Name: 인간 성숙한 지방세포의 고립과 문화는 막 성숙한 지방 세포 골재 배양 (MAAC)를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 배우세요 인간 성숙 지방세포의 고립 및 배양 방법을 MAAC 기술을 활용하여. 이 방법은 당뇨병과 비만 연구를 위한 세포 상호작용 분석 및 장기간 기능 연구에 활용됩니다.

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우리는 자원을 제공하고 지방세포 격리를 최적화한 샤오롱 펑과 스테판 할렌, 기술 지원을 위한 마틴 우르봄, 다니엘 올라우손과 마린 론이 인간 지방을 조정하고 제공한 것에 대해 감사를 표한다.

지방 조직의 익명 샘플은 스웨덴 예테보리의 Sahlgrenska 대학 병원에서 선택 수술을받은 여성 환자의 복부 영역에서 수집되었습니다. 모든 연구 과목은 조직의 사용에 대한 서면 통보 동의를 제공하기 전에 서면 및 구두 정보를 받았다. 연구 결과는 예테보리, 스웨덴에 있는 지역 윤리 검토 위원회에 의해 승인되었습니다.
참고: 메서드의 개요는 그림 1에제공됩니다.
1. 완충제, 조직배양배지, 배양판의 준비
<ol><li>35.1 g의 NaCl, KCl 1.75 g, KH2PO4의 0.82 g, MgSO4·7H2O의 1.48 g을 900 mL의 물에 녹여 5배 의 크렘스 링거(KR) 스톡을 준비한다. 1.84 g의 CaCl2·2H2O를추가하고 물을 추가하여 부피를 1L로 조정합니다. 멸균 필터는 0.22 μm 필터를 통해 4°C에서 보관한다.</li>
	<li>5x KR 주식으로부터, 1x KR, 25 mM HEPES, 2 mM 포도당 및 2% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 완충액 1L을 준비한다(이하 세척 완충제라고 함). pH를 7.4로 조정합니다.</li>
	<li>1x HBSS + CaCl2 + MgCl2,2% BSA 및 450 mL의 물을 함유하는 콜라게나아제 완충액 500 mL을 준비합니다(이하 소화 완충제라고 함). 참고: 콜라게나아제는 2.2단계에서 지방 조직을 칭량한 후까지 소화 완충제에 첨가해서는 안 됩니다.</li>
	<li>중간 199의 pH를 7.4로 조정합니다.</li>
	<li>멸균 필터는 0.22 μm 필터 플라스크를 통해 완충제 및 중간 199 를 모두 37°C로 따뜻하게 한다. 참고 : 시간을 절약하기 위해 지방 조직을 처리하기 전에 조직 배양 배지를 준비하고 플레이트에 첨가 할 수 있습니다. 24웰 플레이트 포맷(그림1A)의경우, 덜베코의 수정된 이글 배지/햄의 영양 혼합물 F12(DMEM/F12), 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(펜/스트렙) 및 20 nM 인슐린의 0.5-1 mL/well을 사용하십시오. 소분자 및 기타 안정한 약리학적 제제는 또한 원하는 레이아웃으로 매체에 이때 첨가될 수 있다. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에놓는다.</li>
</ol>2. 인간 피하 지방 조직의 해부
참고: 생물학적 안전 캐비닛 내에서 작업하고 절연 공정 전반에 걸쳐 멸균 기술을 사용하고 오토클레이브 및 멸균 장비를 독점적으로 사용합니다.
<ol><li>인간의 지방 조직을 15cm 페트리 접시에 넣고 199의 소량을 첨가하여 해부 동안 보습을 유지합니다.</li>
	<li>골프공 크기의 지방조각으로 작업하고 핀셋으로 큰 섬유혈관을 잡고 닫힌 가위 뒤쪽으로 지방을 긁어 내어 지방을 부드럽게 풀어놓습니다. 섬유 조직의 큰 조각을 폐기하십시오. 다듬은 지방의 무게를 측정합니다.</li>
</ol>3. 콜라게나아제 치료
<ol><li>콜라게나아제는 1 mg/mL의 농도로 소화 완충제(1.3단계 참조)에 추가합니다. 0.22 μm 멸균 필터를 사용하여 용액을 멸균 필터. 참고: 지방 1그램당 3 mL의 소화 완충제가 권장됩니다(즉, 지방 100g의 경우 300 mL의 소화 완충제와 300 mg의 2형 콜라게나아제)를 준비하세요. 주의: 타입 2 콜라게나제는 눈, 피부에 유해하며 호흡기 자극을 일으킬 수 있습니다. 콜라게나제를 다룰 때 장갑, 눈 보호, 통풍이 잘 되는 후드로 작업하십시오.</li>
	<li>약 10g의 지방 조직을 15cm 페트리 접시에 옮기고 한 쌍의 곡선 가위를 사용하여 지방을 조심스럽게 다진 후 매끄러운 균질 혼합물이 되고 남은 지방조각이 없을 때까지 조심스럽게 지방을 다듬습니다. 모든 지방이 처리 될 때까지 과정을 반복합니다. 참고 : 각 라운드는 약 2 분이 소요되며, 그들은 넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 파이펫 수 있도록 지방 조각은 충분히 작아야한다. 이 단계는 고품질 의 지방 세포를 산출하는 데 중요합니다. 조각이 너무 큰 경우, 소화 시간을 연장해야 할 것이다, 세포 viabilty손상.</li>
	<li>다진 지방을 숟가락을 사용하여 50 mL 원엽 튜브로 옮김. 다진 조직 10 mL와 각 튜브에 소화 완충제 30 mL를 추가합니다. 다진 지방이 10 mL 미만인 경우 적절한 부피로 축소하십시오.</li>
