Name: 클리어 심장 3 차원 이미징을 통해 표적 세포 집단의 심장 손상 반응을 캡처 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 배우세요 심장 재생 과정에서 다양한 세포 집단의 역할을 클리어 심장 3차원 이미징 기법으로 분석하는 방법을. 이 기술은 심근세포 증식과 조직 복구 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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이 프로젝트에 대한 기금은 위스콘신 파트너십 프로그램 (A.I.M.)에서 UW 의과 공중 보건 학교와 미국 심장 협회 경력 개발 상 19CDA34660169 (A.I.M.)에 의해 제공되었습니다.

모든 실험은 실험실 동물의 사용 및 관리를위한 가이드에 따라 위스콘신 - 매디슨 대학의 의학 및 공중 보건 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행되었습니다. 모든 방법은 잭슨 연구소에서 얻은 야생 형 C57BL / 6J (B6) 및 형질전환 마우스 라인에서 수행되었다.
1. 관상 동맥 폐색 (심근 경색) 1 일 된 신생아 마우스에서 왼쪽 전방 내림차순 동맥 (LAD)의 결찰을 통해 유도6
<ol><li>1일된 신생아 새끼를 원래의 둥지 재료와 함께 깨끗한 케이지에 넣어 어머니와 분리합니다.</li>
	<li>케이지의 절반을 중간 불로 설정된 가열 패드에 놓습니다. 새끼는 케이지의 가열되지 않은 쪽에 남아 있어야하며 수술 후 가열 된 쪽에만 놓아야합니다.</li>
	<li>수술 현미경으로 멸균 수술 영역을 만듭니다. 멸균 수술 장비를 수집합니다(표1).</li>
	<li>저체온증을 통해 강아지를 마취 : 얼음과 직접 피부 접촉을 피하기 위해 거즈에 새끼를 감싸약 3-4 분 동안 얼음 침대에 묻습니다. 발가락 핀치를 수행하여 주기적으로 마우스의 저체온증을 확인합니다. 신생아는 저체온증을 잘 견딜 수 있지만, 저체온증에 장기간 노출되면 동상과 후속 사망이 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>일단 마취되면, 테이프로 팔과 다리를 고정, 척추 위치에 수술 영역에 마우스를 배치합니다. 살균 용액으로 마우스의 수술 부위를 살균하십시오.</li>
	<li>하부 가슴 부위를 찾아 작은 해부 가위로 피부에 가로 절개를합니다. 갈비뼈의 수술 보기를 넓히기 위해 드레싱 포셉으로 피부를 부드럽게 들어 올려 근육에서 피부를 분리하고 닫힌 위치에서 작은 가위로 늑간 근육을 부드럽게 누릅니다.</li>
	<li>네 번째 늑간 공간(그림 1A)을찾아 날카로운 집게를 사용하여 작고 표면적인 구멍을 만들어 내부 장기에 구멍을 뚫지 않도록주의하십시오. 드레싱 집게와 늑간 근육 사이의 영역을 확대하여 무딘 해부를 수행합니다. 절개의 적절한 해부학 적 위치는 심장에 대한 적절한 접근을 위해 필수적입니다.</li>
	<li>손가락을 배치하고 드레싱 집게로 늑간 공간을 열어 유지하면서 복부의 왼쪽에 증가 압력을 가하여 가슴 구멍에서 심장을 부드럽게 안내(그림 1B). 심장이 가슴 바깥쪽에 있으면 드레싱 집게를 제거하고 압력을 완화하고 심장이 늑간 근육에 쉬도록하십시오.</li>
	<li>LAD를 혈액이 적고 올바른 해부학 적 위치에있는 심장 영역으로 LAD를 찾습니다(그림 1C). LAD는 심혼이 수술 시작의 몇 분 안에 접근되는 경우에 현미경의 밑에 만 보일 수 있습니다.</li>
	<li>LAD를 6-0 봉합술로 봉합하여 LAD 결찰을 수행한다(도1D). 심근 경색을 유도하기 위해 사각형 매듭을 두 번 묶습니다(그림 1E). 심근으로 봉합사의 깊이는 다를 수 있습니다, 그러나, LAD 결찰의 적당한 해부학적인 위치는 재현성을 위해 결정적이다. LAD를 결찰 할 때, 봉합사는 LAD를 끊지 않도록 단단히 단단히 당기어야하지만 조심스럽게 당겨야합니다. 심장의 정점에 희게 즉시 볼 수 있습니다(그림 1E)</li>
	<li>심장이 가슴 구멍으로 다시 미끄러 지게하십시오. 이 과정은 드레싱 집게로 부드럽게 촉진 될 수 있습니다. 늑골의 매듭과 함께 봉합을 하고 사각형 매듭을 하고 무딘 집게를 사용하여 갈비뼈의 상부 세트를 6-0 봉합사를 통과하는 동안 갈비뼈의 상부 세트를 들어 올립니다.</li>
	<li>강아지의 뒷다리를 고정하는 데 사용 된 테이프를 제거합니다.</li>
	<li>상부 복부에 소량의 피부 접착제를 배치하여 피부를 함께 부착하십시오. 그런 다음 하복부의 피부를 미세 한 집게로 잡고 노출 된 가슴 부위를 덮습니다. 이 어머니에 의해 거부와 식인 풍습의 가능성을 증가시킬 수 있기 때문에, 새끼에 남아있는 과잉 접착제의 양을 제한합니다.</li>
	<li>즉시 중간 열로 설정 난방 패드에 강아지를 배치하여 마취에서 회복을 용이하게. 주기적으로 신생아의 위치를 전환하여 신체의 모든 부분을 고르게 따뜻하게하십시오.</li>
