Name: 매트릭스 세포 대사 크로스토크 연구를 위한 인간 3D 세포외 세포외 매트릭스-세포세포 배양 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 배우세요 인간 3D 세포외 매트릭스-지방세포 배양 모델을 이용한 지방조직 대사 연구 방법을. 이 기법은 세포외 매트릭스와 지방세포 간 상호작용을 분석하여 제2형 당뇨병 연구에 활용됩니다.

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다니엘 버거, 마릴린 우드럽, 시몬 코레아, 레타 가이스에게 연구 조정에 도움을 주신 것에 감사드립니다. SEM은 미시간 대학 현미경 검사법 및 이미지 분석 실험실 생물 의학 연구 핵심 시설에 의해 수행되었습니다. 이 프로젝트는 NIH 보조금 R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), 재향 군인 업무 공로 그랜트 I01CX001811 (RWO), 미시간 당뇨병 연구 센터 (NIH 그랜트 P30-DK020572)에서 파일럿 및 타당성 부여 (RWO), 재향 군인 관리 VISN 10 스파크 파일럿 그랜트 (RWO). 미시간 대학 현미경 검사법 및 이미지 분석 실험실 생물 의학 연구 핵심 시설에 의해 수행 된 주사 전자 현미경 검사법. 이 원고의 그림 4는 원래 베이커 외, J 클린 엔도 Metab 2017에 게시되었습니다; 3월 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, 옥스포드 대학 출판부 [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]의 허가에 의해 복제되었습니다. 이 자료를 재사용할 수 있는 권한을 받으려면 http://global.oup.com/academic/rights 방문하십시오.

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저자는 상충하는 이해관계를 선언하지 않습니다.

ECM-지방세포 배양 모델은 궁극적인 조직 표현형을 지시하는 ECM 및 세포의 개별적인 역할을 해부하기 위한 귀중한 공구를 제공합니다. ECM 격리 프로토콜은 매우 재현 가능하지만 탈세포화 과정의 가변성이 관찰될 수 있습니다. 3일째 삭제 단계는 프로토콜의 중요한 지점입니다. 하룻밤 추출이 완료되면 매트릭스는 노란색으로 변하는 극성 용매 용액에 의해 입증되어야하며, 매트릭스는 손상되지 않은 지방 조직의 노란색 - 주황색 특성에서 반투명 / 흰색(그림 1)을참조하십시오. 이러한 색상 변경이 발생하지 않으면 삭제가 완료되지 않을 수 있습니다. 지질 효율성에 있는 환자 간 가변성은 일반적입니다, 그러나 현재까지 우리는 대상 DM 상태, 나이, BMI, 또는 그밖 임상 변수를 가진 삭제의 효율성의 어떤 상관관계도 관찰하지 않았습니다. 큰 샘플 (20g 이상)은 효율적인 지질 검사를 받지 않습니다. 처리 샘플 <20 g는이 문제를 방지 할 수 있습니다. 3일차 이후에 시료가 완전히 제...

