Name: 생물학적 활성 Coralline Matrix를 사용한 해리 된 신경 세포 배양의 내구성 향상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 학습하세요 산호골격 매트릭스를 이용한 해리된 신경세포 배양법으로 뉴런과 신경교세포의 생존율과 재생을 촉진하는 방법입니다. 이 기술은 재생의학 및 뇌손상 치료 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 이스라엘 무역 노동부의 KAMIN 프로그램과 Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, US에서 자금을 지원했습니다.

이 프로토콜에서 동물의 사용은 국가 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
참고: 탄산칼슘 산호 골격은 아라고나이트의 결정 형태로 사용해야 합니다. 지금까지 신경 배양에 대해 테스트 된 산호 유형은 Porites Lutea, Stylophora Pistillata 및 Trachyphyllia Geoffroyi입니다. 해골은 전체 또는 지상으로 구입할 수 있습니다.
1. 산호 골격 조각 청소
주의 : 아래 설명된 용액은 위험하고 화상과 자극을 유발할 수 있으므로 실온의 화학 후드에서 다음 단계를 수행해야 합니다.
<ol><li>망치를 사용하여 산호 골격을 부수고 0.5-2cm 조각으로 나눕니다. 유기 및 비 유기 잔류 물을 용해시키기 위해 산호 골격 조각을 10 % 차아 염소산 나트륨 용액에 10 분 동안 담근 다음 이중 증류수 (DDW)로 한 번 씻으십시오.</li>
	<li>남아있는 유기 잔류 물을 제거하려면 1M NaOH 용액에 5 분 동안 담근 다음 DDW로 한 번 씻으십시오. 단편을 30%H2O2용액에 10분 동안 담궈 유기 침전물의 제거를 계속한 다음, 단편을 DDW로 3x 세척한다.</li>
	<li>가능한 한 많은 DDW를 제거하고 후드의 산호 조각을 건조시킵니다 (1-8 시간).</li>
</ol>2. 유리 커버슬립 청소
<ol><li>유리 커버슬립을 100mm 유리 페트리 접시에 옮깁니다. 95% 에탄올 10mL를 15분 동안 넣습니다.</li>
	<li>에탄올을 제거하고 DDW 3x로 세척하고 각 세척 사이에 10 분을 기다립니다. DDW가 증발할 때까지 80°C로 예열된 가열판에 접시를 놓습니다. 건조하는 동안 플레이트 안의 커버슬립이 서로 달라붙지 않도록 여러 번 부드럽게 저어줍니다.</li>
	<li>커버슬립을 오토클레이브합니다.</li>
</ol>3. 산호 골격 알갱이의 제조
<ol><li>산호 골격 조각을 박격포와 유봉 (수동 분쇄)을 사용하여 완전히 분해 될 때까지 분쇄하십시오. 결과는 20 μm-200 μm 범위의 입자 혼합물입니다.</li>
	<li>또는 전기 연삭기를 사용하여 30 초 동안 1,000rpm의 속도로 산호 골격 조각을 분쇄합니다 (블레이드 길이 = 6cm, 너비 = 0.5cm-1.0cm). 생성 된 입자 크기는 수동 분쇄에 의해 생성 된 크기 범위와 유사합니다.</li>
</ol>4. 특정 크기 범위의 입자 정제
알림: 매트릭스의 입자 크기를 제어하려는 경우 다음 여과 기반 입자 정제 절차를 사용하십시오.
<ol><li>곡물을 수동 또는 전기식 40μm 필터 메쉬 스트레이너로 옮깁니다.</li>
	<li>스트레이너를 통해 곡물을 체질하여 곡물을 두 개의 특정 범위로 나눕니다(전기 여과기를 사용하는 경우 다음 조건이 권장됩니다: 흔들림 = 600amplitudes/min, 바운싱 = 6/s). 이 절차는 입자 크기의 두 그룹, 즉 하나는 <40μm이고 두 번째는 >40μm입니다. 알림: 두 가지 크기는 다양한 메쉬의 스트레이너를 사용하여 결정할 수 있습니다. 더 제한된 범위가 필요한 경우 4.2 단계에서 다른 메쉬를 가진 스트레이너를 통해 각 그룹을 다시 체로 만듭니다.</li>
	<li>곡물을 고압 증기 멸균하십시오.</li>
</ol>5. 산호 곡물 코팅 접시 또는 커버 슬립의 준비
<ol><li>플라스크, 접시 또는 페트리 접시 코팅용 알림: 다음 단계는 멸균 조건에서 수행해야 합니다.<ol><li>행크스 용액에 용해 된 20 μg / mL 폴리 -D- 라이신 (PDL) 용액에 산호 골격 알갱이를 첨가합니다. 권장 농도는 PDL 용액 1mL당 곡물 5mg/10mg입니다.</li>
		<li>용액을 플라스크와 접시(약 2mL/25cm2)에 붓고 4°C에서 밤새 배양합니다. 곡물은 가라 앉고 바닥에 붙어 있습니다.</li>
		<li>다음날, 플라스크와 접시를 멸균 DDW로 한 번 씻으십시오. 플라스크와 접시를 후드에서 말리십시오. 알림: 갓 코팅된 플라스크와 접시를 사용하는 것이 좋습니다. 코팅된 플라스크 및 접시는 4°C에서 보존하면 코팅 후 최대 일주일까지 사용할 수 있습니다. 그러나 매트릭스의 효율성이 저하 될 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>코팅 유리 커버슬립(직경 12mm, 두께 0.17mm)<ol><li>원하는 농도로 DDW에 산호 골격 알갱이를 추가하십시오. 신경 세포에 사용되는 일반적인 밀도는 5mg/mL 및 10mg/mL입니다. 40μL의 곡물 용액을 커버슬립 중앙에 붓습니다(그림 4).</li>
		<li>80°C로 예열된 가열판에 커버슬립을 놓고 완전히 증발할 때까지 기다립니다(보통 15분). 이러한 조건 하에서, 곡물은 커버 슬립에 부착됩니다. 코팅된 커버슬립을 오토클레이브합니다. 멸균 상태에서 보관하십시오.</li>
