Name: 난소암 조직에서 미토콘드리아의 준비 및 정량적 프로테오믹스 분석을 위한 난소 조직 제어 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 학습하세요 난소암 및 대조 조직에서 미토콘드리아를 분리하고 정제하는 방법을 통해 정량적 프로테오믹스 분석을 수행하는 기술입니다. 이 프로토콜은 생물학적 표지자와 치료 표적 발견에 활용됩니다.

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이 작품은 후난성 백 인재 계획(X.Z.), 시안야 병원 인재 소개 기금(XZ), 중국 국립 자연과학 재단(그랜트 81572278 및 XZ 81272798), 중국 "863" 계획의 보조금에 의해 지원되었습니다. 프로젝트 (그랜트 번호 2014AA020610-XZ), 중국의 후난 성 자연 과학 재단 (그랜트 번호 14JJ7008 에 XZ). X.Z.는 본 원고의 개념을 구상하고, 미토콘드리아 샘플의 iTRAQ 정량적 프로테오믹스 데이터를 획득하고, 원고를 작성 및 수정하고, 관련 작업을 조정하고, 재정 지원 및 대응에 대한 책임을 지었습니다. 작업. H.L. 미토콘드리아 샘플을 제조하였다. S.Q. 부분 작업에 참여했습니다. X.H.Z는 영어 쓰기 및 편집에 참여했습니다. N.L.은 iTRAQ 프로테오믹스 데이터를 분석했습니다. 모든 저자는 최종 원고를 승인했다.