	<li>신생아가 10-15 분 동안 가열 패드에 직접 남아 있게하십시오. 일반적으로 열에 놓인 후 5 분 이내에 운동이 회복됩니다.</li>
	<li>잔여 혈액을 닦고 알코올 닦음으로 접착제를 닦으소.</li>
	<li>원래 케이지에서 침구로 몸 전체를 문질러 신생아에 외국 향기를 커버. 다른 수술이 수행되는 동안 가열 된 측면에 케이지에 새끼를 배치합니다.</li>
	<li>모든 수술이 완료되고 새끼가 따뜻하고 이동되면 원래 중첩 물질과 함께 쓰레기를 어머니의 새장에 옮니다.</li>
	<li>수술 후 30-60 분 동안 마우스를 모니터링하고 중첩 및 / 또는 그루밍에 의해 새끼의 어머니의 수용을 감시.</li>
	<li>수술 다음날 아침 에 마우스를 확인하십시오. 어머니가 고민하고 새끼를 중첩하지 않은 경우, 새끼를위한 수양 어머니를 고려하십시오.</li>
</ol>2. 패시브 선명도로 마우스 심장 지우기21,,22,,23
<ol><li>이소플루란으로 마우스를 마취시다. 발가락 핀치를 수행하여 마우스가 완전히 진정되었는지 확인합니다.</li>
	<li>마우스를 깨끗한 수술 부위에 놓고 테이프로 팔과 다리를 고정시됩니다.</li>
	<li>심장이 추출 될 때까지 코 콘을 사용하여 마우스에 isoflurane 침강을 유지합니다.</li>
	<li>조직 집게로 xiphoid 과정 바로 아래에 모피를 잡고 하부 가슴을 열고 큰 해부 가위를 사용하여 흉곽의 폭을 가로 막는다.</li>
	<li>수술 가위로 늑골 케이지의 말단 부분과 함께 잘라.</li>
	<li>조직 집게로 xiphoid 과정을 파악하여 횡격막 근육을 노출. 곡면 집게를 사용하여 다이어프램을 분리합니다.</li>
	<li>xiphoid 프로세스의 이해를 유지하면서, 박동 심혼이 접근할 수 있는 때까지 조직을 두개골로 당깁니다.</li>
	<li>구부러진 집게로 베이스의 심장을 잡고 대류와 우수한 정맥카바를 무당색 가위로 절단하여 가슴 구멍에서 심장을 해부하십시오.</li>
	<li>심장이 여전히 뛰는 동안, 심장이 계속 박동할 때 심장이 피를 내뿜을 수 있도록 PBS로 채워진 페트리 접시에 하트를 넣습니다. 심근 경색은 봉합사의 배치가 LAD 결찰을위한 적절한 해부학 적 위치에 있는지 확인함으로써 확인할 수 있습니다.</li>
	<li>심장이 잔여 혈액을 추방 할 수 있도록 집게로 부드럽게 심장을 짜냅니다.</li>
	<li>일회용 2.5 mL 유리 껍질 바이알에 마우스 심장을 전송 2 mL의 PBS. 실온(RT)에서 10분 동안 셰이커에 심장을 배양하여 잔류 혈액을 여러 번 씻어내주세요. PBS가 명확해질 때까지 매번 PBS 솔루션을 변경합니다.</li>
	<li>PBS를 버리고 바이알을 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA)의 2 mL로 채웁니다. RT에서 4 시간 동안 배양하십시오(그림 2A).</li>
	<li>배양 후, PFA 및 바이알을 2 mL의 PBS로 버린다. RT에서 10 분 동안 쉐이커에 심장을 씻어. 세척 단계를 두 번 반복하고, 배수하고 완전히 초과 PFA를 씻어 때마다 새로운 PBS로 유리병을 작성합니다.</li>
	<li>PBS를 버리고 바이알을 4% 아크릴아미드 2 mL 및 0.5% VA-044 용액으로 채웁니다. 4 °C에서 밤새 배양.</li>
	<li>다음날, 바이알을 37°C로 설정된 열 블록으로 3시간 동안 이송하여 중합을 수행한다.</li>
	<li>새로운 유리 껍질 바이알에 심장을 전송하고 반복 단계 2.12 (PBS 세척 주기).</li>
	<li>PBS를 버리고 2 mL의 클리어링 솔루션으로 바이알을 채웁니다(표2). 심장이 깨끗해질 때까지 37°C에서 배양합니다. 솔루션을 교체하고 2-3일마다 신선한 클리어링 솔루션으로 리필하십시오. 정리 프로세스는 최대 몇 주가 걸릴 수있습니다(그림 2B-C). 참고 : P1 하트는 일반적으로 약 3-5 일이 걸리는 반면 P21 하트는 해결 솔루션 배양이 완료되기 까지 거의 한 달이 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>PBS를 버리고 바이알을 2 mL의 PBS로 채우고 2.12 단계 (PBS 세척 주기)를 반복합니다. 바이알을 신선한 PBS로 리필하고 37°C에서 밤새 배양한다.</li>
	<li>면역 염색이 수행될 경우, 단계 2.21-2.22를 건너뛰고 면역 염색을 위해 섹션 3으로 진행합니다. 내인성 형광에전적으로 의존하는 경우, 단계 2.21-2.22를 진행하고 섹션 3을 건너뜁니다.</li>
	<li>PBS를 폐기하고 솔루션을 굴절률 일치 솔루션(RIMS)(표3)으로변경합니다. 37 °C에서 하룻밤 배양.</li>
	<li>배양 후, 지워진 조직은 RT. 조직에서 RIMS 용액에 저장될 수 있다. 몇 주 동안 실온에서 RIMS에서 배양된 후 조직이 투명해져야합니다(그림 2D).</li>
