Name: 슈도모나스 녹농균의 작은 식민지 변형의 문화와 알긴산의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 학습하세요 Pseudomonas aeruginosa의 작은 식민지 변형 배양 조건과 알긴산 정량화 방법을. ELISA 기법이 기존 카바졸 분석법보다 민감하고 안전하게 알긴산을 검출하여 생물막 형성 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (NIH) 보조금 R44GM1113545 및 P20GM103434.

1. SCV 성장 조건 및 인양 통로의 생리적 활성화
<ol><li>SCV 감지.<ol>
<li>P. aeruginosa 균주 PAO1, PAO1ΔpyrD,PAO581 및 PAO581ΔpyrD를 미리 온난한 슈도모나스 격리 한천(PIA) 플레이트에 연속하고 48시간 동안 37°C에서 성장한다. 성장 판상에서 SCV 표현형을 가지는 단일 콜로니 분리(통상의 3−5 mm 콜로니 크기와 는 반대로 1−3 mm의 콜로니 크기)를 식별한다.</li>
		<li>1.1.1 단계를 반복하여 SCV의 순수한 분리를 얻었다. 참고: SCV 식민지의 느린 성장 속도로 인해 성장은 최대 72 시간이 필요할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인양 통로의 생리적 활성화.<ol>
<li>멸균 접종 루프를 사용하여 PIA 플레이트에서 SCV 콜로니를 선택하고 우라실 0.1 mM으로 보충된 미리 따뜻한 PIA에 줄무늬를 지정합니다. 24-48 시간 동안 37 °C에서 플레이트를 성장시다. 참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 PIA 플레이트에는 오토클레이브 전에 혼합물에 추가된 글리세롤 20 mL/L이 포함되어 있습니다. 오토클레이브 후 및 혼합물 온도가 55°C 이하인 후 플레이트를 붓기 전에 액체 매체에 우라실(0.1 mM)의 11.21 mg/L을 첨가한다. 이 방법은 P. aeruginosa에있는 SCV 표현형을 일으키는 원인이 되는 피리미딘 돌연변이를 확인하는 것을 도울 것입니다. SCV 표현형이 말의 돌연변이의 결과인 경우, 정상적인 콜로니 성장 및 크기(3−5 mm)는 우라실 보충 PIA 플레이트에서 관찰될 것이다. 균주가 알긴산을 생산하는 능력을 가지고 있다면, 점막 표현형은 또한 우라실 보충시 반환됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 우론산 카르바졸 분석
<ol><li>테스트할 원하는 균주의 순수한 배양으로부터 단일 콜로니를 식별합니다. 멸균 이쑤시개를 사용하여, 콜로니를 선택하고, 슈도모나스 격리 국물(PIB)의 5 mL를 포함하는 배양 시험관에 이쑤시개를 놓습니다. 24 시간 동안 37 °C에서 셰이커 인큐베이터에서 성장합니다. 참고: 다음 균주 PAO581 (PAO1mucA25),PAO581carA,PAO581carB및 PAO581pyrD는 측정을 위해 알긴산을 수확하기 위해 0.1 mMuracil으로 보충된 PIA 플레이트 또는 PIA 플레이트에서 재배되었습니다.</li>
	<li>미리 따뜻해진 PIA 플레이트위에 배양된 PIB 국물 150 μL(15mm x 100mm 플레이트용) 또는 450 μL의 국물(15mm x 150mm 플레이트)을 첨가합니다. 멸균 세포 스프레더를 사용하여 접시 위에 국물을 뿌린다. 24 시간 동안 37 °C에서 플레이트를 성장시다. 참고 : 한쪽으로 접시를 팁하여 파이펫을 사용하여 플레이트에서 여분의 유체(있는 경우)를 흡인합니다. 프로토콜에 사용된 PIB 및 PIA 플레이트는 알긴산 생산을 돕기 위해 세포에서 탄소 공급원으로 사용되는 글리세롤 20 mL/L을 함유하고 있습니다.</li>
	<li>파이펫 컨트롤러와 멸균 50 mL 파이펫을 사용하여, 재배된 잔디에 0.85% NaCl을 추가하고 셀 스프레더를 사용하여 플레이트를 폐기하여 샘플을 수집합니다. 신선한 50 mL 파이펫을 사용하여 샘플을 50 mL 수집 튜브에 흡인합니다. 샘플을 얼음 위에 섞고 놓기 위해 샘플을 높은 곳에 소용돌이치게 합니다. 참고 : 추가 된 0.85 % NaCl의 부피는 플레이트의 크기에 따라 다릅니다. 15mm x 100mm 플레이트의 경우 10−30 mL를 사용하고 15mm x 150mm 플레이트의 경우 20−50mL를 사용하십시오.</li>
	<li>일회용 큐벳에 시료의 1 mL을 추가하고 분광광도계를 사용하여 OD를 판독하여 시료의 600 nm (OD600)에서광학 밀도를 측정합니다. 이 단계를 2x 반복하여 각 샘플에 대한 읽기의 세 배만 얻습니다.</li>