		<li>배양 하루 전, 멸균 된 24 웰 플레이트의 뚜껑에 커버 슬립을 놓습니다. 각 커버슬립에 20μg/mL PDL 용액 100μL를 추가합니다. 팁을 사용하여 액체가 전체 입자 영역과 나머지 커버슬립 표면을 덮도록 합니다.</li>
		<li>접시 바닥으로 뚜껑을 덮으십시오. 플레이트의 측면을 파라핀 필름으로 감 쌉니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
		<li>다음날 DDW로 한 번 씻고 후드에서 말립니다. 알림: 갓 코팅된 커버슬립을 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 산호 골격 곡물 코팅 유리 커버 슬립에서 해마 해리 세포의 배양
참고: 해마 해리 세포 배양 방법은 이전에 발표된 절차24,27에서 수정되었습니다. 배양 물의 준비는 4 마리의 쥐 새끼에 대해 설명된다. 각 해마의 예상 수율은 1-1.5 x 106 세포입니다.
<ol><li>설치<ol><li>빈 60mm 페트리 접시를 준비합니다. 최소 필수 배지(MEM) 2mL를 60mm 페트리 접시에 붓고 얼음 위에 올려 놓습니다.</li>
		<li>MEM 2mL를 35mm 접시에 붓고 37°C, 5–10%CO2의 인큐베이터에 넣습니다. 2mL의 MEM을 15mL 튜브에 붓고 4°C에서 유지합니다.</li>
		<li>First Day Medium 1mL를 15mL 튜브에 붓고 37°C, 5-10%CO2의 인큐베이터에 넣는다. 참고: First Day Medium의 구성은 재료 표에 설명되어 있습니다.</li>
		<li>2.5% 트립신 용액 200μL를 해동하고 37°C에서 배양합니다.</li>
		<li>화염을 사용하여 직경 0.5mm, 0.75mm 및 1.0mm 헤드가 있는 유리 파스퇴르 피펫 3개를 준비합니다.</li>
		<li>적절한 수술 도구를 준비하십시오 : 큰 가위 1 개, 작은 가위 2 개, 큰 핀셋 1 개, 작은 핀셋 4 개, 메스 1 개.</li>
		<li>후드에 실체 현미경을 준비하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>큰 가위를 사용하여 0-3일 된 Sprague Dawley 쥐 새끼의 머리를 몸에서 분리하여 빈 60mm 페트리 접시에 넣어 희생합니다(6.1.1단계). 시체를 처리하십시오.</li>
	<li>큰 핀셋으로 입에서 머리를 잡고 들어 올리십시오. 작은 가위로 두개골을 덮고있는 피부를 자릅니다.</li>
	<li>깨끗한 가위로 두개골 아래(소뇌 측면)로 들어가 두개골을 오른쪽과 왼쪽으로 잘라 제거할 수 있도록 합니다. 작은 핀셋을 사용하여 뇌에서 두개골을 떼어냅니다.</li>
	<li>깨끗한 핀셋으로 뇌를 머리에서 분리하고 60mL의 차가운 MEM이 들어 있는 2mm 페트리 접시에 넣습니다(6.1.2단계 참조).</li>
	<li>두 개의 작은 핀셋을 사용하여 실체 현미경으로 해마를 해부합니다. 해마를 MEM이 들어있는 준비된 35mm 접시 (6.1.2 단계)에 옮깁니다. 알림: 각 강아지에 대해 6.3–6.6단계를 반복해야 합니다.</li>
	<li>메스를 사용하여 해마를 약 1mm 조각으로 자릅니다. 트립신 용액 200 μL를 첨가한다 (0.25%의 최종 농도로 희석한다). 부드럽게 혼합하고 37 °C, 5–10 % CO2 에서 30 분 동안 배양합니다.</li>
	<li>배양 후 2mL의 차가운 MEM(단계 6.1.2)을 접시에 넣어 트립신을 비활성화합니다. 트립신화된 조직을 37°C로 예열된 1 mL First Day Medium이 들어있는 15 mL 튜브로 옮기고(단계 6.1.3) 가장 큰 직경을 갖는 유리 파스퇴르 피펫을 사용한다(단계 6.1.5). 참고: 조직의 추가 처리를 위한 최상의 배지 대 조직(v:v) 비율은 1mL/8 해마입니다. 가능한 한 조직과 함께 배지를 옮기지 마십시오.</li>
	<li>조직을 가장 큰 직경의 유리 피펫에 10-15 번 통과시켜 분쇄하십시오. 그런 다음 중간 직경의 유리 피펫을 사용하여 이 과정을 반복합니다. 가장 작은 직경의 파이펫으로 연삭을 계속하십시오. 세포 사멸을 줄이기 위해 버블링을 피하십시오.</li>
	<li>나머지 조직 조각을 2-5분 동안 가라앉힌 다음 상층액을 다른 15mL 튜브로 옮깁니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 참고: 바람직한 세포 밀도는 200,000–400,000 cells/mL입니다. First Day Medium을 사용하여 희석하거나 470 x g 에서 원심분리하여 세포를 농축합니다.</li>
	<li>각 유리 커버슬립에 100μL의 세포를 시드합니다. 씨를 뿌리는 동안 전체 커버 슬립을 세포로 덮으십시오. 37 °C, 5–10%CO2에서 배양합니다.</li>
	<li>다음날, 500 μL의 뉴런 성장 배지를 웰에 첨가한다. 참고: Neuronal Growth Medium의 구성은 재료 표에 설명되어 있습니다.</li>
	<li>커버슬립을 기울여 First Day Medium을 제거하면서 핀셋을 사용하여 각 커버슬립을 적절한 웰로 부드럽게 옮깁니다. 뚜껑에서 남은 매체를 흡입합니다.</li>
	<li>37 °C, 5–10%CO2 에서 배양합니다. 배양하는 동안 배지를 교체하지 마십시오. 배양 물은 이러한 조건 하에서 최대 1 개월까지 유지 될 수 있습니다. 주요 관심사는 습도입니다. 따라서 인큐베이터를 최대한 가습 상태로 유지하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