</ol>3. 선택 사항: 전체 마운트 마우스 심장의 면역 화학 염색
<ol><li>RIMS 용액에서 제거된 심장을 제거하고 2mL의 PBST(0.1% 트리톤-X 100의 PBS)로 깨끗한 2.5mL 유리 병으로 넣습니다.</li>
	<li>RT에서 30 분 배양으로 궤도 회전에 PBST에서 심장을 3 번 씻어.</li>
	<li>20% 차단 완충제(PBST에서 희석)의 2 mL에 심장을 침지하여 비특이적 항체 결합을 차단하고 RT에서 3시간 동안 회전하여 배양하여 밤새 회전으로 얼룩을 4°C로 옮김한다. 참고: 차단 완충제는 이차 항체가 제기된 종과 일치하는 정상 혈청으로 만들어집니다.</li>
	<li>RT에서 5 분 배양동안 회전하여 PBST에서 심장을 3 번 씻어 내보하십시오.</li>
	<li>1 차 항체에 심장을 담그고 (PBST로 2 % 차단 버퍼로 희석) 알루미늄 호일에 유리 유리병을 포장하여 빛 노출을 방지하십시오. RT에서 하룻밤 회전으로 인큐베이팅합니다. 참고: 이 시점부터 알루미늄 호일은 주변 광 노출로부터 보조 를 보호하기 위해 지속적으로 사용되어야합니다.</li>
	<li>4 °C에서 회전하여 추가로 24 시간 동안 배양하십시오.</li>
	<li>1차 염색 후, 3.2단계(긴 PBST 세척 주기)를 반복하여 조직에서 언바운드 원발성 항체를 제거한다. RT에서 회전하여 밤새 배양하여 세척을 연장합니다.</li>
	<li>이차 항체 빛 노출을 방지하기 위해 제한된 조명이있는 지역에서 작업하고, 이차 항체 (PBST로 2 % 차단 버퍼로 희석)에 심장을 담그고 RT에서 3 시간 동안 회전하여 배양하십시오.</li>
	<li>다음날, 단계 3.2(긴 PBST 세척 주기)를 반복하여 언바운드 이차 항체를 제거한다.</li>
	<li>용액을 2% 블로킹 버퍼(PBST에서 희석)로 교체합니다. RT에서 회전하여 밤새 세척하여 잔류 언바운드 항체를 제거합니다.</li>
	<li>다음 날, 공초점 현미경을 사용하여 과잉 이차 항체가 제거되었는지 확인하십시오. 필요에 따라 세척을 연장하고 매일 2% 블로킹 버퍼 용액을 교체합니다. 비특이적 보조 보조가 존재하지 않는 경우 한 번 진행하십시오.</li>
	<li>면역 염색된 심장을 PBS에서 4°C로 저장합니다.</li>
	<li>전체 마운트 현미경 검사법 직전에 37 °C에서 RIMS 용액으로 밤새 심장을 배양하십시오. 조직이 아직 완전히 제거되지 않은 경우 추가 24 시간 배양을 연장합니다.</li>
	<li>완전히 지워지고 면역이 묻은 심장을 RT의 RIMS에 보관하십시오.</li>
</ol>4. 삭제된 마우스 심혼의 단 하나 광자 공초점 현미경 현미경 화상 진찰을 가진 3D에 있는 비 근균 인구를 가시화하십시오
참고: 마우스 하트가 배아로 수확되는 경우 섹션 4.1을 계속하십시오. 마우스 하트가 산후적으로 수확되면 섹션 4.2를 계속하십시오.
<ol><li>클리어 배아 마우스 심장 이미징<ol>
<li>PBS 용액으로 현미경 우울증 슬라이드를 채웁니다.</li>
		<li>조심스럽게 구부러진 집게로 맑은 심장을 집어 들고 티슈를 슬라이드에 놓습니다.</li>
		<li>유리 커버 슬립으로 슬라이드를 장착합니다. 조직은 지금 공초점 현미경의 밑에 심상될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>클리어 된 출생 후 마우스 심장 이미징<ol>
<li>PBS 용액으로 우울증 슬라이드의 챔버 의 절반을 채웁니다. 성체 마우스 심장에 맞을 수 있을 정도로 큰 챔버를 만들기 위해, 3D 프린팅 폴리프로필렌 우울증 슬라이드를 맞춤 제작하였다(도4).</li>
		<li>조심스럽게 구부러진 집게로 맑은 심장을 집어 들고 조직을 챔버에 넣습니다. 챔버의 남은 부피를 PBS로 채웁니다.</li>
		<li>액체의 표면이 챔버의 상단 위에 돔을 형성할 수 있도록 PBS로 챔버를 채웁니다. 커버 슬라이드를 장착합니다. 조직은 지금 똑바로 공초점 현미경의 밑에 심상될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Wang, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Reservoir+of+Mature+Cavity+Macrophages+that+Can+Rapidly+Invade+Visceral+Organs+to+Affect+Tissue+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair.</a> Cell. 165 (3), 668-678 (2016).</li>
<li>Vieira, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+lymphatic+system+stimulates+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).</li>
</ol>

