Name: 온도를 이용한 미세소관 기반 3D 활성 유체의 유속 제어 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 배우세요 온도를 이용해 미세소관 기반 3D 활성 유체의 유속을 제어하는 방법을. 현장에서 동적으로 유속을 조절할 수 있어 활성 물질 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

플라스미드 K401-BCCP-H6는 즈보니미르 도딕 박사의 선물이었습니다. 이 연구는 우스터 폴리 테크닉 대학에서 박사 쿤 타 우의 창업 기금에 의해 지원되었다. 우리는 튜불린을 정화하고 라벨링하고 활성 유체를 합성하는 프로토콜에 대한 Zvonimir Dogic 박사에게 감사드립니다. 우리는 단백질 발현 및 정제에 대한 그의 전문 지식에 대한 마크 리딜라 박사에게 감사드립니다. 윌리엄 벤자민 로저 박사님이 온도 조절 스테이지를 구축할 수 있도록 도와주신 것에 대해 감사드립니다. 당사는 생물학적 물질 시설(BMF)의 사용에 대해 Brandeis MRSEC(NSF-MRSEC-1420382)를 인정합니다. 우리는 연약한 물질에베이트 외의 수치를 적응하기위한 화학의 왕립 학회를 인정33.

저자는 공개 할 것이 없다.

장소에서 활성 물질을 제어하는 것은 활성 물질의 지시 자기 조직에 문을 엽니 다4,5,24,28,54. 본 기사에서는, 시스템29,30,31의아레니우스 특성에 기초하여, 온도를 이용하여 키네신 구동, MT 기반 활성 유체를 동위내로 제어하는 프로토콜을 제시한다. 시스템은 단백질 기반이기 때문에 실험 전반에 걸쳐 단백질 기능을 유지하는 것이 프로토콜을 성공적으로 적용하는 데 중요합니다. 시스템의 주요 단백질은 MTs와 키네신 클러스터입니다. 전자는 16 °C 이하의 중합체화되고...

