생물학적 활성 Coralline Matrix를 사용한 해리 된 신경 세포 배양의 내구성 향상

이 프로토콜의 중요성은 in vitro에서 뉴런, 신경교세포 및 줄기세포의 내구성과 성장을 증가시키는 새로운 방법을 제공한다는 것입니다. 다른 세포에도 적용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 산호 골격으로 만든 매트릭스를 사용한다는 것입니다.

이 기질은 신경 세포에 영양을 공급하고 보호하며 재성장을 촉진합니다. 체외(in vitro)에서 신경 세포를 지지하는 산호 골격은 뇌 손상 부위에 재생 임플란트로 유사하게 기능할 수 있습니다. 시작하려면 망치를 사용하여 산호 골격을 부수고 0.5에서 2cm 조각으로 나눕니다.

유기 및 비유기 잔류물을 용해하려면 산호 골격 조각을 10% 차아염소산나트륨 용액에 10분 동안 담그십시오. 그런 다음 이중 증류수로 한 번 씻으십시오. 남아 있는 유기 잔류물을 제거하려면 1몰 수산화나트륨 용액에 조각을 5분 동안 담근 다음 이중 증류수로 한 번 씻습니다.

파편을 30% 과산화수소 용액에 10분 동안 담궈 유기 침전물 제거를 계속하고 이중 증류수로 파편을 세 번 씻습니다. 여분의 이중 증류수를 가능한 한 많이 제거하고 후드의 산호 조각을 건조시키십시오. 그런 다음 100mm 유리 페트리 접시에 95% 에탄올 100ml에 유리 커버 슬립을 담그고 청소합니다.

15분 후 에탄올을 제거하고 이중 증류수로 3회 세척하고 각 세척 사이에 10분을 기다립니다. 이중 증류수를 제거하고 섭씨 80도의 예열된 가열판에 접시를 놓습니다. 그런 다음 이중 증류수가 증발할 때까지 덮개 슬립을 부드럽게 저어줍니다.

커버 슬립을 오토클레이브합니다. 산호 골격 조각을 절구와 절굿공이를 사용하여 완전히 분해될 때까지 갈아줍니다. 20 내지 200 마이크로미터 크기의 입자의 혼합물을 얻어진다.

또는 블레이드 길이가 6cm이고 너비가 0.5-1cm인 전기 연삭기를 사용하여 1000RPM의 속도로 30초 동안 산호 골격 조각을 분쇄합니다. 곡물을 정제하려면 곡물을 전기 40 미크론 필터 메쉬 스트레이너로 옮깁니다. 전기 스트레이너 설정을 분당 600진폭으로 흔들고 초당 6번 바운스하도록 조정합니다.

그런 다음 곡물을 오토클레이브합니다. 무균 조건에서 산호 골격 알갱이를 1밀리리터 PDL 용액당 5mg 또는 10밀리그램의 농도를 얻기 위해 행크 용액에 용해된 20마이크로그램 PDL에 추가합니다. 용액을 25제곱센티미터당 약 2밀리리터의 농도로 플라스크와 접시에 붓고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

알갱이가 가라앉고 바닥에 붙습니다. 다음날 플라스크와 접시를 멸균 이중 증류수로 한 번 씻으십시오. 플라스크와 접시를 후드에서 말리십시오.

유리 커버 슬립을 코팅하려면 먼저 산호 골격 알갱이를 밀리리터당 5 또는 10밀리그램 농도의 이중 증류수에 첨가합니다. 섭씨 80도로 예열된 가열판에 커버 슬립을 놓습니다. 그런 다음 40마이크로리터의 곡물 용액을 커버 슬립 중앙에 떨어뜨리고 완전히 증발할 때까지 15분 동안 기다립니다.

이로 인해 입자가 커버 슬립에 달라붙게 됩니다. 코팅된 커버 슬립을 오토클레이브하고 멸균 상태로 보관하십시오. 다음으로, 멸균 24웰 플레이트의 뚜껑에 커버 슬립을 놓고 각 커버 슬립에 밀리리터당 20마이크로그램 PDL 용액 100마이크로리터를 추가합니다.

팁을 사용하여 액체가 전체 입자 영역과 커버 슬립 표면의 나머지 부분을 덮도록 합니다. 접시 바닥으로 뚜껑을 덮고 파라핀 필름으로 그 자리의 측면을 감쌉니다. 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

다음날 더블 증류수로 커버 슬립을 한 번 세탁하고 후드에서 말리십시오. 쥐 강아지 머리를 준비한 후 큰 핀셋으로 입에서 잡습니다. 두개골을 덮고 있는 피부를 작은 가위로 자릅니다.

