피부 심근세포를 이용한 심장 기능의 체외 평가

이 기술은 동물 모델과 인간의 시험관 및 생체 내 매개변수 간의 상관 관계를 조사하여 심장 질환의 병태 생리학을 명확히 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 작은 생검 또는 냉동 보관된 샘플을 사용하여 깊은 근필라멘트 기능을 연구할 수 있다는 것입니다. 이 기술을 사용하면 근필라멘트에 대한 치료 개입의 영향을 체외에서 평가할 수 있습니다.

실험을 시도하기 전에 심근세포 추출을 몇 번 연습하여 크기, 줄무늬 및 모양이 좋은 심근세포를 선택, 접착 및 활성화하는 방법을 배우는 것이 좋습니다. 절차를 시작하기 전에 챔버 내 테스트 장치의 온도를 섭씨 15도로 조정하고 힘 변환기와 모터를 켭니다. 2.5ml의 릴렉스 ISO 용액이 들어 있는 페트리 접시에 3-5마이크로그램의 심근 샘플을 해동하고 메스를 사용하여 불필요한 세포 손상을 일으키지 않고 조직을 작은 조각으로 정밀하게 자릅니다.

모든 조직을 절단한 후 절단된 피펫 팁을 사용하여 전체 부피의 용액과 조직 조각을 Potter-Elvehjem 유리에 옮기고 그라인더를 사용하여 분당 30-40회 회전으로 조직을 기계적으로 파괴합니다. 양호한 세포 현탁액이 얻어지면 2.25ml의 릴렉스 ISO가 포함된 15ml 튜브에 250마이크로리터의 Triton을 추가하고 결과 용액에 세포 현탁액을 추가합니다. 튜브를 세 번 부드럽게 뒤집어 섞은 다음 튜브를 실온에서 1분 동안 그대로 둔 다음 얼음에서 4분 동안 배양합니다.

얼음 배양이 끝나면 튜브의 최종 부피를 추가 이완 ISO로 최대 15 밀리리터까지 가져오고 시연된 대로 반전으로 튜브를 세 번 혼합한 다음 세포를 원심분리한 다음 상등액의 마지막 3밀리리터를 제외한 거의 모든 액체를 조심스럽게 제거합니다. 마지막 세척 후 최대 5-10 밀리리터의 세포 현탁액까지 상층액을 제거합니다. 스킨 심근세포 선택의 경우, 도립 현미경 슬라이드 홀더의 유리 슬라이드 위에 놓인 커버슬립에 세포 현탁액 한 방울을 추가하고 20X 대물렌즈를 사용하여 줄무늬 패턴과 크기가 좋은 단일 막대 모양의 심근세포를 선택합니다.

선택한 심근 세포가 힘 트랜스듀서 및 모터의 바늘과 끝이 정렬된 상태로 수평으로 배치될 때까지 두 손을 사용하여 커버슬립을 회전하고 피펫 팁을 사용하여 커버슬립 측면을 따라 얇은 접착제 선을 놓습니다. 세포를 제자리에 접착하려면 힘 센서와 모터의 바늘 끝을 접착제 라인에 담그어 양쪽 팁 주위에 접착제 후광을 만들고 힘 변환기의 바늘 끝을 빠르게 아래로 움직여 심근세포의 한쪽 가장자리에 접착되도록 합니다. 모터의 끝과 셀의 다른 쪽 끝으로 이 절차를 반복합니다.

5-8분 후 두 마이크로 매니퓰레이터를 동시에 움직여 바늘을 약 15마이크로미터 들어 올려 셀이 커버슬립에 접착되지 않도록 합니다. 능동 및 수동 힘과 칼슘 민감도를 측정하려면 첫 번째 실험 우물에 55-100 마이크로 리터의 이완 용액을 채우고 두 번째 실험 우물에 55-100 마이크로 리터의 활성화 용액을 채 웁니다. 카메라 소프트웨어를 사용하여 관심 영역을 명확한 줄무늬 패턴이 있는 심근세포 영역으로 설정하고 육상 길이를 2.2마이크로미터로 설정합니다.

심근세포의 두 극단 사이의 거리를 측정하고 그 값을 소프트웨어 내에서 근세포 길이로 기록합니다. 다음으로, 바늘을 약간 더 위로 이동하고 현미경 스테이지를 부드럽게 움직여 세포가 커버슬립에서 스테이지 뒤쪽의 이완 용액이 들어 있는 웰로 이동하도록 합니다. 세포가 칼슘과 이완 용액에서 순차적으로 출현할 때 발생하는 두 개의 세포 단축을 포함하는 프로토콜을 선택합니다.

등척성 수축을 유도하려면 심근세포가 이완 용액에서 활성화 용액으로 이동하도록 현미경 스테이지를 이동합니다. 힘 고원에 도달하면 힘 데이터를 기록하기 시작합니다. 10초 후 셀을 이완 용액으로 전환하고 테스트가 중지될 때까지 데이터를 기록합니다.

칼슘 민감도를 측정하려면 활성화 용액을 각 칼슘 용액 55-100마이크로리터로 교체하고 방금 설명한 대로 데이터를 기록합니다. 측정이 끝나면 힘 센서와 모터의 끝을 늘려 셀에서 바늘을 제거하고 아세톤에 적신 면봉을 사용하여 바늘 끝에서 접착제 후광을 조심스럽게 제거합니다. 장기간의 실험 후 어느 정도의 저하 및 힘 감소가 예상되지만, 기능적 투과성 심근세포 내의 활성 장력 값은 비교적 안정적이어야 합니다.

여기에서는 근필라멘트 칼슘 민감도 프로토콜을 수행하는 데 필요한 8개의 힘 기록 중 3개의 대표적인 힘 흔적이 표시됩니다. 활성화 용액이 들어 있는 우물로 세포를 이동시킴으로써, 심근세포는 고원에 도달할 때까지 힘을 개발하기 시작합니다. 빠른 슬랙 테스트 후 제로 포스의 기준선 값을 얻을 수 있습니다.

이 곡선의 마지막 부분의 기울기는 겉보기 횡교 부착 및 분리 속도의 척도인 힘 재개발 속도의 값을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 세포를 이완 용액이 들어 있는 우물로 다시 옮기면 세포가 이완되고 힘이 떨어집니다. 근필라멘트 칼슘 민감도 및 길이 의존적 활성화 측정 외에도 수동 장력의 sarcomere 길이 의존성 및 단면적 당 칼슘 활성화력의 sarcomere 길이 의존성 및 칼슘 독립 장력을 계산할 수 있습니다.

마지막으로, 심근세포가 분리되는 방식이 결과에 상당한 영향을 미친다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 피부가 벗겨진 심근세포를 사용하여 체외에서 심장 기능을 평가하는 것은 세포 수준에서 발생하는 변화를 명확히 하고 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 근필라멘트 메커니즘을 연구하는 중요한 기술입니다. 이 방법은 최소한의 심근 샘플이 필요하고 다양한 종, 심장 위치 및 병리학의 심근세포를 사용할 수 있다는 장점이 있습니다.