활성 물질은 화학 에너지를 기계적 작업으로 변환하는 능력으로 인해 기존의 수동 물질과 차별화됩니다. 그러한 능력을 가진 물질은 박테리아, 곤충, 콜로이드, 곡물 및 세포골격 필라멘트1,2,3,4,5,6,7,8,9,10과같은 살아 있거나 비생물성 존재체로 구성될 수 있다. 이러한 재질 개체는 이웃과 상호 작용합니다. 더 큰 규모에서, 그들은 난류와 같은 vortices (활성 난류) 또는 물질 흐름11,12,13,14,15,16,17,18,19,20으로스스로 구성한다. 활성 물질의 자기 조직에 대한 이해는 분자 셔틀, 광학 장치 및 병렬 계산21,22,23에서다양한 응용 으로 이어졌습니다. 응용 프로그램을 다음 단계로 끌어올리려면 자체 조직 이상의 제어가 필요합니다. 예를 들어, Palacci 등은 수동으로 제어되는 청색광에 노출되었을 때만 자체 추진되는 헤마타이트 캡슐화 콜로이드를 개발하여 살아있는 결정24의출현을 이끌었다. Morin 등은 튜닝 가능한 외부 전기장을 사용하여 Quincke 콜로이드를 압연하는 제어를 확립하여 경마장과 같은 채널25에서콜로이드 무리를 일으킵니다. 이 전작들은 응용 프로그램에서 로컬 제어의 역할을 보여주고 활성 물질의 지식 기반을 발전시고 있습니다.
이 기사에서는 키네신 구동, 미세 소관 (MT) 기반 3D 활성 유체의 제어성에 중점을 둡니다. 유체는 3개의 주요 분대로 이루어져 있습니다: MTs, 키네신 분자 모터 및 고갈제. 고갈제는 나중에 모터 클러스터에 의해 브리지되는 MT를 번들로 묶는 고갈력을 유도합니다. 이 모터는 더하기 끝에 있는 MTs를 따라 걷습니다. 한 쌍의 브리지 MTsis 반평행이면 해당 모터가 반대 방향으로 걷습니다. 그러나 모터는 클러스터에 바인딩되어 떨어져 걸을 수 없으므로 MT 쌍(인터필라멘트 슬라이딩, 그림 1A)을협조적으로 미끄러뜨습니다. 이러한 슬라이딩 역학이 축적되어, MTsto의 번들이 그들의 좌굴 불안정 지점에 도달할 때까지 연장된다(확장 번들, 도 1B)26. 깨진 번들은 고갈력에 의해 어닐링되어, 이어서 다시 연장되고 역학이 반복됩니다. 반복 역학의 과정에서 번들 움직임은 근처의 액체를 교반하여 미크론 스케일 추적기로 도핑하여 시각화 할 수있는 흐름을 유도합니다(그림 1C). 산체스 외 및 헨킨 외. 추적자의 평균 속도를 특징으로, 속도는 아데노신 삼인산의 농도를 변화시킴으로써 조정되었다는 것을 발견 (ATP), 고갈제, 모터 클러스터, 및 MTs19,27. 그러나, 이러한 튜닝성은 활성 유체 합성 이전에만 존재하였다. 합성 후, 튜닝성이 손실되고, 유체는 자신의 방식으로 자체 조직. 합성 후 활성 유체 활성을 조절하기 위해, Ross.et al.은 모터 단백질의 광 활성화 이각을 이용하여 유체 활성을 광28을사용하여 온/오프로 조절할 수 있는 방법을 보고했다. 빛 제어는 유체를 국소적으로 활성화하는 측면에서 편리하지만, 이 방법은 현미경으로 광학 경로를 수정하는 것과 함께 모터 단백질의 구조를 재설계해야 합니다. 여기서, 우리는 모터 구조를 그대로 유지하면서 현미경 수정없이 유체 흐름을 국부적으로 제어하는 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다.
우리의 국소적인 활성 유체 흐름을 조정하는 방법은 키네신-MT 반응이 온도29,30,31,32와함께 증가하는 것으로 보고되었기 때문에 아레니우스 법칙에 기초한다. 우리의 이전 연구는 활성 유체 흐름의 평균 속도의 온도 의존성이 아레니우스 방정식을 따랐다는 것을 보여주었다: v = exp (-A/RT), 여기서 A는 사전 지수 인자, R은 기체 상수, E는활성화 에너지, 및 T는 시스템온도(33)이다. 따라서, 유체 활성은 온도 환경에 민감하고, 시스템 온도는 모터 성능을 안정화하기 위해 일관되어야 하며, 결과적으로, 유체 유동속도(34)가된다. 이 문서에서는 모터의 온도 의존성을 사용하여 시스템 온도를 조정하여 활성 유체의 유속을 지속적으로 조정하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 또한 컴퓨터 소프트웨어를 통해 온도가 제어되는 현미경 단계에 샘플을 장착한 다음 활성 유체 샘플의 준비를 시연합니다. 온도를 16°C에서 36°C로 증가시키면 평균 유속이 4~8μm/s로 빨라지며, 또한 해석성은 가역적입니다: 반복적으로 온도를 증가시키고 감소시키면 순차적으로 가속화되고 감속됩니다. 입증된 방법은 MT 글라이딩 분석법29,30,31,32와같은 주요 반응이 아레니우스 법칙을 준수하는 광범위한 시스템에 적용가능하다.

