Name: 시험관 내 및 실리코 방법을 사용한 그룹 IV 바이러스 성 SSHHPS 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 배우세요 그룹 IV 바이러스의 SSHHPS를 시험관 내 및 실리코 방법으로 분석하는 기술을. 바이러스 프로테아제가 면역 반응 관련 숙주 단백질을 절단하는 메커니즘을 규명하여 새로운 항바이러스 치료법 개발에 기여합니다.

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이 작품은 국방 위협 감소 기관 (DTRA) 프로젝트 번호 CB-SEED-SEED09-2-0061 및 CBCall4-CBM-05-2-0019에 의해 지원되었다, NCATS의 교내 / 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로, NIH (XH) 및 해군 연구소 기지 기금.

여기에 표현 된 의견은 저자의 의견이며 미국 해군, 미국 육군, 미국 국방부 또는 미국 정부의 의견을 대표하지 않습니다.

외래 서열에 의해 유도된 단백질 또는 핵산의 서열 특이적 파괴는 생물학에서 단지 몇몇 경우에 볼 수 있다. 그림 1에 표시된 메커니즘은 호스트를 바이러스또는 호스트로부터 바이러스로부터 보호하는 방어 메커니즘입니다.
생물 정보학 방법을 사용하여 우리는 이러한 시스템에 의해 파괴되는 대상을 식별 할 수 있습니다. SSHHP 서열의 우리의 분석에서, 우리는 그(것)들의 많은 것이 타고난 면역 반응을 생성하는 데 필요한 단백질에서 찾아낼 수 있었다는 것을 것을을 발견했습니다. 일부는 MAVS 및 TRIF (TIR 도메인 함유 어댑터 -유도 인터페론-β)와 같은 명백한 역할을 가지고 있었고, 다른 것들은 더 복잡한 메커니즘 (예를 들어, 히스톤 H3, SFRP1, FOXG1)8,9. SSHHP 서열에 저장된 표적 정보는 이러한 바이러스에 대한 항 바이러스 효과가있는 경로를 식별 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 생체 내에서 항 바이러스 반응은 종종 바이러스 특이적26,43. 예를 들어, TRIM 단백질의 서브세트는 상이한 바이러스에 대한 항바이러스 효과를가지며, 43,44,45,일부는 바이러스 제한 인자(예를 들어, HIV 및 TRIM5α)이다. TRIM 단백질의 특이성 (~70이 확인됨)은 여전히44,45로조사되고 있다. SSHHPS 내의 정보는 이 바이러스가 타고난 면역 반응을 회피하는 방법의 우리의 이해에 기여할 수 있습니다. 더 많은 SSHHPS를 검사함에 따라 다른 패턴과 상관 관계가 발견될 수 있습니다.
종별 차이는 우리의 분석에서 명백하였다(그림 2, 그림 10). 이 바이러스는 그 외 보다는 몇몇 종에 더 많은 영향을 미치기 위하여 알려지고 있습니다. 호스트 범위, 호스트 감수성 및 호스트 방어에 대한 정보는 SSHHPS 내에 있을 수 있습니다. 예를 들면, 말, 말 뇌염 바이러스에 가장 영향을 받기 쉬운 종은, VEEV nsP2 프로테아제에 의해 일시적으로 절단된 인간 TRIM14의 지구를 결여했습니다. 인간은 VEEV 감염에서 거의 정지하지 않습니다 그러나24를감염될 수 있습니다. 인간 TRIM14 단백질은 nsP2 프로테아제 절단 서열6을운반하였다. 분열 사이트의 존재는 인간이 바이러스에 대하여 방어 기계장치가 있다는 것을 건의합니다. 조류는 이러한 바이러스46의잠재적 인 저수지로 생각되었다. 닭으로부터의 TRIM14 단백질에서 상응하는 SSHHP 서열은 인간 및 다른 종에서 발견되는 서열과 달랐다. 이와 같은 미묘한 차이는 표적 숙주 단백질을 더 쉽게 갈라놓을 수 있습니다. Aguirre등.16 뎅기열 바이러스 감염 후 IFN의 상부를 유도하는 삼촌 돌연변이 STRING 단백질과 그 마우스가 자연스럽게 뎅기열 ns2B3 프로테아제에 의해 절단되지 않는 STING의 버전을 운반하는 것으로 나타났다. 뮤린 스팅 단백질은 ZIKV 프로테아제47에의해 절단되지 않았다. 우리의 SSHHPS 분석에서, 우리는 또한 설치류의 것과 인간 단백질을 비교할 때 ZIKV 프로테아제 절단 부위 서열의 차이를 관찰했습니다(그림10D). 숙주 단백질의 종특이적 단백질용해 분열을 재현하는 것은 그룹 IV 바이러스에 사용되는 동물 모델에서 중요할 수 있다. 숙주 단백질 절단의 억제는 또한 그룹 IV 프로테아제 억제제의 발달에 관하여 연루가 있다. 우리의 이전 간행물에서, 우리는 우리가 CA074 메틸 에스테르6를사용하여 VEEV nsP2 프로테아제에 의해 TRIM14 절단을 억제 할 수 있음을 보여 주었다. 이 결과는 이러한 프로테아제의 소분자 억제제가 감염을 억제할 수 있는 선천적인 면역 반응을 조절할 수 있음을 시사한다6,31.
종 내의 유전 적 변이는 또한 단백질 분석 분열의 차이를 생성 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 코돈 사용에 미묘한 차이 리보솜 일시 중지에 영향을 미칠 수있습니다 48. 몇몇 그룹 IV 바이러스성 proteases는 ER 막에 포함되기 때문에, 이 일시 정지에 있는 다름은 절단이 공동 번역으로 생기는 경우에 표적의 절단에 영향을 미칠 수 있었습니다. 우리가 확인한 분열 부위 중 일부는 예측된 신호 펩티드 서열(예를 들어, SFRP1)에 있었고, 다른 부위는 내부에 있었다.
SSHHPS 분석은 숙주 단백질 분석의 다른 방법과 다른 정보를 생성할 수 있습니다. SSHHPS 분석은 저렴하고 사용하기 쉬웠습니다. 세균 발현 시스템의 사용은 포유류 세포 배양을 사용하지 않고 포유류 서열의 짧은 세그먼트 (~25 아미노산)의 테스트를 허용했다. 우리는 CFP-YFP 기질이 시험된 인간 단백질 서열을 모두 견딜 수 있었다는 것을 발견했습니다; 그러나 수익률은 다양했습니다. 유사한 분석에서, 인간 단백질 서열을 함유하는 기질은 63개의 아미노산이 성공적으로 발현, 정제되고, 운동분석 및 억제제스크리닝49,50,51에활용되었다. 불연속 분석에 소량의 기판만 필요하기 때문에 많은 수의 표적을 탐색할 수 있습니다. 시스템의 한 가지 장점은 CFP/YFP 기판을 SDS-PAGE 분석 및 보다 정교한 운동 분석(예: IC50,Ki,Km,Vmax)에사용할 수 있다는 것입니다. 약물 발견을 위해, 억제 화합물은 형광 성 검사에서 유물을 생성 할 수 있습니다. 따라서, 연속 적인 분석과 결합된 불연속 분석법은 분열의 분열 또는 억제를 확인할 수 있게 한다. 불연속 SDS-PAGE 분석에 대한 샘플은 96웰 플레이트에서 직접 채취할 수 있습니다. CFP/YFP 기판은 화합물 라이브러리스크리닝(52)에사용되어 왔다. 그러나, 기판이 Z-factor53의계산과 같은 높은 처리량 스크리닝에 적합한지 여부를 결정하기 위해 추가적인 분석이 요구된다.
기판을 설계하는 한 가지 과제는 프로테아제에 의해 결합되고 인식되는 가위 결합 주위의 영역을 식별하는 것입니다. 여기에 표시된 예에서, 우리는 가위 결합을 중심으로 12 잔류 물 서열로 시작했다. 가위성 결합의 잔기 N-말단에 대한 골짜기 부위의 서열 정렬을 분석한 후 VEEV 프로테아제에 대해 발견되었으며, 반면 에 대한 ZIKV 프로테아제 상동성은 여러 C-말단 잔기로 발견되었다. 도킹된 기판의 실리코 모델은 기판의 결합 부위를 프로브하는 부위 지향 돌연변이 생성 실험을 설계하는데 사용될 수 있다. 기질 및 효소 서열이 플라스미드에 있기 때문에, 실리코 모델 또는 하위 사이트 내성에서 시험하기 위해 돌연변이될 수 있다. 이는 결합된 기판의 결정 구조를 사용할 수 없는 경우에 유리할 수 있다.
SSHHPS 분석은 또한 바이러스 유도표현형이 바이러스 효소에 의해 생성되는 기계장치에 관하여 새로운 정보를 산출할 수 있습니다. ZIKV 표적 중 하나인 SFRP1은 Wnt 신호 경로의 일부이며 뇌와 눈 발달 및 면역 반응36,37,54,55,56,57에서역할을 합니다. 우리는 ZIKV ns2B/ns3 프로테아제에 의해 절단될 수 있던 그밖 단백질 순서가 두뇌와 눈 발달에서 관련시킨 단백질에서 또한 이었다는 것을 것을을 발견했습니다; 둘 다에 있는 이상은 선천적인 Zika 증후군에서 관찰되고 바이러스 유도한 표현형58의일부인 것으로 생각됩니다.
호스트 병원체 상호 작용의 예측 가능성은 다양한 응용 프로그램에 대해 악용 될 수있다: 표적 특정 용해 바이러스 치료; 라이브 바이러스 백신의 위험 제거; 동물 모델의 정제, 예측 또는 선택; 호스트 범위 또는 감수성의 예측; 동물 유행 사건의 예측; 호스트 방어의 예측. 설명된 메서드는 시퀀스 기반이므로 나중에 소프트웨어에 통합하는 것이 좋습니다.