여기에 제시된 기술은 배양에서 신경 세포의 유지 및 기능을 향상시키는 방법을 설명합니다. 이것은 세포를 키우고 성장과 활동을 촉진하는 산호 골격 알갱이로 만들어진 매트릭스에 세포를 부착함으로써 달성됩니다. 이 기술을 사용하면 뇌의 세포 환경을 모방하는 신경 배양 모델의 능력이 증가합니다.
배양 기질로서 매트릭스의 도입은 고전적인 신경 세포 배양 방법에 사용되는 다른 기질에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 세포 순응도를 높입니다. 산호 골격과 PDL의 조합은 유리 및 PDL(표시되지 않음)보다 더 강한 접착성을 생성합니다. 이러한 접착성의 증가는 배양물에서 부착성 비부유 세포의 생존에 필수적인 것으로 나타났다32. 둘째, 산호 골격 알갱이의 탄산 칼슘 결정은 실제로 세포에 흡수되는 칼슘 이온의 원천입니다. 이것이 산호 골격 매트릭스에 나타난 신경 세포의 내구성 향상과 밀도 증가(그림 5</str...

해리된 신경 세포(이 경우 해마 세포)의 배양은 높은 세포 분리 및 접근성을 제공함으로써 신경 성장 및 기능을 연구하기 위한 귀중한 실험 모델입니다 1,2,3. 이러한 유형의 배양은 성장 및 생존 속도, 신경 독성, 신경 돌기 성장 및 네트워킹, 시냅스 연결 및 가소성, 형태 학적 변형, 신경 돌기 조직 및 배선 등과 같이 수집 할 수있는 많은 양의 정보로 인해 신경 과학, 약물 개발 및 조직 공학에서 자주 사용됩니다.1,4,5,6,7.
배양의 중요성에도 불구하고, 배양 된 세포는 일반적으로 2 차원 단층의 유리 커버 슬립에서 자라도록 강요됩니다. 이러한 엄격한 환경 변형은 시간이 지남에 따라 신경 세포의 생존 능력을 크게 감소시키는데, 이는 유리 커버슬립이 접착 강도가 낮고 세포 성장을 지원하는 능력이 낮기 때문입니다 8,9,10,11.
배양된 신경 세포는 어려운 조건에서 성장해야 하기 때문에 생존을 향상시키기 위한 필수적인 접근 방식은 가능한 한 자연 환경을 모방하는 것입니다12,13. 이것은 매트릭스 역할을 하고 세포의 세포외 기질을 모방하여 조직과 같은 구조를 형성하고 영양을 공급할 수 있도록 하는 생체 재료를 사용하여 달성할 수 있습니다14.
생체 재료의 사용은 생체 적합성 스캐폴드의 역할을 하고 기계적 안정성을 제공하며 접착, 생존, 증식, 이동, 형태 형성 및 분화를 포함한 다양한 세포 특성을 향상시키기 때문에 세포 배양을 개선하는 유망한 접근 방식입니다15,16,17. 시험관 내에서 세포의 상태를 개선하기 위해 여러 유형의 생체 재료가 사용됩니다. 그 중에는 생체 고분자 또는 일반적으로 세포의 세포 외 기질의 일부인 생물학적 성분이 있습니다. 이러한 생체 재료는 주로 중합 코팅제 또는 하이드로겔의 형태로 사용된다(18,19,20). 한편, 위에서 언급한 매트릭스는 세포가 성장할 수 있는 친숙한 3D 환경을 제공하고, 접시에 대한 접착을 촉진하며, 기계적 지지를 제공합니다(21,22). 반면에, 이들의 중합 된 형태와 하이드로 겔 내 세포의 감금은 성장 배지에 존재하는 육성 성분에 대한 세포의 접근을 방해하고 또한 미세한 방법에 의한 세포의 후속 조치를 더 어렵게 만든다23.
산호 외골격은 생물학적 해양 기원 매트릭스입니다. 탄산칼슘으로 만들어졌으며 기계적 안정성이 있으며 생분해성이 있습니다. 산호 골격을 배양에서 성장하는 신경 세포의 매트릭스로 사용한 이전 연구에서는 유리 커버 슬립에 비해 훨씬 더 큰 접착력을 보여주었습니다24,25. 또한, 산호 골격에서 자란 신경 세포는 골격을 구성하는 칼슘을 섭취하는 능력을 입증했으며, 이는 영양 결핍 상태에서 신경 세포를 보호한다26. 또한, 산호 골격은 신경 세포의 생존을 증가시키고, 신경망의 형성을 촉진하고, 시냅스 연결의 속도를 높이고, 조직과 같은 구조의 형성을 가능하게하는지지 및 양육 매트릭스입니다27,28. 최근 연구에 따르면 산호 골격 매트릭스의 표면 지형은 신경교 세포의 분포와 활성화에 중요한 역할을 합니다 8,29. 또한, 산호 골격은 배양에서 골세포30,31, 간세포 및 심근 세포와 같은 다른 세포 유형의 배양을위한 매트릭스로서 효과적이다 (미공개 데이터).