	<li>유황산/붕산 용액 3 mL를 배양 튜브에 넣고 얼음 위에 놓습니다. 수집된 샘플의 350 μL을 시험관내의 산 혼합물에 천천히 넣고 와류를 짧게 낮게 첨가한다.<ol>
<li>45 mL의 물에 수산화 칼륨 (KOH) 분말 10.099 g을 추가하여 붕산 염수를 준비하십시오. 혼합물에 24.74 g의 붕산 (H3BO3)을넣고 100 mL로 부피를 가져옵니다.</li>
		<li>얼음이 있는 싱크대에 1L 병을 놓고 500 mL의 농축 황산으로 병을 채웁니다. 준비된 붕산재 의 15 mL을 천천히 추가하십시오. 병을 식힙니다.</li>
		<li>총 25 mL에 대해 10 mL의 붕산 재고를 추가하십시오. 병이 식으면 부피를 1L로 가져옵니다. 주의 : 이 방법은 고농축 황산의 사용에 의존합니다. 적절한 개인 보호 장비는 안전과 샘플의 적절한 폐기 프로토콜을 준수해야 보장하기 위해 사용되어야한다. 참고: 양성 대조를 위해 P.aeruginosa의 알긴산 생성 균주를 통해 수확 및 정제된 D-mannuronic acid 및/또는 알려진 세균성 알긴산 샘플의 공지된 농도(예: PAO581-PAO1mucA25). 음성 대조군을 위해 0.85% NaCl 용액 및/또는 PAO1ΔalgD(박테리아가 알긴산염을 완전히 생성할 수 없게 만드는 알그D 유전자의 프레임 내 삭제)를 사용한다. 통계 분석을 돕기 위해 기술 적 반복 횟수를 늘리기 위해 각 샘플에서 여러 개의 튜브를 만들 수 있습니다. 각 샘플의 3-5 튜브를 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>산/시료 혼합물에 에탄올 용액에 0.1% 카르바졸 100 μL을 추가합니다. 튜브와 소용돌이를 중간 온도로 5초 동안 뚜껑을 덮고 55°C에서 30분 동안 마른 욕조에 놓습니다.</li>
	<li>배양 후 튜브와 와류를 고온으로 짧게 제거하고 5 분 동안 식힙니다. 참고 : 볼 수있는 색상은 보라색의 그늘이 될 것입니다. 색상은 1-2 시간 동안 측정을 위해 안정적으로 유지됩니다.</li>
	<li>깨끗한 큐벳에 혼합물의 1 mL을 추가하고 분광 광도계에서 530 nm에서 샘플의 OD를 판독하여 각 튜브의 OD530을 읽습니다. 분광광도계에 공백으로 0.85 % NaCl튜브를 사용합니다.</li>
	<li>D-Mannuronic 산의 알려진 농도의 직렬 희석의 OD 530을 측정하여 표준 곡선을 준비 (1,024 μg / mL, 512 μg / mL, 256 μg / mL, 128 μg / mL, 64 μg / mL, 32 μg / mL, 16g / mL, 및 8g/ mL). 2x를 반복합니다. 이러한 판독값에서 선형 방정식을 추출합니다. 참고: 표준 곡선은 한 번만 수행하면 됩니다. 추출된 선형 방정식은 이후 테스트에 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>표준 곡선을 사용하여 각 시료에서 알긴산의 농도를 계산하고 선형 방정식으로부터 알긴산 농도를 OD600으로 나누어 OD600당알긴산의 총량을 얻었다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 알긴산 정량에 대한 ELISA
<ol><li>2.1-2.4단계를 반복하여 알긴산 측정을 위한 샘플을 얻습니다. 참고: 사용되는 균주는 PAO1, PAO1ΔalgD및 PAO1 이pherd20T-algU를 운반했다.</li>
	<li>마이크로파이펫을 사용하여 수집된 시료의 50 μL을 처리되지 않은 96웰 플레이트에 첨가한다. 50 μL의 코팅 버퍼(탄산염/중탄산염 버퍼 pH 9.6)를 웰에 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 참고: 양성 대조를 위해, 알려진D-Mannuronic 산 및/또는 알려진 안정알긴산 생산 균주(예: PAO581-PAO1mucA25)의공지된 농도를 사용할 수 있다. 음성 대조군 을 위해 0.85% NaCl 용액 및/또는 PAO1ΔalgD (algD 유전자의 프레임 내 삭제는 박테리아가 어떤 알긴산질도 생성할 수 없게 한다). 통계 분석을 돕기 위해 기술 반복 횟수를 늘리기 위해 각 샘플에서 여러 개의 웰을 만들 수 있습니다. 각 샘플의 3-5 웰을 준비합니다.</li>
	<li>분출 병을 사용하여, 0.05 % 트웬 20 (PBS-T)와 1 x 인산 완충식염수 (PBS)로 플레이트 웰2x를 세척한 다음 플레이트를 뒤집어 서 배수하십시오.</li>
	<li>마이크로파이펫을 사용하여 웰에 차단 완충액(PBS-T의 10% 탈지 우유)을 200 μL 추가합니다. 밤새 4°C에서 배양합니다. 참고: 냉장고의 증발을 방지하기 위해 파라핀 필름또는 수축 랩에 플레이트를 감싸십시오.</li>
