시안게이트 모듈형 복제 툴킷을 사용하여 컨쥬게이션에 의한 시아노박테리아의 유전자 변형

시아노박테리아는 합성 생물학 및 재생 가능한 생명 공학 응용 분야에 유용한 플랫폼으로 점점 더 인식되는 광합성 미생물의 중요한 필럼입니다. 따라서 다른 시아노균 종에 이종 DNA의 설계, 복제 및 도입을 단순화하는 강력한 기술을 개발하는 것이 중요합니다. 따라서 이 기술은 자연적으로 변형할 수 없는 시아노균 종에 DNA를 도입하기 위한 균주 또는 삼각조라는 잘 확립된 방법을 보여줍니다.

컨쥬게이션은 단일 세포에서 다세포 필라멘트 종에 이르는 다양한 시아노균 균주에서 성공적으로 수행되었습니다. 이 기술을 처음 시도하는 경우, 시아노균과 대장균 균주를 모두 조심스럽게 처리하십시오. 예를 들어 프로토콜에 제공된 값 위에 원심 분리하지 말고 소용돌이하지 마십시오.

박테리아와 시아노박테리아를 혼합하는 것은 처음 사용자에게 이상하게 보일 수 있습니다. 우리는 컨쥬게이션 과정을 시연함으로써 이를 명확히 하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 레벨 1 어셈블리를 생성한 후 적절한 레벨 T 수락자 벡터를 선택합니다.

최종 레벨 1 어셈블리의 세 가지 최종 끝을 T 백본 레벨로 리게이트하는 적절한 끝 링크를 선택합니다. 하나 이상의 레벨 하나의 어셈블리를 레벨 T로 조립하려면 PBI1 및 필요한 종단 링크 벡터로 반응 믹스를 준비합니다. 열 사이클러 프로그램을 설정하고 원고에 따라 진행합니다.

첫날, 시에코시스테스 PCC 6803 또는 Synechococcus longatus UTEX 2973의 신선한 문화를 설정하여 시아노균 배양을 성장. 열 멸균 루프를 사용하여 축 BG-11 마고 플레이트에서 세포를 긁어 내고 신선한 BG-11 배지의 50 밀리리터로 채워진 100 밀리리터 원추형 플라스크에 넣습니다. 100 RPM에서 30섭씨에서 시코시스티스 PCC 6803 세포 배양을 성장시키기 위해 플라스크를 조명과 함께 흔들리는 인큐베이터에 넣습니다.

Synechocous longatus UTEX 2973의 경우, 100 RPM에서 섭씨 40도에서 세포 배양을 성장시합니다. 1~2일 후에는 세포 배양의 1밀리리터를 그리고 분광계에 측정합니다. OD 750의 흡광도는 0.5에서 1.5에 도달합니다.

둘째 날, 밀리리터당 100 마이크로그램의 농도로 밀리리터와 클로람페니콜의 농도로 암피실린을 함유한 벡터 PRK24 및 PRL528을 포함하는 MC1061 E.coli 도우미 균주를 밀리리터당 25 마이크로그램의 농도로 접종한다. 흔들리는 인큐베이터에서 225 RPM에서 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 자랍니다. 그런 다음 레벨 T 화물 벡터를 운반하는 대장균 배양과 적절한 항생제를 함유하는 LB 배지의 5밀리리터를 접종한다.

흔들리는 인큐베이터에서 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 문화를 성장시다. 셋째 날에는 실온에서 10분 동안 도우미와 화물 E.coli 하룻밤 문화를 3, 000g에서 원심분리합니다. 셀 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오.

항생제없이 신선한 LB 배지의 5 밀리리터를 추가하여 펠릿을 씻어. 상류체를 제거하기 위해 위아래로 부드럽게 파이프를 하고 원심분리기를 사용하여 펠릿을 다시 놓습니다. 이 세척 단계를 세 번 반복하여 하룻밤 문화에서 잔류 항생제를 제거하십시오.

