니라 세포의 생물 물리학의 실체 관찰을 가능하게하는 플랫폼의 개발은 집단 세포 이동 뒤에 메커니즘을 해명하는 데 도움이 될 것입니다.
여기에서 개발및 기술된 다중 채널화 미세유체 시스템은 패턴세포 클러스터의 이동을 조절하는 수용성 인자의 농도 구배를 생성할 수 있게 해줍니다. 본 연구에서, 간세포 성장 인자(HGF)는 매딘-다비 개 신장(MDCK) 세포의 철새 거동을 조절하기 위해 선택된다. HGF는 세포-세포 무결성을 감쇠시키고세포(27,28)의운동성을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 미세 유체 시스템에서, 푸리에 변환 견인 현미경 검사법 및 단층 스트레스 현미경도 통합되어 HGF에 대한 응답으로 구성 세포에 의해 유도 된 운동성, 수축력 및 세포 간 긴장을 분석 할 수 있습니다. 그라데이션. 같은 섬 내에서, HGF의 높은 농도 근처에 위치한 세포는 더 빨리 이동하고 낮은 HGF 농도와 측면에있는 것보다 낮은 세포 간 스트레스 수준을 보여줍니다. 결과는 이 새로운 실험 시스템이 각종 수용성 요인의 화학 구배의 밑에 집단 적인 세포 이동을 관련시키는 필드에 있는 그밖 질문을 탐구하기 위하여 적당하다는 것을 건의합니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES 버퍼 용액</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>1 mm 생검 펀치</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 페트리 접시</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>100 mm 직경, 15 mm 높이</td></tr><tr><td>14 mm 중공 펀치</td><td>ILJIN</td><td>124-0571</td><td></td></tr><tr><td>18 mm &Oslash; 커버슬립</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111580</td><td>원형 18mm, 두께 No. 1 (0.13 - 0.16 mm)</td></tr><tr><td>2% 비스-아크릴아미드 용액</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td>보호 장갑, 의복 및 보안경을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트 (TMSPMA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>440159-500ML</td><td></td></tr><tr><td>3-방향 스톱콕</td><td>협성</td><td>HS-T-61N</td><td>주의: 이전에 개봉한 경우에는 사용하지 마십시오.</td></tr><tr><td>최소 볼륨 라인 30cm</td>를 재사용하거나 재사용하지 마십시오(소아용)<td>협성</td><td>HS-MV-30</td><td>주의: 이전에 개봉한 경우에는 사용하지 마십시오.</td></tr><tr><td>35mm 세포 배양 접시</td>를 재사용하거나 재사용하지 마십시오<td>. Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>430165 40% 아크릴아미드 용액</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td>보호 장갑, 의복 및 보안경을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>최소 볼륨 라인 75cm(소아용)</td><td>협</td>성 <td>HS-MV-75</td><td>주의: 이전에 개봉한 경우 사용하지 마십시오.</td></tr> 아세트산을 재사용하거나 재사용하지 마십시오. <tr><td></td><td>J.T. Baker</td><td>JT9508-03</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄(APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>바닥 유리 칩</td><td>MicroFIT</td><td></td><td>24 x 24 x 1mm, 맞춤형, 직사각형 홈(6 x 12mm, 깊이: 100 & m)</td></tr><tr><td>콜라겐 I형, 쥐꼬리</td><td>코닝</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>맞춤형 유리 홀더</td><td>한구그 메카트로닉스</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Welgene</td><td>LM 001-11</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Biowest</td><td>L0615-500</td><td>w/o Magnesium, Calcium</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres 아민 변성 마이크로스피어</td><td>Invitrogen</td><td>F8764</td><td>0.2 &micro; m, 황록색 형광등(505/515)</td></tr><tr><td>간세포 성장 인자(HGF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1404-5UG</td><td>재조합, 인간</td></tr><tr><td>JuLI 스테이지 라이브 셀 이미징 시스템</td><td>NanoEnTek In</td><td></td><td>Automated X-Y-Z 스테이지 및 형광 이미징 인큐베이터 호환(37 &deg; C 및 5% CO2)</td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 세포</td><td></td><td></td><td>유형 II</td></tr><tr><td>산소 플라즈마 시스템</td><td>Femto Science</td><td>CUTE-MPR</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate&ndash; dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379-100MG</td><td>70kDa, 미세유체 채널에서 HGF의 시공간 분포를 추정하는 데 사용</td></tr><tr><td>멸균 피하 주사 바늘 18G</td><td>KOVAX</td><td></td><td>바늘 끝을 자르고 90도 구부려 볼륨 라인으로 입/출력 포트 연결</td></tr><tr><td>접착 테이프</td><td>3M/Scotch</td><td>810D</td><td>33m x 19mm</td></tr><tr><td>SU-8 마스터 몰드</td><td>MicroFIT</td><td></td><td>4인치 직경, 맞춤형</td></tr><tr><td>sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td><td>-20°C에 보관하십시오. 습기와 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 엘라스토머 키트</td><td>다우 코닝</td><td></td><td>PDMS</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Chemyx Inc.</td><td>모델 Fusion 720</td><td>회수</td></tr>액 <tr><td>주사기 주사기</td><td>KOVAX</td><td></td><td>1, 3, 5, 10 또는 50cc 입구 저장소 또는 출구 주사기 펌프</td></tr><tr><td>테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610800</td><td>보호 장갑, 의복 및 보안경을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>자외선(UV) 램프</td><td>UVP LLC</td><td>95-0248-02</td><td>365nm 파장</td></tr></tbody></table>