	<li>분출 병을 사용하여 우물을 채우고 접시를 뒤집어 배수하여 PBS-T로 플레이트 웰을 2 배 씻어.</li>
	<li>마이크로파이펫을 사용하여 100 μL의 희석된 1차 항체(마우스 항-알긴산 단일클론 항체)를 웰에 넣고 37°C에서 1-2시간 동안 배양한다. 참고: 1차 항체(마우스 항-알긴산 단일클론 항체)는 항체 희석제 용액(1x PBS에서 1% 탈지 우유)에서 0.5 μg/mL(1 mg/mL 스톡의 1:2,000의 희석)의 농도로 제공되었다.</li>
	<li>분출 병을 사용하여 우물을 채우고 접시를 뒤집어 배수하여 PBS-T로 플레이트 웰을 3 배 씻어.</li>
	<li>마이크로파이펫을 사용하여 100 μL의 희석된 이차 항체를 웰에 추가하고 1-2 시간 동안 37°C에서 배양한다. 참고: 사용된 이차 항체는 항체 희석액에서 0.25 μg/mL의 농도로 염소 항-마우스 폴리-HRP 항체(0.2,000 의 희석 0.5 mg/mL 스톡)를 관통하였다.</li>
	<li>분출 병을 사용하여 우물을 채우고 접시를 뒤집어 배수하여 PBS-T로 플레이트 웰을 3 배 씻어.</li>
	<li>마이크로파이펫을 사용하여 TMB-ELISA 용액 100μL(재료 표)을넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 참고 : 긍정적 인 반응의 색상은 파란색의 그늘이 될 것입니다.</li>
	<li>마이크로파이펫을 사용하여 스톱 액 용액 100 μL (2 N 황산)을 추가하십시오. 참고: 정지 솔루션이 추가되면 색상이 파란색에서 노란색으로 바뀝니다. 반응은 중지 된 후 최대 30 분 동안 색상이 안정적입니다.</li>
	<li>플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 OD를 읽습니다.</li>
	<li>D-Mannuronic 산의 알려진 농도의 직렬 희석의 OD 450을 측정하여 표준 곡선을 생성합니다(1,024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16g/mL, 및 8g/mL). 2x를 반복합니다. 이러한 판독값에서 선형 방정식을 추출합니다. 참고: 표준 곡선은 한 번만 수행해야 합니다. 추출된 선형 방정식은 이후 테스트에 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>표준 곡선을 사용하여 각 시료에서 알긴산의 농도를 계산하고 선형 방정식으로부터 알긴산 농도를 OD600으로 나누어 OD600당알긴산의 총량을 얻었다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 알긴산 측정의 통계 분석
<ol><li>그래픽 소프트웨어 시트에서 표준 곡선에서 파생된 선형 방정식으로 열을 설정합니다. Y축 결과를 알긴산 농도 및 x축 결과를 우론산 분석및 ELISA에 대한 OD530으로 설정하고 각 샘플에서 알긴산 농도를 수득한다.</li>
	<li>각 시료의 알긴산 양을 5.5 x108 CFU/mL(1 OD600)당양으로 정규화하기 위해, 위에서 얻은 각 샘플의 농도를 각각의 OD600 값으로 나눈다. 각 샘플에 대해 여러 개의 OD600을 측정한 경우 평균 OD600으로나눕니다.</li>
	<li>선호하는 통계 소프트웨어(예: GraphPad 프리즘 7.02)를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.</li>
	<li>소프트웨어를 엽니다. 새 테이블 및 그래프에서 열을 선택하고 단방향 ANOVA 데이터 집합을 선택합니다.</li>
	<li>변형을 테스트한 각 열의 이름을 지정하고 아래에 알긴산 농도를 추가합니다.</li>
	<li>모든 데이터를 입력 한 후 상단 메뉴에서 분석을 클릭합니다. 그러면 분석 설정 창이 열립니다. 테스트에 적합한 매개 변수를 선택하고 여러 비교를 실행해야 하는지 여부를 나타냅니다. 참고: 분석 후 데이터 집합에는 데이터의 통계적 유의를 결정하는 데 도움이 되는 p-값이 포함됩니다. p-값이 설정된 α 값보다 낮으면 데이터가 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다(일반적으로 α 값은 p&lt; 0.01로 설정됩니다).</li>
	<li>그래프 탭 에서 막대 그래프 유형을 선택합니다. 그러면 입력 데이터 시트에서 표시된 제목으로 데이터가 자동으로 차트로 표시됩니다. 관심 있는 막대 사이의 결합선 위의 * 기호를 표시하여 필요에 따라 데이터의 통계적 유의를 나타냅니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 Hongwei D. Yu는 Progenesis Technologies, LLC의 최고 과학 책임자 겸 공동 설립자입니다.