	<li>37°C에서 조직을 30-45분 동안 150 rpm에서 일정한 교반으로 흔들리는 인큐베이터에서 소화한다. 30분 후, 과다 소화를 피하기 위해 5분마다 과정을 확인하십시오. 참고 : 지방 용액이 큰 조각없이 균일하고 살구 색이있을 때 소화가 완료됩니다.</li>
</ol>4. 세포 현탁액의 여과 및 성숙한 지방세포의 정화
<ol><li>깔때기 1L 멸균 플라스크 위에 깔때기를 놓고 깔때기 내부에 멸균 된 250 μm 메쉬 필터를 놓습니다. 소화되지 않은 조직을 제거하기 위해 필터에 소화 된 지방 용액을 붓습니다.</li>
	<li>모든 지방세포 현탁액이 필터를 통과하면 메쉬 필터를 부드럽게 짜서 지방세포 수율을 높입니다. 약 50-100 mL의 세척 버퍼를 필터에 부어 헹급하고 필터를 다시 짜냅니다.</li>
	<li>플라스크에서 분리된 지방세포 현탁액을 분리 깔때기에 붓고 깔때기가 거의 완전히 채워질 때까지 세척 버퍼를 추가합니다. 부드럽게 퍼널을 몇 번 반전시켜 지방세포 현탁액을 버퍼와 혼합합니다.</li>
	<li>현탁액은 2층(도1B)의뚜렷한 분리가 있을 때까지 2-3분 동안 방치하고, 성숙한 지방세포 및 자유 지질및 완충제 및 지방기질 혈관 분획(SVF)을 함유하는 하부 층을 포함하는 상부 황색 층과 함께 한다.</li>
	<li>분리 깔때기에서 노즐을 열고 바닥 용액을 멸균 플라스크로 천천히 용해시(SVF로부터의 세포는 200 x g에서 원심분리 후 7분 동안 펠릿하고 수집할 수 있음). 분리 깔때기에 성숙한 지방 세포로 상단 층을 유지하십시오.</li>
	<li>4.3-4.5 단계에서 세 번 세탁 과정을 반복하여 성숙한 지방세포를 철저히 세척하고 콜라게나제를 모두 제거하십시오.</li>
</ol>5. 성숙한 지방 세포의 포장
<ol><li>노즐을 열고 정제된 성숙한 지방세포 현탁액을 50 mL 원엽 튜브로 수집합니다.</li>
	<li>튜브를 50 x g에서 3 분 동안 회전시켜 성숙한 지방 세포체를 가볍게 포장하십시오.</li>
	<li>18 G 바늘과 주사기를 사용하여 지방세포 현탁액 아래에 남은 세척 버퍼를 제거하십시오.</li>
	<li>피펫을 사용하여 성숙한 지방세포 위에 떠있는 자유 지질 층 (분리 절차 중에 파손 된 지방세포의 작은 부분에서 오일)을 제거하십시오. 참고 : 6.5 단계에서 지방 세포가 막에서 떨어지는 위험을 줄이기 위해 성숙한 지방 세포가 막에 씨를 뿌려할 때 지질 층과 모든 세척 버퍼를 제거하는 것이 중요합니다. 이러한 이유로 3 개의 튜브에서 지방 세포가 수집됩니다. 마지막으로 수집된 샘플은 이월 지질이 가장 많으며 따라서 가장 낮은 품질입니다. 그러나 이러한 샘플을 신중하게 파이펫팅하여 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 성숙한 지방 세포의 파종
<ol><li>투과성 멤브레인 인서트(Tableof Materials)를함유한 패키지를 열고 멤브레인 성분을 꺼낸다. 거꾸로 뒤집어 멸균 표면에 놓아 멤브레인이 천장을 향하게 합니다.</li>
	<li>피펫 30 μL의 포장 된 성숙한 지방 세포각 막에(그림 1C). 팁으로 멤브레인을 만지지 마십시오. 넓은 보어 피펫 팁을 사용하여 셀을 시드하거나 가위를 사용하여 파이펫 팁의 작은 조각을 잘라내어 더 넓게 만듭니다.</li>
	<li>부드럽게 다른 크기의 지방 세포의 균일 한 분포를 보장하기 위해 파딩 과정을 통해 여러 번 포장 된 지방 세포와 50 mL 튜브를 반전.</li>
	<li>인큐베이터에서 바이오 세이프티 캐비닛으로 매체를 포함하는 준비된 멀티웰 플레이트를 가져와 뚜껑을 제거합니다. 지방 세포로 씨를 뿌린 멤브레인을 집어 바닥에서 잡아 6.5 단계에서 반전 할 수 있습니다.</li>
	<li>하나의 부드러운 움직임은 종자 지방세포가 지금 아래로 향할 수 있도록 상단에 지방 세포와 막을 반전(그림 1D). 지방세포가 있는 플레이트를 매체를 함유한 웰에 넣습니다(그림1E).</li>
	<li>접시에 뚜껑을 놓고 조심스럽게 조직 배양 인큐베이터로 플레이트를 옮김. 지방세포는 처음에 쉽게 빠질 수 있기 때문에 플레이트의 빠른 움직임을 피하십시오. 참고 : 세포가 멤브레인에 더 단단히 부착되는 데 며칠이 걸립니다.</li>
</ol>7. 분석을 위한 지방세포 및 수확의 유지 보수
<ol><li>적어도 7일마다 미디어를 변경합니다. 각 멤브레인 인서트가 컷아웃 구멍을 통해 용지를 제거하고 추가합니다. 용지를 제거하려면 주사기와 바늘, 흡인 지팡이 또는 p200 팁이 있는 파이펫을 사용하십시오. 미디어를 추가하려면 피펫을 사용하고 접포 세포가 방해되지 않도록 벽 측면을 따라 우물에 천천히 파이펫 새 미디어를 사용하십시오. 참고 : 지방 세포는 7 일 후 하나의 미디어 변경으로 2 주 동안 배양되었습니다. 그러나, 다른 지방 기원 및 실험 적인 질문 증가 미디어 변화에서 혜택을 받을 수 있습니다.</li>
	<li>RNA를 수확하기 위해, 7.1단계에서 설명한 바와 같이 매체를 제거하고, 500 μL의 포염 완충액(표의 물질)을웰에 직접 추가하여 세포를 포액화한다. 이미징을 위해 세포를 고정하려면 최종 농도인 1%에서 포름알데히드를 웰에 직접 추가하십시오. 참고 : 세포는 4 °C에서 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