<table><tbody><tr><td>(&플러스mn;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>Trolox</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC216550050</td><td></td></tr><tr><td>3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603</td><td>HACH</td><td>2074038</td><td>Water tubes</td></tr><tr><td>31.75 mm diameter uncoated, 사파이어 창</td><td>Edmund Optics</td><td>43-637</td><td>사파이어 디스크</td></tr><tr><td>3M 1181 구리 테이프 - 1/2 IN 너비 X 18 YD 길이 - 2.6 MIL 총 두께 - 27551</td><td>R.S. HUGHES</td><td>054007-27551</td><td>구리 테이프</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드 용액 (40%/전기영동), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1402-1</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5'-트리포스페이트 디칼륨 염 수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td>ATP</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS 에스테르(숙시니미딜 에스테르)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20006</td><td>원적외선 형광 염료. Alexa 647은 미세소관(1.3.3.2)과 혼합하기 전에 디메틸설폭사이드(DMSO)에 미리 현탁할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 원심 필터 유닛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC801024</td><td>원심 필터 튜브. 컷오프 분자량: 10kDa</td></tr><tr><td>과황산암모늄, 100g, MP Biomedicals</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN802829</td><td>APS</td></tr><tr><td>암피실린 나트륨염(결정성 분말), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td>암피실린</td></tr><tr><td>방진 테이블</td><td>Nikon</td><td>63-7590S</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-E 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td><td>VWR</td><td>90000-760</td><td>Agar</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14207</td><td></td></tr><tr><td>양동이-플라스틱 흰색 - 2 갤런</td><td>Bon</td><td>84-715</td><td>물 양동이</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>소 간에서 카탈라제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 4x Obj</td><td>Nikon</td><td>MRD00045</td><td>4x 공기 대물렌즈</td></tr><tr><td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td><td>Nikon</td><td>96372</td><td>GFP 필터 큐브</td></tr><tr><td>CH-109-1.4-1.5</td><td>TE 기술</td><td>CH-109-1.4-1.5</td><td>열전 냉각기(TEC)</td></tr><tr><td>클로람페니콜, 98%, ACROS</td><td>Organics Fisher Scientific</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>냉각 블록</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>맞춤형 밀링 알루미늄</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td><td>Bio-Rad</td><td>1610400</td><td>트리페닐메탄 염료</td></tr><tr><td>D-(+)-글루코스</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(ACS 인증), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>DL-1,4-디티오트레이톨, 99%, 생화학용, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165680050</td><td>DTT</td></tr><tr><td>DOWSIL 340 방열판 화합물</td><td>Dow</td><td>1446622</td><td>Thermal</td></tr><tr><td>paste ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE</td><td>Pharmco by Greenfield Global</td><td>111000200CB05</td><td>에탄올</td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>E3889</td><td>EGTA</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>798681</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents 미생물학 매체 첨가제: Tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421</td><td>트립톤</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents 미생물학 매체 첨가제: 효모 추출물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td>효모 추출물</td></tr><tr><td>Fluorebrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 &micro; m</td><td>Polysciences</td><td>18861</td><td>추적자 입자</td></tr><tr><td>Aspergillus niger의 포도당 산화효소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>GpCpp</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td>Guanosine-5'[ (&알파;,&베타;)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)</td></tr><tr><td>GS Power의 18 게이지(True American Wire Ga), 100피트, 99.9% 좌초 무산소 구리 OFC, 자동차, 오디오, 홈 시어터용 레드/블랙 2 도체 본딩 지퍼 코드 전원/스피커 전기 케이블</td><td>아마존</td><td>B07428NBCW</td><td></td></tr>선 <tr><td>구아노신 5'-트리포스페이트 나트륨 염 수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>G8877</td><td>GTP</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z805939</td><td>세제</td></tr><tr><td>HEPES 나트륨 염 (백색 분말), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP410</td><td>NaHEPES</td></tr><tr><td>고성능 블렌더 기계</td><td>AIMORES</td><td>AS-UP1250</td><td>블렌더</td></tr><tr><td>His GraviTrap</td><td>GE 헬스케어</td><td>11003399</td><td>중력 기둥</td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>시그마-알드리치</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>시그마-알드리치</td><td>I6758</td><td>이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드</td></tr><tr><td>이소프로필 알코올 99%</td><td>Pharmco by Greenfield