바이러스에서 호스트로 또는 호스트에서 바이러스로의 수평 유전자 전달의 증거는 다양한 게놈1,2,3,4에서찾을 수 있습니다. 바이러스 내인성화의 예는 세균 숙주 게놈4에서발견되는 CRISPR 스페이서 서열이다. 최근에, 우리는 (+)ssRNA 그룹 IV 바이러스의 비구조적 다단백질에 내장된 숙주 단백질 서열의 증거를 발견했다. 바이러스 게놈의 코딩 영역 내에서 이러한 서열은 세대적으로 전파될 수 있다. 상동 숙주-병원체 단백질 서열(SSHHPS)의 짧은 스트레칭은 바이러스 및 숙주5,6에서발견된다. SSHHPS는 특정 숙주 단백질에 대한 상동성을 가지는 바이러스 성 프로테아제에 의해 인식된 보존된 분열 부위 모티프 서열이다. 이 서열은 특정 숙주 단백질의 파괴를 지시합니다.
우리의 이전 간행물6에서,우리는 바이러스 성 프로테아제에 의해 표적으로 된 모든 숙주 단백질의 목록을 컴파일하고 표적의 목록이 무작위가 아닌 것을 발견했습니다(표 1). 두 가지 추세가 분명했다. 먼저, 숙주 단백질을 절단하는 대부분의 바이러스 성 프로테아제는 그룹 IV 바이러스(25건 중 24건 중 24개 그룹 IV 바이러스 프로테아제)에 속하며, 1개의 프로테아제는 (+)ssRNA 그룹 VI 레트로바이러스(HIV, 인간 면역 결핍바이러스)에속한다. 7. 둘째, 바이러스 성 프로테아제에 의해 절단되는 숙주 단백질 표적은 일반적으로 분열이 숙주의 면역 반응을 길항하기 위한 것이었다는 것을 시사하는 선천적인 면역 반응을 생성하는데 관여했다. 바이러스 성 프로테아제에 의해 표적화된 숙주 단백질의 절반은 인터페론(IFN) 및 전염증성 사이토카인을 생성하는 시그널링 캐스케이드의 공지된 성분이었다(표1). 다른 사람들은 숙주 세포 전사8,9,10 또는 번역11에관여했다. 흥미롭게도, Shmakov 외4 많은 CRISPR 프로토스페이서 서열이 플라스미드 컨쥬게이션 또는복제에관여하는 유전자에 대응하는 것으로 나타났다 4.
그룹 IV에는 플라비리대, 피코나비리대, 코로나비리대, 칼시비리대, 토가비리대등이 포함됩니다. 몇몇 새로운 신흥 병원체는 Zika 바이러스 (ZIKV), 서쪽 나일강 (WNV), Chikungunya (CHIKV), 가혹한 심각한 호흡 증후군 바이러스 (SARS) 및 중동 호흡기 증후군 바이러스 (MERS)와 같은 그룹 IV에 속합니다. (+)ssRNA 게놈은 본질적으로 mRNA의 한 조각이다. 게놈 복제에 필요한 효소를 생성하기 위해, (+)ssRNA 게놈을 먼저 번역해야 한다. 알파바이러스 및 기타 그룹 IV 바이러스에서 복제에 필요한 효소는 단일 다단백질(즉, VEEV를 위한 nsP1234)에서 생성됩니다. 비구조적 다단백체(nsP)는 nsP2 프로테아제에 의해 프로테올리스 처리(nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4)로 활성효소를 생성한다(도1). nsP2 프로테아제에 의한 다단백질의 분열은 바이러스 복제에 필수적이다; 이는 nsP2 프로테아제13,14의활성 부위 시스테인의 결실 및 부위 지시 돌연변이 발생에 의해 입증되었다. 특히, 바이러스 성 단백질의 번역은 게놈 복제 사건을 선행합니다. 예를 들어, nsP4는 (+)ssRNA 게놈을 복제하는 데 필요한 RNA 의존성 RNA 폴리머라제를 함유한다. 게놈 복제는 dsRNA 중간을 생성할 수 있습니다; 이 중간체는 호스트의 타고난 면역 반응을 시작할 수 있습니다. 따라서, 이들 바이러스는 그들의 효과를 억제하기 위해 감염 초기에 숙주 면역 반응단백질을 15,16,17로갈라놓을 수 있다.
침묵은 DNA, RNA 및 단백질 의 수준에서 생길 수 있습니다. 도 1에 나타난 각 침묵 기전에서 공통되는 것은 짧은 외래 DNA, RNA 또는 단백질 서열이 그들의 기능을 길항하기 위해 특정 표적의 파괴를 유도하는 데 사용된다는 것입니다. 침묵 메커니즘은 세 가지 다른 언어로 작성된 "검색 및 삭제" 프로그램과 유사합니다. 짧은 분열 사이트 시퀀스는 "키워드"와 유사합니다. 각 프로그램에는 삭제할 "파일"의 짧은 시퀀스("키워드")와 단어 간의 일치를 인식하는 효소가 있습니다. 일치하는 것이 발견되면 효소는 더 큰 표적 서열을 잘라내게 됩니다("삭제"). 그림 1에 표시된 세 가지 메커니즘은 호스트를 바이러스로부터 방어하거나 호스트의 면역 체계로부터 바이러스를 방어하는 데 사용됩니다.
바이러스 성 프로테아제는 ~ 2-11 아미노산 사이의 짧은 절단 부위 모티프 서열을 인식; 뉴클레오티드에서, 이것은 6-33 염기와 일치합니다. 비교를 위해, CRISPR 스페이서 서열은 ~26-72 뉴클레오티드 및 RNAi는 ~20-22 뉴클레오티드18,19이다. 이러한 서열은 비교적 짧지만 구체적으로 인식할 수 있습니다. 아미노산의 높은 다양성을 감안할 때, 무작위 분열 이벤트의 확률은 6-8 아미노산 이상 단백질 서열을 인식하는 바이러스 성 프로테아제에 대해 상대적으로 낮다. 숙주 단백질에서 SSHHPS의 예측은 주로 검사되는 바이러스 성 단백질의 특이성에 달려 있습니다. 프로테아제에 엄격한 서열 특이성 요구 사항이 있는 경우, 분열 부위 서열을 찾을 확률은 6,400만 개에1/20 6 = 1/208 = 1 에서 256억; 그러나 대부분의 프로테아제에는 가변 하위 사이트 허용 오차가 있습니다(예: R 또는 K는 S1 사이트에서 허용될 수 있음). 따라서 호스트에서 발견된 서열과 바이러스 간의 서열 ID에 대한 요구 사항은 없습니다. 느슨한 서열 요구 사항이 있는 바이러스 성 프로테아제의 경우(예: 피코나비리대에 속하는 것) 숙주 단백질에서 분열 부위를 찾을 확률이 더 높을 수 있다. 표 1의 많은 항목은 피코나비리대 가족입니다.
Schechter & Berger 표기법20은 일반적으로 프로테아제 기판 및 이들이 결합하는 서브사이트에서 잔기를 기술하는 데 사용되며, 우리는 이 표기법 전반에 걸쳐 활용한다. 가위 결합의 N-말단인 기판내의 잔기는 P3-P2-P1로 표시되고 C-단말은 P1'-P2'-P3'로 표시된다. 이들 아미노산 잔기와 결합하는 프로테아제의 상응하는 하위 부위는 각각 S3-S2-S1 및 S1'-S2'-S3'입니다.
어떤 숙주 단백질이 표적으로 되고 있는지 결정하기 위하여는, 우리는 바이러스성 다단백질 분열 사이트에 있는 SSHHPS를 확인하고 그(것)들을 포함하는 호스트 단백질을 검색할 수 있습니다. 본 명세서에서, 우리는 공지된 바이러스 성 프로테아제 절단 부위 서열을 사용하여 SSHHPS를 식별하기 위한 절차를 간략하게 설명한다. 생물정보학 방법, 프로테아제 검법 및 기재된 실리코 방법에서 세포 기반 검법과 함께 사용되기 위한 것이다.