막 성숙 지방세포 골재 배양(MAAC)은 신선하게 단리된 성숙한 지방세포의 장기 배양을 위한 새로운 방법이다. MAAC를 설정할 때 성숙한 지방세포의 수율, 품질 및 생존에 큰 영향을 미치는 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이 단계는 지방세포가 콜라게나아제에 노출되는 시간의 양에 직접적으로 영향을 미치기 때문에 3.2 단계에서 지방을 다듬기 위해 많은 노력을 기울여야합니다. 지방분의 조각이 너무 큰 경우, 소화 시간은 세포의 생존에 부정적인 영향을 미치는 확장해야합니다. 반대로, 조직이 가위로 너무 미세하게 처리되는 경우에, 생존력은 또한 영향을 받을 수 있습니다. MAAC로 성숙한 지방세포의 성공적인 문화를 위해, 하나는 다음 단계에 특별한주의를 기울여야한다 : 막에 지방 세포의 성공적인 파종을 위해, 그것은 자유 지질 및 이월 세척 버퍼가 성숙한 지방 세포에서 제거하는 것이 중요합니다 5.3 단계와 5.4 단계에서. 남아있는 지질 또는 세척 버퍼는 지방 세포의 표면 장력을 감소시키고 그들이 뒤집을 때 막을 떨어지는 지방 세포의 위험을 증가시킬 것이다. 지방세포가 씨를 뿌리고 매체에 있을 때, 세포는 주로 부력을 통해 막과 접촉하게 되므로 세포를 잃지 않도록 매체를 변경할 때 느리고 부드러운 기술을 권장합니다. 7.1단계에 설명된 대로 우물 바닥에서 용지를 제거하고 벽면 아래로 천천히 매질을 피펫팅하여 매체를 추가합니다. 마지막으로, 시간 절약 제안은 지방 세포 격리 과정 전에 매체 및 치료와 플레이트를 준비하는 것입니다. 특히 복잡한 실험 설계의 경우 플레이트를 미리 준비하면 많은 시간을 절약 할 수 있으며 지방 세포가 분리되는 즉시 처리와 함께 미디어에 배치되도록합니다.
차별화 preadipocytes에 비해 MAAC를 사용하는 한 가지 장점은 사용되는 MAAC 매체가 매우 간단하고 생리호르몬 칵테일을 필요로하지 않는다는 것입니다. 여기에서 우리는 포도당이 풍부한 매체 (DMEM/F12), 10% FBS, 1% 펜/스트렙 및 20 nM 인슐린에 있는 MAAC를 배양했습니다. 중요한 것은, 우리는 인슐린이 UCP110의rosiglitazone/pioglitazone 구동 유도를 위해 절대적으로 필요하다는 것을 것을을 발견했습니다. 인슐린은, 그러나, 세포의 지광 표현형을 유지하기 위하여 요구되지 않습니다. 따라서, 실험적 질문에 따라, 인슐린은 포함되거나 생략될 수 있다.
위에서 자세히 설명한 절차는 인간 지방세포의 고립과 문화에 최적화되어 있습니다. 그러나, 마우스, 그리고 아마도 다른 유기체의 지방세포는, 또한 MAAC로 배양될 수 있습니다. 마우스 지방세포가 MAAC로 배양되는 경우 염두에 두어야 할 추가 고려 사항 및 예방 조치가 있습니다. 우리는 마우스에서 성숙한 지방세포가 인간에게서 그것 보다는 훨씬 더 연약하다는 것을 것을을 발견했습니다. 그 결과, 소화 시간은 세포 생존력을 높이기 위해 절대 최소로 단축되어야합니다. 우리는 또한 젊은 마우스 (8 주 이하)에서 지방 세포가 가장 강력하고 재현 가능한 결과를 제공한다는 것을 발견했습니다. 마지막으로, 마우스 MAAC는 최대 1 주일 동안 배양 될 수 있지만, 그들의 지방 생성 표현형이 인간보다 덜 안정적으로 나타난다는 것을 감안할 때 (적어도 2 주를 통해 배양 될 수 있음) 마우스 MAAC를 최소 필요한 시간 동안 배양하는 것이 좋습니다. 실험적인 질문.
MAAC 모형은 투과성 막을 사용하여 기지를 두기 때문에, 이 기술의 1개의 이점은 그밖 세포 모형과 성숙한 지방세포를 공동 배양하는 가능성입니다. 우리는 이전에 MAAC10의사용을 통해 크로스 토크 성숙한 지방 세포및 대식세포의 능력을 입증했습니다. 이것은 비만, 인슐린 저항 및 면역 반응15,16,17사이 연계를 더 탐구하는 기회를 열어줍니다. 미래 실험은 MAAC 모형의 복잡성 그리고 번역 관련성을 더 증가시키고 다중 세포 모형 사이 교차를 조사하기 위하여 간세포, preadipocytes, 내피 세포, 또는 췌장 세포와 같은 그밖 세포 모형을 통합할 수 있었습니다.
MAAC는 시험관 내 다른 지방세포 모델에 비해 지방세포의 기능 및 정체성을 유지하는 데 탁월한 것으로 나타났지만, 또한 고려해야 할 한계가 있다. 전구체 세포에서 분화 된 지방 세포를 사용하는 데 비해 MAAC는 더 힘들고 시간이 많이 걸리는 모델입니다. 멤브레인이있는 플레이트는 일반 세포 배양 판에 비해 더 비쌉입니다. 중요한 것은, 성숙한 지방세포는 파종시마다 신선하게 분리되어야 하며 전구체 세포와 같은 주식으로 확장되거나 동결될 수 없습니다. 따라서, 이것은 신선한 백색 지방 조직 견본에 접근을 갖는 것을 요구합니다, 그러나 또한 기증자 변이에 기증자에서 유래하는 복잡성의 수준을 추가합니다.
여기에서 우리는 인간 성숙한 지방세포를 격리하고 MAAC를 설치하기 위한 상세한 프로토콜을 제시했습니다. 우리는 MAAC로 배양 된 지방 세포가 2 주를 통해 실행 가능한 상태로 유지되고, 그들의 지질 유전자 서명이 보존되고, 다양한 약리학 작용에 반응한다는 것을 입증했습니다. MAAC를 사용하면 크로스 토크 betweeen 지방 세포 및 기타 세포 유형의 연구, 그리고 다른 자극에 대한 응답으로 성숙한 지방 세포의 장기 표현형 변화의 평가를 할 수 있습니다.