SCV와 알긴산은 모두 몇몇 만성 감염에서 연루된 중요한 질병 마커입니다. 따라서, SCV를 성장시킬 뿐만 아니라 P. aeruginosa에 의한 알긴산의 조절 및 생산을 연구하는 능력은 이러한 만성 질환에 대한 새로운 치료법의 발견에 필수적이다.
SCV 균주는 다른 P. aeruginosa 균주에 비해 느린 성장속도 4로 인해 성장하기가 악명 이어, 이는 그들의 항균 저항에 에이즈3. 우리의 일은 de novo 피리미딘 생합성에 있는 돌연변이의 결과인 P. aeruginosa SCV의 특정 양식을 식별합니다. 여기서, 우리는 뉴클레오시드 우라실이 공급될 때 이러한 SCV가 정상 성장 표현형으로 되돌리는 것에 대해 논의한다. 그러나 UMP/UTP가 배지에 추가되었을 때 결함 있는 성장이 복원되지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 이 선택성에 대...

녹농균을 가진 만성 폐 감염은 낭포성 섬유증 (CF)를 가진 환자에 있는 이환율 그리고 사망의 중요한 원인입니다. 초기 유년기 도중, 환자는 P. aeruginosa1,2의비 점막 격리를 포함하여 다중 세균성 병원체에 의해 식민지화됩니다. 작은 식민지 변이체 (SCV)의 출현은 점막 분리뿐만 아니라 분리만성 감염에 발병을위한 마커이다. SCV 분리제는 그들의 느린 성장 속도4때문에 높게 약 저항하는3, 그(것)들을 치료 연대 및 그밖 만성 감염에 있는 가혹한 억지력을 렌더링합니다5 에 의하여 P. aeruginosa. Al Ahmar 외6에 의한 작업은 de novo 피리미딘 생합성에 의해 연결된 SCV와 점막 사이의 연관성을 보여주었다. 피리미딘 기아는, 피리미딘 생산과 관련된 유전자의 돌연변이로 인해, 비점막 기준 균주 PAO1 및 점막 유도체, PAO581 (PAO1mucA25)에서 SCV 표현형을 초래하였다.
알긴산 과잉 생산은 CF에서 만성 폐 감염에 대한 중요한 질병 마커임에도 불구하고, 알긴산과 폐 병리학의 양 사이에 직접적인 상관관계가 있는지 는 명확하지 않으며, 알긴산이 치료를 위한 예후 마커로 사용될 수 있는지는 불분명하다7. 알긴산 생산은 주로 2개의 오페론, 조절오페론(algUmucABCD)8,9 및 생합성 오페론(algD operon) 10,11에의해 조절된다. 알긴산 생산은 시그마 인자 AlgU9,12(일명 AlgT라고도 함)와 반시그마 인자 MucA13의분해에 의해 엄격하게 조절된다. 환자의 가래 표본에서 즉석에서 알긴산의 생산을 모니터링하는 능력은 새로운 치료 옵션의 개발에 도움이 될 수 있습니다.
여기서, 우리는 피리미딘 드 노보를 합성할 수 없는 돌연변이체에 의한 SCV의 존재를 검출하는 성장 조건을 기술한다. 피리미딘 뉴클레오티드의 질소 염기인 우라실 및/또는 시토신을 보충하여 인양 경로를 활성화시켜 돌연변이체의 정상적인 성장을 회복시다. 이들 특정 SCV 돌연변이체에 대한 이러한 성장 방법은 환자 샘플에서 피리미딘 돌연변이를 식별하는 스크리닝 방법으로 사용될 수 있다. 또한, 우리는 P. aeruginosa에의해 생성되고 분비되는 알긴산의 검출 및 측정을위한 두 가지 방법에 대해 논의합니다. 첫 번째는 고농도의 산을 이용하여 다당류를 분해한 다음 시료의 농도를 정량화하기 위해 색도 지표를 첨가하는 전통적인 방법14,15,16이다. 우리의 실험실에서 개발 된 두 번째 방법은 QED 바이오 사이언스가 개발 한 항 알긴산 단일 클론 항체 (mAb)를 사용하여 효소 연결 면역 흡착 분석 (ELISA)을 활용합니다. ELISA 방법은 우론산 분석법보다 더 구체적이고 민감하며 고농축 황산의 회피로 인해 보다 안전한 사용을 가능하게 합니다. Alginate를 측정하기 위하여 참을성 있는 가래 견본에 직접 이용되는 ELISA의 기능으로, 감염의 다른 기간에 폐에 존재하는 알긴산의 양을 따르는 감시 진단 공구로 개발될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>앱솔루트 에탄올(200 프루프)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>분자 생체 등급</td></tr><tr><td>Accu 블록 디지털 드라이 배스</td><td>랩넷</td><td>NC0205808</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>분석 플레이트 96-well</td><td>CoStar</td><td>2021-12-20</td><td></td></tr><tr><td>벤치 탑 Vortex-Genie 2</td><td>과학 산업</td><td>G560</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>연구 제품 국제 공사</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>캐비닛 인큐베이터</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>Carbazole</td><td>Sigma</td><td>C-5132</td><td></td></tr><tr><td>탄산염-중탄산염 버퍼</td><td>Sigma</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브(50mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>배양 시험관</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-6D</td> via <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>큐벳 폴리스티렌 (1.5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Cytosine</td><td>Acros Organics</td><td>71-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Diposable Inoculation Loops</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannuronic Acid Sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SMB00280</td><td></td></tr><tr><td>FMC Alginate</td><td>FMC</td><td>2133</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>분자 생물학</td></tr><tr><td>마우스 안티 알긴산 단클론 항체</td><td>QED Biosciences</td><td>N/A</td><td>Lot # :15725/15726</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 분말(PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP 항체</td><td>Thermo Scientific</td><td>32230</td> via <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>수산화칼</td>륨 <td>Fisher Scientific</td><td>1310-58-3</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td><td>Alpha Biosciences</td><td>P16-115</td> via <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Round Toothpicks</td><td>다이아몬드</td><td></td>: <td>모든 브랜드</td></tr>, <tr><td>해조류 알긴산염(Protanal, CR 8133),</td> <td>FMC Corporation</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Skim Milk</td>, <td>Difco</td><td>232100</td>, <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus, 분광광도계</td>, <td>BioRad</td><td>170-2525</td><td>또는 선호 공급업체</td></tr>: <tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr>, <tr><td>SpectraMax i3x 다중 모드 마이크로플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td>i3x</td><td>또는 선호 공급업체</td></tr><tr><td>멸균 페트리 접시 100mm x 15mm</td><td>Fisher Scientific</td>황산을 통한 <td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>A298-212</td><td>기술 등급</td></tr><tr><td>황산(2 Normal -Stop Solution)</td><td>R& D 시스템</td><td>DY994</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>시그마</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>우라실</td><td>아크로스 오가닉스</td><td>66-22-8</td><td></td></tr></tbody></table>

