결핵 분자 세균 부하 분석 (TB-MBLA)

이 결핵 분자 세균 분석, 세 가지 주요 질문에 대답. 하나: 환자의 질병 부담의 크기는 무엇입니까? 2: 환자 질병 부담은 항 결핵 약물에 어떻게 반응합니까?

그리고 세 : 질병 부담과 치료 반응 사이의 관계는 무엇입니까? 이 분석은 환자 결핵 부담의 정량적 결과를 생성하고, 짧은 시간에 치료로 이 부담이 어떻게 변하는지 측정합니다. 수정으로, 이 방법론은 그밖 세균성 병원체에 적용될 수 있습니다.

우리는 이미 비 결핵 진균의 진단을 위한 유사한 기술을 개발했습니다, 만성 폐쇄성 폐 질환과 관련되었던 박테리아. 이 기술을 처음 수행할 때 비디오를 보고 단계를 연습합니다. 환자 진단 결과에 필요하지 않은 샘플을 사용하여 연습하는 것이 매우 중요합니다.

시각적 데모는 학습 및 단계 마스터, 특히 텍스트로 설명하기 어려운 메서드의 해당 부분을 단순화하기 때문에 중요합니다. 세포 배양을 준비하는 것으로 시작합니다. 깨끗한 실험실 벤치 또는 클래스 1 오두막에서, 기하급수적 인 단계 바실 칼레트 게린 또는 BCG 문화의 1 밀리리터 알리쿼트를 15 밀리리터 플라스틱 튜브로 수확하고 단단히 닫습니다.

환자의 가래 샘플을 준비할 때 통풍이 잘 되는 공간에서 작업하고 GL One Stop TB 핸드북의 지침을 따르십시오. 시편 컵과 파이펫 1 밀리리터 알리쿼트를 15밀리리터 플라스틱 원심분리기 튜브에 조심스럽게 엽니다. 그런 다음 튜브를 단단히 닫습니다.

샘플 튜브를 예열된 수조에 침지된 홀딩 랙으로 옮기면 각 튜브의 3/4가 침지되도록 합니다. 샘플을 20분 동안 끓입니다. 그런 다음 튜브를 벤치로 옮겨 실온에서 5 분 동안 식힙니다.

페놀 클로로폼 또는 종양 자본 에탄올이 있는 키트를 사용하는 경우 연기 후드에서 RNA 추출을 수행한다. 여기서 설명된 RNA 절차는 페놀 클로로폼 추출 절차입니다. 그러나, RNA 추출을 위한 대체 방법도 사용될 수 있다.

열 불활성 시료의 1밀리리터 알리쿼트를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 각 시료에 추출 제어 100마이크로리터를 스파이크합니다. 튜브를 닫고 세 번 반전하여 혼합합니다. 10 분 동안 20, 000 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다.

그런 다음, 퇴적물의 50 마이크로 리터를 떠나, 슈퍼 나티를 흡인. 우리는 침수 버퍼의 950 마이크로 리터에서 퇴적물을 일시 중단하고 전체 서스펜션을 RNA 추출 키트와 함께 공급되는 용액 매트릭스 튜브로 이송합니다. 튜브를 단단히 닫고 뚜껑과 측면에 라벨이 부착되어 있는지 확인합니다.

그런 다음 6, 000 rpm에서 40초 동안 샘플을 균질화합니다. 실온에서 5분 동안 12, 000배 g의 리세스원심분리. 한편, 신선한 1 밀리리터 튜브를 준비하고 300 마이크로리터의 클로로폼을 추가합니다.

1 밀리리터 파이펫을 사용하여 용해 매트릭스를 만지지 않고 조심스럽게 체퍼를 흡인하고 클로로폼으로 튜브로 옮기십시오. 튜브를 5초 동안 소용돌이쳐 5분 동안 또는 3단계가 명확하게 드러날 때까지 정착시키십시오. 튜브를 12, 000배에서 5분간 원심분리합니다.

그런 다음 상층을 조심스럽게 피펫하여 1.5 밀리리터 튜브로 옮기습니다. 500 마이크로리터의 얼음 차가운 100% 에탄올을 샘플에 넣고 튜브를 닫고 세 번 반전하여 섞습니다. 15분 간 영하 80도, 영하 20도에서 30분간 튜브를 배양합니다.

그런 다음 튜브를 13, 000 배 및 섭씨 4도에서 20 분 동안 미리 냉각 된 미세 원심 분리기와 원심 분리기에 적재하십시오. 상체를 버리고, 13, 000g에서 또 다른 10 분 동안 70 %의 얼음 차가운 에탄올과 원심 분리기의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 모든 상체를 폐기합니다.

그리고 핵산 펠릿을 건조하기 위해 20분 동안 50°C의 튜브를 배양하여 튜브를 부분적으로 열어 에탄올의 증발을 가능하게 합니다. 다음으로, 100 마이크로리터의 핵 프리 워터를 펠릿에 넣고 실온에서 5분간 배양합니다. 3 초 동안 샘플을 소용돌이및 DNA 제거를 진행하거나 사용할 준비가 될 때까지 영하 80도에서 저장합니다.