비만과 비만 관련 공동 이환에 있는 세계적인 증가는 새로운 치료의 발달을 필요로 합니다. 백색 지방 조직(WAT)은 전신 대사, 에너지 항상성의 중요한 조절제이며, 인슐린 저항성 및 제2형 당뇨병(T2D)1,2의발달에 중심적인 역할을 한다. 만성 과잉 칼로리 소비 하는 동안, 지방 세포 에너지의 잉여를 처리 하기 위해 확대. 그러나, 지방세포 지질 저장 용량은 초과될 수 있으며, 그 결과 지방산의 순환 수준이 높아지고 말초 비지방 조직에 저장이증가하여 지질중독3,4가이르게 된다.
높은 번역 관련성을 가진 시험관 내 지방세포 모델의 부족은 비만과 T2D를 위한 새로운 처리의 발달에 있는 중요한 도전입니다. 지방 조직의 작은 조각이 배양되는 ex vivo 배식물 모델은 저산소증 및 염증에 의해 구동되는 지방 생성 유전자 발현의 급속한 변경과 관련이 있다5,6. 천장 배양체(CCs)는 성숙한 지방세포가 부유하고 배지로 채워진 플라스크의 상부에 부착되며,지질이결여된 섬유아세포로 급속히 분화되는7,8,9,10. 가장 일반적으로 사용되는 모델은 체외에서 분화 된 지방세포체입니다. 분화한 세포는, 그러나, 형태학적으로 크기가 훨씬 작고 단엽 지질 물방울이 결여되기 때문에 생체 내에서 성숙한 지방세포와 구별됩니다. 이 모델의 다른 한계는 분화를 유도하기 위한 화학적 칵테일의 비생리학적 필요성뿐만 아니라 다수의 요인11,12,13,14에의해 영향을 받을 수 있는 분화 효율의 가변성을 포함한다.
우리는 최근에 막 성숙 지방 세포 골재 배양 (MAAC), 담포세포가 투과성 막(10)하에서 배양되는 신선하게 분리된 성숙한 지방세포의 장기 배양을 위한 방법을 개발하였다. RNA 염기서열 분석 데이터의 편견 분석은 지방 조직 이식 및 시험관 내 분화 지방세포에 비해 MAAC가 새로 분리된 지방세포와 가장 유사하다는 것을 보여주었다. MAAC는 비만과 마른 과목 모두에서 피하 및 내장 지방 조직 모두에서 분리 성숙한 지방 세포뿐만 아니라 지방 세포체배양에 사용할 수 있습니다. 이 방법론은 장기 지방세포 표현형 변화의 연구를 허용하고 다른 세포 유형과 지방 세포의 공동 배양을 용이하게합니다. 여기에서 우리는 인간 지방 조직에서 성숙한 지방세포의 격리를 위한 상세한 프로토콜 및 MAAC 시스템을 설정하는 방법을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>오토클레이브 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>오토클레이브 스푼,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 핀셋,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>시그마-알드리치</td>, <td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>완충액, RLT</td><td>, QIAGEN</td><td>79216</td>, <td>용해 완충액</td></tr>, <tr><td>CaCl2*2H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브, 50 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>필터 플라스크 0.2 &마이크로; m 기공 크기, 75mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>156-4020</td><td>500mL</td></tr><tr><td>필터 플라스크 0.2 &마이크로; m 기공 크기, 75 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>158-0020</td><td>1000 mL</td></tr><tr><td>HBSS+CaCl2+MgCl2</td><td>Gibco</td><td>14065-49</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충 용액 (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>고용량 cDNA 역전사 키트</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Insulin (Actrapid Penfill)Novo</td> <td>Nordisk A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>104873</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Gibco</td><td>10012-011</td><td></td></tr><tr><td>메시 필터 (250 &micro; M)</td><td>Sintab AB</td><td>6111-025043</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>바늘, 18 G, 1.20 mm x 40 mm</td><td>Sterican</td><td>613-2948</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep)</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 150 mm x 21 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR 마스터 믹스</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR 기계</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kits</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Separation funnel</td><td>VWR</td><td>527-0008</td><td>대규모 준비용</td></tr><tr><td>분리 깔때기</td><td>VWR</td><td>527-0005</td><td>소규모 준비용</td></tr><tr><td>진탕 인큐베이터(37 &deg; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기, 5 mL</td><td>Omnifix</td><td>612-2892</td><td>100 st</td></tr><tr><td>조직 배양 인큐베이터(37 &deg; C, 5% CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transwells, 24-well(6.5 mm)</td><td>Costar</td><td>3397</td><td>투과성 멤브레인 인서트</td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Invitrogen</td><td>10296010</td><td>용해 완충액</td></tr><tr><td>유형 2 콜라겐분해</td>효소 <td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 성숙한 지방세포의 고립과 문화는 막 성숙한 지방 세포 골재 배양 (maac)를 사용하여