슈도모나스 녹농균의 작은 식민지 변형의 문화와 알긴산의 정량화

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

기회 그람 음성 세균성 병원균인 슈도모나스 녹농균은점막이라는 독특한 표현형을 초래하는 외다당류 알긴산을 과잉 생산할 수 있습니다. Alginate는 낭포성 섬유증 (CF)를 가진 환자에 있는 나쁜 예후 귀착되는 만성 폐 감염에 연결됩니다. 알긴산의 생산을 조절하는 경로를 이해하면 알긴산 형성을 대상으로 하는 새로운 치료 전략의 개발에 도움이 될 수 있습니다. 또 다른 질병 관련 표현형은 작은 콜로니 변이체(SCV)이다. SCV는 박테리아의 느린 성장 및 종종 항균제에 증가 저항과 관련. 이 논문에서, 우리는 먼저 피리미딘 생합성 돌연변이로 인해 유전적으로 정의 된 형태의 P. aeruginosa SCV를 배양하는 방법을 보여줍니다. 질소 염기, 우라실 또는 시토신의 보충은 이러한 돌연변이체에 정상적인 성장을 반환하여 환경으로부터 자유 염기를 청소하는 인양 통로의 존재를 보여줍니다. 다음으로, 우리는 세균성 알긴산의 측정을 위한 2개의 방법을 토론합니다. 첫 번째 방법은 다당류의 가수분해를 그것의 우론산 단량체에 의존하고 염색체 시약, 카르바졸로 유도하는 반면, 두 번째 방법은 시판되는 알긴산 특이적 mAb에 기초한 ELISA를 사용한다. 두 방법 모두 정량화에 대한 표준 곡선이 필요합니다. 우리는 또한 면역학적 방법이 알긴산 정량화를 위해 특이적이고 임상 구편에서 알긴산의 측정을 위해 사용될 수 있음을 보여준다.

도 1은 SCV6을초래하는 pyrD 유전자(피리미딘 생합성 경로내의 유전자)에서 프레임 내 결실 유무에 관계없이 PAO1 및 PAO581의 플레이트를 나타낸다. PAO1 SCV 돌연변이체는 우라실 보충에 반응하여 정상 성장으로 회복되었다(도1A,B). 더욱이, PAO581ΔpyrDSCV 돌연변이체는 부모 균주 PAO581이 추가적인 mucA25 돌연변이를 가지기 때문에 동일한 우라실 처리를 통해 점막으로 복귀하였다(도1C,D). 우론산 카르바졸 분석에 대한 결과는 도 26에</s...

여기서, 우리는 녹농균의 작은 식민지 변종을 배양하는 성장 상태를 설명한다. 우리는 또한 전통적인 우론산 카르바졸 분석및 알긴산 특이적 단일클론 항체(mAb) 기반 ELISA를 사용하여 P. aeruginosa에 의해 생성된 외다당류 알긴산의 검출 및 정량화를 위한 2개의 개별적인 방법을 기술한다.