바이러스 성 프로테아제에 의해 표적으로 한 숙주 단백질의 서열 정렬은 이 짧은 분열 사이트 서열 내의 종 특정 다름을 밝혔습니다. 예를 들어, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) nsP2 프로테아제는 인간 TRIM14, 삼자모티프(TRIM) 단백질6을절단하는 것으로 나타났다. 일부 TRIM 단백질은 바이러스 제한 인자(예를 들어, TRIM5α21)이며,대부분은 유비퀴틴 E3 리가제인 것으로 생각된다. TRIM14는 링 (정말 흥미로운 새로운 유전자) 도메인이 부족하고 E3 ligase22로생각되지 않습니다. TRIM14는 미토콘드리아 항바이러스 신호(MAVS)22에서어댑터로 제안되었으나, 다른 항바이러스 기능을 가질 수있다(23). 다양한 종에서 TRIM14 서열의 정렬은 말절단 사이트가 부족하고 C 말단 PRY / SPRY 도메인이 누락 된 TRIM14의 잘린 버전을 항구 것을 보여줍니다. 이 도메인에는 폴리유비퀴틴화 사이트가 포함되어있습니다(그림 2). 말에서, 이 바이러스는 높게 치명적입니다 (~20-80% 사망) 반면 인간에서는 단지 ~1% VEEV 감염에서정지24. PRY/SPRY 도메인의 분열은 MAVS 시그널링 캐스케이드를 일시적으로 단락시킬 수 있다. 이 캐스케이드는 dsRNA에 의해 시작될 수 있고 인터페론 및 프로 염증성 사이토카인의 생산으로 이끌어 냅니다. 따라서, SSHHPS의 존재는 어떤 종들이 특정 그룹 IV 바이러스에 대한 방어 시스템을 가지고 있는지 예측하는데 유용할 수 있다.
그룹 IV 바이러스에서, IFN 길항 메커니즘은25를곱하는 것으로 생각된다. 숙주 단백질 절단은 감염 도중 일시적일 수 있고 사격량은 시간이 지남에 복구할 수 있습니다. 우리는 TRIM14 분열 제품이 프로테아제 (cytomegalovirus 프로모터)를 코딩하는 플라스미드와 함께 형질감염 (6 시간) 후에 아주 일찍 검출될 수 있었다는 것을 세포에서 찾아냈습니다. 그러나, 더 긴 기간에, 분열 제품은 검출되지 않았습니다. 바이러스에 감염된 세포에서는, 역학은 달랐고 분열 제품은 6-48 h6사이에서 검출될 수 있었습니다. 그 외는 3-6 시간 포스트 감염9,11로일찌기 호스트 단백질 분열 제품의 외관을 보고했습니다.
세포에서 의 체액 활성은 종종 잡기 어렵다; 분열 제품은 용해도, 집중력, 안정성 및 수명이 다를 수 있습니다. 세포 기반 세포 기반 세포 에서, 절단 제품이 세포에 축적되거나 절단 된 단백질의 밴드 강도가 매우 빠르게 저하 될 수 있으며 예상 분자량 (MW)에서 서양 얼룩에서 검출되지 않을 수 있으므로 보상 증가 및 감소를 보일 것이라고 가정 할 수 없습니다 (예를 들어, epitope를 포함하는 영역은 다른 숙주 protins에 의해 절단 될 수 있음). 바이러스 성 프로테아제의 기질이 선천적인 면역 반응 단백질인 경우, 감염 시 농도가 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 선천성 면역 반응 단백질은 바이러스 감염 이전에 존재하며 인터페론26에의해 추가로 유도된다. 표적 단백질의 농도는 감염 시 변동될 수 있으며 감염되지 않은 세포 와 감염된 세포 리세이스의 비교는 해석하기 어려울 수 있다. 추가적으로, 모든 세포는 균일하게 형질 감염되거나 감염되지 않을 수 있습니다. 반면에 대장균에서 정제된 단백질을 이용한 시험관내 프로테아제 분석실험은 면역혈전이 아닌 SDS-PAGE를 사용하여 조절할 수 있는 변수가 적다. 오염 프로테아제는 CFP/YFP 기판의 단백질 정제의 초기 단계에서 억제될 수 있으며, 돌연변이된 바이러스 성 프로테아제는 분열이 바이러스 성 프로테아제 또는 오염된 세균 성 프로테아제 때문인지 를 결정하기 위한 대조군으로서 정제 및 테스트될 수 있다.
시험관 내 프로테아제 시험법의 한 가지 제한은 포유류 세포의 복잡성이 부족하다는 것입니다. 효소가 기판을 절단하려면 두 가지를 공동 국소화해야 합니다. 그룹 IV 바이러스 성 프로테아제는 구조 및 국소화가 다릅니다. 예를 들어, ZIKV 프로테아제는 소포체(ER) 막에 내장되어 시토솔을 마주하는 반면, VEEV nsP2 프로테아제는 세포질 및핵(27)에서용해성 단백질이다. ZIKV SSHHPS 분석에서 발견된 일부 절단 부위 서열은 일부 표적에 대해 공동 번역으로 발생할 수 있음을 시사하는 신호 펩티드에 있었다. 따라서, 세포 내의 프로테아제 및 기판의 위치또한 이러한 분석에서 고려될 필요가 있다.
세포 기반 세포 계 검사는 감염에서 확인된 숙주 단백질(들)에 대한 역할을 확립하는 데 유용할 수 있다. 프로테아제 억제제6 또는 돌연변이를 숙주표적(16)에 첨가하는 것과 같은 숙주 단백질의 바이러스 성 프로테아제 절단을 중단시키는 것을 목표로 하는 방법은 바이러스 복제에 대한 그들의 효과를 조사하기 위해 사용될 수 있다. 표적 단백질의 과발현은 또한 바이러스 복제에 영향을 미칠 수 있다28. 플라크 검사 또는 다른 방법은 바이러스 복제를 정량화하는 데 사용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>250 mL 삼각 플라스크</td><td>VWR</td><td>89000-362</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>아크로스 유기물(피셔)</td><td>125472500</td><td>위험: 급성 독성. 연기를 흡입하지 않도록 후드에 있는 병을 엽니다.</td></tr><tr><td>4 L Pyrex 와이드 마우스 눈금 삼각 플라스크, 나사 캡 포함</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS49954L-1EA</td><td></td></tr>, <tr><td>AKTA Prime Plus</td>, <td>GE Healthcare</td><td>17-0729-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTA XK 16/20 Column</td>, <td>GE Healthcare</td><td>28988937</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 원심 필터 장치</td>, <td>Millipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 원심 필터 장치</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 원심 필터 장치</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>위험: 알레르기 반응(피부 또는 호흡).</td></tr><tr><td>킬레이트 세파로스 패스트 플로우</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0575-02</td><td>수지가 0.2M 니켈 설페이트로 평형을 이루면 텍스트에서 니켈 컬럼으로 참조됩니다. 기둥은 물로 씻은 후 녹색을 띱니다. 열은 buffer와 평형을 이룬 후 파란색을 띱니다.</td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>RPI</td><td>C61000</td><td>위험: 암을 유발할 수 있음.