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

심근세포와 비 근세포 집단 사이의 세포 세포 상호 작용은 심장이 섬유증을 겪거나 부상 다음 수리를 받을지 여부를 결정하는 요소입니다. 발견은 신경14,후막 세포24,복막 대식세포25,동맥12,,13,및 림프내피세포(26)를포함한 다양한 세포 유형이 모두 심장 수리를 중재하는 데 필수적인 역할을 한다는 것을 입증하였다. 이러한 세포 계선 및 관심의 다른 쥐에 Cre-lox 및 CRISPR-Cas9 기술을 적용 하 여 개발, 질병, 그리고 재생 하는 동안 유전적으로 추적될 수 있다. 기관 정리 및 고급 현미경 검사법과 결합될 때, 비 근심세포 인구의 기여는 상해 다음 심근 재생의 세포와 분자 표적을 해명하는 문을 열어 정확하게 평가될 수 있습니다.
<p...

심혼은 오래 포스트 유사분열 기관으로 여겨지고 있습니다, 그러나 최근 기록은 심근 세포 갱신이 대략 1%에 성인 인간 심혼에서 일어납니다1. 그러나, 심근 세포 회전율의 이 낮은 비율은 상해 다음 생기는 조직의 거대한 손실을 보충하기 위하여 불충분합니다. 심근 경색을 겪은 심장은 심근세포 약 10억 개를 잃게 되며, 종종 심부전과 갑작스런 심장 사망의 전주곡으로 쓰일 수 있습니다2,,3. 전 세계적으로 2,600만 명 이 넘는 사람들이 심장 마비로 인해 심장 질환으로 인한 피해를 되돌릴 수있는 치료법에 대한 충족되지 않은필요성이 있습니다 4.
치료에 있는 이 격차를 해소하기 위하여는, 과학자는 상해 다음 내인성 재생의 기초가 되는 진화적으로 보존한 기계장치를 조사하기 시작했습니다. 포유류 심장 재생을 연구하기위한 하나의 모델은 신생아 마우스입니다. 출생 다음 주 안에, 신생아 마우스는 심장 손상 다음 강력한 재생 반응이5. 우리는 이전에 신생아 마우스가 정점 절제술5에 따라 심근 세포 증식을 통해 심장을 재생할 수 있음을 입증했습니다. 이 기술은 신생아에서 심장 재생을 불러 일으킬 수 있지만, 수술은 인간의 심장 부상에 임상 관련성이 부족합니다. 신생아 마우스 모델에서 사람의 상해를 모방하기 위해 관상동맥 폐색을 통해 심근경색을 유도하는 기술을개발하도6. 이 기술은 좌심실 심근 에 혈액의 40%-50%를 전달하는 책임있는 좌측 전방 내림차종 동맥 (LAD)의 외과결찰을 요구합니다 6,,7. 따라서, 수술은 좌심실 벽의 상당 부분에 영향을 미치는 경색을 초래한다. 심근에 이 손상은 신생아에 있는 심근 세포 증식 그리고 심혼 재생을 자극할 것입니다5.
관상 동맥 폐색 수술은 심장 재생의 내부 작용을 밝히기 위해 매우 재현가능하고 직접적인 번역 방법을 제공합니다. 신생아 수술은 인간의 심장에 관상 동맥 동맥 경화증을 평행, 여기서 동맥의 내벽 내에서 플라크의 축적은 폐색 및 후속 심근 경색을 일으킬 수 있습니다8. 심부전 환자를 위한 치료 치료에 있는 무효 때문에, LAD에 있는 폐색은 상해9다음 년 안에 26%까지 도달하는 사망률과 연관되고, 결과적으로 "과부 제조자"로 불려졌습니다. 치료법의 발전은 심장 손상의 복잡한 생리적 및 병리학적 효과를 정확하게 반영하는 모델이 필요합니다. 신생아 마우스 심장 부상에 대한 우리의 수술 프로토콜은 연구원이 부상 후 포유류 심장 재생을 신호 분자 및 세포 단서를 조사 할 수있는 플랫폼을 제공합니다.
최근 연구는 세포 외 환경과 증식 심근 세포 사이의 동적 관계를 강조합니다. 예를 들어, 산후 재생 창은심장(10)을둘러싼 세포외 기질의 강성을 감소시킴으로써 연장될 수 있다. 신생아 외 세포 질성에서 생체 물질은 또한 심장 부상 다음 성인 포유류 심장에서 심장 재생을 촉진 할 수있습니다 11. 또한 수반되는 심근세포 증식은 혈관신생 반응12,,13; 신생아 마우스의 재생심장에 특이적인 부수적인 동맥 형성은 심장 재생을 자극하는 데 필수적인 것으로 나타났다12. 더욱이, 우리의 실험실은 신경 신호가 성장 인자 수준의 변조를 통해 심근 세포 증식 및 심장 재생을 조절하고, 부상 다음 염증반응14를입증했다. 이 사실 인정은 심장 상해에 응하여 비 근세포 세포 인구를 추적하는 필요를 강조합니다. 이 목표를 달성하기 위해, 우리는 계보 추적을 위한 형광 리포터 단백질의 구성또는 조건부 표현을 통합하기 위하여 형질전환 마우스 라인에 있는 Cre-lox 재조합 시스템을 이용했습니다. 더욱이, 우리는 표적 세포집단(15)의클론 팽창을 결정하기 위해 Cre 의존성, 다색 형광기의 스토컨스 발현에 의존하는 레인보우 마우스 라인으로 클론 팽창 패터닝을 결정하기 위한 고급 방법을 사용할 수 있다. 신생아 관상 동맥 폐색 수술과 계보 추적을 채택하는 것은 심장 재생의 복잡한 세포 메커니즘을 해부하기위한 강력한 도구입니다.