Global</td><td>231000099</td><td>이소프로판올</td></tr><tr><td>JA-10 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>L-글루탐산 칼륨염 일수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td> 닭 달걀 흰자위의 <td>K-글루타메이트</td></tr><tr><td>라이소자임</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 클로라이드 육수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>MgCl2&bull; 6H2O</td></tr><tr><td>MES 나트륨 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>M5057</td><td>2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 나트륨 염</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1254</td><td>3-(N-모르폴리노)프로판설폰산</td></tr><tr><td>MP-3022</td><td>TE 기술</td><td>MP-3022</td><td>열전대</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 99%, 아크로스 오가닉스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>AC138450500</td><td>TEMED</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c UV-VIS 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E112352</td><td>분광계</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E Nikon 도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>MEA54000</td><td></td></tr><tr><td>Norland 광학 접착제 81</td><td>Norland 제품</td><td>NOA81</td><td>UV 접착제</td></tr><tr><td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC5800</td><td>단백질 표준 사다리</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris 단백질 젤, 1.5mm, 10웰</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td>SDS 젤</td></tr><tr><td>Optima L-90K 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm PM996 랩, 4" 와이드; 125 Ft/Roll</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06720-40</td><td>왁스 필름</td></tr><tr><td>Pe 300 울트라 일루미네이션 시스템 싱글 밴드, 3mm 라이트 가이드 제어 포드 전원 공급 장치</td><td>Nikon</td><td>PE-300-UT-L-SB-40</td><td>쿨 LED 조명기</td></tr><tr><td>페닐메탄설포닐 플루오라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>78830</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>포스포에놀피루브산 모노칼륨염, 99%</td><td>BeanTown Chemical</td><td>129745</td><td>PEP</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie(Bradford) 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 프로테아제 억제제 미니 정제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32953</td><td></td></tr><tr><td>파이프</td><td>: 시그마 - 알드리치</td><td>P6757</td><td>1,4- 피페 라진 디에 탄 술폰산</td></tr><tr><td>플루 로닉 F-127</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>폴리 (에틸렌 글리콜)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>81300</td><td>PEG. 평균 분자량 20,000 Da</td></tr><tr><td>수산화칼륨 (펠릿/인증 ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td>KOH</td></tr><tr><td>PowerEase 300W 전원 공급 장치(115VAC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PS0300</td><td>젤 박스의 DC 전원 공급 장치</td></tr><tr><td>PS-12-8.4A</td><td>TE Technology</td><td>PS-12-8.4A</td><td>온도 조절기</td></tr><tr><td>의 DC 전원 공급 장치토끼 근육의 피루브산 키나아제/젖산 탈수소효소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0294</td><td>PK/LDH</td></tr><tr><td>Quiet One Lifegard 분수 펌프, 시간당 296갤런</td><td>Amazon</td><td>B005JWA612</td><td>어항 펌프</td></tr><tr><td>Rosetta 2(DE3)pLysS 유능한 세포 - Novagen</td><td>Millipore Sigma</td><td>71403</td><td>유능한 세포</td></tr><tr><td>Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W 조리대 전자 레인지, 0.9 입방 피트, 스테인리스 스틸</td><td>Amazon</td><td>B01MT6JZMR</td><td>물을 끓이기 위한 전자레인지</td></tr><tr><td>염화나트륨(결정질/인증 ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>도데실황산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>L3771</td><td>SDS</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기</td><td>성 시그마-알드리치</td><td>S8282</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>스트렙타비딘 단백질</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21122</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>TC-720</td><td>TE 기술</td><td>TC-720</td><td>온도 컨트롤러</td></tr><tr><td>트리스 베이스, 분자 생물학 등급 - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td><td>시그마-알드리치</td><td>648310</td><td>트리스-HCL</td></tr><tr><td>유형 45 Ti 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>유형 70 Ti 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>Type 70.1 Ti 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>342184</td><td></td></tr><tr><td>VWR 범용 실험실 라벨링 테이프</td><td>VWR</td><td>89097-916</td><td>종이 테이프</td></tr><tr><td>VWR 마이크로 커버 안경, 사각형, No. 1 1/2</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>유리 커버 슬립</td></tr><tr><td>VWR 일반 및 젖빛 마이크로 슬라이드, 프리미엄</td><td>VWR</td><td>75799-268</td><td>유리 슬라이드</td></tr><tr><td>XCell SureLock 미니 셀</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>젤 상자</td></tr><tr><td>ZYLA 5.5 USB3.0 카메라</td><td>Nikon</td><td>ZYLA5.5-USB3</td><td>흑백 CCD 카메라</td></tr></tbody></table>