</td></tr><tr><td>코닝 50 mL 원심 분리기 튜브</td><td>코닝</td><td>430828</td><td>제안 : 폴리 프로필렌 튜브는 폴리에틸렌 튜브보다 초음파 처리 중에 균열 가능성이 적습니다</td></tr><tr><td>코닝 96 웰 절반 면적 마이크로 플레이트, 비 바인딩 표면</td><td>코닝</td><td>3993</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜브 클립</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI68011</td><td></td></tr><tr><td>일회용 PD-10 탈염 컬럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td><td>RPI</td><td>D11000-50.0</td><td>경고: 급성 경구 독성; 피부 및 눈 자극</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>투명 뚜껑이 있는 Fisherbrand 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Acros Organics (Fisher)</td><td>15892-0010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H4034-1KG</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>아크로스 유기물</td><td>301870010</td><td>위험 : 독성, 자극성</td></tr><tr><td>IPTG (이소 프로필 베타 ;-D-thiogalactopyranoside)</td> <td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td> <td>420291</td><td>먼지를 흡입하지 마십시오. 눈과 피부와의 접촉을 피하십시오.</td></tr><tr><td>Laemmli 샘플 버퍼</td><td>BIO-RAD</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani Agar</td><td>Fluka (Millipore Sigma)</td> <td>L3027-1KG</td><td>제안 : 액체에 자석 교반기로 오토 클레이브하고 냉각하면서 저어줍니다. 30초 동안 통증 없이 병에 손을 얹을 수 있을 때까지 항생제를 첨가할 때까지 기다립니다.</td></tr><tr><td>Luria Bertani Media</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L4919-5g</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 수직 전기영동 CellGel Box</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Oak Ridge 고속 PPCO 원심분리기 튜브</td><td>Nalgene (Thermo Scientific)</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator</td><td>Eppendorf</td><td>M1335</td><td></td></tr><tr><td>Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>N73-500</td><td>위험: 삼키거나 흡입하면 유해함, 피부 및 눈 자극</td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td><td>C600003</td><td>흡입하거나 삼키면 해로울 수 있습니다. 민감한 사람에게는 피부와 눈에 자극을 일으킬 수 있습니다.</td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td><td>C606003</td><td>흡입하거나 삼키면 유해할 수 있습니다. 민감한 사람에게는 피부와 눈에 자극을 일으킬 수 있습니다.</td></tr><tr><td>pet15b plasmid DNA</td><td>Novagen (Millipore Sigma)</td><td>69661</td><td>GenScript Inc.는 상용 DNA 합성에 사용되었다. pet15b 플라스미드는 CFP/YFP 기질에 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>pet32b</td><td>Novagen (Millipore Sigma)</td><td>69016-3</td><td>pet32b 플라스미드는 시스테인 프로테아제 구조체에 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>피어스 프로테아제 억제제 미니 정제, EDTA-free</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32955</td><td>경고: 피부 부식/자극; 눈 손상</td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td>모델 M5</td><td></td></tr><tr><td>정밀 플러스 단백질 모두 파란색 사전 염색 단백질 표준</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0373</td><td></td></tr><tr><td>단백질 추출 시약</td><td>Novagen (Millipore Sigma)</td><td>70584-4</td><td>BugBuster 또는 Bper (카탈로그 # 78248, ThermoFisher)</td></tr><tr><td>Q-Sepharose Fast Flow</td><td>G.E. Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td>음이온 교환 수지</td></tr><tr><td>RunBlue (12%) 17-well PAGE gels</td><td>Expedeon</td><td>BCG01227</td><td>모든 12% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔을 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td><td>Expedeon</td><td>NXB50500</td><td>50mL를 950mL 탈이온수로 희석하여 1x</td></tr><tr><td>RunBlue Instant Blue Gel을 얻을 수 있습니다. Stain</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td>희석하지 말고 지시에 따라 사용하십시오</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td><td>Branson Ultrasonics (VWR)</td><td>모델 번호 101-063-346R</td><td>Sonicator는 레벨 5</td></tr><tr><td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td><td>Spectrum Labs</td><td>132645T</td><td>투석 튜빙</td></tr><tr><td>SP-Sepharose Fast Flow</td><td>G.E.에서 사용되었습니다. 헬스케어</td><td>17-0729-01</td><td></td></tr><tr><td>소 플라즈마에서 추출한</td> 양이온 교환 수지 트롬빈 <td>시그마</td><td>T6634-500UN</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP152-500</td><td>주의: 눈/피부 자극성</td></tr></tbody></table>