세포외 매트릭스 (ECM)는 조직에 대한 기계적 스캐폴드를 제공 할뿐만 아니라 그 안에 있는 세포와 복잡한 크로스 토크에 종사하여 세포 증식을 포함한 조직 항상성에 필요한 다양한 과정을 조절합니다. 차별화, 신호 및 신진 대사1. 건강한 ECM은 정상적인 조직 기능의 유지에 필수적인 역할을하지만, 기능 장애 ECM은 여러 질병에 연루되어있다2.
지방 조직은 신진 대사 질환의 발병기전에 중요한 역할을합니다. 비만은 과도한 지방세포 비대 및 세포 저산소증, 지방세포 세포 대사의 결함, 지방 조직 산후 염기 및 산화 스트레스 및 염증과 관련이 있습니다. 제대로 이해하는 동안, 이러한 복잡한 과정은 지방 조직 영양소 버퍼링 용량을 손상공모, 지방 조직에서 영양 오버플로로 이어지는, 여러 조직의 독성, 및 전신 대사 질환3,4 ,5. 지방 조직 실패의 기초가 되는 사건 그리고 특정 기계장치의 순서는 제대로 이해되지 않습니다, 그러나 지방 조직 ECM에 있는 변경은 연루되었습니다. ECM 조성물은 인간 및 뮤린 비만에서 지방 조직 내에서 변경되며, ECM 단백질의 증착이 증가하고, 인간 대사 질환과 관련된 지방 조직 ECM의 질적 생화학적 및 구조적 차이와 함께 타입-2 당뇨병과 고지혈증6,7,8,9,10,11.
이러한 관찰에도 불구하고, 지방 조직 기능 장애를 중재하는 지방 조직 ECM의 역할은 잘 정의되지 않는다. 이것은 부분적으로 궁극적인 지방 조직 기능을 조절에 ECM및 지방세포의 특정 역할의 해부를 허용하는 견인 가능한 실험 모형의 부족 때문이. ECM-지방세포 배양은 적어도 2개의 측면에서 네이티브 지방 조직의 생체 내 환경을 더 잘 시뮬레이션한다. 첫째, ECM 배양은 표준 2D 배양에 없는 네이티브 콜라겐, 엘라스틴 및 기타 매트릭스 단백질을 포함한 네이티브 지방 조직과 유사한 분자 환경을 제공합니다. 둘째, 2D 플라스틱에 대한 배양은 ECM 배양이 제거되는 플라스틱기판(12)의탄성 감소로 인한 기계적 효과를 통해 지방세포 대사를 변화시키는 것으로 나타났다.
탈세포화된 지방 및 기타 조직에서 ECM을 분리하여 생물학적 스캐폴드를 설계하는 방법은 재생 및 재생 의학 및 조직 공학 13,14, 15,16,17,18. 우리는 이전에 인간 내장 지방 조직으로부터 유래된 ECM 및 지방세포 줄기세포(preadipocytes)를 사용하여 인간 ECM-지방세포 배양의 체외 3D 모델을 개발하기 위해 이러한 방법을 적용한 방법론을 공표했다11. 본 기사에서는 이러한 방법을 자세히 설명합니다. 인간 지방 조직에 대한 탈세포화 절차는 세포와 지질을 제거하기 위한 기계적 및 효소 적 치료를 수반하는 4 일 간의 과정으로, 유래되는 조직의 특성을 유지하는 생물학적 스캐폴드를 남깁니다. 탈세포화된 ECM은 인간 preadipocytes의 지방 분화를 지원하고, 지방세포로 재구성될 때, 그대로 지방 조직의 미세 건축 및 생화학 및 질병 특이적 특성을 유지하고 대사에 관여합니다. 네이티브 지방 조직의 특징. 이 매트릭스는 단독으로 공부하거나 세포로 다시 시드 할 수 있습니다, 지방 조직의 세포와 세포 외 구성 요소 사이의 상호 작용과 누화의 연구를 허용.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#25200056</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 극저온 튜브</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#02-682-557</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#89370-094</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m 나일론 메쉬 필터</td><td>Corning Inc., Corning, NY, USA</td><td>Cat#352360</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#D8375</td><td></td></tr><tr><td>2 nM 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#T6397</td><td></td></tr><tr><td>24웰 조직 배양 플레이트</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10861-700</td><td></td></tr><tr><td>3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#I5879</td><td></td></tr><tr><td>96웰 조직 배양 플레이트</td><td>VWR International LLC., 미국 펜실베이니아주 래드너</td><td>Cat#10861-666</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균 용액(ABAM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#15240062</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#B4639</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#A8806</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>Cat#79216</td><td></td></tr><tr><td>Ciglitizone</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#C3974</td><td></td></tr><tr><td>Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#NET328A250UC</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 디옥시리보뉴클레아제 I, 유형 II-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#D4513</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#D4902</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#BP231</td><td>가연성, 가성</td></tr><tr><td>이나트륨 EDTA</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA 미국</td><td>Cat#BP118</td><td></td></tr><tr><td>D-판토텐산 헤미칼슘염</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#21210</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#11320033</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA</td><td>Cat#DSP-MD.43</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., 미국 매사추세츠주 월섬</td><td>Cat#10437028</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#G5882</td><td>가성</td></tr><tr><td>헥사메틸디살리잔</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#440191</td><td>가연성 가성인간</td></tr><tr><td>인슐린 용액</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#I9278</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#A415</td><td>가연성</td></tr><tr><td>이소프로테레놀</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#I5627</td><td>가연성</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#S25484</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#P5655</td><td></td></tr><tr><td>돼지 췌장에서 추출한 리파아제, 유형 VI-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#L0382</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H2O</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#S5136</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NaCl Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#S233</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#A661</td><td></td></tr><tr><td>최적 절단 온도(OCT) 화합물</td><td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK</td><td>Cat# AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O Solution (ORO)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#O1391</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O Stain Kit</td><td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA</td><td>Cat#KTORO-G</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#201030</td><td>Caustic</td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#93482</td><td>가성</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 리보뉴클레아제 A, III-A형</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#R5125</td><td></td></tr><tr><td>RNAEasy 섬유 조직 MiniKit</td><td>Qiagen, 독일 힐덴</td><td>Cat#74704</td><td></td></tr><tr><td>섬광 유체</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., 미국 매사추세츠주 월섬</td><td>Cat#SX18</td><td></td></tr><tr><td>섬광 카운터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>가위, 집게, 멸균</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorensen의 인산염 완충액</td><td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td><td>CAS #: 10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>T-150 배양 플라스크</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10062-864</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스</td><td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#4369016</td><td></td></tr><tr><td>온도 제어 궤도 쉐이커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 균질화기, BeadBug 마이크로튜브 균질화기</td><td>벤치마크 Scientific</td><td>Cat#D1030</td><td></td></tr><tr><td>트랜스페린</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#T3309</td><td></td></tr><tr><td>트리글리세리드 측정 키트</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#TR0100</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain, 0.4%</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Type II collagenase</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#17101015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Reeve Angel 여과지, 등급 201, 150mm</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., 미국 미주리주 세인트루이스</td><td>Cat#WHA5201150</td><td></td></tr></tbody></table>