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

작은 식민지 변형 또는 SCV 기술은 슈도모나스 아에루기노사의 작은 식민지 변종의 선택과 성장을 허용합니다. 이 방법은 매우 확실하며 일반 방법보다 쉽게 선택할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 표준 비뇨기산 카르바졸 방법에 비해 알지네이트 정량화를 위한 보다 안전하고 민감한 ELISA 방법을 상세히 설명하여 소터리 또는 시료 조작 없이 시료에서 직접 알자능 정량화를 가능하게 한다.절차를 시연하는 것은 실험실 기술자 인 브랜든 커비와 내 실험실대학원생 인 로이 알 아마르 (Roy Al Ahmar)가 될 것입니다. 작은 식민지 변형 또는 SCV를 검출하기 위해, 먼저 사전 따뜻하게 PIA 플레이트에 P.aeruginosa 변형 PAO1 델타 PYRD를 줄입니다. 48 시간 동안 섭씨 37도에서 균주를 성장시면 됩니다.성장 판상에서, 일반적인 3~5밀리미터 식민지 크기와 는 반대로 1~ 3밀리미터의 식민지 크기를 특징으로 하는 SCV 표현형을 가지는 단일 식민지 분리를 식별한다. SCV의 순수한 분리를 얻기 위해 선택한 식민지를 다시 줄입니다. 인양 경로의 생리적 활성화를 수행하려면 멸균 접종 루프를 사용하여 PIA 플레이트에서 SCV 콜로니를 선택하십시오.0.1 밀리몰라 우라실로 보충된 미리 데운 PIA 플레이트에서 선택한 콜로니를 줄입니다. 24 ~48시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 자랍니다. 우론산 카르바졸 분석기를 시작하려면, 멸균 이쑤시개를 사용하여 콜로니를 시험하고 선택하기 위해 원하는 균주의 순수한 배양으로부터 단일 식민지를 식별한다.PIB의 5 밀리리터를 포함하는 배양 시험 관에 이쑤시개를 놓습니다. 셰이커 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 성장합니다. 인큐베이션을 따라 미리 데워진 PIA 플레이트에 배양된 PIB 국물의 알리쿼트를 넣습니다.멸균 세포 스프레더를 사용하여 국물을 접시 에 퍼뜨리고 섭씨 37도에서 24 시간 동안 자랍니다. 파이펫 컨트롤러와 멸균 50 밀리리터 파이펫을 사용하여, 어른 잔디에 0.85 %의 염화 나트륨을 추가하고 세포 스프레더를 사용하여 플레이트를 긁어 샘플을 수집합니다. 신선한 50 밀리리터 파이펫을 사용하여 샘플을 흡인하고 50 밀리리터 수집 튜브로 옮킨다.샘플을 높은 곳에 소용돌이쳐 얼음에 샘플을 섞고 놓습니다. 샘플의 OD600을 측정하려면 먼저 0.85%의 염화나트륨을 사용하여 분광계를 블랭크합니다. 그런 다음 샘플 1 밀리리터를 새로운 일회용 큐벳에 추가하고 OD를 읽습니다. 이 단계를 두 번 반복하여 각 샘플에 대한 트리플리케이트를 얻습니다.이제 황산 붕산 용액 3 밀리리터를 배양 튜브에 넣고 얼음 위에 앉게 하십시오. 수집된 샘플의 마이크로리터 350을 시험관의 산 혼합물에 천천히 넣습니다. 낮은 에 잠시 소용돌이 후, 산 시료 혼합물에 0.1%의 카바졸 및 에탄올 용액의 100 마이크로리터를 추가합니다.중간 설정에서 튜브와 소용돌이를 5초 동안 캡합니다. 그런 다음 55°C의 건조한 욕조에 30분간 놓습니다. 인큐베이션 후 튜브를 조심스럽게 소용돌이쳐 5분 동안 식힙니다.0.85%의 염화나트륨을 가진 튜브를 분광광계에 공백으로 사용하십시오. 그런 다음 깨끗한 큐벳에 혼합물의 1 밀리리터를 추가하고 분광계에서 530 나노미터에서 샘플의 OD를 읽습니다. d-mannuronic 산의 알려진 농도의 직렬 희석의 OD530을 측정하여 표준 곡선을 준비합니다.두 번 반복하고 이러한 판독값에서 선형 방정식을 추출합니다. 표준 곡선을 사용하여 각 샘플의 알긴네이트 농도를 계산하고 ALginate 농도를 선형 방정식에서 OD600으로 나누어 OD600당 총 알긴네이트양을 얻습니다. 