단일 세포 약물 섭취, 신진 대사 및 효과를 연구하기 위한 통합 라만 분광법 및 질량 분광법 플랫폼

우리는 메타볼로믹스를 위한 혁신적인 방법을 개발했습니다. 우리는 살아있는 세포의 Belfry 스펙트럼 화상 진찰을 단세포 질량 분석과 결합했습니다. 우리의 기술은 약물에 대한 단일 세포의 신진 대사 변화를 모니터링하고 예측할 수 있습니다.

그리고 이것은 기초 연구 및 산업에 대한 많은 응용 프로그램을 엽니 다. 우리의 방법은 현재 약물 평가 기술에 단일 세포 해상도를 추가하여 향후 약물 발견 노력을 크게 돕습니다. 우리의 기술은 또한 우리가 암 저항에 있는 세포 이질성에 의해 행해진 역할을 이해하는 것을 도울 수 있습니다.

단일 셀 샘플링 및 데이터 분석은 이 실험에서 가장 어려운 측면입니다. 현재 이 두 단계, 특히 샘플링 부분을 자동화하기 위해 노력하고 있습니다. 각 미세 조작기 설정이 약간 다르기 때문에 실험 전에 단일 셀 샘플링을 잘 연습하는 것이 좋습니다.

70%의 합류에 도달하기 위해 세포를 배양한 후 적절한 배양 매체에 관심 있는 배양 세포는 오염을 피하기 위해 페니실린-스트렙토마이신을 추가합니다. 혈종계에 세포 밀도를 측정한 후, 35밀리미터 유리 바닥 그리드 접시 또는 석영 슬라이드로 서브배양스 세포, 0.7배 10~6분의 1의 파종 밀도에서 동일한 배지를 이용하여. 그런 다음 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.

다음 날, 세포는 50 ~60%의 합류에 도달하여 37°C에서 미리 따뜻해진 PBS 버퍼로 세포를 두 번 세척합니다. 세포를 35mm 배양 접시에 치료및 치료되지 않은 하위 그룹으로 나눕니다. 배양 매체와 디메틸 설프리산화물에 용해된 타목시펜을 혼합하여 10 마이크로몰러의 2밀리리터 와 타목시펜 농도의 최종 부피를 얻습니다.

이것은 약물 치료 그룹입니다. DMSO의 효과를 연구하기 위해 대조군으로서 DMSO의 해당 부피를 매체에 혼합한다. 24시간 동안 스파이크 된 매체의 두 밀리리터로 두 그룹을 배양하여 스펙트럼 측정 전에 70 ~80 %의 합류에 도달하고 대상을 사용하여 핀홀 과 레이저 위치 일치를 확인하십시오.

각 실험 전에 분광계를 보정하려면 유리 바닥 접시에 에탄올을 배치하고, 1초 동안 주어진 레이저 강도로 스펙트럼을 측정하고, 피크를 알려진 파장에 연결한다. 그런 다음 마이크로 챔버를 이산화탄소 5 %와 섭씨 37도로 설정합니다. 현미경 시스템이 준비되면 인큐베이터에서 세포를 제거하고 37섭씨에서 따뜻하게 한 PBS 버퍼로 세포를 두 번 헹구는 다.

그런 다음 따뜻하게 데운 PBS 또는 플루오로브리테 DMEM의 2 밀리리터를 추가합니다. 물에 10 마이크로리터를 추가하여 침수 목적 렌즈에 넣습니다. 그리고 유리 바닥 세포 접시를 현미경 단계에 섬세하게 놓습니다.

세포 샘플링 시스템을 라만 현미경으로 수정합니다. 3D 미세 조작기를 빈 주사기에 부착된 유리 모세관 홀더에 연결하여 시료 빨기를 합니다. 유리 모세관의 끝을 관찰하기 위해 현미경을 40 배율 의 높은 배율 장으로 설정하고 파손되지 않았는지 확인하십시오.

마이크로 조작기를 사용하여 유리 모세관의 위치를 제어합니다. 모세관 팁이 시야에 중심이 되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 모세관을 Z 축으로 위로 이동하여 나중에 문화 요리에 대한 여유를 제공합니다.

현미경의 단계에 샘플 접시를 놓고 배율과 초점을 조정하고 그리드 접시의 대상 셀을 선택하고 보기 의 중심으로 이동합니다. 레이저 라인에 초점을 맞추어 각 셀을 측정합니다. 셀당 15초 노출 시간은 명확한 라만 신호를 가진 세포의 단면을 얻기에 충분합니다.

갈바노 미러를 사용하면 12분 이내에 한 세포 또는 셀 그룹을 스캔할 수 있습니다. 그런 다음 팁이 초점이 될 때까지 미세 조작기로 유리 모세관을 조심스럽게 낮추어 둡니다. 현미경 관찰하에 모세관 끝으로 표적 단일 세포를 터치하십시오.

그런 다음 주사기를 사용하여 음압을 적용하여 모세관 팁 내부의 세포를 트랩합니다. 비디오를 촬영하여 이 절차를 기록하여 셀의 타이밍과 빨려 있는 위치를 정확하게 확인합니다. 모세관을 Z 축위로 이동합니다.

그런 다음 질량 분광분석 에 대비하여 포셉을 사용하여 모세관 홀더에서 모세관을 분리한다. 질량 분광계기를 설정하고 미디어를 분석한 후, 이온화 용매의 2개의 마이크로리터를 세포가 함유하는 모세관에 추가한다. 적절한 질량 분광계에 연결된 나노 전기 스프레이 어댑터에 모세관을 고정하고 자동 획득 방법을 시작합니다.

약물 치료 유무에 관계없이 각 상태의 평균 스펙트럼에 대한 비교 분석이 여기에 나와 있습니다. 두 조건의 평균 스펙트럼은 다양한 피크에서 명확하게 다릅니다. 특히, 피크1, 000 센티미터, 페닐알라닌과 티로신 과 같은 방향족 화합물에 대한 표시는 강한 차이를 보여줍니다.

잠재 구조 모델의 투영에 기초하여 VIP 점수는 실험 조건을 차별하는 파장의 중요성을 나타내는 계산되었습니다. 중요한 것은, VIP 프로필의 가장 높은 피크는 두 치료 사이에 강한 차이가 보인 라만 봉우리에 해당한다는 것입니다. 이것은 처리된 처리되지 않는 세포 사이 특정 분자 다름을 확인했습니다.

양성 식별 후, 약물과 대사 산물의 상대적 풍부는 각 세포에서 측정되었고 치료되지 않은 세포의 배경 피크와 비교되었습니다. 타목시펜의 풍부에서 강한 변화가 관찰되었다. 그리고 이 현상은 대사산물 4-하이드록시 타목시펜의 경우에 더욱 두드러졌습니다.

연구원은 스펙트럼 이미지와 세포의 신진 대사 프로필 사이의 링크를 탐험에 관심이 있을 수 있습니다. 우리의 연구는 또한 제약 제조를 위한 세포의 현지 검열을 허용하기 때문에 산업 응용을 가지고 있습니다. 질량 분광계 측정을 위한 이온화 용매를 준비하는 동안주의를 기울여야 합니다.

연기 후드 아래에 준비해야합니다. 또한, 감전되지 않도록 질량 분광계 기기의 이온 소스를 만지지 않도록주의하십시오. 마지막으로, 측정 전반에 걸쳐 사용되는 샘플링 모세혈관은 매우 선명하므로 부상을 피하기 위해 조심스럽게 처리하십시오.