깨끗한 가위로 소뇌 측면의 두개골 아래로 들어가 두개골을 오른쪽과 왼쪽으로 잘라 제거할 수 있도록 합니다. 작은 핀셋을 사용하여 뇌에서 두개골을 떼어냅니다. 머리에서 뇌를 분리하여 2밀리리터의 차가운 MEM이 들어 있는 60mm 페트리 접시에 넣습니다.

실체 현미경으로 두 개의 작은 핀셋을 사용하여 해마를 해부합니다. MEM이 들어 있는 준비된 35mm 접시에 해마를 옮깁니다. 메스를 사용하여 해마를 약 1mm 조각으로 자릅니다.

트립신 용액 200마이크로리터를 추가합니다. 부드럽게 섞어 섭씨 37도에서 5-10%의 이산화탄소를 30분 동안 배양합니다. 배양 후 접시에 2ml의 차가운 MEM을 첨가하여 트립신을 비활성화합니다.

그런 다음 직경이 가장 큰 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 트립신화된 조직을 섭씨 37도로 예열된 1일차 배지 1밀리리터가 들어 있는 15ml 튜브로 옮깁니다. 가장 큰 직경의 유리 피펫에 조직을 통과시켜 10-15회 분쇄합니다. 그런 다음 중간 직경의 유리 피펫을 사용하여 이 과정을 반복합니다.

가장 작은 직경의 피펫으로 계속 분쇄합니다. 세포 사멸을 줄이기 위해 거품을 피하십시오. 분리된 조직 조각을 2-5분 동안 가라앉힙니다.

그런 다음 상등액을 다른 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 200, 000 및 400 사이의 바람직한 세포 밀도를 달성하기 위해, 밀리리터 당 000 개의 세포.

첫날 매체를 사용하여 희석하십시오. 다음으로, 각 유리 커버 슬립에 100마이크로리터의 세포를 시드합니다. 커버 슬립 전체를 셀로 덮으십시오.

섭씨 37도에서 5-10%의 이산화탄소에서 배양합니다. 다음 날, 500마이크로리터의 신경 세포 성장 배지를 웰에 추가합니다. 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 기울여 첫날 매체를 제거하고 각 커버 슬립을 적절한 웰에 부드럽게 옮깁니다.

뚜껑에서 남은 매체를 흡입합니다. 접시를 섭씨 37도에서 5-10%의 이산화탄소로 배양합니다. 인큐베이터 바닥에 있는 물통을 사용하여 인큐베이터를 최대한 가습된 상태로 유지하십시오.

매체를 교체하지 마십시오. 배양은 이러한 조건에서 최대 1개월까지 유지될 수 있습니다. 이 연구에서는 수동 연삭 기계와 전기 연삭 기계 모두 20-200마이크로미터 크기의 입자 혼합물로 유사한 결과를 얻었습니다.

수동 또는 전기 여과기는 두 가지 유형의 곡물 혼합물을 생산했습니다. 하나는 입자 크기가 40에서 200 마이크로 미터이고 다른 하나는 40 마이크로 미터 이하입니다. 위상차 현미경 사진은 산호 골격 알갱이로 코팅된 커버 슬립에서 해마 세포의 배양이 매트릭스의 부재 및 존재 하에서 복잡한 신경 네트워크를 형성했음을 보여줍니다.

세포핵 염색 결과, 파종 14일 후 세포 밀도가 코팅되지 않은 커버 슬립보다 매트릭스에서 더 높았습니다. 미세소관 관련 단백질 2로 염색한 결과, 대조군과 비교하여 기질에 복잡한 신경 및 수지상 네트워크가 형성된 것으로 나타났습니다. 또한, 신경교섬유산성 단백질을 사용하여 시각화된 산호 골격 매트릭스에서 성장한 신경교세포는 상당한 형태학적 변화를 겪었습니다.

그들은 대조군 기질에서 자란 신경교세포보다 더 긴 과정으로 더 뾰족한 모양을 얻었으며, 그곳에서 더 둥글고 평평하게 보였습니다. 세포를 분리하는 동안에는 빠르게 작업하고, 필요한 경우 CO2를 첨가하여 pH를 유지하고, 산호 알갱이가 분리되지 않도록 가능한 한 부드럽게 작업하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.