온도를 이용한 미세소관 기반 3d 활성 유체의 유속 제어

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

우리는 온도를 사용하여 키네신 구동, 미세 소관 기반 의 3 차원 (3D) 활성 유체의 유속을 조정하는 방법을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 원하는 다른 속도에 도달하기 위해 새로운 샘플을 제조할 필요 없이 도면의 속도를 조정할 수 있습니다. 또한,이 방법은 속도의 동적 제어를 할 수 있습니다. 온도를 순환하면 유체가 주기적으로 빠르고 느리게 흐릅니다. 이 제어성은 키네신-미세소관 반응의 아레니우스 특성을 기반으로 하며, 4-8 μm/s의 제어된 평균 유속 범위를 보여줍니다. 제시된 방법은 밸브없이 채널의 유량이 국부적으로 튜닝 할 수있는 미세 유체 장치의 설계에 문을 엽니 다.

키네신 구동, MT 기반 활성 유체를 준비하려면 키네신과 MT가 모두 필요합니다. MT는 소 뇌로부터 정제된 표지된 tubulins(단계 1.3 및 1.4)로부터 중합되었고(단계 1.1, 도 2A),순도 향상을 위해 재활용(단계 1.2, 도 2B). 키네신 운동 단백질은 대장균(단계 2.1 및 2.2단계, 도 2B)41,52에서발현 및 정제하였다. 제조된 키네신 스톡의 농도는 주요 밴드 밝기와 재활용 된 튜불린의 밝기를 공지된 농도와 비교하여 SDS 겔로 측정하였다(단계 2.3, 도 2B</st...

이 프로토콜의 목표는 온도를 사용하여 3차원 활성 유체의 유속을 제어하는 것입니다. 이 방법의 장점은 현장에서 유속을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 주기적으로 유속을 위아래로 조정하는 것과 같은 동적 제어를 가능하게 합니다.