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

백색 지방 조직 (WAT) dysregulation는 인슐린 저항과 타입-2 당뇨병 (T2D)의 발달에 있는 중앙 역할을 합니다. T2D에 대 한 새로운 치료를 개발 하려면, 더 생리적으로 관련 된 체 외 지방 세포 모델이 필요 하다. 이 연구는 성숙한 인간 지방세포들을 분리하고 배양하는 새로운 기법을 설명한다. 이 방법은 MAAC (막 성숙한 지방 세포 골재 배양)의 제목이며, 시험관 내 다른 지방 세포체 모델과 비교하여, MAAC는 갓 분리 된 성숙한 지방 세포에 가장 가까운 지방 질 유전자 서명을 소유합니다. MAAC를 사용하여, 지방세포는 린 및 비만 환자로부터 배양될 수 있고, 상이한 지방 창고, 상이한 세포 유형과 공동 배양되고, 중요한 것은, 2주 동안 배양될 수 있다. 기능적 실험은 또한 포도당 섭취, 지질 발생 및 지방 분해를 포함한 MAAC에서 수행 될 수있다. 더욱이, MAAC는 다양한 약리학 적인 근치에 강하게 반응하고 갈색 같이 지방 세포로 백색 지방세포의 분신을 포함하여 지방세포 표현형 변경을 공부하는 것을 이용될 수 있습니다.