시험관 내 및 실리코 방법을 사용한 그룹 iv 바이러스 성 sshhps 분석

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

알파바이러스 효소는 단일 폴리펩티드에서 합성됩니다. 비구조적 다단백(nsP)은 nsP2 시스테인 프로테아제에 의해 처리되어 바이러스 복제에 필수적인 활성 효소를 생성합니다. 바이러스성 프로테아제는 매우 특이적이고 보존된 분열 부위 모티프 서열(~6-8 아미노산)을 인식한다. 여러 그룹 IV 바이러스에서, nsP 프로테아제(들) 절단 부위 모티프 서열은 선천적인 면역 반응을 생성하는 데 관여하는 특정 숙주 단백질에서 발견될 수 있으며, 경우에 따라 표적 화된 단백질은 바이러스 유발 표현형에 연결되는 것으로 보인다. 이 바이러스는 호스트 단백질의 표적으로 한 파괴를 위한 상동 호스트 병원체 단백질 서열 (SSHHPS)의 짧은 뻗어를 이용합니다. SSHHPS를 식별하기 위해 바이러스 성 프로테아제 절단 부위 모티프 서열을 BLAST로 입력할 수 있고 숙주 게놈(들)을 검색할 수 있다. 분열은 초기에 대장균에서만들어진 정제된 nsP 바이러스 성 프로테아제 및 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기판을 사용하여 시험될 수 있다. FRET 기질은 청색 및 황색 형광 단백질 및 절단 부위 서열(CFP-서열-YFP)을 함유한다. 이러한 프로테아제 분석제는 플레이트 리더에서 지속적으로 사용되거나 SDS-PAGE 겔에서 연속상으로 사용될 수 있다. 결합된 펩티드 기판의 모델은 실리코에서 생성되어 기질 선택 및 돌연변이 발생 연구를 안내할 수 있다. CFP/YFP 기판은 또한 프로테아제 억제제 식별에 활용되었습니다. 이러한 시험관내 및 실리코 방법에서는 표적 숙주 단백질이 바이러스 복제에 영향을 미치는지 확인하기 위해 세포 기반 세포 기반 검사법과 함께 사용될 수 있다.