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

세포는 화학 자극에 반응하여 이동 패턴을 변경, 자극의 그라데이션을 포함. 화학 구배의 방향으로 세포 이동, 화학 요법으로 알려진, 개발에 중요 한 역, 면역 반응, 상처 치유, 그리고 암 전이. 화학요법은 생체 내에서 세포의 집합뿐만 아니라 단일 세포의 이동을 조절하는 동안, 시험관 내 연구는 단일 세포 화학 요법에 초점을 맞추고, 부분적으로 적절한 실험 도구의 부족으로 인해. 이러한 격차를 해소하기 위해 여기서 설명한 것은 미세 유체와 미세 패턴화를 결합하여 집단 세포 이동에 대한 화학 적 그라데이션의 효과를 입증하는 독특한 실험 시스템입니다. 또한 견인 현미경 검사법과 단층 스트레스 현미경 검사가 시스템에 통합되어 기판뿐만 아니라 주변 세포 간의 세포력 의 변화를 특성화합니다. 개념 증명으로서, Madin-Darby 개 신장 (MDCK) 세포의 마이크로 패턴 원형 섬의 이동은 알려진 산란 인자 인자 (HGF)의 구배 하에서 테스트됩니다. HGF의 높은 농도 근처에 위치한 세포는 세포 섬 내의 반대쪽에 있는 세포보다 더 빨리 이동한다는 것을 발견했습니다. 같은 섬 내에서, 셀 룰 러 견인 은 양쪽에 유사, 하지만 세포 간 스트레스는 높은 HGF 농도의 측면에 훨씬 낮은. 이 새로운 실험 시스템은 세포 집단에 의한 화학 전술 이동의 역학을 연구하는 새로운 기회를 제공 할 수 있습니다.

화학 구배 하에서 집단 이동을 탐구하기 위해 미세 유체 시스템은 견인 현미경 검사법(그림 1)과통합되었습니다. 통합 시스템을 구축하기 위해, 폴리아크릴아미드(PA) 겔을 맞춤형 절단 유리상에 시공하고, MDCK 세포를 PDMS 스텐실로 만든 미세패턴 섬 내에서 시종하였다. 이 실험을 위해, MDCK 세포의 12개의 섬(3개의 열에 의하여 4개의 행, ~700 μm의 직경)이 생성되었다. PA 겔에 부착된 세포 후, PDMS 스텐실을 제거하여 집단 이동을 개시하였다. 미리 만들어진 미세유체 채널은 세포 섬 위에 미세 유체 채널을 구축하기 위해 PA 겔 의 상부에 배치되었다(도1A).
이어서 미세유체 채널 내에서 농도 구배를 확립하기 위해, 좌측 입구는 형광 염료 용액을 함유하는 공급 저장소에 연결되었다. 또한, 중간 및 우측 입구는 미디어만을 포...

개발에 집단 세포 이동, 상처 치유, 그리고 암 전이 종종 성장 인자 또는 신호 분자의 그라데이션에 의해 유도. 여기에 설명된 견인 현미경과 미세 유체 시스템을 결합한 실험 시스템과 생화학 구이도하에서 집단 이동의 역학을 정량화하는 방법에 대한 데모입니다.