MAAC로 배양 성숙한 지방 세포는 자신의 기능을 보존, 표현형, 다양한 약리학적 치료에 지방 세포 반응을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 피하 지방 조직에서 분리된 배양 MAAC의 1주일 후 성숙한 지방세포에서만 발견되는 특징적인 단구 지질 방울을 유지한다(도2A). MAAC는 PPARγ 아고니스트 로시글리타존(Rosi) 및 피오글리타존(Pio) 또는 글루코코르티코이드 수용체(GR) 아고니스트 덱사메타손(Dex)을 사용하여 처리하면서 1주일 동안 배양하였으며, 다른 핵 호르몬 수용체(NHR) 작용제가 MAAC의 하류 표적 유전자의 예측 된 변화를 유도하는지 여부를 결정하였다. 로시와 피오는 PPARγ 반응성 유전자 FABP4 및 LPL의 발현을 각각 4 및 2-3배 증가시킨 반면 덱사메타손은 아무런 효과가 없었다(도2B). 유사하게, 덱사메타손은 GR 표적 유전자 APOD 및 FKBP5의 유전자 발현을 각각 13-55배로 견인한 반면, PPARγ 아고니스트는 유의한 효과가 없었다. 우리는 이전에 신선하게 고립된 인간 성숙한 백색 지방세포가 Rosi10으로취급될 때 MAAC에 있는 갈색 같이 표현형으로 분화할 수 있다는 것을 설명했습니다. 7일 간의 로시 또는 피오로 치료한 결과, 갈색 지방 특이적 유전자 UCP1의 유전자 발현을 44-65배로 강력하게 유도할 뿐만 아니라, 갈색 지방 마커 PDK4 의 발현을 12-18배 증가하였다(도2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig1a.jpg"> 그림 1: MAAC 설정의 시각적 다이어그램입니다. (A)배지 준비. (B)성숙 한 지방 세포의 격리 및 포장. (C)모막에 성숙한 지방 세포를 파종. (D)지방세포가 부착된 상태로 유지하면서 막을 뒤집습니다. (E)멤브레인을 배지로 낮추고 배지를 변경합니다. 이 수치는 Harms 외10에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig2a.jpg"> 그림 2: MAAC는 1 주를 통해 단방외관을 유지하고 다양한 약리학 적인 작용통증에 반응합니다. (A)1주일 의 문화 후 MAAC의 대표4배 및 10배 밝은 필드 이미지. 큰 단엽 지질 방울을 가진 100 μm의 평균 직경이 있는 지방세포는 쉽게 분별할 수 있습니다. (B)PPARγ 표적 유전자 및 글루코코르티코이드 수용체(GR) 표적 유전자의 mRNA 수준은 7일 후 비히클(Vehc), 로시글리타존(Rosi), 피오글리타존(Pio), 또는 덱사메타손(Dex)으로 치료한 후 MAAC에서 표적 유전자를 표적으로 한다. 로시, 피오 및 덱스는 모두 10 μM의 최종 농도에서 사용하였다.(C)mRNA 수준에서 MRNA 수준에서 마비된 갈색 지방이 풍부한 유전자를 7일 간 치료한 후 비히클(Vehc), 로시글리타존(Rosi), 피오글리타존(Pio), 또는 덱사메타손(Dex)을 치료하였다. 로시, 피오 및 덱스는 모두 10 μM의 최종 농도에서 사용되었다. 모든 유전자 발현 데이터에 대해, TATA 결합 단백질(TBP)을 내부 정규화 대조군으로 사용하였다. 통계는 Tukey의 다중 비교 테스트와 단방향 ANOVA를 사용하여 계산되었습니다. (평균 ± SD, n = 3, *p &lt; 0.05; **p &lt; 0.01; ***p &amp; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

막 성숙한 지방세포 골재 배양(MAAC)은 성숙한 인간 지방세포배양하는 새로운 방법이다. 여기서 우리는 인간의 지방에서 지방세포를 분리하는 방법과 MAAC를 설정하는 방법을 자세히 설명합니다.