따라서 산호 골격은 시험관 내에서 세포 배양을위한 유망한 매트릭스입니다. 따라서 아래에 자세히 설명 된 프로토콜은 기존 방법으로 달성 한 것보다 더 안정적이고 번영하는 신경 배양을 생산하기 위해 산호 골격에서 신경 세포를 배양하는 기술을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 심근 세포, 간세포 및 다른 세포 유형의 배양에 유용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Greiner</td><td>#60-662160</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>#17504-044</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma</td><td>#A4503</td><td></td></tr><tr><td>D &ndash; 포도</td><td>당 Sigma</td><td>#G8769</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Minimal Essential Eagle(DMEM)</td><td>Sigma</td><td>#D5796</td><td></td></tr><tr><td>Electrical sieve</td><td>Ari Levy</td><td>#3700</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serun (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>#04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>첫날 중간</td><td></td><td></td><td>85.1% 최소 필수 독수리' s 배지(MEM), 11.5% 열 불활성화 소 태아 혈청, 1.2% L-글루타민 및 2.2% D-글루코스.</td></tr><tr><td>Flasks</td><td>Greiner</td><td>#60-690160</td><td>25cm^2, 조직 배양 처리</td></tr><tr><td>플루오로-데옥시-우리딘</td><td>Sigma</td><td>#F0503</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips</td><td>Menzel-Glaser</td><td>#BNCB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Romical</td><td>#007130-72-19</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nutrient</td><td>Mixture Sigma</td><td>#N4888</td><td></td></tr><tr><td>HANK의 솔루션</td><td>Sigma</td><td>#H6648</td><td></td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma</td><td>#K3375</td><td></td></tr><tr><td>L - 글루타민</td><td>Sigma</td><td>#G7513</td><td></td></tr><tr><td>수동 여과기 (40&micro; m)</td><td>VWR</td><td>#10199-654</td><td></td></tr><tr><td>Minimun Essential Eagle (MEM)</td><td>Sigma</td><td>#M2279</td><td></td></tr><tr><td>모르타르 및 유봉</td><td>De-Groot</td><td>4-P090</td><td></td></tr><tr><td>NaClO(차아염소산나트륨)</td><td>Sigma</td><td>#425044</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>#S8045</td><td>위험한</td></tr><tr><td>신경 세포 성장 배지</td><td></td><td></td><td>MEM 45%, 둘베코 변형 독수리 배지(DMEM) 40%, 영양소 혼합물 F-12 햄 10%, 소 혈청 알부민(BSA) 0.25%(w/v), D-글루코스 0.75%, L-글루타민 0.25%, B-27 보충제 0.5%, 키누렌산 0.1%, 70% 우리딘 0.01% 및 플루오로-데옥시-우리딘 30%.</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Greiner</td><td>#60-628160, #60-627160</td><td>각각 60mm, 35mm.</td></tr><tr><td>폴리 D &ndash; 라이신</td><td>시그마</td><td>#P7280</td><td></td></tr><tr><td>스마트 상아질 그라인더</td><td>KometaBio</td><td>#GR101</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>#15-090-046</td><td></td></tr><tr><td>우리딘</td><td>시그마</td><td>#U3750</td><td></td></tr></tbody></table>