마지막 세척 후, 초기 배양 부피의 LB 배지의 절반 부피로 세포 펠릿을 다시 놓는다. 그런 다음 도우미 균주의 450 마이크로리터를 2 밀리리터 튜브에 450 마이크로리터의 마이크로리터를 결합하고 실온에서 둡니다. 다음으로, 실온에서 10분 동안 1밀리리터의 시아노균 배양1밀리리터를 원심분리하여 시아노균 배양을 준비한다.

그런 다음 셀 펠릿을 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 버리십시오. 동일한 초기 볼륨의 신선한 BG-11 배지를 추가하여 펠릿을 4번 세척합니다. 세척된 시아노균 배양900마이크로리터를 2밀리리터 튜브에 결합된 대장균 균주 900마이크로리터에 추가합니다.

위아래로 부드럽게 배관하여 문화를 섞는다. 시에코시스티스 PCC 6803에 대해 30분 또는 시에코코커스 길쭉성 UTEX 2973의 경우 2시간 동안 실온에서 혼합물을 배양한다. 상온에서 10분 동안 혼합물을 1, 500g에서 원심분리합니다.

상류체의 1.6 밀리리터를 제거하고 나머지 상체에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 항생제없이 LB BG-11 한천 플레이트에 0.45 미크론 막 필터 를 놓습니다. E.coli/cyano균 배양 믹스의 200마이크로리터를 멸균 스프레더 또는 멸균 배드 팁으로 멤브레인에 조심스럽게 퍼집니다.

파라핀 필름으로 접시를 밀봉하고 24 시간 동안 조명 인큐베이터에 접시를 배치합니다. 24시간 후, 화염 살균 된 집게를 사용하여 막을 적절한 항생제를 포함하는 신선한 BG-11 한고 판으로 조심스럽게 이송하여 화물 벡터를 선택한다. 파라핀 필름으로 접시를 밀봉하고 식민지가 나타날 때까지 이전과 동일한 조건에서 배양하십시오.

식민지는 일반적으로 Synechocystis PCC 6803 및 Synechococcus longatus UTEX 2973에 대 한 3-7 일 동안 7-14 일 후에 나타납니다. 물자를 선택하려면, 열 멸균 접종 막대를 사용하여, 멤브레인에서 적어도 두 개의 개별 식민지를 선택하고 적절한 항생제를 포함하는 새로운 BG-11 천판에 줄무늬. 그런 다음 치아 노 균 배양의 줄무늬를 LB 배지의 5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 접종하고 흔들리는 인큐베이터에서 225 RPM에서 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 배양합니다.

명확한 배양은 대장균 오염의 부재를 확인합니다. 7 일의 충분한 성장 기간에 따라, 장기 저온 저장 또는 후속 실험을위한 액체 문화를 설정하는 개별 축축식민지를 선택합니다. 이 연구에서는 황금 게이트 어셈블리 워크플로우가 입증되었습니다.

조립 반응의 변환에 따라, 성공적인 어셈블리는 E.coli 식민지의 표준 파란색 흰색 검사를 사용하여 확인되었다. 레벨 1 벡터 및 끝 링크에서 eYFP 식 카세트는 벡터 cpcBA-eYFP를 주기 위해 레벨 T 수용자 벡터로 조립하였다. 조립된 cpcBA-eYFP 벡터는 제한 소화에 의해 검증되었다.

cpcBA-eYFP 또는 pPMQAK1-T 벡터의 성공적인 부부 전달은 시에코시티스 PCC 6803 및 Synechocous elongatus UTEX 2973에 대한 멤브레인에 최대 수백 개의 식민지의 성장을 초래했다. 강력한 Pcpc560 프로모터에 대해 예상대로, 유동 세포계로부터의 플레이트 판독기 및 eYFP 형광으로부터의 정규화된 eYFP 형광에 대한 값은 음의 대조에 비해 높았다. 플레이트 판독기와 유동 세포계 모두, 형광 값은 Synechococcus longatus UTEX 2973에서 Synechocystis PCC 6803에서 보다는 더 높았습니다.

어떤 균주에 따라 최소 시간 동안 배양해야 합니다.