ZIKV ns2B/3 프로테아제의 SSHHPS 분석은 4개의 숙주 단백질 표적을 확인하였다: FOXG1, SFRP1, 망막 cDNA 라이브러리로부터의 Gs 알파 소부체, NT5M 미토콘드리아 5',3'-뉴클레오티다제(도 10)6. 특히, 다른 방법은 ZIKV 프로테아제의 잠재적인 표적으로 이 단백질을 예측하지 못했습니다. FOXG1 유전자에 있는 돌연변이는 microcephaly와 같은 손상한 발달 및 구조적인 두뇌 이상을 특징으로 하는 선천적인 증후군에 연결되었습니다. SFRP1은 분비된 곱슬머리 관련 단백질(SFRP); 이러한 수용성 수용체는 Wnt 리간드를 경쟁적으로 결합하여 Wnt 신호를 적대하고 억제할 수 있습니다. Wnt 신호 통로는 플라비바이러스 감염36동안 IFN 반응의 조절에 관여한다. SFRP1의 분열은 플라비바이러스 복제를 강화할 것으로 예상됩니다. SFRP1은 또한 Th17 세포분화(37)에관여한다. SSHHPS의 서열 정렬은 분열 부위 서열에서 종별 차이를보였다(도 10D). SFRP1의 분열 부위 서열은 인간과 닭에서 동일하였다; ZIKV는 닭 배아에서 사망률 및 소두증을 유발할 수 있다38. 설치류에서, 고도로 보존된 P1 잔류물 (K/R)R↓G는 글리신(RGG)으로 대체된다. 마우스의 면역 적격 균주는 일반적으로 ZIKV 감염 및 질병39에내성이 있다.
정상 상태 운동 파라미터 및 억제 상수는플레이트리더(31),40,41(도 11A)에서연속 분석기를 사용하여 바이러스 성 다단백 서열 및 숙주 단백질 서열에 대해 측정될 수 있다. 다양한 화합물에 의한 특정 서열의 분열 또는 프로테아제의 억제와 같은 질적 절단 정보의 경우, 불연속 분석제가 사용될 수있다(도 11B).
CFP와 YFP 사이에 잔기의 수를 최적화하는 것이 필요할 수 있습니다. 기판 바운드 모델은 실리코 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. nsP1/nsP2 접합의 대표적인 도킹 모델은 그림 9에나와 있습니다. VEEV nsP2 프로테아제의 경우, 12-아미노산 셈리키 포레스트 바이러스(SFV) 서열의절단(Km= 0.58 mM)(Km=0.58 mM)이33으로보고되었다. 기판 서열을 19, 22 및 25 잔기로 연장하고 완충제의 이온 강도를 감소시켜Km의현저한 감소를 이끌어 냈습니다. VEEV nsP2 결정 구조 및 결정 패킹의 검사는 또한 접합부 중 하나의 일부가 프로테아제 도메인에 대해 포장되고 나선인 것으로 나타났다. 따라서, VEEV 기판이 길수록 이차 구조 모티프의 인식으로 인해 더 잘 결합할 수 있다.
TRIM14의 경우 Km = 21 μM6,33을얻었습니다. 숙주 단백질 서열을 운반하는 기질에 대한Km은 바이러스 성 다단백분열 부위 서열을 포함하는 기판의Km 값과 비교하였다(K m(V12) = 12 μM 및Km(V34)= 21 μM). nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 및 nsP3/nsP4 접합부에서의 절단 사이트 시퀀스는 서로 다른 효율성으로 절단되었습니다. 세포에서, 이것은다단백질(42)의순차적 절단을 허용하는 것으로 생각된다.
부정적인 결과를 해석할 때는 주의를 기울여야 합니다. 분열이 발생하지 않는 경우, 절단 부위가 너무 짧거나 정제된 프로테아제는 비활성 상태일 수 있다. 절단되는 기질의 경우, 바이러스에 감염된 세포에서 전체 길이 단백질또는 분열의 절단을 확인하기 위해 추가 적인 실험이 필요합니다. 적절한 후속 실험을 선택해야 합니다. 바이러스 복제에 대한 표적 단백질의 과발현 또는 침묵의 효과도 시험될 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg"> 그림 1: 침묵의 세 가지 메커니즘. 침묵은 DNA, RNA 또는 단백질 의 수준에서 생길 수 있습니다. 이러한 "검색 및 삭제" 알고리즘은 각각 "키워드"를 사용하여 단어가 포함된 파일의 분열을 지시합니다. 이 도면은 모라자니외 32 및 그 안에 있는 참조로부터 수정되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg"> 도 2: 분열 부위 서열의 종별 차이. TRIM14 호몰로그의 C 단말 PRY/SPRY 도메인이 선형에 표시됩니다. PRY/SPRY 도메인은 회색으로 강조 표시된 보존된 모티브로 식별할 수 있습니다. 휴먼 트림14는 VEEV nsP2 시스테인 프로테아제에 의해 QEAGA↓G에서 절단된다. SSHHP 시퀀스는 색상으로 표시됩니다. 녹색의 잔류물은 P1' 잔류물; 파란색은 P4 잔기이고, 빨간색은 분열 부위 모티프 서열 내의 다른 보존된 잔류물이다. 말은 PRY / SPRY 도메인이 없는 TRIM14의 잘린 버전을 항구합니다. 시안에서 강조 된 리신은 폴리 유비퀴틴화이며 MAVS 신호체의 조립에 중요합니다. C-말단 PRY/SPRY 도메인은 nsP2 프로테아제에 의해 일시적으로 절단되어 급성 바이러스 감염 동안 숙주의 항바이러스 반응을 세포내로 손상시킬 수 있다. 말에서 이 도메인은 항상 존재하지 않습니다. 이것은 TRIM14의 PRY/SPRY 도메인이 VEEV 감염에 대하여 보호 기능을 가질 수 있다는 것을 건의합니다. 이 그림은 Morazanni 등에서재현되었습니다. 6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg"> 그림 3: BLAST를 사용한 SSHHPS 식별. VEEV nsP1/nsP2 접합부에서의 절단 부위 모티프 서열은 숙주 단백질 TRIM14에서 SSHHP 서열과 정렬된다. 녹색으로 칠해진 잔류물은 P1' 잔류물입니다. 파란색은 P4 잔기이고 빨간색은 분열 부위 모티프 서열의 다른 보존 잔류물이다. 대부분의 정렬은 보존 된 분열 사이트 모티프 외부 영역에 상동성을 포함하거나 P1 / P1 '가위 결합 잔류물을 포함하지 않았다. TRIM14는 P1 및 P1'을 포함하는 순차적으로 6잔고에 대한 일치를 보였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg"> 도 4: VEEV nsP2 시스테인 프로테아제에 대한 CFP-V12-YFP 기판의 단백질 및 DNA 서열. NdeI (CATATG) 및 XhoI (CTCGAG) 제한 사이트는 대문자로 표시됩니다. 빨간색은 nsP1과 nsP2 사이에 있는 바이러스 성 다단백으로부터의 분열 부위 서열이다. 녹색의 잔류물은 P1의 잔류물이며 파란색은 분열 부위의 P4 잔류물입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg"> 도 5: Trx-VEEV-nsP2 시스테인 프로테아제 생성물의 단백질 서열. 티오레독신(Trx)은 노란색으로 나타난다. 트롬빈 분열 사이트와 그의 태그는 시안으로 표시됩니다. 싸이스-그의 염료는 빨간색으로 표시되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg"> 도 6: MOE에서 펩티드 구조. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg"> 그림 7: PyRx/AutoDock을 사용하여 기질 펩티드의 도킹. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg"> 그림 8: Biowulf 클러스터에서 실행되는 작업입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg"> 도 9: nsP1/nsP2 접합부에서의 절단 부위 서열을 포함하는 VEEV P12 기판의 모델. Cys-477/His-546 촉매 다이드는 파란색으로 표시됩니다. 도면은 피몰(https://pymol.org)을 사용하여 만들어졌다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg"> 그림 10: 지카 바이러스 ns2B/ns3 프로테아제의 SSHHPS 분석. (a)ZIKV ns2B/ns3 프로테아제의 예상 숙주 단백질 표적. 적색의 잔기는 단일 분열 부위 서열과 일치한다. 녹색잔류물은 하위 부위에서 허용되며 다른 분열 부위의 잔류물을 일치시다. SFRP1은 연속순으로 동일한 잔기수가 가장 많았다. (b)CFP-기질-YFP 단백질(~50-60 kDa)을 발현하고 각 숙주 단백질(human)으로부터 예측된 SSHHP 서열을 함유하여 정제하였다. ZIKV 프로테아제는 망막 cDNA 라이브러리로부터 분리된 인간 FOXG1, SFRP1, NT5M 및 Gs알파 소부를 절단한다. 분열 제품은 약 28 ~ 30 kDa입니다. 기판 서열은 morazzani등에서 사용할 수 있습니다 6(C)ns2B/ns3 프로테아제 컷 SFRP1 동안, 그 상동체(SFRP2 및 SFRP4)를 절단하지 않았다. (D)상이한 동물 종으로부터의 분열 부위의 정렬은 그룹 IV 바이러스에 대한 동물 모델을 선택하는데 유용할 수 있다. 보존된 R↓G 시퀀스는 SFRP1에서 인간과 설치류 간에 다릅니다. 모라자니등에서재현 된 그림<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">6이 그림의 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg"> 도 11: 연속 및 불연속 분석을 이용한 정상 상태 운동 분석. (A)표 5에 나타낸 운동 데이터는 GraFit에 플롯되었다. 인세트는 라인위버-버크 플롯을 표시합니다. (B)CFP-V12-YFP 기판의 분열 제품을 나타내는 SDS-PAGE 겔. 레인 1은 "UNCUT" 기판(48 kDa)입니다. 차선 2는 "CUT" 기판(31 kDa 및 27 kDa)입니다. 레인3-9상이량의 화합물을 이들은 저해 활성을 시험하기 위해 포함하였다. 레인 4에는 E64d 공유 억제제가 포함되어 있습니다. 이들 반응은 실온에서 ~17시간 동안 하룻밤 동안 실행되었다. 날카로운 밴딩 패턴을 달성하기 위해 샘플의 비등이 필요하였다. nsP2 프로테아제는 효소를 함유하는 반응에서 볼 수 있지만, 차선 1에서는 볼 수 없다. 레인 1은 "효소 없음" 대조군입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 바이러스성 다단백질에 내장된 상동 호스트 병원체 단백질 서열(SSHHPS)의 짧은 스트레칭을 확인하기 위한 일반적인 프로토콜을 제시한다. SSHHPS는 바이러스 성 프로테아제에 의해 인식되고 여러 그룹 IV 바이러스에 의해 특정 숙주 단백질의 표적 파괴를 지시한다.