난소암 조직(n=7) 및 정상 대조군 난소 조직(n=11)을 포함하는 난소 조직 샘플을 이 프로토콜에 사용하였다. 본 의정서3,4,5는 중국 중남대학교 시안야병원 의료윤리위원회의 승인을 받았다.
1. 인간 난소암 조직에서 미토콘드리아의 준비
<ol><li>210 mM 만미톨을 혼합하여 미토콘드리아 절연 완충액의 250 mL를 준비하고, 70 mM 수크로오스, 100 mM 염화칼륨 (KCl), 50 mM 트리스-HCl, 1 mM 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 0.1 mM 에틸렌 글리콜 비스 (2-아미노 에테르) 테트라 아세트산 (EGTA), 1 mMM 페닐메탄설포닐 불소(PMSF) 프로테아제 억제제, 2 mM 나트륨 오르토바나데이트(V), 및 0.2% 소 혈청 알부민(BSA), pH 7.4.</li>
	<li>깨끗한 유리 접시에 난소암 조직 1.5 g을 놓습니다.</li>
	<li>미리 냉각된 미토콘드리아 분리 완충제 2 mL를 추가하여 조직 표면에서 혈액을 3x 가볍게 세척합니다.</li>
	<li>깨끗한 안과 가위를 사용하여 조직을 약 1mm3 개로 완전히 다진 다음 다진 조직을 50mL 원심 분리튜브로 옮김하십시오.</li>
	<li>0.2 mg/mL 의 나가스를 함유한 미토콘드리아 절연 완충액 13.5 mL을 추가한 다음 전기 균질화를 사용하여 다진 조직(2분, 4°C)을 균질화합니다(사용 스케일 2, 10 s 6x, 간격 10초).</li>
	<li>또 다른 추가 3 미토 콘 드리 아 절연 버퍼 조직 균질 화 하 고 파이펫팅에 의해 그들을 잘 혼합.</li>
	<li>제조 된 조직 균질화 (1,300 x g,10 분, 4 °C)를 원심 분리기. 원유 핵 분획(즉, 펠릿)을 제거하고 상류를 유지합니다.</li>
	<li>최근 상월체 (10,000 x g,10 분, 4 °C)를 지내다. 미세한 물질(즉, 상류체)을 제거하고 펠릿을 유지합니다.</li>
	<li>미토콘드리아 절연 버퍼 2 mL를 추가하고 라이트 파이펫팅으로 펠릿을 잘 다시 놓습니다.</li>
	<li>펠릿 현탁액 (7,000 x g,10 분, 4 °C)을 원심 분리기. 상급을 버리고 조미토콘드리아 (즉, 펠릿)를 유지하십시오.</li>
	<li>추출된 조미토콘드리아를 재중단시키기 위해 25% 밀도 그라데이션 배지(즉, Nycodenz)의 12 mL를 추가합니다.</li>
	<li>튜브를 34mL 의 5 mL, 30% 8 mL, 25%의 12 mL(1.11단계에서 의 한 미토콘드리아 포함), 8 mL 의 23%, 20% 밀도 그라데이션 배지의 3 mL, 원심분리기(52,000 x g,90°C)로 아래에서 위로 튜브를 채우면서 불연속 밀도 구배를 만든다.</li>
	<li>길고 무딘 주사기를 사용하여 25% 및 30% 밀도 그라데이션 배지 사이의 계면에서 정제된 미토콘드리아를 깨끗한 튜브로 수집합니다.</li>
	<li>수집된 미토콘드리아에 미토콘드리아 분리 완충액을 추가하여 3배 부피로 희석합니다. 원심분리기 (15,000 x g,20 분, 4 °C)를 폐기한다.</li>
	<li>미토콘드리아 절연 완충액 2 mL을 추가하여 펠렛및 원심분리기(15,000 x g,20분, 4°C)를 재중단시스터. 상급을 버리고 펠릿을 유지하십시오.</li>
	<li>최종 펠릿(즉, 정제된 미토콘드리아)을 수집하고 -20°C에 보관한다. 참고: 양적 프로테오믹스 분석을 위해 난소암 조직에서 정제된 모든 미토콘드리아를 미토콘드리아 샘플로 결합합니다.</li>
</ol>2. 인간 통제 난소 조직에서 미토콘드리아의 준비
<ol><li>1.1단계에서 기재된 바와 같이 미토콘드리아 격리 완충액의 250 mL를 준비한다.</li>
	<li>정상 대조군 난소 조직 ~1.5 g을 깨끗한 유리 접시에 놓습니다.</li>
	<li>미리 냉각된 미토콘드리아 분리 완충액 2 mL를 추가하여 조직 표면에서 혈액을 3x 가볍게 씻습니다.</li>
	<li>깨끗한 안과 가위를 사용하여 조직을 약 1mm3 개로 완전히 다진 다음 다진 조직을 50mL 원심 분리튜브로 옮김하십시오.</li>
	<li>다진 대조군 조직에 인산완충식염수(PBS)에 0.05% 트립신/20 mM EDTA 8mL을 추가하고, 조직과 세포를 용해시키고 미토콘드리아를 방출하는 데 도움이 되는 다이제스트(30분, 실온)를 첨가합니다. 그런 다음 원심 분리기 (200 x g,5 분). 상급체를 버리고 조직과 세포를 유지하십시오.</li>
	<li>0.2 mg/mL 의 나가스를 함유한 미토콘드리아 절연 완충액 13.5 mL을 추가한 다음 전기 균질화를 사용하여 다진 조직(2분, 4°C)을 균질화합니다(사용 스케일 2, 10 s 6x, 간격 10초).</li>
	<li>또 다른 추가 3 미토 콘 드리 아 절연 버퍼 조직 균질 화 하 고 파이펫팅에 의해 그들을 잘 혼합.</li>
	<li>준비된 조직 균질화 (1,300 x g,10 분, 4 ° C)를 원심 분리. 원유 핵 분획(즉, 펠릿)을 제거하고 상류를 유지합니다.</li>
	<li>최근 상류분 (10,000 x g,10 분, 4 ° C). 미세한 물질(즉, 상류체)을 제거하고 펠릿을 유지합니다.</li>
	<li>미토콘드리아 절연 버퍼 2mL를 추가하여 라이트 파이펫팅으로 펠릿을 잘 재중단시면됩니다.</li>
	<li>펠릿 현탁액 (7,000 x g,10 분, 4 °C)을 원심 분리기. 상급을 버리고 조미토콘드리아 (즉, 펠릿)를 유지하십시오.</li>
	<li>추출된 원유 미토콘드리아를 다시 중단시키기 위해 25% 밀도 그라데이션 배지의 12 mL를 추가합니다.</li>
	<li>튜브를 아래에서 위로 8mL 38%, 34% 5mL, 25%의 8mL, 25%의 12mL(단계 2.12에서 조미토콘드리아 포함), 8 mL 23%, 20% 밀도 구배 배지 및 3 mL의 20% 밀도 구배 배지, 및 원심 분리(52,00°C)로 튜브를 채우하여 불연속 밀도 구배를 만듭니다.</li>
	<li>길고 무딘 주사기를 사용하여 25 %와 30 % 사이의 인터페이스에서 34 %와 38 %의 인터페이스에서 깨끗한 튜브로 정제 된 미토콘드리아를 수집합니다.</li>
	<li>수집된 미토콘드리아에 미토콘드리아 분리 완충액을 추가하여 3배 부피로 희석합니다. 원심분리기 (15,000 x g,20 분, 4 °C)를 폐기한다.</li>
	<li>미토콘드리아 절연 완충액 2 mL을 추가하여 펠렛을 재중단하고 원심 분리기 (15,000 x g,20 분, 4 °C). 상급을 버리고 펠릿을 유지하십시오.</li>
	<li>최종 펠릿(즉, 정제된 미토콘드리아)을 수집하고 -20°C에 보관한다. 참고 : 정량적 인 프로테오믹스 분석을위한 미토콘드리아 샘플로 제어 난소 조직에서 모든 정제 된 미토콘드리아를 결합합니다.</li>
</ol>3. 정제 된 조직 미토콘드리아 샘플의 품질 검증
<ol><li>정제된 미토콘드리아 샘플(즉, 1.16단계에서 난소암 조직에서 펠릿을 취하고 2.17단계에서 난소 조직을 대조군)을 복용하여 전자현미경(EM)으로 검증한다. 참고 : 상세 한 프로토콜은 이전에설명 된 15,16.</li>
	<li>미토콘드리아 단백질 추출 완충액을 8 M 우레아, 2 M 티우레아, 40 mM 트리스, 1 mM EDTA, 130 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 4%(3-cholamidopropyl) 3-(3-cholamidopropyl) 디메틸람모니오(CHAP)-1-프로판술포포네이트(CHAP)를 혼합하여 준비한다. pH를 8.52로 조정합니다.</li>
	<li>정제된 미토콘드리아 시료(즉, 1.16단계에서 난소암 조직으로부터의 펠릿과 2.17단계에서 난소 조직을 대조군)을 취하고 미토콘드리아 단백질 추출 완충액(미토콘드리아 시료를 단백질 추출 완충액에 미토콘드리아 샘플, 1:5)을 첨가하여 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 샘플을 액체 질소3x로 동결시키고 실온에서 2시간 동안 보관합니다.</li>
	<li>12,000 x g,30 분, 4 °C에서 원심 분리기를, 상판 (즉, 추출 된 미토콘드리아 단백질 샘플)을 수집하고, 비신코닌산 (BCA) 단백질 분석 키트로 단백질 함량을 측정합니다.</li>