온도를 이용한 미세소관 기반 3D 활성 유체의 유속 제어

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

활성 물질은 분자 그림자와 같은 다양한 응용 분야에서 사용되었습니다. 응용 프로그램을 한 단계 끌어올리려면 로컬에서 활성 물질을 제어할 수 있는 기능을 개발해야 합니다. 활성 유체의 수정이 필요하지 않은 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다.또한 활성 유체의 국소 제어를 달성하기 위해 현미경의 광학 경로를 수정할 필요가 없습니다. 우리의 방법은 주요 반응이 마이크로 투알 글라이딩 분석법 또는 효소 기반 시스템과 같은 잘못된 법칙에 순종하는 광범위한 시스템에 적용 될 수 있습니다. 설정에는 물 순환 시스템이 포함됩니다.누출이 발생하면 물이 현미경을 손상시킬 수 있습니다. 따라서 프로토콜을 채택하기 전에 시스템이 누출되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 우리의 프로토콜은 온도 단계에 유리 샘플을 장착해야합니다.원고는 장착 절차를 설명하지만 샘플을 스테이지로 고정하는 것과 같은 기계적 미묘함은 부족합니다. 절차를 시연하는 것은 티건 베이트, 에드워드 자비스, 메건 바니가 될 것입니다. 티건과 에드워드는 대학원생이며, 메건은 실험실에서 학부생입니다.Eppendorf 튜브에서 활성 유체를 준비하기 위해 밀리리터 마이크로튜비질 당 8 밀리그램의 16점 7마이크로리터를 1점 8마이크로몰러 키네신 모터 클러스터의 6점 7마이크로리터와 고염 M2B의 500밀리알라 DTT 1점 1마이크로리터를 혼합합니다. 무게 폴리에틸렌 글리콜에 의해 7 %의 무게의 11 점 4 마이크로 리터를 추가하여 마이크로 투튜블을 번들. 그런 다음 50 밀리플러 ATP의 2점 8 마이크로리터를 추가하여 키네신 모터를 활성화합니다.ATP 농도를 유지하여 2점 8마이크로리터의 스톡 피루바테 키나아제/락테이트 탈수소효소, 200밀리알포피루바테의 마이크로리터 13점 3개를 첨가하여 ATP 농도를 유지한다. 20 밀리머 트롤록스의 마이크로리터 10개, 밀리리터 카탈라아제당 3점 5밀리그램의 1점, 밀리리터 당 20밀리그램의 1점, 밀리리터 당 300밀리리터 1개를 추가하여 사진 표백 효과를 줄입니다. 체액의 움직임을 추적하여 0 포인트 0의 마이크로리터 1점을 추가하여 볼륨 트레이서 입자에 의해 25% 부피.고염 M2B를 추가하여 총 100마이크로리터를 달성합니다. 다음으로 폴리아크릴아미드 코팅 유리 슬라이드를 헹구고 DI 물로 미끄러지는 커버를 합니다. 가압 공기로 안경을 말리십시오.깨끗하고 평평한 표면에 안경을 놓습니다. 왁스 필름에서 3mm 너비의 채널을 잘라냅니다. 총 폭은 유리 커버가 20mm에서 미끄러지는 것과 동일한 너비입니다.슬라이드와 커버 슬립 사이에 왁스를 삽입하여 유체에 대한 유동 셀 채널을 형성합니다. 왁스를 녹여 80도 온수 판에 유리 왁스 복합체를 배치하여 왁스 필름에 유리를 부착합니다. 용융 하는 동안, 유리 표면에 왁스 필름을 균일 하 게 부착 하는 파이펫 끝으로 커버 슬립을 누릅니다.접착 후 유리 복합체를 실온으로 식힙니다. 준비된 활성 유체를 채널 개구부에서 멀리 떨어진 각도로 유리 슬라이드 표면과 접촉하여 파이펫 팁으로 유량 채널에 즉시 로드합니다. UV 접착제로 채널을 밀봉합니다.온도 제어 설정을 구축한 후, 표면에 접촉하는 슬라이드 측과 함께 사파이어 표면에 활성 유체 샘플을 배치합니다. 종이 테이프로 유리 슬라이드를 고정합니다. 구리 테이프를 사용하여 ThermoSensor을 커버 슬립 표면에 부착합니다.현미경 단계에 설치를 장착하려면, 커버 슬립 슬라이드가 목표를 향해 향하도록, 현미경 단계 바늘 클램프로 설정을 확보. 온도 컨트롤러와 수조 펌프를 켭니다. 제조업체 가이드를 따라 목표 온도를 설정합니다.온도 제어를 활성화합니다. 그리고 ThermoSensor 온도 데이터를 기록합니다. 활성 믹스에서 Alexa 488 표지된 트레이서 입자를 모니터링하기 위해 GFP 필터 큐브가 장착된 형광 현미경 검사법에 일정한 시간 간격으로 샘플을 이미지합니다.시간 간격을 조정하여 프레임 사이의 트레이서 변위가 9픽셀 이내로 변위를 할 수 있도록 합니다. 초당 10 마이크로미터로 이동하는 이미징 추적자의 경우 4배 의 목표를 사용하여 시간 간격을 1~5초로 하는 것이 좋습니다. 이미지를 TIF 파일로 저장하고 프레임 번호를 기반으로 파일의 이름을 지정하고 별도의 폴더에 저장합니다.이러한 키네신 구동 미세투부및 활성 유체의 경우 온도는 섭씨 10, 20, 30 및 40도에서 제어되었습니다. 온도의 변동은 이 온도 제어 설정의 안정성과 신뢰성을 보여주는 4시간 동안 섭씨 3도까지 0점 이내였습니다. 추적자는 2초마다 이미지화되어 순차적인 이미지가 추적추적을 허용했습니다.평균 속도는 섭씨 20~36도로 0~2시간 가까이 독립적인 것으로 나타났습니다. 섭씨 10도와 40도에서 평균 속도는 섭씨 16도 이하로 미세투포울 분해로 인해 빠르게 감소되고 키네신 클러스터는 각각 섭씨 36도 이상으로 고장나고 있습니다. 시스템 온도가 30분마다 섭씨 20~30도 사이를 번갈아 가며 조정했을 때, 활성 유체의 평균 속도는 그에 따라 가속및 감속뿐만 아니라 10초 이내에 온도 변화에 응답했습니다.활성 유체는 16도 이하로 냉각되거나 36도 이상으로 가열될 때 오작동하기 시작합니다. 따라서 온도 컨트롤러를 조작할 때 온도가 16도에서 36도 사이인지 확인하십시오. 활성 유체를 로컬로 튜닝하는 기능을 통해 A 지점에서 B 지점까지 화물을 전달하거나 물리적 밸브가 필요하지 않은 미세 유체 장치를 개발하는 것과 같은 유체 전력을 연출할 수 있습니다.유리 제품을 코팅하는 데 사용되는 아크릴아미드는 피부를 통해 흡수 할 수있는 신경 독소입니다. 위험을 최소화하기 위해 장갑, 실험실 코트 및 안전 고글과 같은 적절한 보호 장비를 착용하십시오.

controlling-flow-speeds-microtubule-based-3d-active-fluids-using

Research

연구

JoVE Journal

Engineering

공학

이 비디오에서는 적절한 완충액이 있는 커버슬립 표면에서 자라는 미세소관을 시각화하기 위한 간섭 반사 현미경(IRM) 기술에 대해 설명합니다. 입사광을 이용한 조명 시, 커버슬립-버퍼 인터페이스와 버퍼-미세소관 인터페이스는 빛을 반사하며, 이 두 인터페이스가 결합되어 간섭 패턴을 생성함으로써 미세소관을 밝은 배경에 대한 고대비 이미지로 시각화할 수 있습니다.