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

집단 세포 이동은 종종 신호 분자의 그라데이션에 의해 유도됩니다. 이 비디오에서는 생화학 적 그라데이션에 의해 유도되는 집단 이동 중에 세포력을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 그래서, 우리는 견인 현미경 검사법과 미세 유체 칩을 통합, 우리는 생화학 적 그라데이션을 생성하기 위해 미세 유체 칩을 사용하고, 우리는 세포 힘을 측정하기 위해 견인 현미경 을 사용합니다.내 실험실에서 포스트라드인 장환석 박사가 그 절차를 시연할 예정이다. 기본 탄성 중합체 및 경화제를 10 대 1의 비율로 혼합하여 PDMS 솔루션을 준비하십시오. 50 밀리리터 원내 튜브에 베이스 엘라스토머 15밀리리터를 넣고 1.5 밀리리터의 경화제를 추가합니다.이 튜브 중 두 개를 준비합니다. 196 시간 g에서 원심분리하기 전에 5 분 동안 PDMS 혼합물을 소용돌이하여 거품을 제거합니다. PDMS 스텐실을 제조하려면, PDMS가 SU-8 기둥의 측면에 닿지 않도록 SU-8 패턴 영역을 피하면서 웨이퍼에 PDMS 혼합물의 약 1 밀리리터를 부어 주어 그러나 SU-8 패턴의 상단은 아닙니다.실온에서 30분 이상 평평한 표면에 웨이퍼를 놓고 2시간 이상 섭씨 80도의 건조한 오븐에서 PDMS를 치료합니다. SU-8 금형에서 PDMS를 조심스럽게 벗겨내고 14mm 중공 펀치를 사용하여 얇은 PDMS 멤브레인을 다듬습니다. PDMS 스텐실을 오토클레이브하기 전에 스티커 테이프를 사용하여 PDMS 조각 표면의 먼지를 제거합니다.PDMS 마이크로 채널을 제작하려면 SU-8 금형에 약 30 밀리리터의 PDMS 혼합물을 붓습니다. 진공 챔버에서 30 분 동안 가스를 드린 다음 2 시간 이상 섭씨 80도에서 건조한 오븐에서 PDMS를 치료하십시오. SU-8 금형에서 PDMS를 조심스럽게 벗겨내고 PDMS를 24mm 크기로 24밀리미터 로 자른다.각 PDMS 블록에서 1mm 생검 펀치를 사용하여 콘센트 1개와 3개의 입구를 만듭니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유리 슬라이드를 제조하고 격리합니다. 바인드 시레인 용액의 100 마이크로리터로 아래 유리의 가장자리 표면을 덮습니다.1 시간 동안 실온에서 유리를 떠난 후, 탈이온 된 물로 유리를 세 번 헹구는 다. 그런 다음 유리가 주변 공기 온도에서 또는 압축 공기를 불어 건조하게하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 폴리아크릴아미드 젤 용액을 준비한다.그런 다음 혼합 젤 용액 10 마이크로리터를 직사각형 마이크로웰에 옮기고 원형 커버 슬립을 위에 놓습니다. 사용자 정의 유리, 젤 용액의 조립을 고정하고, 끈적 끈적한 테이프로 6 웰 플레이트의 표지에 커버 슬립을 고정하고 뒤집습니다. 그런 다음 원심분리기는 96배 g에서 10분 동안 원심분리기를 사용하여 형광 입자를 폴리아크릴아미드 젤의 상부 층으로 가져옵니다.원심분리기에서 어셈블리를 제거하고 덮개 가느리를 아래로 향하여 평평한 표면에 놓습니다. 30분 후 조립을 뒤집어 35mm 페트리 접시에 놓습니다. 식수 2밀리리터로 접시를 채웁니다.집게를 사용하여 커버 슬립을 한쪽으로 밀어 부드럽게 제거합니다. 폴리아크릴아미드 젤에 콜라겐을 코딩하려면 밀리리터 설포-SANPAH당 1밀리그램을 따뜻한 50밀리마일헤르 HEPES 버퍼에 녹입니다. 용액 200마이크로리터를 젤 표면에 떨어뜨리고 UV 광으로 10분 동안 활성화합니다.UV 활성화에 따라 0.1 대구 헤페스 버퍼로 젤을 두 번 헹구고 PBS로 한 번 헹구는 다. 하룻밤 사이에 콜라겐 용액으로 폴리아크릴아미드 젤을 코드로 보관하십시오. 다음 날, PBS로 젤을 세 번 씻으시면 됩니다.F-127 솔루션에 오토클레이브 PDMS 스텐실을 침수합니다. 섭씨 37도 인큐베이터에 1시간 동안 보관하십시오. PDMS 스텐실을 PBS로 세 번 세척하고 PDMS 스텐실과 폴리아크릴아미드 젤 모두에서 액체를 제거합니다.그런 다음 PDMS 스텐실을 폴리아크릴아미드 젤에 놓고 스텐실에 PBS를 추가합니다. 