	<li>9.08 g의 Tris 와 40 mL의 ddH2O를 혼합하고 HCl을 사용하여 pH를 8.8로 조정하고 ddH2O를 최종 부피 50 mL에 추가하여 1.5 ML 트리스-HCl(pH 8.8)의 50 mL을 준비합니다. 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>6.06 g의 트리스와 40 mL의 ddH2O를 혼합하고 HCl을 사용하여 pH를 6.8로 조정하고 ddH2O를 최종 부피 50 mL에 추가하여 1 M Tris-HCl(pH 6.8)의 50 mL을 준비합니다. 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>아크릴아미드 29g, 비스 아크릴아미드 1g, ddH2O80 mL를 혼합하고 ddH2O를 최종 부피에 100 mL를 추가하여 30% 아크릴아미드-비스 용액 100 mL을 준비합니다. 4 °C에서 갈색 병에 저장합니다.</li>
	<li>글리신 29g, 트리스 58g, 도데실 황산나트륨(SDS) 3.7g, ddH2O800 mL를 혼합하여 10x 트리스 글리신 전기 영동 완충액 1,000 mL을 준비한 다음 ddH2O를 최종 부피에 1,000 mL의 최종 부피에 추가합니다.</li>
	<li>글리세린 2 mL, 브로모페놀 블루 0.02 g, SDS 0.4 g, 트리스-HCl pH 6.8, 및 7 mL의 ddH2O를 10 mL의 최종 부피에 추가하여 10 mL의 로딩 버퍼를 10 mL을 준비합니다.</li>
	<li>ddH2O의 4 mL을 혼합하여 10 % 나트륨 도데실 설페이트 폴리 아크릴아미드 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 해결 젤의 10 mL을 준비, 3.3 mL 의 30% 아크릴아미드-비스 용액, 2.5 mL 의 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 0.1 mL 의 10% SDS, 0.1 mL 의 10% 황황산염, 그리고 0.004 mL의 테트라메틸레테틸렌디아민(TEMED). SDS-PAGE 분해 젤 용액을 유리 판 사이의 플레이트에 붓고 빗 바닥의 레벨에 넣습니다. 상단에 이소프로필 알코올 2 mL를 추가합니다. 30분 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>이소프로필 알코올을 제거하고 ddH2O 3x로 상단을 세척합니다. ddH2O의 4.1 mL, 30% 아실아미드-비스 용액의 1.0 mL, 0.75 mL의 1 M Tris-HCl (pH 6.8), 0.06 mL의 10% SDS, 0.06 mL의 10% 퍼설페이트 암모늄, 00m0을 함유하는 5% 농도 겔 용액을 붓습니다. 즉시 농축 젤 용액에 빗을 삽입하고 30 분 동안 방치 한 다음 빗을 꺼내십시오.</li>
	<li>ddH2O의 900 mL로 10x 트리스 글리신 전기 영동 완충액 100 mL을 희석하여 1x 트리스 글리신 전기 영동 완충제를 준비하고 전기 영동 탱크에 부어 넣습니다.</li>
	<li>난소암에서 미토콘드리아 단백질 30 μg를 혼합하고 3.4 단계에서 난소 조직을 로딩 버퍼로 조절하여 최종 부피에 도달하여 20 μL. 혼합물을 5 분 동안 끓인 다음 100 V의 일정한 전압을 사용하여 10 % SDS-PAGE 해결 젤로 분리하십시오. 브롬페놀 블루가 바닥에 도달하면 전기 동극을 중지하십시오.</li>
	<li>10x 트리스 글리신 전기 영동 완충제 150 mL, ddH2O 1,050 mL 및 메탄올 300 mL을 혼합하여 1.5 L의 전기 영동 전달 버퍼를 준비합니다.</li>
	<li>PVDF 멤브레인을 100% 메탄올에 10분 동안 담그고 전기 동백 전달 버퍼에서 적어도 5분 동안 담그십시오.</li>
	<li>단백질을 함유한 SDS-PAGE 젤을 꺼내 전기 영동 전달 완충제에 10분 동안 담급니다.</li>
	<li>흰색 판에 젖은 스폰지, 습식 필터 용지 3 장, PVDF 멤브레인, 단백질이있는 SDS-PAGE 젤, 습식 필터 용지 2 장 및 젖은 스폰지를 아래에서 위로 배치하여 전사 카세트를 만듭니다. 거품을 피하십시오.</li>
	<li>전사 카세트를 전기 동환 탱크에 넣고 전기 동환 전달 버퍼에 부은 다음 일정한 200 mA 전류에서 2 시간 동안 전달하십시오.</li>
	<li>트리스 12.114g, NaCl 29.22g, ddH2O를500 mL의 최종 부피에 추가하여 10x Tris 버퍼링 식염수(TBS) 스톡 솔루션을 준비합니다. 10x TBS 200 mL, 트웬-20 mL, ddH2O 1,798 mL을 혼합하여 1x TBST 의 2L를 준비하여 100 mL의 TBST와 5 g의 BSA를 혼합하여 차단 용액100 mL을 준비합니다.</li>
	<li>이송 후 PVDF 멤브레인을 꺼내 TBST에서 5 분 동안 가볍게 씻은 다음 실온에서 1 시간 동안 차단 용액으로 차단하십시오.</li>
	<li>PVDF 멤브레인(4°C 하룻밤)을 라민 B(세포 핵; 염소 항인간 항체 1: 1,000 차단 용액), 플로틸린-1(사이토막; 토끼 항인간)을 포함한 상이한 세포소기관에 특이적인 다른 원발성 항체와 배양 항체 1:500 차단 액액), COX4I1 (미토콘드리아, 토끼 항인간 1:1,000 차단 용액), GM130 (골지 장치; 마우스 항인간 항체 1:1,000 차단 액), 카랄라제 (퍼록시솜; 토끼 항체 1:1,000 차단 용액), 및 카테신 B (리소좀; 토끼 항 인간 항체 1:1,000 차단 용액). TBST에서 5분 3x로 가볍게 씻으소서.</li>
	<li>상응하는 이차 항체(토끼 항염소, 염소 항토끼, 또는 염소 항마우스)로 실온에서 1시간 동안 PVDF 멤브레인을 배양한다. TBST에서 5분 3x로 가볍게 씻으소서. 전기 화학 발광 (ECL)으로 시각화하십시오.</li>
</ol>4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS 분석
참고: 섹션 4에 대한 자세한 절차는 iTRAQ지침(재료 표)을참조하십시오.
<ol><li>정제된 미토콘드리아 샘플(즉, 1.16단계에서 난소암 조직으로부터의 펠릿및 2.17단계로부터난소 조직을 대조하는) 정제된 미토콘드리아 샘플에 SDT 완충액(4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7.6, 및 100 mM DTT)을 첨가한다. 눈에 보이는 침전이 없을 때까지 샘플을 소용돌이. 참고: SDT 버퍼 비율에 대한 미토콘드리아 샘플은 1:5이어야 합니다.</li>
	<li>SDT 처리 된 샘플을 5 분 동안 끓인 다음 얼음에서 샘플을 식힌 다음 원심 분리기 (2,000 x g, 2 분).</li>
	<li>추출된 미토콘드리아 단백질 샘플로서 상판액을 수집하고 BCA 단백질 분석 키트로 단백질 함량을 측정합니다.</li>
	<li>SDT 추출된 미토콘드리아 단백질(각 시료의 200 μg)을 섭취하여 트립신, 담수화 및 용이성 화로 환원, 알킬화, 소화를 위해3,4. 각 샘플에 대해 세 개의 복제를 수행합니다.</li>
	<li>트립펩티드(각 시료의 100 μg)를 100 mMM 테트라에틸 암모늄 브로마이드 용액(pH 8.5)으로 4.4단계에서 처리하고, 그 지침에 따라 6-플렉스 iTRAQ 시약 중 하나로 트립틱 펩티드에 라벨을 붙인다3,4. 각 샘플에 3x 레이블을 지정합니다.</li>
	<li>똑같이 6개의 라벨이 붙은 트립틱 펩타이드 샘플(난소암 조직3개, 난소 대조군 조직에서 3개)을 혼합하고 진공 농축기로 건조시면 됩니다.</li>
	<li>혼합 iTRAQ 표지 된 펩티드를 SCX 크로마토그래피와 60 분획 (1 분당 1 분분)으로 분획 한 다음 SCX 분별 샘플 (n = 30)으로 모든 두 분획을 결합합니다.</li>
	<li>질량 분석기3,4MS/MS 데이터를 얻기 위해 60분 LC 분리 구배 내에서 나노 LC 시스템과 결합된 질량 분석기3에서LC-MS/MS 분석에 각각의 SCX 분별 샘플을 적용하였다.</li>
	<li>MS/MS 데이터를 검색엔진(재료 표)으로단백질을 식별합니다.</li>
	<li>iTRAQ 리포터-이온 강도를 사용하여 각 단백질을 정량화하고 >1.5 또는 <-1.5 배, p< 0.05의 변화로 미토콘드리아 차동 발현 단백질(mtDEPs)을 결정합니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없다.

