November 26th, 2019
이 프로토콜의 목표는 온도를 사용하여 3차원 활성 유체의 유속을 제어하는 것입니다. 이 방법의 장점은 현장에서 유속을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 주기적으로 유속을 위아래로 조정하는 것과 같은 동적 제어를 가능하게 합니다.
활성 물질은 분자 그림자와 같은 다양한 응용 분야에서 사용되었습니다. 응용 프로그램을 한 단계 끌어올리려면 로컬에서 활성 물질을 제어할 수 있는 기능을 개발해야 합니다. 활성 유체의 수정이 필요하지 않은 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다.
또한 활성 유체의 국소 제어를 달성하기 위해 현미경의 광학 경로를 수정할 필요가 없습니다. 우리의 방법은 주요 반응이 마이크로 투알 글라이딩 분석법 또는 효소 기반 시스템과 같은 잘못된 법칙에 순종하는 광범위한 시스템에 적용 될 수 있습니다. 설정에는 물 순환 시스템이 포함됩니다.
누출이 발생하면 물이 현미경을 손상시킬 수 있습니다. 따라서 프로토콜을 채택하기 전에 시스템이 누출되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 우리의 프로토콜은 온도 단계에 유리 샘플을 장착해야합니다.
원고는 장착 절차를 설명하지만 샘플을 스테이지로 고정하는 것과 같은 기계적 미묘함은 부족합니다. 절차를 시연하는 것은 티건 베이트, 에드워드 자비스, 메건 바니가 될 것입니다. 티건과 에드워드는 대학원생이며, 메건은 실험실에서 학부생입니다.
Eppendorf 튜브에서 활성 유체를 준비하기 위해 밀리리터 마이크로튜비질 당 8 밀리그램의 16점 7마이크로리터를 1점 8마이크로몰러 키네신 모터 클러스터의 6점 7마이크로리터와 고염 M2B의 500밀리알라 DTT 1점 1마이크로리터를 혼합합니다. 무게 폴리에틸렌 글리콜에 의해 7 %의 무게의 11 점 4 마이크로 리터를 추가하여 마이크로 투튜블을 번들. 그런 다음 50 밀리플러 ATP의 2점 8 마이크로리터를 추가하여 키네신 모터를 활성화합니다.
ATP 농도를 유지하여 2점 8마이크로리터의 스톡 피루바테 키나아제/락테이트 탈수소효소, 200밀리알포피루바테의 마이크로리터 13점 3개를 첨가하여 ATP 농도를 유지한다. 20 밀리머 트롤록스의 마이크로리터 10개, 밀리리터 카탈라아제당 3점 5밀리그램의 1점, 밀리리터 당 20밀리그램의 1점, 밀리리터 당 300밀리리터 1개를 추가하여 사진 표백 효과를 줄입니다. 체액의 움직임을 추적하여 0 포인트 0의 마이크로리터 1점을 추가하여 볼륨 트레이서 입자에 의해 25% 부피.
고염 M2B를 추가하여 총 100마이크로리터를 달성합니다. 다음으로 폴리아크릴아미드 코팅 유리 슬라이드를 헹구고 DI 물로 미끄러지는 커버를 합니다. 가압 공기로 안경을 말리십시오.
깨끗하고 평평한 표면에 안경을 놓습니다. 왁스 필름에서 3mm 너비의 채널을 잘라냅니다. 총 폭은 유리 커버가 20mm에서 미끄러지는 것과 동일한 너비입니다.
슬라이드와 커버 슬립 사이에 왁스를 삽입하여 유체에 대한 유동 셀 채널을 형성합니다. 왁스를 녹여 80도 온수 판에 유리 왁스 복합체를 배치하여 왁스 필름에 유리를 부착합니다. 용융 하는 동안, 유리 표면에 왁스 필름을 균일 하 게 부착 하는 파이펫 끝으로 커버 슬립을 누릅니다.
접착 후 유리 복합체를 실온으로 식힙니다. 준비된 활성 유체를 채널 개구부에서 멀리 떨어진 각도로 유리 슬라이드 표면과 접촉하여 파이펫 팁으로 유량 채널에 즉시 로드합니다. UV 접착제로 채널을 밀봉합니다.