부드럽게 파이프를 통해 PDMS 스텐실 구멍의 거품을 제거합니다. 거품을 제거한 후 PDMS 스텐실 표면에서 PBS를 지웁울 수 있습니다.이제 세포 용액의 200 마이크로리터를 PDMS 스텐실에 추가하고 세포가 폴리 아크릴아미드 젤에 부착되도록 1 시간 동안 인큐베이터에 젤을 배치합니다. 인큐베이션에 따라 세포 배양 배지로 세포 용액을 부드럽게 씻어 내고 세포 배양 매체를 더 추가합니다. PDMS 스텐실을 제거하고 현미경으로 세포 섬의 형성을 확인하십시오.다음으로, 30초 동안 PDMS 마이크로채널의 표면을 산소 플라즈마로 처리한다. 폴리아크릴아미드 젤로 채워진 바닥 유리상의 유체를 제거한 후, PDMS 마이크로채널을 하단 유리 위에 놓고 맞춤형 유리 홀더에 어셈블리를 놓습니다. 세포 배양 배지로 마이크로채널을 채웁니다.통합 된 미세 유체 시스템의 입구 튜브를 준비하려면 트리밍 된 바늘과 30 센티미터 미니 볼륨 라인을 3 방향 스톱콕과 연결합니다. 이러한 준비 중 세 가지를 준비합니다. 아울렛 튜빙의 경우, 트리밍 된 바늘과 75 센티미터 미니 볼륨 라인을 3 방향 스톱콕과 연결하십시오.튜브 라인을 1시간 동안 예열된 매체로 채웁니다. 주사기에서 플런거를 제거하고 입구 튜브 라인을 연결하여 저수지를 준비합니다. 각 튜브 라인의 바늘 커넥터를 미세 유체 장치의 세 개의 입구와 하나의 콘센트에 연결합니다.각 저장소에 신선한 중간 또는 조건된 매체의 3밀리리터를 채웁니다. 그라데이션 테스트를 위해, 좌측 입구 저장소를 밀리리터 간세포 성장 인자, 또는 HGF당 20 나노그램으로 채우는 세포 배양 배지에 있다. 농도 그라데이션의 시각화를 위해 왼쪽 입구 저장소에 형광 염료밀리리터 당 200 마이크로그램을 추가합니다.콘센트 튜빙 라인을 주사기 펌프에 연결합니다. 기존의 상피 현미경의 단계에 통합 된 미세 유체 시스템을 배치합니다. 인큐베이터에 보관된 자동화된 현미경을 사용하여 최대 24시간 동안 10분마다 이미지를 찍습니다.매 번 세포 이동을 시각화하는 상 영상, 젤에 내장된 형광구를 시각화하는 녹색 형광화상, 화학 물질의 농도 그라데이션을 시각화하는 적색 형광 화상 등 3개의 다른 채널에서 4X 목표 렌즈를 사용하여 일련의 이미지를 취합니다. 시간 경과 영상을 촬영한 후 0.25%의 트립신-EDTA 용액을 마이크로 채널에 주입하여 폴리아크릴라미드 젤에서 세포를 분리합니다. 젤에서 세포를 완전히 제거하면 녹색 형광 이미지를 사용하여 견인력 현미경 검사법을 위한 기준 이미지로 사용하십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 진행합니다. 수축력과 세포간 스트레스를 측정하기 위해 견인 현미경 검사법과 단층 스트레스 현미경 검사법은 미세 유체 채널과 결합되었습니다. 지도는 차가운 색상을 사용하여 따뜻한 색상과 안쪽 견인을 사용하여 외부 견인과 라디오 조정에 플롯되었다.제로 시, 모든 섬은 가장자리에 강한 내부 견인과 섬 내에서 변동유사한 견인 분포를 보였다. 후 10 HGF 그라데이션을 적용 의 시간, 섬 확장의 정도는 각 열에서 다른 동안, 견인 분포는 주로 시간 제로와 유사했다. 평균 견인력은 10시간 동안 변경되지 않았습니다.그러나 단층 응스트레스를 계산할 때 각 열은 서로 다른 추세를 보였습니다. HGF 농도가 낮은 곳, 섬 내평균 긴장 주위 유지 되었다 200 10 시간 기간 동안 파스칼. HGF 농도가 높았던 곳에서는 섬 내의 평균 장력이 230파스칼에서 10시간 동안 100파스칼로 점차 감소했습니다.HGF 농도가 왼쪽 절반에 높고 섬의 오른쪽 절반에 낮은 곳, 평균 긴장 주위 유지 되었다 150 파스칼. 미세 유체 채널을 채우는 것은 온화해야합니다. 동시에 마이크로 모의 세포 섬을 방해하지 않으면서 채널에 갇혀 거품을 제거하는 것이 중요합니다.이 통합 시스템을 사용하여 세포 집단이 화학 요법 이나 성장 인자와 같은 다양한 화학 적 그라데이션에 기계적으로 반응하는 방법을 조사 할 수 있습니다. 이 플랫폼은 재생, 암 전이 및 개발을 이해하는 열쇠인 화학 적 그라데이션하에서 집단 세포 이동의 역학을 더 탐구하는 데 도움이 될 것입니다.

