Scleractinian 세포 인구의 격리를 위한 형광 활성화 세포 분류

산호는 인간과 해양 생물 모두에게 중요한 생물 다양성 생태계를 만듭니다. 그러나, 우리는 아직도 많은 산호 세포의 완전한 잠재력과 기능을 이해하지 못합니다. 여기에서, 우리는 돌로 된 산호 세포 인구의 격리, 표지 및 분리를 위해 개발된 프로토콜을 제시합니다.

이 프로토콜은 이전에는 불가능했던 설명 수준에서 살아있는 산호 세포 집단의 식별 및 격리를 용이하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 지금까지 대부분 달성 할 수없는 세포 특이성의 수준에 대한 액세스를 허용한다는 것입니다. 절차를 보여주는 것은 박사 섀넌 사이, 실베스터 포괄적 인 암 센터에서 흐름 세포 측정 공유 자원에서 연구 동료가 될 것입니다.

라이브 산호 셀 정렬을 위한 유동 사이토미터를 설정하려면 유량 사이토미터 소프트웨어에 새 프로젝트 템플릿을 열고 레이저 패널의 분석에 적합한 레이저를 선택합니다. 그런 다음 게이팅 및 분석 전략을 설정하기 위한 적절한 플롯에서 측면 분산 대 전방 분산 플롯을 만듭니다. 살아있는 산호 세포의 흐름 세포 측정 분석 및 정렬을 위해, 세포계의 샘플 챔버에 제어 미염색 세포 샘플을 로드하고 판독 과정을 시작합니다.

산호 세포는 특히 깨지기 때문에 세포 리시를 방지하기 위해 세포계 압력을 낮게 유지하십시오. 분산 플롯에서 사진 승수 전압을 조정하여 점을 중앙으로 조정하고 이벤트 기록을 시작합니다. 전방 및 측면 분산 플롯에서, 전방 분산 x 축의 10에서 4번째 마크 주위의 셀 주위게이트를 만듭니다.

제어 샘플을 스테인드 셀의 첫 번째 샘플로 교체하고 일시 중지하기 전에 약 10, 000 세포를 기록합니다. 그런 다음 스테인드 샘플 그룹에 고유한 이벤트를 게이트합니다. 살아있는 산호 세포를 정렬하려면, 유동 세포계 소프트웨어에 대한 관심의 세포 집단을 선택한 후, 각 집단에 대한 세포계 수집 챔버에 적절한 수집 용액의 250 ~ 500 마이크로 리터를 포함하는 하나의 미세 원심 분리기 튜브를 배치정렬합니다.

적절한 시간이 경과하여 잔해를 씻어내고, 원하는 인구를 분류하여 10, 000에서 수백만 개의 세포로 수집합니다. 새로운 얼룩, 종 또는 선별기가 사용될 때마다, 적어도 20, 000개의 관심 있는 세포를 500 마이크로리터로 분류하여 관심 집단에서 순도 검사를 수행하고 선별된 세포를 재분석하여 초기 선별에 사용되는 게이트 내에서 이벤트가 읽혀지고 있는지 확인한다. 시험관 내 연구의 경우 정렬된 세포를 인큐베이터 또는 살균 된 환경으로 옮겨질 때까지 얼음에 보관하십시오.

산호 세포와 동일한 모양이나 세분성을 공유하지 않는 다른 비세포 입자를 가져오기 위해 전방 및 측면 산란 플롯에 게이트 선택을 만들어 분석에서 제거할 수 있다. 죽은 세포는 히스토그램을 이용하여 염색되지 않은 세포 현탁액의 DAPI 신호를 비교하고 높은 DAPI 표현 세포를 제거함으로써 배제될 수 있다. 병렬로, 자동 형광 공생을 호스팅하는 세포는 먼 적색 채널에서 높은 신호로 세포에 대해 게이팅하여 제거 할 수 있습니다.

이 반복 게이팅 과정 후, 나머지 세포는 공생증이 부족한 그대로 살아있는 산호 세포 집단을 나타낸다. 이러한 세포는 반응성 산소 종 활성 및/또는 리소솜 함량과 같은 특징을 염색하여 상이한 세포 하위 집단으로 분류될 수 있다. 일부 세포는 다른 세포보다 더 연약하다는 것을 기억하고 가능한 한 신중하게이 과정을 실행하는 것이 중요합니다.

일단 특정 세포가 격리되면, 세포 배양을 확립하고 전사 성단을 만드는 것과 같은 x-vivo 기능적 소사에 사용될 수 있다.