생물학적 활성 coralline matrix를 사용한 해리 된 신경 세포 배양의 내구성 향상

Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

해리된 해마 신경 세포 및 신경교 세포의 배양은 높은 세포 격리와 통제된 환경을 제공함으로써 신경 성장 및 기능을 연구하기 위한 귀중한 실험 모델입니다. 그러나, 시험관 내에서 해마 세포의 생존은 손상된다 : 대부분의 세포는 배양 첫 주 동안 죽는다. 따라서 배양에서 신경 세포의 내구성을 높이는 방법을 식별하는 것이 매우 중요합니다.
산호의 골격에서 유래 한 결정질 아라고나이트 형태의 탄산 칼슘은 신경 배양을위한 우수한 활성 매트릭스로 사용될 수 있습니다. 신경교 세포를 육성, 보호 및 활성화함으로써 산호 골격은 다른 매트릭스보다 시험관 내에서 이러한 세포의 생존과 성장을 더 잘 향상시킵니다.
이 프로토콜은 산호 매트릭스에서 해마 세포를 배양하는 방법을 설명합니다. 이 매트릭스는 산호 골격 알갱이를 배양 접시, 플라스크 및 유리 커버 슬립에 부착하여 생성됩니다. 곡물은 세포를 미세한 3차원(3D) 환경에 도입하여 성장하고 조직과 같은 구조를 형성함으로써 세포의 환경을 개선하는 데 도움이 됩니다. 산호 골격에 의해 도입 된 3D 환경은 분쇄를 통해 세포에 최적화 될 수 있으며, 이는 신경교 세포 활동에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 특성 인 입자의 크기와 밀도 (즉, 매트릭스 거칠기)를 제어 할 수 있습니다. 또한, 곡물을 사용하면 특히 광학 현미경을 사용할 때 배양을 더 쉽게 관찰하고 분석할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜에는 시험관 내에서 신경 세포의 유지 및 기능을 개선하기 위한 도구로서 산호 매트릭스의 생성 및 최적화를 위한 절차가 포함됩니다.

산호 골격 매트릭스를 준비하기 위해 전체 산호 골격 (그림 1A)을 망치 (그림 1B)를 사용하여 0.5-2cm 조각으로 나누고 10 % 차아 염소산염 용액, 1M NaOH 용액 및 30 % H 2 O2용액 (그림 1C)을 사용하여 3 단계 (프로토콜의 1 단계)를 통해 유기 잔류 물로부터 철저히 세척했습니다. 산호 조각은 골격 색이 갈색 (그림 1D)에서 흰색 (그림 1E)으로 변했을 때 잘 청소되었습니다. 그런 다음 세척된 조각(그림 2A)을 모르타르와 유봉(그림 2B) 또는 전기 연삭기(그림 2C)를 사용하여 분쇄했습니다</stro...