3차원(3D) 전체 장기 이미징으로 형광표지된 세포의 혈통을 추적하는 것은 전통적인 단면화 및 재건 기법을 사용하여 달성하기 가 어렵습니다 - 특히 신경 섬유 나 혈관과 같은 세포 집단이 취약할 때. 광학 단면에 의하여 기관의 직접적인 전체 마운트 화상 진찰이 표면 적인 세포 인구를 붙잡을 수 있는 동안, 조직 내의 깊은 곳에 있는 구조물은 접근할 수 없는 남아 있습니다. 이러한 장벽을 우회하기 위해 전체 장기 조직의 불투명도를 줄이기 위해 조직 정리 기술이 개발되었습니다. 최근에는 지질추출을통해 고정조직을 클리어하는 클리어 지질교환 아크릴아미드-혼성화 강성 이미징 호환 조직 hYdrogel(CLARITY)-기반 방법(CLARITY)에 상당한 진전이 이루어지고 있다. 단계는 또한 굴절률을 균질화하고 이후에 화상 진찰17동안 광 산란을 감소시키기 위하여 취합니다. 이러한 방법 중 하나는 활성 CLARITY이며, 이는 전기 활성을 이용하여 조직 전체에 세제를 침투시킴으로써 지질 분해를가속화한다(18). 효과적이지만, 이 조직 정리 방법은 고가의 장비를 필요로 하고 조직 손상을 일으킬 수 있으며, 심장신경(19)과같은 연약한 세포 집단과 호환되지 않는 접근법을 만드는 것이다. 따라서, 우리는 부드럽게 세제 침투를 용이하게하기 위해 열에 의존 수동 CLARITY 접근 방식을 채택, 따라서 복잡한 세포 구조의 보존에 도움20,,21.
수동 선명도는 일반적으로 활성 CLARITY 보다 덜 효율적인 것으로 생각된다 18,기술은 종종 두 가지 주요 장애물을 동반: 전체 장기 깊이 지우지 못하는 성인 조직을 취소 하는 데 필요한 시간의 광범위 한 금액. 우리의 수동적인 CLARITY 접근법은 신생아와 성인 심장 조직을 완전히 지를 수 있는 신속한 클리어링 프로세스로 이러한 장벽을 모두 극복합니다. 우리의 수동 CLARITY 조직 정리 기술은 성인 심혼을 통하여 분포된 희소한 인구를 포함하여 심장 세포 인구의 다양한 의 시각화를 허용하는 효율성에 도달했습니다. 지워진 심혼이 공초점 현미경으로 심상될 때, 발달, 질병 및 재생 도중 세포 특정 패터닝의 건축은 점등될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1-thioglycerol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 Prolene 봉합</td>사 <td>Ethicon</td><td>8889H</td><td>폴리프로필렌 봉합사</td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>곡선 집게</td><td>Excelta</td><td>16-050-146</td><td>반 곡선, 톱니 모양, 4인치</td></tr><tr><td>드레싱 집게</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-39</td><td>해부, 4.5</td></tr>인치 <tr><td>유리 바이알</td><td>Fisherbrand</td><td>03-339-26A</td><td>12 x 35mm 바이알(캡 포함</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>밀도 구배 매체</td></tr><tr><td>홍채 절제술 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>2mm 커팅 엣지</td></tr><tr><td>대형 해부 가위</td><td>Fisherbrand</td><td>08-951-20</td><td>스트레이트, 6인치</td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>Fisherbrand</td><td>08-966</td><td>Mayo-Hegar, 6인치</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>날카로운 집게</td><td>Sigma-Adrich</td><td>Z168777</td><td>파인 팁, 스트레이트, 4.25인치</td></tr><tr><td>소형 해부 가위</td><td>Walter Stern Inc</td><td>25870-002</td><td>30mm 커팅 엣지</td></tr><tr><td>아지드</td><td></td><td></td><td></td>화</tr><tr><td>나트륨 도데실 황산염 (SDS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>조직 겸자</td><td>Excelta</td><td>16050133</td><td>매체 조직, 1X2 이</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako 화학 수용</td><td></td><td>성 azo 개시제</td></tr></tbody></table>