미토콘드리아 변경은 난소암의 특징입니다. 인간 난소암에서 고품질의 미토콘드리아 시료를 제조하고 대규모 정량적 프로테오믹스에 대한 대조조직을 제조하여 난소암 발병기전 및 미토콘드리아 분자 네트워크 변화에 대한 미토콘드리아 기능에 대한 심층적인 이해를 돕고, 미토콘드리아4,8에기초한 표적 치료 및 효과적인 바이오마커의 후속 발견을 위한 분자 메커니즘을 명확히 하는 데 도움을 줍니다. 밀도 구배 원심분리와 결합된 차동 속도 원심분리는 인간 난소암으로부터 효과적으로 분리되고 정제된 미토콘드리아및 난소 조직을 조절한다. 제조된 미토콘드리아 샘플은 매우 높은 품질이었고 추가의 정량적 프로테오믹스 분석에 적합하였다.
제조된 미토콘드리아 샘플에는 소량의 퍼옥시좀3,<...

난소암은 사망률이 높지만 분자기전이 불분명한 흔한부인과암1,2. 난소암의 대부분은 심각하게 치료를 방해하는 고급 단계에서 진단됩니다. 미토콘드리아 변화는 인간 난소암의 특징이며, 미토콘드리아는 에너지 대사, 세포 신호, 산화 스트레스3, 4,5,6,7의중심이다. 난소암의 미토콘드리아 프로테오메의 변화에 대한 심층적인 통찰력은 난소암의 분자 메커니즘에 대한 심층적인 이해와 효과적이고 신뢰할 수 있는 바이오마커 및 치료 표적의 발견에 도움이 될 것입니다. 미토콘드리아 대사가 암 치료의 표적으로 제안되고 인식되고 있으며, 항미토콘드리아 요법은 궁극적으로 암의 재발 및 전이를 방지하는 데 매우 유익할 수 있다8. 개별 적인 대사 프로파일링은 또한 이미 암 계층화 및 예측 전략9,10에유용한 도구로 실행되고 있다.
이 연구의 장기적인 목표는 난소암과 대조군 난소 조직 사이의 미토콘드리아 프로테오메 변경을 명확히 하기 위한 난소암을 연구하기 위한 정량적 미토콘드리아 프로테오믹스 방법을 개발하고 사용하는 것입니다. 및 그들의 분자 네트워크 변화는 체계적인 다중 omics 각도11,12,이는 난소암의 분자 기전의 설명을 위한 미토콘드리아 표적 분자바이오마커(13)의 발견을 초래할 것이다, 난소암 환자의 맞춤형 치료. 상대적 및 절대 정량화(iTRAQ) 라벨링3,4에 대한 등음표는 미토콘드리아 단백질 변화를 정량화하는 효과적인 방법이다. 인간 난소암및 대조군 난소조직에서 고품질 미토콘드리아 시료의 제조는 미토콘드리아 프로테옴의 iTRAQ 정량 분석을 위한전제조건3. iTRAQ 정량 단백질과 결합된 미토콘드리아 제제는 미토콘드리아 단백질레고메 의 확립을 포함한 인간 난소암 미토콘드리아 프로테오메에 대한 장기 연구 프로그램에서 성공적으로 사용되어 왔으며, 미토콘드리아 단백질레오스 기준 맵3,미토콘드리아 프로파일의 분석은 미토콘드리아 프로파일4,14 및 포스포릴을 포함한 사후 번역 경로의 중요한 발견을 포함하고 있다. 인간 난소암의 네트워크 변화5,에너지 대사4,지질 대사 및 미토파지 경로 시스템3.
이전 연구는 밀도 구배 원심분리와 함께 차동 속도 원심분리가 인간 난소암으로부터 미토콘드리아를 분리및 정화하고 난소 조직을 조절하는 효과적인 방법인 것을발견했으며 3,4,5,14. 강력한 양이온 교환(SCX)-액체 크로마토그래피(LC)-탠덤 질량 분석법(MS/MS)과 결합된 iTRAQ 라벨링은 준비된 미토콘드리아 샘플의 단백질을 검출, 식별 및 정량화하는 핵심 기술입니다.
여기서, iTRAQ 정량적 프로테오믹스와 결합된 미토콘드리아 제제에 대한 상세한 프로토콜이 기재되어 있다. 이들은 인간 난소암 조직 미토콘드리아 프로테옴의 분석에 성공적으로 사용되어 왔다. 프로토콜은 샘플의 준비를 포함, 차동 속도 원심분리, 밀도 그라데이션 원심 분리, 미토콘드리아 샘플의 품질 평가, 트립신과 단백질 소화, iTRAQ 라벨링, SCX 분획, LC, MS / MS, 데이터베이스 검색, 및 미토콘드리아 단백질의 정량 분석. 더욱이, 이 프로토콜은 다른 인간 조직 미토콘드리아 프로테옴을 쉽게 분석하기 위해 번역한다.