해리 된 해마 세포 배양은 신경 과학에서 중추적 인 실험 도구입니다. 산호 골격이 신경 보호 및 신경 조절 역할로 인해 매트릭스로 사용될 때 배양에서 신경 세포 생존과 기능이 향상됩니다. 따라서 산호 기질에서 자란 신경 세포는 더 높은 내구성을 나타내므로 배양에 더 적합합니다.

생물학적 활성 Coralline Matrix를 사용한 해리 된 신경 세포 배양의 내구성 향상

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

이 프로토콜의 중요성은 in vitro에서 뉴런, 신경교세포 및 줄기세포의 내구성과 성장을 증가시키는 새로운 방법을 제공한다는 것입니다. 다른 세포에도 적용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 산호 골격으로 만든 매트릭스를 사용한다는 것입니다.이 기질은 신경 세포에 영양을 공급하고 보호하며 재성장을 촉진합니다. 체외(in vitro)에서 신경 세포를 지지하는 산호 골격은 뇌 손상 부위에 재생 임플란트로 유사하게 기능할 수 있습니다. 시작하려면 망치를 사용하여 산호 골격을 부수고 0.5에서 2cm 조각으로 나눕니다.유기 및 비유기 잔류물을 용해하려면 산호 골격 조각을 10% 차아염소산나트륨 용액에 10분 동안 담그십시오. 그런 다음 이중 증류수로 한 번 씻으십시오. 남아 있는 유기 잔류물을 제거하려면 1몰 수산화나트륨 용액에 조각을 5분 동안 담근 다음 이중 증류수로 한 번 씻습니다.파편을 30% 과산화수소 용액에 10분 동안 담궈 유기 침전물 제거를 계속하고 이중 증류수로 파편을 세 번 씻습니다. 여분의 이중 증류수를 가능한 한 많이 제거하고 후드의 산호 조각을 건조시키십시오. 그런 다음 100mm 유리 페트리 접시에 95% 에탄올 100ml에 유리 커버 슬립을 담그고 청소합니다.15분 후 에탄올을 제거하고 이중 증류수로 3회 세척하고 각 세척 사이에 10분을 기다립니다. 이중 증류수를 제거하고 섭씨 80도의 예열된 가열판에 접시를 놓습니다. 그런 다음 이중 증류수가 증발할 때까지 덮개 슬립을 부드럽게 저어줍니다.커버 슬립을 오토클레이브합니다. 산호 골격 조각을 절구와 절굿공이를 사용하여 완전히 분해될 때까지 갈아줍니다. 20 내지 200 마이크로미터 크기의 입자의 혼합물을 얻어진다.또는 블레이드 길이가 6cm이고 너비가 0.5-1cm인 전기 연삭기를 사용하여 1000RPM의 속도로 30초 동안 산호 골격 조각을 분쇄합니다. 곡물을 정제하려면 곡물을 전기 40 미크론 필터 메쉬 스트레이너로 옮깁니다. 전기 스트레이너 설정을 분당 600진폭으로 흔들고 초당 6번 바운스하도록 조정합니다.그런 다음 곡물을 오토클레이브합니다. 무균 조건에서 산호 골격 알갱이를 1밀리리터 PDL 용액당 5mg 또는 10밀리그램의 농도를 얻기 위해 행크 용액에 용해된 20마이크로그램 PDL에 추가합니다. 용액을 25제곱센티미터당 약 2밀리리터의 농도로 플라스크와 접시에 붓고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.알갱이가 가라앉고 바닥에 붙습니다. 다음날 플라스크와 접시를 멸균 이중 증류수로 한 번 씻으십시오. 플라스크와 접시를 후드에서 말리십시오.유리 커버 슬립을 코팅하려면 먼저 산호 골격 알갱이를 밀리리터당 5 또는 10밀리그램 농도의 이중 증류수에 첨가합니다. 섭씨 80도로 예열된 가열판에 커버 슬립을 놓습니다. 그런 다음 40마이크로리터의 곡물 용액을 커버 슬립 중앙에 떨어뜨리고 완전히 증발할 때까지 15분 동안 기다립니다.이로 인해 입자가 커버 슬립에 달라붙게 됩니다. 코팅된 커버 슬립을 오토클레이브하고 멸균 상태로 보관하십시오. 다음으로, 멸균 24웰 플레이트의 뚜껑에 커버 슬립을 놓고 각 커버 슬립에 밀리리터당 20마이크로그램 PDL 용액 100마이크로리터를 추가합니다.팁을 사용하여 액체가 전체 입자 영역과 커버 슬립 표면의 나머지 부분을 덮도록 합니다. 접시 바닥으로 뚜껑을 덮고 파라핀 필름으로 그 자리의 측면을 감쌉니다. 