시험관 내 및 실리코 방법을 사용한 그룹 IV 바이러스 성 SSHHPS 분석

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

우리는 그룹 IV 바이러스 게놈호스트 단백질 서열의 짧은 뻗어를 인코딩한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 시퀀스는 바이러스 성 프로테아제 분열 부위 내에서 찾을 수 있습니다. 그(것)들은 숙주 단백질의 표적으로 한 파괴를 위해 이용되고 있습니다, 면역 반응을 생성에 관련시키는 전형적으로 단백질.프로테아제 스세이스를 사용하는 주요 장점은 세포의 복잡성을 제거하고 바이러스 성 프로테아제가 특정 시퀀스를 갈라둘 수 있는지 여부를 보여줍니다. 따라서 Zika SSHHPS 서열을 분석했을 때, 우리는 프로테아제가 면역 반응을 생성하는 데 관련된 단백질의 서열을 절단할 수 있으며 이러한 단백질 중 일부는 뇌와 눈 발달에 있어 역할을 했다는 것을 발견했습니다. 이 기술을 처음으로 수행할 때, 골짜기가 관찰되지 않으면 프로테아제의 활성과 같은 다양한 요인 때문일 수 있음을 기억해야 한다.절차를 시연하는 것은 제 실험실의 기술자인 제이미 콤프턴(Jaimee Compton)이 될 것입니다. 단백질 BLAST를 열고 가위 결합과 바이러스 다단백을 둘러싼 20개의 아미노산을 넣고 비중복 단백질 서열을 선택한 다음 숙주 게놈에 입력하여 검색한다. 필요한 경우, 피-블라스트를 선택하고 제곱 괄호가 대괄호 내의 아미노산이 대체 위치에 있을 수 있음을 나타내는 패턴 서열로 입력한 다음 BLAST를 명중시키십시오.분열 부위 시퀀스와 일치하는 연속 동일하거나 허용된 잔류물의 수를 기준으로 BLAST 히트를 순위를 매깁니다. 목록에서 프로테아제 분석에서 분석을 위해 6개 이상의 동일하거나 유사한 잔류물을 함유하는 단백질을 선택한다. 시안 형광 단백질, 최대 25개의 아미노산의 분열 서열 및 황색 형광 단백질을 코딩하는 플라스미드를 생성한다.다음으로, 하룻밤 문화의 25 밀리리터와 네 개의 4 리터 플라스크를 접종하여 CFP와 YFP 기판을 준비합니다. 섭씨 37도에서 배양을 흔들고 600 나노미터에서 UV-Vis 분광법에 의해 시간당 성장을 모니터링합니다. 박테리아가 약 하나의 흡수도에 도달하면, 각 플라스크에 하나의 어금니 IPTG의 0.5 밀리리터를 첨가하여 단백질 발현을 유도한 다음 흔들리는 인큐베이터의 온도를 섭씨 17도로 낮추고 발현이 17~20시간 동안 밤새 계속되도록 한다.다음 날, 원심분리에 의해 박테리아를 7000 g에서 10 분 동안 4섭씨에서 펠릿. 액체 매체를 제거하고 폐기한 다음 펠릿을 영하 80도에 보관하거나 세포 용해로 진행합니다. 세포를 lyse하려면, 원고 방향에 따라 100 밀리리터의 리시스 버퍼를 준비하고, 완충제내의 펠릿을 재일시 중단하고, 서스펜션의 25~25밀리리터를 50밀리리터 일회용 원추형 튜브로 이송한다.튜브를 얼음물이 있는 플라스틱 비커에 넣은 다음 초음파 처리기 팁을 튜브에 삽입하여 팁이 튜브 바닥에서 약 1센티미터 떨어져 있고 액체화되고 액화될 때까지 lysate를 10~20회 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후, 용액을 고속 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 30분 동안 20, 500 x g의 원심분리기로 옮긴다. 상체를 깨끗한 병에 옮기고 펠릿을 버리십시오.니켈 열에 용액을 적재한 다음 2개의 컬럼 부피로 열을 세척한 다음 280나노미터에서 20%버퍼 B.absorbance의 5개의 컬럼 부피가 이어서 세척 중에 오염물질이 열에서 엘루트로 증가한다. A280이 기준값으로 돌아올 때까지 계속 세척합니다. 그런 다음 100% 버퍼 B의 2~3개의 컬럼 부피로 단백질을 엘테하고 10밀리리터 분획을 수집하여 각 분획의 A280을 측정합니다.원고 방향에 따라 8개의 반응 믹스를 준비하고 각 믹스의 파이펫 45 마이크로리터를 블랙 하프 리전 96웰 플레이트의 각 행의 처음 3개의 우물에 넣습니다. 고정 된 광증 튜브 설정으로 두 파장에서 꽃의 동시 감지를 위해 플레이트 판독기를 설정합니다. 읽기 시간을 분당 한 번 읽으면서 20~30분으로 프로그래밍하고 읽을 우물을 선택합니다.플레이트를 기계에 삽입하고 읽기를 시작하여 시간이 지남에 따라 배출 비율을 모니터링합니다. 절단되지 않은 기판을 포함하는 플레이트의 끝점 읽기를 실행합니다. 각 우물에 접시와 파이펫 5 마이크로 리터를 제거합니다.첫 번째 열을 잘라내기 취소 컨트롤로 저장할 수 있습니다. 그런 다음 플레이트를 20~30분 동안 다시 읽고 플레이트 판독기를 절대 값을 출력하도록 설정합니다. 판독이 완료되면, 증발을 방지하기 위해 필름으로 접시를 밀봉하고 효소가 기판을 완전히 절단 할 수 있도록 실온에서 하룻밤 둡니다.24시간 후 필름을 제거하고 플레이트의 끝점 판독을 수행합니다. 배출 비율을 평균하고 절단으로 기록합니다. SDS-PAGE를 사용하여 기판의 골짜기를 확인합니다.분자량 마커를 첫 번째 또는 마지막 차선에 적재하고 절단되지 않은 반응부터 시작하여 각 반응 혼합물의 5마이크로리터를 젤의 차선에 적재합니다. 젤 탱크의 전극을 전원 공급 장치에 부착하고 60 분 동안 110 볼트로 제품을 실행합니다. 크래킹 도구를 사용하여 카세트에서 젤을 제거하고 염색 용액의 5~10밀리리터에 담급하십시오.1-24시간 후에, 과도한 얼룩을 제거하고 젤을 물에 담급드시면 됩니다. 그런 다음 젤 이미저를 사용하여 젤사진을 찍습니다. 단백질 구조를 준비하려면 단백질 PDB 파일을 MOE에 적재하십시오.선택 및 용매를 클릭한 다음 용매를 삭제합니다. 컴퓨트 상단 메뉴 모음에서 구조 p준비 패널을 열고 올바른 항목을 클릭하여 모든 구조 항목을 자동으로 수정합니다. 프로토네이트 3D를 클릭하여 구조를 프로토네이트합니다.부분 충전 패널을 열고 AMBER 99를 선택하고 필요에 따라 수소와 고독한 쌍을 조정하여 단백질에 부분 충전을 추가합니다. 그런 다음 구조 파일을 저장합니다. 기판 펩티드와 TRIM14에 대한 구조를 구축하기 위해, 단백질 빌더 패널을 열고 기판 서열을 입력하고 자동 재포장을 선택합니다.다음으로 형상을 확장으로 설정하고 빌드를 클릭합니다. 마지막으로 구조를 최소화하고 PDB 파일로 저장합니다. PyRx AudoDock 4.2 소프트웨어를 사용하여 기판 펩티드를 VEEV-nsP2에 도킹합니다.단백질을 로드하고 이름을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 매크로 분자 만들기를 선택하여 PDBQT 도킹 파일을 준비합니다. 그런 다음 기판 분자를 로드하고 리간드 만들기를 선택하여 리간드 도킹 파일을 준비합니다. 하단의 도킹 패널에서 AutoDock 마법사를 시작하고 준비된 리간드 및 단백질 파일을 선택합니다.그리드 치수를 수동으로 조정하여 단백질 바인딩 포켓을 정의한 다음 AuotGrid를 실행합니다. 그런 다음 AutoDock을 실행하고 라마르키안 유전 알고리즘 방법을 선택합니다. 도킹 매개 변수를 클릭하고 GA 실행 수를 50으로 설정한 다음 앞으로 클릭하여 도킹 실행을 시작합니다.자동 도크가 완료되면 결과 분석 패널을 열고 예측된 모든 바인딩 포즈를 검사합니다. 가장 낮은 예측 결합 에너지와 분열 부위의 기판 사이의 합리적인 바인딩 상호 작용을 가진 최상의 모델을 선택한 다음 추가 MD 시뮬레이션을 위한 PDB 파일로 저장합니다. AutoDock에서 바인딩 포즈를 읽은 후 MD 시뮬레이션을 사용하여 구체화할 타당한 바인딩 모델을 식별하기 위해 도킹 후 분석을 수행하는 것이 중요합니다.이 프로토콜은 Zika 바이러스 ns2B/3 protease에서 상동성 숙주 병원체 단백질 서열 또는 SSHHPS의 짧은 뻗어를 찾아서 이용되었습니다. 4개의 숙주 단백질 표적은 확인되었습니다. FOXGS, SFRP1, 망막 cDNA 라이브러리에서 Gsalpha 하위 단위, NT5M 미토콘드리아 5'3'nucleotidase.SSHHPS의 서열 정렬은 분열 부위 서열에서 종별 차이를 허용하였다. SFRP1 서열은 Zika 바이러스가 닭 배아에 있는 사망그리고 microcephaly를 유도할 수 있기 때문에 주목할 만한 인간과 닭에서 동일했습니다. 연속 분석법은 바이러스 다단백 서열 및 불연속 분석에 대한 꾸준한 상태 운동 매개변수 및 억제 상수를 측정하는 데 사용되었으며, 이는 다양한 화합물에 의한 특정 서열의 분열 또는 프로테아제의 억제와 같은 질적 분열 정보를 얻기 위해 사용되었다.베네수엘라 말 뇌염 nsP1-nsP2 접합의 모델은 실리코 방법으로 사용하였습니다. nsP2 프로테아제의 경우, 기판 서열을 연장하고 완충제의 이온 강도를 감소시킴으로써 셈리키 포리스트 바이러스 서열의 골짜기의 미하니스 상수에 상당한 감소를 초래하였다. 이 절차를 시도할 때는 컨트롤을 실행하는 것이 중요합니다.바이러스 성 프로테아제 분열 부위 서열을 포함하는 기판은 SSHHPS 서열 분석을 진행하기 전에 테스트되어야 합니다. 숙주 단백질의 분열이 관찰되는 경우 숙주 단백질이 바이러스 복제에 영향을 미치는지 확인하기 위해 후속 실험을 수행해야합니다. 이것은 단백질을 과발 표현하거나 침묵시키고 바이러스성 복제에 대한 효력을 검토해서 행해질 수 있습니다.그룹 IV에는 많은 수의 신규 및 신흥 병원체가 포함되어 있습니다. SSHHPS 서열은 특정 숙주 단백질 및 경로를 바이러스 성 프로테아제와 매우 예측 가능한 방식으로 연결합니다.