마이크로피펫을 사용하여 수집된 샘플의 50마이크로리터를 처리되지 않은 96웰 플레이트에 추가합니다.그런 다음 우물에 ELISA 코팅 버퍼 50 마이크로 리터를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 분출 병을 사용하여, 우물을 채우고 접시를 뒤집어 서 그들을 배수하여 PBS-T로 접시 우물을 두 번 세척합니다.마이크로피펫으로 200마이크로리터의 블로킹 버퍼를 우물에 넣고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 배양합니다. 다음 날, 이전과 같이 PBS-T로 접시를 두 번 씻으시다. 그런 다음 1~2시간 동안 100마이크로리터의 희석된 1차 항체를 우물에 넣고 섭씨 37도에서 배양합니다.배양 후, 이전과 같이 PBS-T로 플레이트 웰을 세 번 씻으시다. 다음으로, 1~2시간 동안 100마이크로리터의 희석된 이차 항체를 우물에 넣고 섭씨 37도에서 배양한다. 접시를 세 번 다시 세척한 후 마이크로 파이프를 사용하여 TMB ELISA 용액 100 마이크로리터를 추가하십시오.접시를 서랍에 넣거나 호일로 포장하여 어둠 속에서 30 분 동안 실온에서 플레이트를 배양하십시오. 그런 다음 정지 용액 100 마이크로리터를 추가합니다. 플레이트 판독기를 사용하여 450 나노미터에서 OD를 측정합니다.d-mannuronic 산의 알려진 농도의 직렬 희석의 OD450을 측정하여 표준 곡선을 생성합니다. 측정값을 두 번 반복하고 선형 방정식을 추출합니다. 표준 곡선을 사용하여 각 샘플에서 알긴의 농도를 계산하고 OD600당 총 알긴네이트양을 얻기 위해 OD600으로 선형 방정식에서 알긴전농도를 나눕니다.여기에 표시된 PAO581 및 PAO581의 샘플은 PIA및 PIA에서 자란 피리미딘 드 노보 생합성을 조절하는 유전자의 돌연변이를 우라실의 0.1 밀리머로 보충합니다. 데이터는 미디어에 우라실의 존재가 복원 된 alginate 생산에 의해 본 바와 같이 점액으로 돌연변이 변형의 변환을 초래한다는 것을 보여줍니다. 여기서, 항알기네이트 단클론 항체-ELISA에 대한 결과가 나타난다.식민지는 PBAD 프로모터와 pHERD-20T 플라스미드의 유도를 위해 아라비노스가 있는 PIA 플레이트에서 재배됩니다. 주요 알기네이트 특이적 시그마 인자 알루U를 탑재한 PAO1, PAO1, PAO1은 주요 알기네이트 생합성 효소 GDP-만노스 탈수소효소를 코딩하는 데 있는 algD 유전자의 인프레임 삭제를 갖는다. 이 데이터는 PAO1 및 PAO1 델타 algD에 대해 측정된 알기네이트의 비점액 수준을 pHERD-20T algU와 PAO1에 대해 측정된 알긴네이트의 점막 수준과 비교합니다.항 알자네이트 ELISA는 또한 플레이트에 대한 사전 성장없이 환자 가래 샘플에서 테스트되었습니다. 점액 P.aeruginosa의 성장을 했다 3 개의 CF 가래 샘플 비 점액 P.aeruginosa 또는 아니 P.aeruginosa 성장을 포함 하는 두 개의 환자 가래 샘플에 비해 검출 알기네이트 를 보였다. 이는 샘플 내에서 알긴산의 정확하고 정확한 측정을 가능하게 하기 때문에 알지네이트 정량화를 위한 표준 곡선의 준비는 매우 중요합니다.카르바졸 방법에 사용되는 산용액은 매우 위험하므로 적절한 개인 보호 장비와 예방 조치를 사용하여 안전을 보장해야 합니다. SCV를 격리한 후, 추가 유전 프로파일링은 발생하는 돌연변이와 그러한 돌연변이와 관련된 병원성을 더 잘 이해하기 위해 수행 될 수 있습니다. ELISA 방법은 낭포성 섬유증 환자에서 만성 폐 감염을 모니터링하도록 조정할 수 있습니다.게다가, 우리의 성장 방법은 특정 SCV에 기인한 감염을 진단하는 것을 도울 수 있었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