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.다음날 더블 증류수로 커버 슬립을 한 번 세탁하고 후드에서 말리십시오. 쥐 강아지 머리를 준비한 후 큰 핀셋으로 입에서 잡습니다. 두개골을 덮고 있는 피부를 작은 가위로 자릅니다.깨끗한 가위로 소뇌 측면의 두개골 아래로 들어가 두개골을 오른쪽과 왼쪽으로 잘라 제거할 수 있도록 합니다. 작은 핀셋을 사용하여 뇌에서 두개골을 떼어냅니다. 머리에서 뇌를 분리하여 2밀리리터의 차가운 MEM이 들어 있는 60mm 페트리 접시에 넣습니다.실체 현미경으로 두 개의 작은 핀셋을 사용하여 해마를 해부합니다. MEM이 들어 있는 준비된 35mm 접시에 해마를 옮깁니다. 메스를 사용하여 해마를 약 1mm 조각으로 자릅니다.트립신 용액 200마이크로리터를 추가합니다. 부드럽게 섞어 섭씨 37도에서 5-10%의 이산화탄소를 30분 동안 배양합니다. 배양 후 접시에 2ml의 차가운 MEM을 첨가하여 트립신을 비활성화합니다.그런 다음 직경이 가장 큰 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 트립신화된 조직을 섭씨 37도로 예열된 1일차 배지 1밀리리터가 들어 있는 15ml 튜브로 옮깁니다. 가장 큰 직경의 유리 피펫에 조직을 통과시켜 10-15회 분쇄합니다. 그런 다음 중간 직경의 유리 피펫을 사용하여 이 과정을 반복합니다.가장 작은 직경의 피펫으로 계속 분쇄합니다. 세포 사멸을 줄이기 위해 거품을 피하십시오. 분리된 조직 조각을 2-5분 동안 가라앉힙니다.그런 다음 상등액을 다른 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 200, 000 및 400 사이의 바람직한 세포 밀도를 달성하기 위해, 밀리리터 당 000 개의 세포.첫날 매체를 사용하여 희석하십시오. 다음으로, 각 유리 커버 슬립에 100마이크로리터의 세포를 시드합니다. 커버 슬립 전체를 셀로 덮으십시오.섭씨 37도에서 5-10%의 이산화탄소에서 배양합니다. 다음 날, 500마이크로리터의 신경 세포 성장 배지를 웰에 추가합니다. 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 기울여 첫날 매체를 제거하고 각 커버 슬립을 적절한 웰에 부드럽게 옮깁니다.뚜껑에서 남은 매체를 흡입합니다. 접시를 섭씨 37도에서 5-10%의 이산화탄소로 배양합니다. 인큐베이터 바닥에 있는 물통을 사용하여 인큐베이터를 최대한 가습된 상태로 유지하십시오.매체를 교체하지 마십시오. 배양은 이러한 조건에서 최대 1개월까지 유지될 수 있습니다. 이 연구에서는 수동 연삭 기계와 전기 연삭 기계 모두 20-200마이크로미터 크기의 입자 혼합물로 유사한 결과를 얻었습니다.수동 또는 전기 여과기는 두 가지 유형의 곡물 혼합물을 생산했습니다. 하나는 입자 크기가 40에서 200 마이크로 미터이고 다른 하나는 40 마이크로 미터 이하입니다. 위상차 현미경 사진은 산호 골격 알갱이로 코팅된 커버 슬립에서 해마 세포의 배양이 매트릭스의 부재 및 존재 하에서 복잡한 신경 네트워크를 형성했음을 보여줍니다.세포핵 염색 결과, 파종 14일 후 세포 밀도가 코팅되지 않은 커버 슬립보다 매트릭스에서 더 높았습니다. 미세소관 관련 단백질 2로 염색한 결과, 대조군과 비교하여 기질에 복잡한 신경 및 수지상 네트워크가 형성된 것으로 나타났습니다. 또한, 신경교섬유산성 단백질을 사용하여 시각화된 산호 골격 매트릭스에서 성장한 신경교세포는 상당한 형태학적 변화를 겪었습니다.그들은 대조군 기질에서 자란 신경교세포보다 더 긴 과정으로 더 뾰족한 모양을 얻었으며, 그곳에서 더 둥글고 평평하게 보였습니다. 세포를 분리하는 동안에는 빠르게 작업하고, 필요한 경우 CO2를 첨가하여 pH를 유지하고, 산호 알갱이가 분리되지 않도록 가능한 한 부드럽게 작업하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