analysis-of-group-iv-viral-sshhps-using-in-vitro-and-in-silico-methods

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 모델 herpesvirus, 감마 herpesvirus 68 (γHV68)의 lytic 복제에 호스트 신호 분자의 핵심 역할을 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 유전자 변형 마우스 긴장과 γHV68 lytic 복제 배아 섬유 아세포를 활용, 프로토콜 phenotypic 특성화 및 바이러스 lytic 복제에서 바이러스 호스트 상호 작용의 분자 심문을 모두 할 수 있습니다.

모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

단일 바이러스 게놈 (SVG)는 단일 virons의 게놈을 분리하고 증폭하는 방법이다. 혼합 조립의 바이러스 현탁액하여 virion의 캡처 및 다운 스트림 처리하는 동안 게놈 전단을 줄이고, 아가로 오스를 포함하는 개별 우물 현미경 슬라이드에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬됩니다. 전체 게놈 증폭 시퀀싱에 적합한 유전 물질의 결과로 여러 변위 증폭 (MDA)를 사용하여 수행됩니다.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

이 비디오는 항바이러스 화합물을 스크리닝하기 위한 바이러스 부착 분석을 보여줍니다. 유전자 변형 C형 간염 바이러스와 루시페라아제를 사용하여 바이러스만 처리한 웰에 비해 공동 처리된 웰에서 낮은 광 강도로 알 수 있듯이 바이러스 부착에 대한 억제 효과를 평가합니다.

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이 비디오는 바이러스가 숙주 세포로 진입하고 엔도솜과 융합하는 특정 단계를 표적으로 하는 항바이러스제를 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 세포는 저온에서 배양된 다음 HCV에 감염됩니다. 낮은 온도는 숙주 세포에 대한 바이러스 결합을 허용하지만 내포작용(endocytosis)을 통한 내재화를 억제합니다. 테스트 항바이러스 화합물을 첨가하고 세포를 생리학적 온도에서 배양합니다. 이러한 더 높은 온도로의 이동은 바이러스 진입을 용이하게 하고 엔도솜과의 바이러스 외피 융합에 대한 테스트 화합물의 영향을 평가할 수 있습니다.

숙주 세포의 바이러스 진입 및 융합에 대한 테스트 화합물의 효과를 평가하기 위한 분석

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시험관 내 및 실리코 방법을 사용한 그룹 IV 바이러스 성 SSHHPS 분석

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