클리어 심장 3 차원 이미징을 통해 표적 세포 집단의 심장 손상 반응을 캡처

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

심혈관 질환은 다른 모든 사망 원인을 능가하며 전 세계적으로 사망률의 31%를 차지합니다. 이 질병은 주로 급성 심근 경색의 형태로 심장 손상으로 나타납니다. 부상 다음 약간의 탄력성으로, 한 번 건강한 심장 조직은 섬유질로 대체됩니다, 비 수축 흉터 조직종종 심장 마비의 전주곡이 될. 재생 의학에서 새로운 치료 옵션을 식별 하기 위해, 연구는 타고난 재생 기능을 가진 척추 동물에 초점을 맞추고 있다. 그러한 모델 유기체 중 하나는 강력한 심근 재생으로 심장 손상에 반응하는 신생아 마우스입니다. 임상적으로 관련이 있는 신생아 마우스의 부상을 유도하기 위해, 우리는 인간의 심장에 있는 동맥 경화증에 의해 유발된 심근 경색을 미러링하는 왼쪽 전방 내림차순 동맥 (LAD)을 폐색하는 수술을 개발했습니다. 심근세포 와 비 근세포 집단 내의 변화를 추적하는 기술과 일치할 때, 이 모형은 심혼 재생을 인도하는 기계장치를 확인하는 플랫폼을 저희에게 제공합니다. 상해 다음 심장 세포 인구에 있는 변경에 통찰력을 얻는 것은 한 번 2 차원 분석으로 제한되고 수시로 프로세스에 있는 조직을 손상하는 조직 단면도 와 조직학 검사와 같은 방법에 크게 의존했습니다. 더욱이, 이 방법은 세포 계의 변경을 추적하는 기능이 부족합니다, 대신 상해 반응의 단지 스냅샷을 제공하. 여기에서는 계보 추적 모델, 전체 장기 클리어링 및 3차원(3D) 전체 마운트 현미경 검사법에서 기술적으로 진보된 방법을 사용하여 심장 수리 메커니즘을 설명하는 방법을 설명합니다. 신생아 마우스 심근 경색 수술, 조직 정리 및 3D 전체 장기 이미징을위한 프로토콜을 사용하면 심근 세포 증식을 유도하는 복잡한 경로를 풀어 심장 재생을위한 새로운 치료 목표를 드러냅니다.

종종 가장 어려운 두 단계는 가슴 구멍에서 심장을 안내하고 LAD를 결찰하는 것입니다. 이러한 단계를 해결하기 위해, 조정은 제 4 늑간 근육 사이의 초기 펑크의 배치에 이루어질 수있다; 천자와 무딘 해부가 흉골에 너무 가깝으면 심장이 흉강을 빠져 나갈 수 없을 수 있습니다(그림 1A).
추가적으로, 좌측 복부에 증가한 압력은 이 프로세스를 촉진하기 위하여 필요할 수 있습니다(그림 1B). 합병증은 늑간 근육에 심혼을 쉬게 할 때 또한 생길 수 있습니다. 우리는 무딘 해부가 최소한의 크기로 유지되고 주로 수평 방향으로 수행 될 때 심장이 철회하지 않고 공동 의 외부에 남아 있다는 것을 발견했습니다. 이 방향은 또한 LAD(그림 1C)에</stron...

상해 다음 심근 세포 증식은 비 근세포 세포 집단에서 세포 외 단서의 교향곡을 요구하는 동적 프로세스입니다. 계보 추적, 수동 선명도 및 3차원 전체 마운트 공초점 현미경 기술을 활용하여 다양한 세포 유형이 심장 수리 및 재생에 미치는 영향을 분석할 수 있습니다.