미세소관 역학의 Label-free 시각화를 위한 간섭 반사 현미경 검사

유사분열 방추체의 조립 및 위치는 미세소관 역학, 운동 단백질 및 가교제에 의해 생성된 결합된 힘에 따라 달라집니다. 여기에서 우리는 구형 에멀젼 방울의 기하학적 구속이 기본 유사 분열 방추체의 상향식 재구성에 사용되는 최근에 개발 된 방법을 제시합니다.

구형 에멀젼 방울의 기본 유사 분열 스핀들의 재구성

여기 선물이 미세 응용 프로그램에 사용 되는 압력 제어 주사기 펌프를 구성 하는 프로토콜. 이 주사기 펌프는 없애는 제조, 상용 하드웨어, 본문과 오픈 소스 전자에서 이루어집니다. 결과 시스템은 저가, 간단 하 게 구현할 빠른 미세 연구 수 있도록 잘 규제 유체 흐름을 제공 합니다.

인쇄를 만드는 열가 소성 재료의 3 차원 미세 응용 프로그램에 대 한 피드백 제어와 주사기 펌프를 자동

이 프로토콜은 시험관 내 표면 분석법을 사용하여 미세 소관의 무, 고대비, 고속 이미징을 위한 표준 형광 현미경에 간섭 반사 현미경 을 구현하기 위한 가이드입니다.

마이크로소관의 라벨이 없는 고속 이미징을 위한 간섭 반사 현미경 검사법 구현

우리는 동적 미세 소관 및 형광 표지 된 미세 소관 관련 단백질의 동시 이미징을 위해 간섭 반사 현미경 검사 및 전체-내부-반사-형광 현미경을 구현하기위한 프로토콜을 제시합니다.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 키네신-3 계열의 구성원인 KIF1A(1-393LZ)의 정제에 대해 자세히 설명합니다. 이들 정제된 모터의 시험관내 단일분자 및 다중-모터 글라이딩 분석은 포유동물 세포 용해물로부터의 모터에 필적하는 강력한 운동성 특성을 나타냈다. 따라서, Sf9-바쿨로바이러스 시스템은 관심있는 운동 단백질을 발현하고 정제하는 것이 가능하다.

Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

우리는 형광 현미경과 함께 간단한 액틴 필라멘트 미세 유체 분석을위한 프로토콜을 제시하여 개별 액틴 필라멘트를 실시간으로 정확하게 모니터링하면서 순차적으로 다른 단백질 용액에 노출 할 수 있습니다.

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

이 기사는 MAP65, 식물 기반 미세 소관 가교제 및 PEG를 크라우밍 제로 사용하여 촉각제 모양의 미세 소관 어셈블리를 형성하기위한 프로토콜을 제시합니다.

미세 소관 선인장체의 자체 조립

본 프로토콜은 미세유체 장치에서 미세한 얼음 결정 및 포접 수화물의 결정화를 설명하여, 형성된 결정 주위에서 액체 교환을 가능하게 한다. 이것은 억제제의 결정화 과정과 결합 메커니즘을 검사할 수 있는 비할 데 없는 가능성을 제공합니다.

얼음 및 포접 수화물 결정화 연구를 위한 미세유체 접근법

여기에는 단백질 준비 및 구성과 활성 네마틱 감금을위한 우물 사용을 포함하여 미세 소관 및 키네신 모터에서 활성 네마틱스를 준비하는 방법이 제시됩니다.

미세소관 기반 활성 네마틱스의 형성, 제한 및 관찰

이 프로토콜은 미세소관 고분자 역학을 조사하는 데 적합한 미세유체 장치의 설계 및 제작에 대해 자세히 설명합니다. 미세 가공, 자동화된 흐름 제어 및 컴퓨터 모델링 기술의 합성은 세포 세포골격을 in vitro 프로빙하는 데 이상적으로 적합한 유연한 시스템을 가능하게 합니다.

미세소관 고분자 역학 조사를 위한 미세유체역학 기반 접근법 개발

배우세요 온도를 이용해 미세소관 기반 3D 활성 유체의 유속을 제어하는 방법을. 현장에서 동적으로 유속을 조절할 수 있어 활성 물질 연구에 활용됩니다.

온도를 이용한 미세소관 기반 3D 활성 유체의 유속 제어

더 많은 동영상 탐색