온도 제어 설정을 구축한 후, 표면에 접촉하는 슬라이드 측과 함께 사파이어 표면에 활성 유체 샘플을 배치합니다. 종이 테이프로 유리 슬라이드를 고정합니다. 구리 테이프를 사용하여 ThermoSensor을 커버 슬립 표면에 부착합니다.
현미경 단계에 설치를 장착하려면, 커버 슬립 슬라이드가 목표를 향해 향하도록, 현미경 단계 바늘 클램프로 설정을 확보. 온도 컨트롤러와 수조 펌프를 켭니다. 제조업체 가이드를 따라 목표 온도를 설정합니다.
온도 제어를 활성화합니다. 그리고 ThermoSensor 온도 데이터를 기록합니다. 활성 믹스에서 Alexa 488 표지된 트레이서 입자를 모니터링하기 위해 GFP 필터 큐브가 장착된 형광 현미경 검사법에 일정한 시간 간격으로 샘플을 이미지합니다.
시간 간격을 조정하여 프레임 사이의 트레이서 변위가 9픽셀 이내로 변위를 할 수 있도록 합니다. 초당 10 마이크로미터로 이동하는 이미징 추적자의 경우 4배 의 목표를 사용하여 시간 간격을 1~5초로 하는 것이 좋습니다. 이미지를 TIF 파일로 저장하고 프레임 번호를 기반으로 파일의 이름을 지정하고 별도의 폴더에 저장합니다.
이러한 키네신 구동 미세투부및 활성 유체의 경우 온도는 섭씨 10, 20, 30 및 40도에서 제어되었습니다. 온도의 변동은 이 온도 제어 설정의 안정성과 신뢰성을 보여주는 4시간 동안 섭씨 3도까지 0점 이내였습니다. 추적자는 2초마다 이미지화되어 순차적인 이미지가 추적추적을 허용했습니다.
평균 속도는 섭씨 20~36도로 0~2시간 가까이 독립적인 것으로 나타났습니다. 섭씨 10도와 40도에서 평균 속도는 섭씨 16도 이하로 미세투포울 분해로 인해 빠르게 감소되고 키네신 클러스터는 각각 섭씨 36도 이상으로 고장나고 있습니다. 시스템 온도가 30분마다 섭씨 20~30도 사이를 번갈아 가며 조정했을 때, 활성 유체의 평균 속도는 그에 따라 가속및 감속뿐만 아니라 10초 이내에 온도 변화에 응답했습니다.
활성 유체는 16도 이하로 냉각되거나 36도 이상으로 가열될 때 오작동하기 시작합니다. 따라서 온도 컨트롤러를 조작할 때 온도가 16도에서 36도 사이인지 확인하십시오. 활성 유체를 로컬로 튜닝하는 기능을 통해 A 지점에서 B 지점까지 화물을 전달하거나 물리적 밸브가 필요하지 않은 미세 유체 장치를 개발하는 것과 같은 유체 전력을 연출할 수 있습니다.
유리 제품을 코팅하는 데 사용되는 아크릴아미드는 피부를 통해 흡수 할 수있는 신경 독소입니다. 위험을 최소화하기 위해 장갑, 실험실 코트 및 안전 고글과 같은 적절한 보호 장비를 착용하십시오.
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이 프로토콜은 온도를 사용하여 3차원 활성 유체의 흐름 속도를 제어하는 방법을 보여줍니다. 이 접근 방식은 현장에서 흐름 속도를 조절하고 동적으로 조정할 수 있습니다.
Temperature-dependent control of microtubule-based active fluids enables tunable flow rates without physical valves, supporting dynamic microfluidic device design. This approach enhances predictive confidence in active matter systems by leveraging Arrhenius kinetics for reproducible speed modulation. The method reduces experimental variability and supports scalable assay development for target validation and phenotypic screening workflows.
The method integrates into early discovery workflows by providing a tunable biophysical readout that complements biochemical and imaging-based assays for target validation and lead optimization.