제조 된 DNA의 하나의 믹스 원고 방향 및 파이펫 11 마이크로 리터는 RNA 추출물을 포함하는 각 튜브에. 3 초 동안 소용돌이와 튜브의 벽에서 물방울을 제거하기 위해 잠시 아래로 회전. 그런 다음, 뜨거운 블록 이나 인큐베이터에서 30 분 동안 섭씨 37도에서 튜브를 배양.

인큐베이션 후, DNA의 1개 효소의 마이크로리터를 튜브에 직접 추가하고, 소용돌이에 잘 섞습니다. 그런 다음, 37섭씨에서 30분 동안 튜브를 배양합니다. DNA의 비활성화 시약이 해동되고 소용돌이합니다.

그런 다음 각 RNA 추출물에 10 개의 마이크로 리터를 추가하십시오. 그리고 5 분 동안 실온에서 튜브를 배양. 인큐베이션 단계에서 튜브를 세 번 소용돌이.

이어서, 혼합물을 13, 000배g에서 2분간 원심분리하고 상체체를 1.5밀리리터 RNA의 자유 튜브로 조심스럽게 이송하여 불활성화 매트릭스를 만지지 않도록 한다. 모든 알려지지 않은 RNA 샘플을 RNA의 자유 물에 1-10을 희석하고 5초 동안 소용돌이를 가하고 잠시 회전하여 혼합합니다. MTB 및 EC-RNA 샘플을 해동하고 표준 곡선을 위해 각각 7배와 6개의 10배 희석제를 만듭니다.

원고 방향에 따라 RT 플러스 와 RT 마이너스 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. RT 플러스 를 혼합하고 각 RT 플러스 PCR 튜브에 16 마이크로 리터를 전송 소용돌이. 그런 다음 RT를 뺀 소용돌이가 각 RT에서 PCR 튜브를 뺀 16마이크로리터를 추가합니다.

RNA 추출물 또는 물의 4개의 마이크로리터를 추가하고 RT 플러스 튜브에 복제합니다. 물은 템플릿이 아닌 제어 또는 NTC입니다. RT 마이너스 튜브에 RNA 추출물 또는 물의 4개의 마이크로리터를 추가합니다.

반응 튜브를 실시간 PCR 기계에 로드하고, 원고에 설명된 바와 같이 반응을 프로그래밍하고 반응을 실행한다. 치료 반응을 해석하려면 표준 곡선을 사용하여 CQ 값을 세균 부하로 변환하고 후속 기간 동안 세균 부하의 변화로 반응을 계산합니다. 치료 후 세균 부하의 하락은 긍정적인 반응을 의미하지만 세균 부하의 변화 나 상승은 부정적인 반응을 의미합니다.

모든 M.결핵 간균이 열이 비활성화되었는지 확인하기 위해 세포의 광학 밀도를 측정하고 살아있는 세포의 광학 밀도와 비교하였다. 시간이 지남에 따라 OD의 변화는 성장을 나타내는 열 비활성화 샘플에 대해 관찰되지 않았다. 열 비활성화 된 샘플은 세포의 열 비활성화 다음 RNA가 저하 여부를 결정하기 위해 섭씨 37도에서 배양되었다.

열 불활성화 직후 수확된 RNA 와 BCG 배양및 결핵 양성 가래 모두에서 1, 2, 3 및 4일 후에 RNA를 격리한 사이에는 차이가 발견되지 않았다. RNA의 A 효소가 외인성 으로 시료에 첨가되었을 때, 열 불활성화 전후에, RNA 손실은 4일 간 모든 열 불활성화 시료에서 발생하였다. 리보소말 RNA에 대한 열 불활성화의 효과는 결핵 양성 환자로부터 BCG 배양 및 가래에서 측정되었다.

대조군 배양의 측정된 세균부하는 섭씨 80도, 섭씨 85도, BCG 및 가래 시료 의 경우 섭씨 95도에서 불활성 배양의 결합된 세균 부하보다 높았다. 시료의 열 불활성화는 RNA의 최소 손실을 일으켜 다운스트림 TB-MBLA 및 기타 다운스트림 분자 검사를 위한 적절한 RNA를 남깁니다. 전송 전자 현미경 검사는 세포가 열 불활성화에 의해 lysed 여부를 조사하기 위해 사용되었다.

더 낮고 더 높은 배율에서 세포의 검사는 그대로 세포벽과 눈에 보이는 세포 내 지질 바디를 드러냈다. 세포는 길어 보였지만, 은은하지 않았다. 이 절차를 시도할 때, 가난한 RNA 추출로 인한 거짓 부정적인 결과를 제어하는 추출 제어를 추가하는 것이 중요합니다.

이 접근법은 만성 폐쇄성 폐 질환, 비결핵 균 감염 및 기타 호흡기 병원균과 관련된 박테리아에 적용 될 수 있습니다. TB-MBLA의 정량적 결과는 환자가 결핵 치료에 어떻게 반응하는지의 수학 및 약리 모델링을 가능하게 했습니다. 우리는 결핵 환자가 관리되고 있는 일상적인 배려에 기술을 적용하는 것을 기대합니다.