인간 성숙한 지방세포의 고립과 문화는 막 성숙한 지방 세포 골재 배양 (MAAC)를 사용하여

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

지방 생물학 분야에서 한 가지 과제는 문화에서 성숙한 지방을 유지하는 것입니다. 우리는 큰 변화를 통해 장기 적혈구의 연구를 허용하는 새로운 방법을 개발했습니다. 우리의 지방 세포 배양 기술은 세포 상호 작용의 연구를 허용하고 잘하면 당뇨병과 비만에 대한 새로운 치료의 개발에 유용 할 것입니다.유전자 품질과 성숙한 지방세포의 생존가능성에 크게 영향을 미치는 몇 가지 중요한 단계가 있기 때문에 프로토콜을 신중하게 따르는 것이 중요합니다. 예를 들어, 도금하기 전에 모든 무료 지질 및 세척 버퍼가 제거되었는지 확인하십시오 그렇지 않으면 삽입이 반전될 때 리포사이클이 벗겨질 수 있습니다. 인간 피하 지방 조직 샘플을 받은 후, 15cm 페트리 접시에 멸균 생물학적 안전 캐비닛에 조직을 배치합니다.소량의 중간 199. 핀셋을 사용하여 조직 내의 큰 섬유질 혈관을 파악하고 닫힌 한 쌍의 끝의 뒷면을 사용하여 혈관을 따라 지방을 부드럽게 긁어 내어 지방을 방출합니다. 모든 세포가 수집되면 섬유 조직의 큰 조각을 버리고 손질 된 지방을 무게.지방 조직에서 세포를 더 방출하기 위해 10 그램의 지방 조직을 새로운 15 센티미터 페트리 접시로 옮기고 곡선 가위를 사용하여 지방을 잘게 자게하여 큰 지방 조각이없는 부드러운 균질 혼합물이 될 때까지 조심스럽게 지방을 다진다. 모든 지방이 처리되면 숟가락을 사용하여 다진 조직의 10 밀리리터를 개별 50 밀리리터 튜브로 옮기고 각 튜브에 30 밀리리터의 소화 버퍼를 추가하십시오. 그런 다음 흔들리는 인큐베이터에 튜브를 섭씨 37도, 분당 150회전을 30~35분 동안 배치합니다.지방 용액이 균일하고 살구색이며 큰 조각이 없을 때 소화가 완료됩니다. 소화가 끝나면 소화된 지방 용액을 멸균 1리터 플라스크로 설정된 깔때기 내부의 250 마이크로미터 메쉬 필터로 디게팅합니다. 대포세포 현탁액의 전체 부피가 제거되면 메쉬 필터를 부드럽게 짜서 백러를 다시 짜내기 전에 50~100밀리리터의 세척 버퍼로 필터를 세척합니다.격리된 분리 형액을 분리 깔때기로 옮기고 깔때기가 거의 완전히 채워지 때까지 세척 버퍼를 추가합니다. 깔때기를 부드럽게 반전시켜 안구체 서스펜션을 버퍼와 혼합하고 레이어의 뚜렷한 분리가 있을 때까지 서스펜션이 2~3분 동안 방치하도록 합니다. 층이 분리되면 깔때기의 노즐을 열고 바닥 용액을 멸균 플라스크로 천천히 피합니다.콜라게나아제의 모든 제거되면, 50 밀리리터 원모형 튜브에 정제 된 성숙한 지방 세포 용액을 수집하고 가볍게 원심 분리에 의해 세포를 포장. 이어서, 18 게이지 바늘을 장착한 10밀리리터 주사기를 사용하여 교포현 액수 아래에 남은 세척 버퍼를 제거하고 파이펫을 사용하여 성숙한 지방세포 위에 떠 있는 프리 지질층을 제거한다. 성숙한 안도세포의 파종의 경우, 투과성 멤브레인 인서트 성분을 멸균 표면에 거꾸로 놓고 포장된 지방세포의 튜브를 몇 번 부드럽게 반전하여 세포의 균일한 분포를 보장합니다.넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 각 멤브레인에 포장된 성숙한 지방세포 30마이크로리터를 추가합니다. 시드 된 교신구가 인서트의 맨 아래에 있도록 하나의 부드러운 모션으로 삽입 패널을 반전. 삽입 패널을 500 ~1, 000 마이크로리터가 들어 있는 24개의 웰 플레이트에 잘 배치합니다.그런 다음 접시를 덮고 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 조심스럽게 넣습니다. 7일마다 각 인서치의 컷아웃 구멍을 통해 배지를 교체한다. 문화의 1 주일 후, 피하 지방 조직으로부터 분리 된 성숙한 지방 체재는 성숙한 지방 세포에서만 관찰된 특징적인 외구 지질 액적 형태를 유지합니다.PPAR-GAMMA 작용제 피오글리타존과 로시글리타존을 통한 치료는 PPAR-GAMMA 반응성 유전자에서 발현이 증가하는 반면, 글루코코르티코이드 수용체 고뇌의 치료는 이러한 유전자에 영향을 미치지 않는다. 유사하게, 글루코코르티코이드 수용체 작용제는 글루코코르티코이드 수용체 표적 유전자의 유전자 발현을 강력하게 유도하고, PPAR-GAMMA 작용제는 이 유전자에 유의한 효력이 없는 동안. 또한, PPAR-GAMMA 작용제와의 7일 치료는 갈색 지방 특이 유전자, UCP1의 유전자 발현을 강력하게 유도한다.체외 모델의 새로운 지방세포는 포도당 섭취, 리포발생 및 지방분해를 포함한 성숙한 지방세포의 기능적 연구에 사용될 수 있습니다. 이 새로운 지방 세포 문화 기술을 통해 우리는 인간의 성숙한 흰색 지방 세포가 갈색과 같은 지방 세포로 변형 할 수 있음을 보여줄 수있었습니다.