본 논문은 성장의 다른 방법을...

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

출처: Al Ahmar, R., et al. 녹농균 의 작은 군집 변종의 배양 및 알지네이트의 정량화. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 산 가수분해 후 우론산을 검출하기 위해 카르바졸을 사용하여 녹 농 균에 의해 생성된 알지네이트를 정량화하기 위한 비색 분석을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 연구 및 임상 연구에서 박테리아 바이오매스로 정규화된 알지네이트 생산의 비교 분석이 가능합니다.

Uronic Acid Carbazole Assay를 사용한 박테리아 알지네이트의 정량

출처: Al Ahmar, R., et al. 녹농균 의 작은 군집 변종의 배양 및 알지네이트의 정량화. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 녹농균에 의해 생성되는 보호용 엑소다당류인 알긴산염을 정량화하기 위한 비색 면역분석법을 보여줍니다. 이 절차에는 마이크로플레이트를 샘플로 코팅하고, 특정 항체를 적용하고, 효소-기질 반응을 사용하여 측정 가능한 색상 변화를 생성하는 작업이 포함됩니다. 그런 다음 표준 곡선을 사용하여 샘플의 색상 강도에 따라 알지네이트 농도를 결정합니다.

항체 기반 효소 결합 면역흡착 분석을 사용한 박테리아 알지네이트 정량

여기서 우리는, 화면 고밀도 삽입 돌연변이 체 라이브러리를 생성하기위한 미니 himar1 마리너 트랜스포존-매개 돌연변이 유발을 사용하여 프로토콜을 설명 분리 및 프로토 타입 녹농균 스트레인 PAO1 참신한 알긴산 레귤레이터를 식별한다.

에 알긴산 생산과 관련된 새로운 유전자의 식별<em&gt; 녹농균</em&gt; 사용 미니<em&gt; himar1</em&gt; 마리너 트랜스포존 매개 돌연변이 유발

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슈도모나스 녹농균의 작은 식민지 변형의 문화와 알긴산의 정량화

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