traction-microscopy-integrated-with-microfluidics-for-chemotactic

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

전단 흐름 내의 곳곳에 영양 씨스 케이프와 박테리아의 수영 동작 이내에 해양 미생물의 chemotactic 식량 약탈을 배워 동작을 공부를위한 microfluidic 채널과 실험에서 구현의 제조가 설명되어 있습니다.

마이크로 스케일 영양소 레이어에 해양 미생물의 Chemotactic 응답

Microfluidics를 사용하여 세균 Chemotaxis의 연구 - 인터뷰

이 프로토콜은 chemoeffectors의 안정적인 농도 기울기에 박테리아 chemotaxis 조사를위한 microfluidic 장치의 개발을 설명합니다.

안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

암 줄기 세포 이주를 조사하기위한 compartmentalizing 마이크로 유체 장치가 설명되어 있습니다. 이 소설 플랫폼은 가능한 세포 microenvironment를 생성 및 라이브 세포 운동의 미세 시각화 할 수 있습니다. 높은 운동성 암 세포는 잠재적으로보다 효과적인 미래의 치료로 이어지는 공격적인 침투 분자 메커니즘을 공부 절연되어 있습니다.

Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

출처: Scheidweiler, D. 외. 유체 장치와 현미경 및 유동 세포분석을 결합하여 공간적 규모를 넘어 다공성 배지 내 미생물 수송을 연구합니다. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 무작위로 배열된 기둥들로 구성된 다공성 매트릭스를 통해 박테리아의 운동성을 정량화하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 형광 표지된 박테리아를 장치에 투입하고, 다공성 매트릭스를 통과해 관찰 채널로 이동하는 동안 현미경으로 영상화한 후 분석하여 돌파 곡선(BTC)을 생성합니다.

마이크로플루이딕 장치를 이용한 박테리아 운동성 평가

라이브 셀 마이그레이션 연구에 대한 현미경 챔버의 접착제 및 가용성 그라디언트의 조립 방법이 설명되어 있습니다. 엔지니어링 환경 솔루션 기울기와 antifouling 표면과 접착제 트랙을 결합하기 때문에 하나가지도 단서의 상대적 중요성을 확인할 수 있습니다.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

일차원 국한 미세 환경에서 세포의 자발적인 이동을 연구하는 정량적 방법이 설명된다. 이 방법은 미세 채널을 활용하고 번의 실험에서 서로 다른 조건 하에서 세포의 다수의 이동을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

미세 채널에서 세포의 이동에 관한 연구

세포 이동은 인간의 발달과 생활에서 중요한 부분을 차지합니다. 세포 이동을 변경할 수 있는 메커니즘을 이해하기 위해 3D 콜라겐 매트릭스에서 화학주성을 조사할 수 있는 평면 구배 확산 시스템을 제시하여 기존 분석법의 최신 확산 챔버 한계를 극복할 수 있습니다.

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

여기에서 우리는 화학 전술 보완 C5a 구배를 이미지 마우스 상주 복막 대식세포에 시간 경과, 위상 대조 현미경 검사법을 사용하여 방법을 설명합니다. 프로토콜은 그밖 면역 세포로 확장될 수 있습니다.

마우스 대식세포 화학의 시간 경과 화상 진찰

여기에 제시된 것은 환경에서 직접 미생물 행동의 연구를 가능하게 하는 최근 개발된 미세 유체 장치인 시투 화학분석분석의 프로토콜이다.

수생 생태계에서 미생물 행동을 검사하는 시투 화학 분석분석

학습하세요 화학적 그라디언트 하에서 세포 집단 이동 시 세포 힘을 정량화하는 미세유체 견인 현미경법. 이 방법은 재생 및 암 전이 연구에 활용됩니다.

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

더 많은 동영상 탐색