isolation-culture-human-mature-adipocytes-using-membrane-mature

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 형광 표지된 신경능선 유래 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 분리 및 배양하는 기술을 보여줍니다. 분리 후 NCADSC를 검출하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분류한 후 플레이트에서 배양하여 세포 증식을 촉진합니다.

쥐 대동맥 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 분리

성숙한 지방세포는 역분화를 통해 줄기세포의 풍부한 공급원을 나타낼 수 있으며, 이는 섬유아세포와 같은 세포의 균질한 집단으로 이어집니다. 콜라겐분해효소 소화는 인간 지방에서 성숙한 지방세포를 분리하는 데 사용됩니다. 우리 프로토콜의 목표는 인간의 성숙한 지방 세포에서 다분화능, 역분화된 지방 세포를 얻는 것입니다.

천장 문화 성숙한 지방 세포의 탈분화를 통해 인간 된 지방 줄기 세포의 생성

여기에서는 MCS (Magnetic-activated Cell Sorting)를 사용하여 Perivascular Adipose Tissue (PVAT)에서 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cell, APC) 개체군을 분리하는 방법을보고합니다. 이 방법은 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)와 비교할 때 지방 조직 1g 당 APC의 증가 된 분리를 허용합니다.

자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도

흰색 adipose 조직 (WAT) 약물 개발 및 대사 연구를 방해, 그것의 현재 기본 문화 모델에 중요 한 결함을 있다. 여기, 선물이 stromal 세포 시트 사이 붙여 와트에 의해 많은 microphysiological 시스템을 생산 하는 프로토콜. 이 구조는 기본 와트 문화에 대 한 안정적이 고 융통성 있는 플랫폼을 제공합니다.

인간 지방 Microphysiologic 플랫폼: 백색 지방 조직에 끼여

우리는 지방 조직 신진 대사 표현형에 기여에 매트릭스 및 지방 세포의 역할의 해부를 허용하는 시험관 내 3D 인간 세포 외 매트릭스 -adipocyte를 설명합니다.

매트릭스 세포 대사 크로스토크 연구를 위한 인간 3D 세포외 세포외 매트릭스-세포세포 배양 모델

우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 마우스 전도성 지방 패드에서 매우 실행 가능한 지방 전구 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다.

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

이 프로토콜은 피하 지방에서 마우스 지방전구세포의 분리, 성숙한 지방세포로의 분화 및 인슐린 저항성 유도를 설명합니다. 인슐린 작용은 웨스턴 블롯을 통한 인슐린 신호 전달 경로 구성원의 인산화/활성화에 의해 평가됩니다. 이 방법을 사용하면 원발성 지방세포에서 인슐린 저항성/민감도를 직접 측정할 수 있습니다.

1차 배양에서 분화된 마우스 지방세포: 인슐린 저항성 모델

여기에서는 인간 피하 지방 조직(hSATMVECs)에서 미세혈관 내피 세포를 분리, 배양 및 표현형으로 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 hSATMVEC-지방 세포 누화의 실험 모델을 설명합니다.

인간 피하 지방 조직에서 지방 내피 세포/지방 세포 누화 연구

성숙한 지방세포의 크기와 취약성으로 인해 연구 및 분리에 사용할 수 있는 기술과 도구가 제한되어 있습니다. 여기에서는 성숙한 쥐 지방세포의 분리를 위한 프로토콜이 설명되어 있으며, 이는 다양한 지방세포 및 마우스 사료에 쉽게 적용할 수 있습니다.

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

배아 쥐의 두뇌 집합의 문화 시스템을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 집계에 Multipotent progenitors 개발하고 뉴런, astrocytes 및 oligodendrocytes로 구별하실 수 있습니다.

신경 세포와 Glia 개발 연구 랫 두뇌 집계 문화의 준비

배우세요 인간 성숙 지방세포의 고립 및 배양 방법을 MAAC 기술을 활용하여. 이 방법은 당뇨병과 비만 연구를 위한 세포 상호작용 분석 및 장기간 기능 연구에 활용됩니다.

인간 성숙한 지방세포의 고립과 문화는 막 성숙한 지방 세포 골재 배양 (MAAC)를 사용하여

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