<table><tbody><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Vazyme</td><td>E112</td><td>BCA 단백질 분석 키트는 묽은 단백질 용액(0.5 - 20 micrograms/ml)의 총 단백질 농도(A562nm)를 측정하도록 최적화된 당사의 인기 있는 BCA 시약의 특수 3성분 버전입니다.</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>Solarbio</td><td>A8020-5G</td><td>열 충격 분율, 호주 원산지, 프로테아제 무료, 저지방산, 낮은 IgG, pH 7, &ge; 98%</td></tr> <tr><td>원심분리기</td><td>XiangYi</td><td>TDZ4--WS</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>시그마</td><td>C9426-5G</td><td>생물 시약, 전기 영동에 적합, &ge; 98 % (HPLC) (시그마 - 알드리치)</td></tr> <tr><td>디아민 테트라 아세트산 (EDTA)</td> <td>시그마</td><td>798681-100G</td><td>무수, 자유 유동, Redi-Dri, &ge; 98%</td></tr><tr><td>DTT</td><td>시그마</td><td>10197777001</td><td>1,4-Dithiothreitol</td></tr><tr><td>Easy nLC</td><td>Proxeon Biosystems (현재 Thermo Fisher Scientific)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜 비스(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E0396-10G</td><td>BioXtra, &ge; 97 .0%</td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>SilentShake</td><td>HYQ-3110</td><td></td></tr><tr><td>iTRAQ 시약 키트</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Applied Biosystems iTRAQ 시약&ndash; 화학 참조 안내서, P/N 4351918A</td></tr><tr><td>저온 초고속 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Macklin</td><td>M813424-100G</td><td>만니톨은 과당에서 수소화하여 생산되는 폴리올(다가 알코올)로 감미료, 습윤제 및 벌크제 역할을 합니다. 흡습성이 낮고 오일 지급 능력이 좋지 않습니다.</td></tr><tr><td>MASCOT 검색 엔진</td><td>Matrix Science, London, UK; 버전 2.2</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nagarse Solarbio</td><td>P9090</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (SDT)</td><td>Sigma</td><td>56480-25G</td><td>Purum, &ge; 97.0% (T)</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Alere/Axis-Shield</td><td>1002424-1</td><td></td></tr><tr><td>페닐메탄설포닐플루오라이드(PMSF) 프로테아제 억제제</td><td>Solarbio</td><td>P0100-1ML</td><td>PMSF는 세린 잔기와 반응하여 트립신, 키모트립신, 트롬빈 및 파파인을 억제하는 프로테아제 억제제입니다.</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Macklin</td><td>P816354-25G</td><td>염화칼륨, KCI, 또한 muriate 칼륨 및 실바이트로 알려진 무색의 결정질 고체는 776°C에서 녹는 짠 맛을 가지고 있습니다. C (1420 년). 물에는 용해되지만 알코올에는 녹지 않습니다. 염화칼륨은 비료, 제약, 사진 및 소금 대용품으로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Proteome Discover 1.4</td><td>Matrix Science, London, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>Millipore</td><td>05317</td><td>1 롤, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 &micro; m 기공 크기, 웨스턴 블로팅을 위한 낮은 배경 형광을 가진 소수성 PVDF 전달 멤브레인. 가시광선 및 적외선 형광 프로브와 호환됩니다.</td></tr><tr><td>Q Exactive 질량 분석기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCX 컬럼</td><td>Sigma</td><td>58997</td><td>5-&mu입니다. M 입자 크기, 길이 5cm &times; 내경 4.6mm(Supelco).</td></tr><tr><td>오르토바나데이트 나트륨 (V)</td><td>맥클린</td><td>S817660-25G</td><td>오르토바나데이트 나트륨(Vanadate)은 단백질 포스포티로실 포스파르타아제에 대한 일반적인 경쟁 억제제입니다. 오르토바나데이트나트륨에 의한 억제는 EDTA의 첨가 또는 희석에 의해 가역적이다.</td></tr><tr><td>자당</td><td>Macklin</td><td>S824459-500G</td><td>Vetec 시약 등급, 99%</td></tr> <tr><td>Thiourea</td><td>Sigma</td><td>62-56-6</td><td>ACS 시약, &ge; 99.0%</td></tr> <tr><td>트리스 베이스</td><td>시그마</td><td>10708976001</td><td>트리스 베이스는 7.0-9.0의 pH 범위에서 유용합니다. 25°C에서 8.1의 pKa를 갖습니다.</td></tr><tr><td>트립신(세포 배양 사용)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>이 트립신의 액체 제형은 EDTA와 페놀 레드를 함유하고 있습니다. Gibco 트립신-EDTA는 돼지 췌장에서 추출한 프로테아제의 방사선 조사 혼합물인 트립신 분말로 만듭니다. 트립신은 소화 강도로 인해 세포 해리, 일상적인 세포 배양 파시징, 1차 조직 해리에 널리 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378-100G</td><td>분말, BioReagent, 분자생물학용, 세포 배양에 적합</td></tr></tbody></table>