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

내인성 심장 재생은 강력한 재생 반응을 탑재하기 위해 함께 작업하는 여러 세포 유형을 포함하는 동적 과정입니다. 부상에 대한 응답으로 클리어 된 심장의 3D 이미징을 통해 재생 조직으로 피어링은이 심장 재생 반응을 안내하는 세포 역학의 재건에 도움이 될 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 개발 및 재생 중에 세포를 추적하도록 특별히 설계되었습니다.우리는 다른 장기 유형에 우리의 청산, 염색 및 화상 진찰 기술을 광범위하게 적용하는 데 아무런 제한이 없다고 예측합니다. LAD 유도 관상 동맥 폐색의 경우, 먼저 살균 된 1 일 된 신생아 새끼의 수술 부위를 살균하여 방부제 용액을 제공합니다. 가슴 부위에 횡단 피부 절개를 합니다.피부와 근육을 분리하려면 드레싱 포셉을 사용하여 피부를 조심스럽게 들어 올리는 동시에 가위를 닫힌 자세로 늑간 근육에 부드럽게 누르십시오. 네 번째 늑간 공간을 찾아 작은 집게를 사용하여 내부 장기를 피하기 위해 작은 피상적 인 구멍을 처리합니다. 무딘 해부와 드레싱 집게를 사용하여, 손가락이 복부의 왼쪽에 적용 될 때까지 늑간 근육 사이의 영역을 넓히고 드레싱 집게로 늑간 공간을 열어 가슴 구멍에서 부드럽게 안내합니다.심장이 추출되면 심장이 늑간 근육에 휴식을 취하여 풀이 덜 한 혈액을 가진 심장 영역으로 LAD를 찾도록 하십시오. 심근 경색을 유도하기 위해 6-0 봉합사를 사용하여 동맥을 끊지 않고 용기 주위에 사각형 매듭을 두 번 단단히 묶습니다. 정점에 희게 즉시 관찰해야합니다.비슷한 경색 크기에 대 한 LAD를 따라 봉합사 배치에 일관성을 유지 하는 것이 중요 하다. 이것은 혈액이 아직도 동맥을 통해 흐르는 동안 심장에 빨리 접근하여 달성됩니다. 봉합사가 배치되면 심장이 가슴 구멍으로 다시 미끄러질 수 있습니다.갈비뼈의 상부와 하부 세트를 통과하는 동안 갈비뼈의 상부 세트를 들어 올리는 무딘 집게를 사용하여 한 외과 의사와 한 평방 매듭과 함께 갈비뼈를 봉합합니다. 상복부에 소량의 피부 접착제를 바르고 미세 한 집게를 사용하여 노출 된 가슴 부위에 하복부의 피부를 배치하십시오. 그런 다음 강아지를 가열 패드에 놓고 다음 동물에 결찰을 수행합니다.모든 수술이 수행되면 따뜻하고 이동식 새끼를 어머니의 집 케이지로 되돌려 놓습니다. 수확된 심장 조직의 수동적인 명확성을 위해, 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후 21일 수술 후, 마우스를 supine 위치에 있는 깨끗한 수술 부위에 놓고 테이프로 팔다리를 고정시하십시오. 조직 집게를 사용하여, xiphoid 과정 바로 아래에 모피를 잡고 흉곽의 폭에 걸쳐 절개를합니다.흉곽의 말단 부분과 함께 잘라 횡격막을 노출하는 xiphoid 과정을 들어 올리기 위해 집게를 사용합니다. 다이어프램을 구부러진 집게로 분리하고 박동하는 심장이 접근 할 때까지 조직을 미친 듯이 당깁니다. 곡선 된 집게를 사용하여 베이스의 심장을 파악하고 iridectomy 가위를 사용하여 대오르타와 우수한 베나 카바를 자른다.심장이 유지된 혈액을 펌핑할 수 있도록 박동하는 심장을 PBS의 페트리 접시에 넣습니다. 심근 경색은 LAD 결찰의 올바른 해부학적 배치에 의해 확인될 수 있다. 심장박동이 멈추면, 잔류 혈액을 추방하고 표본을 PBS 의 2 밀리리터를 포함하는 일회용 2.5 밀리리터 유리 껍질 바이알로 옮기기 위해 집게로 기관을 부드럽게 짜냅니다.용액이 혈액이 제거될 때까지 10분마다 PBS 용액을 변경하는 실온에서 적어도 30분 동안 바이알을 셰이커에 놓습니다. PBS가 명확할 때 PBS를 실온에서 4시간 동안 잠복한 후 워시당 2밀리리터의 신선한 PBS2밀리리터로 셰이커에 10분 동안 세척할 수 있는 2밀리리터로 PBS를 교체하십시오. 마지막 세척 후, 4%의 아크릴아미드의 2밀리리터로 바이알을 채우고 섭씨 4도에서 하룻밤 잠복할 수 있도록 0.5%VA-044 용액을 보충합니다.다음 날, 3 시간 동안 섭씨 37도 열 블록에 유리병을 배치합니다. 중합의 끝에서, 새로운 유리 껍질 유리 바이알로 심혼을 전송하고 모든 잠복의 끝에 PBS를 상쾌하게 한 번에 신선한 PBS 10 분의 2 밀리리터에 심장 조직을 씻어. PBS가 명확하면 세척 버퍼를 2밀리리터의 클리어링 솔루션으로 교체합니다.심장이 맑을 때까지 몇 주 동안 섭씨 37도에서 표본을 배양하여 2~3일마다 클리어링 솔루션을 새로 고침합니다. 장기가 명확할 때, 37섭씨에서 24시간 배양을 위해 바이알을 신선한 PBS로 리필하기 전에 시연된 대로 셰이커에 PBS로 시편을 씻으시다. 다음 날, PBS를 RIMS로 교체하여 섭씨 37도에서 24시간 배양할 수 있습니다.잠복이 끝나면 조직이 완전히 지워집니다. 조직은 몇 주 후에 투명해져야 합니다. 심근 경색 유도 후 삭제 된 산후 마우스 심장의 이미징을 위해 PBS와 맞춤형 우울증 슬라이드의 챔버의 절반을 채우고 곡선 된 집게를 사용하여 클리어 된 심장을 조심스럽게 챔버로 옮긴다.PBS로 챔버의 나머지 볼륨을 채웁니다. 그런 다음 액체 표면이 챔버의 상단 위에 돔을 형성하고 표준 이미징 프로토콜에 따라 공초점 현미경에 의해 조직을 이미징하기 전에 커버 슬라이드를 장착 할 때까지 PBS로 챔버를 채웁니다. 천자와 무딘 해부는 흉골에 근접너무 가까이있는 경우, 심장은 가슴 구멍을 종료하지 못할 수 있습니다.심장이 쉽게 구멍을 빠져나가지 않으면 왼쪽 복부에 압력을 가하여 과정을 용이하게 하십시오. 합병증은 늑간 근육에 심혼을 휴식에서 생길 수 있습니다. 따라서 LAD의 명확한 시각화 및 접근성을 허용하기 위해 무딘 해부를 수평 방향으로 최소한의 크기로 유지하는 것이 중요합니다.피상적 결찰은 최종 봉합사 배치에서 조정할 여지가 적고 LAD 주변의 봉합사가 제어된 꾸준한 움직임으로 수행되어야 합니다. 클리어링 단계가 끝날 때까지 심장 전체가 중앙에 변색없이 일관되게 불투명해야합니다. 실온에서 RIMS 용액에서 며칠 후, 심장은 완전히 지워야하며 일부 조직 확장을 관찰 할 수 있습니다.tdTomato 리포터 단백질 발현에 의해 관찰된 바와 같이, 심장 신경은 주로 상고층에 거주하는 일부 인구와 피상적이다. 중요한 것은, 리포터 단백질 발현 확인은 입증된 바와 같이 선명도 프로토콜을 받은 후에 보존된다. 3D 심장을 지우고 이미징하면 심장 세포 집단의 위치와 형태에 대한 관점을 제공합니다.이것은 우리가 세포 패터닝 및 세포 세포 상호 작용에 있는 새로운 양상을 확인하는 것을 허용합니다.