매트릭스 세포 대사 크로스토크 연구를 위한 인간 3d 세포외 세포외 매트릭스-세포세포 배양 모델

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

세포외 매트릭스 (ECM)는 조직 항상성을 조절하고 세포와의 크로스 토크에 참여하고 세포 기능의 여러 측면을 조절하는 데 핵심적인 역할을합니다. ECM은 비만에서 지방 조직 기능에 특히 중요한 역할을 하며, 지방 조직 ECM 증착 및 조성물의 변화는 마우스 및 인간에서 대사 질환과 관련이 있다. 글로벌 조직 표현형에 기여하는 ECM 및 세포의 역할의 해부를 허용하는 견인성 체외 모델은 희소하다. 우리는 지방 조직 신진 대사 표현형을 조절에 ECM 및 지방세포의 특정 역할의 연구를 허용하는 인간 ECM-지방세포 문화의 새로운 3D 체외 모형을 기술합니다. 인간 지방 조직은 ECM을 분리하기 위해 탈세포화되며, 이는 이후에 ECM 내에서 성숙한 지방세포로 분화되는 preadipocytes로 다시 채워집니다. 이 방법은 대사적으로 활성화되어 있는 ECM-adipocyte 구조를 생성하고 조직과 환자가 파생되는 특성을 유지합니다. 우리는 인간 지방 조직에서 질병 특이적 ECM-지방 세포 누토크를 입증하기 위해이 시스템을 사용했습니다. 이러한 배양 모델은 글로벌 지방 조직 대사 표현형에 기여하는 ECM 및 지방세포의 역할을 해부하는 도구를 제공하고 지방 조직 항상성을 조절하는 ECM의 역할에 대한 연구를 허용한다.

지방 조직 ECM의 준비, preadipocytes와 파종, 성숙한 지방 세포로 시험관 내 분화는 프로토콜 전반에 걸쳐 진행의 시각적 평가를 허용하는 조직에 명확한 순차적 형태 변화를 초래(그림 1) . ECM을 종하는 데 사용되는 Preadipocytes는 별도의 VAT 샘플로부터 콜라게나아제 소화를 사용하여 분리됩니다(그림2). 처리의 각 단계에서 ECM-adipocyte 구성의 주사 전자 현미경은 ECM의 탈세포화 및 재종 및 분화 시 지질 함유 지방세포의 후속 재캡을 밝혀냅니다(그림 3). 비세포화된 ECM의 콜라겐 1특이적 면역조직화학은 콜라겐 미세아키텍처의 유지를 밝혀내고, 오일 레드-O 염색은 살아있는 3D ECM-adipocyte 구조가 지질 함유지방세포(그림 ...