increasing-durability-dissociated-neural-cell-cultures-using

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

여기서 우리는 glial 피더 층의 존재에 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 프로토콜을 제공합니다. 교양 뉴런은 극성을 설정하고 시냅스를 만들고, 이러한 전기 생리학, 칼슘 이미징, 세포 생존 assays, immunocytochemistry, 그리고 RNA / DNA / 단백질 분리 등 다양한 어플 리케이션에 사용하기 위해 glia에서 분리 수 있습니다.

차 쥐 두피 뉴런과 Glia의 Bilaminar의 공동 문화

여기서 우리는 자기 조립 3 차원 비계 문화에 인간 신경 전구 세포의 사용을 설명합니다. 우리는 유동세포계측법에 의해 연속적 예 분석하는 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 상세한 mechanistically 연구를 수행하는 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다.

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

이 비디오는 실크 콜라겐 골격을 사용하여 3D 편광 신경 조직 모델을 만드는 방법을 보여줍니다. 다공성 실크 골격에 신경 세포를 파종하고, 세포 부착을 위해 배양하고, 골격에 콜라겐을 삽입하는 과정을 자세히 설명하고, 3D 편광 신경 조직 모델을 형성하는 데 있어 지지 콜라겐 매트릭스의 중요성을 강조합니다.

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이 비디오는 일차 인간 각막 섬유아세포와 분화된 신경 세포의 3차원 공동 배양 모델 시스템을 생성하는 기술을 보여줍니다. 이 공동 배양 시스템은 기질-신경 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

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편광 신경 조직의 엔지니어링 3D 실크 콜라겐 기반 모델

다중 전극 어레이에서 배양 된 마우스 신경 세포는 전기적 자극 후 반응의 증가를 나타낸다. 이 프로토콜은 뉴런을 배양하는 방법, 활동을 기록하는 방법, 자극 패턴에 반응하도록 네트워크를 훈련시키는 프로토콜을 수립하는 방법을 보여줍니다.

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

골수 내에서 골수 간질 세포 (MSC)가 존재합니다. 우리의 프로토콜은 hypoxic preconditioning을 통해 세포의 인구를 풍요롭게하고 이후 그들이 성숙한 Schwann 세포가되도록 지시합니다.

성숙한 슈반 세포 생성을위한 골수 유래 선조 세포의 저산소 전처리

우리 쇼케이스 경도 정렬된 astrocytic somata 소설 소재 넣음 내 프로세스의 자기 조립, 3 차원 번들의 개발. 이러한 "생활 건설 기계", 아직 테스트-베드 neurodevelopmental 메커니즘을 공부 하거나 감독 신경 마이그레이션 및 axonal neuroregeneration를 용이 하 게 하 역할 수 센티미터 길이, 확장 미크론 단위 직경을 전시 설계 길입니다.

3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

이 프로토콜에는 새로운 3 차원 생체 외에서 모델을, 어디 각 막 실질 세포와 분화 된 신경 세포 교양 함께 시험에는 두 종류의 세포 상호 작용의 이해를 돕기 위해 설명 합니다.

각 막 조직 공학:는 생체 외에서 의 모델 인간 각 막의 실질 신경 상호 작용

우리는 치과 펄프 (DP) 1 차 세포의 격리, 분산 및 도금이 지나치게 트랜스웰 필터 위에 배양된 삼차 (TG) 뉴런을 설명합니다. DP 세포의 세포 반응은 면역 형광 또는 RNA /단백질 분석으로 분석 될 수있다. 공초점 현미경검사법을 가진 신경 마커의 면역형광은 신경질성 파생 반응의 분석을 허용합니다.

치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법

여기에서는 3차원(3D) 세포외 기질에서 IDG-SW3 세포를 배양하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

IDG-SW3 3차원 세포외 기질에서의 세포 배양

학습하세요 산호골격 매트릭스를 이용한 해리된 신경세포 배양법으로 뉴런과 신경교세포의 생존율과 재생을 촉진하는 방법입니다. 이 기술은 재생의학 및 뇌손상 치료 연구에 활용됩니다.

생물학적 활성 Coralline Matrix를 사용한 해리 된 신경 세포 배양의 내구성 향상

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