capturing-cardiac-injury-response-targeted-cell-populations-via

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

성인 심장 myocytes 동물 마음으로부터 격리하고 며칠 동안 교양 수있는 기본 세포입니다. 이 문화가 기간 내에 adenoviral 유전자 전송은 유전자 인코딩 bi​​osensors (GEBs) 또는 형광 융합 단백질을 표현하는 데 사용할 수 있습니다. 두 접근 방법 공촛점 현미경에 의해 세포 조사를 허용합니다.

공촛점 이미징에 대한 분리 및 성인 심장 Myocytes의 유전자 조작

우리는 온전한 배아 및 출생 후 심장 내부 깊숙한 곳에서 형광 단백질로 표지된 세포를 체적 측정으로 이미지화하는 프로토콜을 설명합니다. 전체 산 염색과 함께 조직 제거 방법을 사용하면 배아 또는 출생 후 심장 내부의 단일 형광 단백질 표지 세포를 명확하고 정확하게 이미지화할 수 있습니다.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

이 프로토콜은 MRI와 전체 심장 심근 조직의 3 차원 비교를위한 새로운 방법을 설명합니다. 이는 심근 경색의 만성 돼지 모델의 경색 경계 영역에서 심근 내 주입의 정확한 평가를 위해 설계되었습니다.

3D 전체 심장 심근 조직 분석

이 연구 murine 마음 공부 광 청소와 함께 양면 조명 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 기법을 사용 합니다.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

여기서, 우리는 미리 분화된 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포로 구성된 3D 자가 조립 심장 미세 조직 배열을 생성하는 사용하기 쉬운 방법론을 기술합니다. 심장 미세 조직을 생성하는 기술을 요구하는 이 사용자 친화적이고 낮은 세포는 질병 모델링 및 약물 개발의 초기 단계를 위해 구현될 수 있습니다.

인간 iPSC 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 사용하여 3D 심장 미세 조직 배열의 제조

조직 제거의 세련된 방법이 개발되어 성인 마우스 심장에 적용되었습니다. 이 방법은 유전 기자 전략에 기인하는 표시된 섬유아세포 형광을 유지하면서 조밀한, 자동 형광 심장 조직을 취소하도록 설계되었습니다.

건강하고 부상당한 마우스 심혼에 있는 3차원 섬유아세포 조직을 위한 정제된 CLARITY 기지를 둔 조직 정리

우리는 조직 변형 및 염색의 새로운 발전과 축 방향 스캔 라이트 시트 현미경의 개발을 결합하여 전체 마우스 심장의 메조스코픽 재구성 방법을 보고합니다.

전체 마우스 심장의 메조스코픽 광학 이미징

이 프로토콜은 설치류 심장의 복잡한 심장 구조를 조사하기 위해 적응된 조직 투명화 방법과 함께 고급 광시트 현미경을 활용하여 심장 형태 형성 및 리모델링을 이해하는 데 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

재관류 급성 심근경색증(repAMI)에서 심장 손상의 3차원(3D) 재구성은 관련 질병에 영향을 미치는 패턴의 충실한 정량화 및 공동 국소화를 가능하게 합니다. 여기에서는 심장 손상, 위험 영역 및 면역 세포 반응의 동시 측정을 위해 자동화 가능한 라이트 시트 유도 이미징 접근 방식이 제공됩니다.

라이트 시트 형광 현미경을 이용한 재관류 급성 심근경색증의 심장 손상 및 면역 반응의 동시 3D 분석

현재의 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 분석법은 미세한 해상도로 심근 손상을 분석할 수 있는 정교한 TTC 염색 프로토콜을 도입하여, 세포 수준에서 경색 크기와 심근세포 생존성을 정확하고 신뢰할 수 있게 하는 고품질 이미지를 생성합니다.

심근손상의 정확하고 신뢰할 수 있는 분석을 위한 현미경 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 염화염법 분석법

배우세요 심장 재생 과정에서 다양한 세포 집단의 역할을 클리어 심장 3차원 이미징 기법으로 분석하는 방법을. 이 기술은 심근세포 증식과 조직 복구 메커니즘 연구에 필수적입니다.

클리어 심장 3 차원 이미징을 통해 표적 세포 집단의 심장 손상 반응을 캡처

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