난소암 조직에서 미토콘드리아의 준비 및 정량적 프로테오믹스 분석을 위한 난소 조직 제어

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

난소암은 사망률이 높지만 분자 메커니즘이 불분명한 일반적인 부인과 암입니다. 대부분의 난소암은 치료를 심각하게 방해하는 고급 단계에서 진단됩니다. 미토콘드리아 변화는 인간 난소암의 특징이며, 미토콘드리아는 에너지 대사, 세포 신호 및 산화 스트레스의 중심입니다. 난소암의 미토콘드리아 프로테오메의 변화에 대한 심층적인 통찰력은 난소암의 분자 메커니즘에 대한 심층적인 이해와 효과적이고 신뢰할 수 있는 바이오마커 및 치료 표적의 발견에 도움이 될 것입니다. 인간 난소암을 분석하고 미토콘드리아 프로테옴을 조절하기 위해 상대적 및 절대정량화(iTRAQ) 정량적 프로테오믹스를 위한 이소바릭 태그와 결합된 효과적인 미토콘드리아 제제 방법이 여기에 제시되고, 차동 속도 원심분리, 밀도 구배 원심분리, 미토콘드리아 시료의 품질 평가, 트립신을 함유한 단백질 소화, iTRAQ 라벨링, 강력한 양이온 교환 분획(SCX), 액체 크로마토그래피(LC), 탠덤 질량 분석법(MS/ MS), 데이터베이스 분석, 미토콘드리아 단백질의 정량분석. 많은 단백질은 인간 난소암 미토콘드리아 프로테오메의 커버리지를 최대화하고 인간 난소암에서 차별적으로 발현된 미토콘드리아 단백질 프로파일을 달성하기 위해 성공적으로 확인되었습니다.

난소암 조직및 대조군 난소 조직에서 미토콘드리아의 준비에 차이가 있었다. 이 연구는 난소 암 조직에서 미토콘드리아를 대조군 난소 조직보다 훨씬 쉽게 준비하는 것이3,4. 몇몇 개선은 통제 난소 조직에서 미토콘드리아의 준비를 위한 프로토콜에 이루어져야 했습니다. 먼저, 조직 균질화에 앞서, 다진 대조군 조직에 첨가된 PBS 용액에 0.05% 트립신/20 mM EDTA의 8 mL을 추가하고, 실온에서 30분 동안 소화하고, 5분 동안 200 x g에서 원심분리를 추가해야 하였다(프로토콜 단계 2.5 참조). 이것은 미토콘드리아의 준비를 향상시켰습니다. 둘째, 불연속 밀도 구배는 대조군 난소 조직 및 난소암 조직으로부터미토콘드리아의 제조를 위해 상이하였다(도1). 난소암 조직을 위해 34의 5 mL, 3...

이 문서는 인간 난소 암 조직에서 미토콘드리아를 분리하고 정량적 프로테오믹스 분석을 위한 난소 조직을 통제하기 위해 밀도 구배 원심분리와 함께 차동 속도 원심분리의 프로토콜을 제시합니다. 인간 난소암 미토콘드리아 프로테오메의 고품질 미토콘드리아 시료 및 높은 처리량 및 높은 재현성 정량적 프로테오믹스 분석의 결과.

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

미토콘드리아 변화는 인간 난소암에서 중요한 역할을 합니다. 이 프로토콜은 인간 난소암및 대규모 프로테오믹스 분석을 위한 통제 조직으로부터 미토콘드리아를 분리하고 정화하는 효과적인 플랫폼을 확립한다. 미토콘드리아는 에너지 대사, 세포 신호 및 산화 스트레스의 중심지로서 난소암의 미토콘드리아 프로테오메 변화에 대한 통찰력은 우리의 이해 분자 메커니즘에 도움이 되며 효과적인 바이오마커및 치료 표적을 발견합니다.이 기술은 밀도 그라데이션 원심분리와 함께 차분 속도 원심분리를 사용하여 제어 조직에서 인간 난소암과 미토콘드리아를 분리하여 정량적 프로테오믹스 분석을 위한 고품질 미토콘드리아 샘플을 생성합니다. iTRAQ 정량 프로테오믹스와 결합된 미토콘드리아 제제는 다른 조직인 미토콘드리아 프로테오믹스를 쉽게 분석하는 인간 난소암 조직의 분석에 성공적으로 사용되었습니다. 이 방법을 수행 한 적이없는 사람들은 암 조직보다 난소 제어에서 미토콘드리아를 분리하는 것이 어려울 수 있음을 발견 할 수 있습니다.그것은 제어 조직 균질화를 개선하고 미토 콘 드리아 분리를 개선하기 위해 밀도 그라데이션 배지의 여분의 층을 추가하기 위해 트립신을 추가 할 필요가있다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 미토콘드리아 격리 버퍼의 250 밀리리터를 준비합니다. 깨끗한 유리 접시에 약 1.5 그램의 난소암 조직을 놓습니다.미리 차가운 미토콘드리아 절연 버퍼 2밀리리터를 추가하여 조직 표면에서 혈액을 가볍게 씻어줍니다. 이 세척을 세 번 반복합니다. 그런 다음 깨끗한 안과 가위를 사용하여 조직을 약 1 입방 밀리미터의 조각으로 완전히 다진 다음 다진 조직을 50 밀리리터 원심분리관으로 옮기습니다.밀리리터당 0.2 밀리그램의 농도로 나구를 함유한 미토콘드리아 절연 버퍼 13.5 밀리리터를 추가합니다. 전자 균질화제를 사용하여 다진 조직을 섭씨 4도에서 2분 동안 균질화합니다. 그 후, 조직균질에 미토콘드리아 절연 버퍼의 또 다른 3 밀리리터를 추가하고 파이펫팅하여 잘 섞는다.원심 분리기 준비 된 조직 은 1, 300 xg, 그리고 섭씨 4도에서 10 분 동안 균모합니다. 펠릿을 제거하고 상체를 유지합니다. 다음으로, 상류체는 10, 000 xg, 섭씨 4도에서 10분 동안 상류체를 원심분리합니다.미세한 함유 상체를 제거하고 펠릿을 유지합니다. 미토콘드리아 절연 버퍼 2 밀리리터를 추가하고 가벼운 파이펫팅으로 펠릿을 철저히 중단합니다. 원심 분리기 7, 000 xg 및 섭씨 4도에서 10 분 동안이 펠릿 서스펜션.상체를 버리고, 조잡한 미토콘드리아가 들어있는 펠릿을 보관하십시오. 추출된 원유 미토콘드리아를 다시 중단하기 위해 25% 밀도 그라데이션 배지의 12 밀리리터를 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다시 중단된 원유 미토콘드리아를 포함하는 불연속 밀도 그라데이션을 만들고, 원심분리기는 52, 000xg, 그리고 섭씨 4도에서 90분 동안 만듭니다.길고 무딘 주사기를 사용하여 25%와 30%의 그라데이션 배지 사이의 인터페이스에서 정제된 미토콘드리아를 수집하고 이를 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 수집된 미토콘드리아에 미토콘드리아 절연 버퍼를 추가하여 3배 부피로 희석합니다. 15, 000 xg의 원심 분리기, 섭씨 4도에서 20 분 동안.상체를 버리고 펠릿을 보관하십시오. 정제된 미토콘드리아가 들어있는 최종 펠릿을 수집하고 섭씨 20도에 보관하십시오. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 미토콘드리아 절연 버퍼250밀리리터를 준비합니다.깨끗한 유리 접시에 일반 제어 난소 조직의 약 1.5 그램을 추가합니다. 미리 차가운 미토콘드리아 절연 버퍼 2밀리리터를 추가하여 조직 표면에서 혈액을 가볍게 씻어줍니다. 이 세척을 세 번 반복합니다.깨끗한 안과 가위를 사용하여 조직을 약 1입방 밀리미터의 조각으로 완전히 다진 다음 다진 조직을 깨끗한 50 밀리리터 튜브로 옮기습니다. 0.05%의 트립신과 20 밀리몰러 EDTA 및 PBS를 함유한 용액의 8밀리리터를 다진 대조조직에 추가하고, 실온에서 30분 동안 소화하여 세포를 분해하고 미토콘드리아를 방출합니다. 5 분 동안 200 xg에서 원심 분리기.상체를 버리고 조직과 세포를 유지합니다. 밀리리터당 0.2밀리그램의 농도로 나구를 함유한 미토콘드리아 절연 완충제 13.5밀리리터를 추가하고, 전기 균질화제를 사용하여 다진 조직을 섭씨 4도에서 균질화합니다. 미토콘드리아 절연 버퍼의 또 다른 3 밀리리터를 조직에 균질화하고 파이펫팅하여 완전히 섞는다.원심 분리준비 된 조직 은 1, 300 xg 및 섭씨 4도에서 10 분 동안 동종합니다. 펠릿을 제거하고 상체를 유지합니다. 10, 000 xg및 섭씨 4도에서 10 분 동안 상피 원심 분리합니다.미성수체가 포함된 상체를 제거하고 펠릿을 유지합니다. 그런 다음 미토콘드리아 절연 버퍼 2 밀리리터를 추가하고 가벼운 파이펫팅으로 펠릿을 철저히 중단합니다. 원심 분리기 7, 000 xg 및 섭씨 4도에서 10 분 동안이 펠릿 서스펜션.상체를 버리고 조잡한 미토콘드리아가 들어있는 펠릿을 보관하십시오. 추출된 원유 미토콘드리아를 다시 중단하기 위해 25% 밀도 그라데이션 배지의 12 밀리리터를 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 미토콘드리아조를 함유한 불연속 밀도 그라데이션을 만들고, 원심분리기는 52, 000xg, 섭씨 4도에서 90분 동안 만듭니다.길고 무딘 주사기를 사용하여 25~30% 그라데이션 배지 사이의 인터페이스에서 34~38%의 그라데이션 배지 사이의 인터페이스까지 다양한 범위에서 정제된 미토콘드리아를 수집한다. 정제된 미토콘드리아를 깨끗한 튜브로 옮는다. 수집된 미토콘드리아에 미토콘드리아 절연 버퍼를 추가하여 3배 부피로 희석합니다.15, 000 xg및 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심 분리기를 폐기하고 상류부를 폐기하십시오. 미토콘드리아 절연 버퍼 2밀리리터를 추가하여 펠릿과 원심분리기를 15, 000 xg, 섭씨 4도에서 20분 동안 다시 중단합니다. 상체를 버리고 펠릿을 유지합니다.최종 펠릿을 수집하고 섭씨 20도에 보관하십시오. 이 연구에서는, 고품질 미토콘드리아 견본은 인간 난소암 및 대규모 정량성 proteomics를 위한 통제 조직에서 제조됩니다. 난소암 조직으로부터 미토콘드리아의 제조에 몇 가지 차이가 있으며, 다른 불연속 밀도 그라데이션을 사용하는 것을 포함하여 난소 조직을 제어합니다.원심분리 후 난소암 조직으로부터정제된 미토콘드리아는 25%에서 30%사이의 계면에서 발견되는 반면, 제어난소 조직에서 온 사람들은 25%와 30%사이의 계면에서 34%와 38%사이의 인터페이스에서 발견되는 반면, 제조된 미토콘드리아의 품질은 그 때 다른 미세 중구 및 원각성 심근으로 평가된다. 전자 현미경 이미지는 난소암과 통제 난소 조직에서, 고립된 주요 세포기관이 소량의 peroxisomes를 제외하고 미토콘드리아임을 보여줍니다. 그러나, 미토콘드리아의 형태는 난소 조직을 통제하기 보다는 난소암에서 더 많은 것을 바꾸기 위하여 보입니다.준비된 미토콘드리아의 품질은 또한 서쪽 얼룩을 통해 평가됩니다. 서부 블롯 이미지는 또한 난소암및 제어 난소에서 제조된 미토콘드리아 샘플의 주요 성분이 전자 현미경 분석과 일치하는 소량의 peroxisomes를 제외하고는 미토콘드리아임을 보여줍니다. 미토콘드리아가 퍼록시좀과 광범위하게 상호 작용하기 때문에 퍼록시솜이 제조된 미토콘드리아에 함유되는 것이 합리적이며, 이는 미토콘드리아의 기능적 완전성을 반영한다.이러한 결과는 준비된 미토콘드리아 샘플의 고품질을 보여줍니다. 이 절차를 수행할 때 균질화 하기 전에 조직을 완전히 다진 하 고 다진 제어 조직에 트립신을 추가하는 것이 매우 중요합니다. 또한 암 샘플 및 대조군을 위해 불연속 밀도 그라데이션을 만들고 제조하는 것도 중요합니다.이 절차에 따라 iTRAQ 또는 TMT 정량성 프로테오믹스 또는 인포프로테오믹스는 난소암 미토콘드리아 프로테오메 프로파일을 명확히 하기 위해 수행될 수 있으며, 인포프로테오메 프로파일은 난소암에서 미토콘드리아의 역할을 큰 깊이에서 명확히 하기 위해 확립될 수 있다. 이 기술은 연구원이 체계적으로 난소암에서 미토콘드리아 proteome및 인포프로테오메를 연구하고, 신호 경로 네트워크 시스템을 구축하고, 신뢰할 수 있는 바이오마커및 치료 표적을 발견하는 길을 열어줍니다.

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이 동영상은 밀도 구배 원심분리와 함께 차등 속도 원심분리를 사용하여 인간 난소암 조직에서 미토콘드리아를 분리하는 절차를 설명합니다. 분리된 미토콘드리아는 인간 난소암 미토콘드리아 단백질체의 단백질체 분석에 사용할 수 있습니다.

미토콘드리아 분리: 인간 난소암 조직 샘플에서 미토콘드리아를 분리하는 기술

이 프로토콜은 난소 절치와 나팔관 암 세포를 공동 배양하여 검체 준비 기술을 설명합니다. 이러한 샘플은 이미징 질량 분광법(IMS)을 사용하여 시각화하여 종양 발생으로 이어지는 세포와 조직 간의 소분자 교환을 감지합니다.

이미징 질량 분석 분석을 위한 난소암 커뮤니케이션 모델링: 전이성 난소 종양 발달에서 소분자 화학 전달자를 식별하는 방법

이 연구는 고체 임상 검체에서 기본 난소 암 세포의 분리 및 특성에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 난소 암 임상 검체는 다운 스트림 애플리케이션에 매우 적합 가능한, 섬유 아세포없는 상피 난소 암 (EOC) 세포를 얻기 위해 소화 효소를 실시하고 있습니다.

고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

여기에서는 소량의 마우스 골격근에서 고품질의 정제된 미토콘드리아를 분리할 수 있도록 이전에 보고된 방법의 변형을 제시합니다. 이 절차는 마이크로플레이트 기반 호흡기 분석 중에 높은 기능으로 호흡하는 고도로 결합된 미토콘드리아를 생성합니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

면역조직화학 염색 및 16S 리보소말 RNA 유전자(16S rRNA 유전자) 시퀀싱은 시투에서 암 및 비암 난소 조직에서 박테리아를 발견하고 구별하기 위해 수행되었다. 박테리아의 구성 및 기능적 차이는 관찰되지 않은 국가의 재건에 의해 지역 사회의 BugBase 및 Phylogenetic 조사를 사용하여 예측되었다 (PICRUSt).

난소 조직에서 박테리아의 특성화 및 기능적 예측

우리는 신선한 종양 균질화에서 미토콘드리아 산화 인산화 및 전자 전달 용량을 평가하기 위한 실용적인 프로토콜 및 분석 접근법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 암 개시, 진행 및 치료 반응에 기여하는 다양한 미토콘드리아 기능을 조사하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다.

절제된 고형 종양 균질화의 미토콘드리아 기능의 분석 적 결정

우리는 프로테옴 규모에서 단백질 발견 및 정량화와 호환되는 고품질 미토콘드리아 분리를 위한 2단계 프로토콜을 제시합니다. 우리의 프로토콜은 유전 공학을 필요로하지 않으므로 모든 일차 세포와 조직에서 미토콘드리아를 연구하는 데 적합합니다.

단백질 발견 및 정량 분석을 개선하기 위한 미토콘드리아의 2단계 태그 없는 분리

이 프로토콜은 암세포-omentum 상호 작용의 3차원(3D) 생체 외 모델의 확립을 설명합니다. 이 모델은 지방 틈새 시장 내에서 종양 유발 기전을 규명하고 새로운 치료법을 테스트하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

인간 Omentum을 사용한 난소암 복막 전이의 생체 외 모델

이 프로토콜은 소량의 샘플만 사용할 수 있는 경우 호흡기 초복합체를 분석하는 기술을 설명합니다.

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리) 

이 프로토콜은 레이저 캡처 미세해부를 이용해 교모세포종 샘플로부터 충분한 고품질 신생혈관 조직을 성공적으로 준비하여 종양 혈관형성의 정량적 단백질체학 분석을 수행하여, 전통적으로 주로 혈관형성 인자에 초점을 맞춘 연구의 한계를 극복하고 교세포종 혈관신생의 대규모 단백질체학 프로파일을 제공하였습니다.

종양 혈관신생의 정량적 단백질체학 분석을 위한 인간 교모종 조직에서 신생혈관 조직 준비

학습하세요 난소암 및 대조 조직에서 미토콘드리아를 분리하고 정제하는 방법을 통해 정량적 프로테오믹스 분석을 수행하는 기술입니다. 이 프로토콜은 생물학적 표지자와 치료 표적 발견에 활용됩니다.

난소암 조직에서 미토콘드리아의 준비 및 정량적 프로테오믹스 분석을 위한 난소 조직 제어

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