우리는 지방 조직 신진 대사 표현형에 기여에 매트릭스 및 지방 세포의 역할의 해부를 허용하는 시험관 내 3D 인간 세포 외 매트릭스 -adipocyte를 설명합니다.

매트릭스 세포 대사 크로스토크 연구를 위한 인간 3D 세포외 세포외 매트릭스-세포세포 배양 모델

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

우리의 프로토콜은 ECM이 고전적인 반포성 중재자가 없는 상태에서 사이포겐성 분화를 촉진할 수 있으며 ECM에 의한 세포 대사의 질병 별 조절을 최초로 입증한다는 것을 보여줍니다. 우리의 기술은 지방 조직 대사에 ECM과 지방 세포의 역할을 해부하고 지방 조직 항상성을 조절하는 ECM의 역할에 대한 연구를 허용하는 도구를 제공합니다. 표준 2D 세포 배양과 비교하여, 우리의 3D 모형은 타입-2 당뇨병의 맥락에서 지방 조직 ECM 사이 단화제의 더 강력한 검사 그리고 해부를 허용합니다.더 작은 샘플부터 세포화정도를 측정하는 것이 좋습니다. 세포가 얼마나 잘 성장하고 조직이 얼마나 잘 탈세포화에 입원 환자 간 가변성이 있다는 것을 명심하십시오. 조직이 세포탈화되고 있는지 확인하고 샘플 사이의 잠재적 인 차이를 이해하기 위해 각 단계 전후의 조직을 관찰하는 것이 중요합니다.수술에서 내장 지방 조직 또는 부가가치세를 얻은 후 50 밀리리터 원추형 튜브에 5-10 그램의 조직을 동결 완충액에 추가하여 저장을 준비하십시오. 완전히 샘플을 담그고 탈세포화 될 때까지 영하 80도에서 저장하십시오. 지방 세포 절연을 위해, 콜라게나아제 타입 II 용액의 20 밀리리터에 그대로 부가가치세의 신선한 샘플 2 그램을 배치한 다음, 멸균 가위를 튜브에 삽입하고 조직을 철저히 다진다.일단 훌륭한 슬러리에 다진 후, 60 분 동안 궤도 셰이커에 섭씨 37도에서 콜라게나제 용액에 인큐베이션. 인큐베이션 후, 100 마이크로미터 나일론 메쉬를 통해 소화된 결과체를 신선한 50밀리리터 원뿔튜브로 필터링합니다. 소화는 적당한 점도와 소화되지 않은 조직의 소량의 잔류 가닥을 가진 황색 오렌지 액체여야 합니다.원심 분리시 샘플을 10 분 동안 270 배 g에서 제거하고, 상류체를 제거하고 파이펫으로 1X RBC 용액의 2 밀리리터에서 셀 펠릿을 재연합니다. 25도에서 1분 동안 솔루션을 배양한 다음 15%의 FBS DMEM F12의 10밀리리터를 추가하고 원심분리기를 10분 동안 270배 g로 추가합니다. ECM을 준비하려면 이전에 냉동 된 VAT 샘플을 섭씨 37도로 동결 / 해동하여 주기적 부드러운 수동 교반으로 20 분 동안 예열 된 수조에서 배양하십시오.일단 해동되면, 20 분 동안 다시 영하 80도까지 조직을 전송하고 해동으로 끝나는 동결 / 해동 과정을 세 번 반복합니다. 멸균 집게를 사용하여 부가가치세 샘플을 15-25 밀리리터의 효소 용액 1을 포함하는 신선한 50 밀리리터 원추형 튜브로 전송하여 샘플이 완전히 침지되도록 하십시오. 그런 다음 130 RPM에서 흔들면서 섭씨 37도에서 하룻밤 을 배양하십시오.다음 날, 헹구는 완충액15-25 밀리리터로 샘플을 세 번 세척하고 세척 후 용액을 부어 주세요. 샘플을 15-25 밀리리터의 효소 용액 2로 신선한 50 밀리리터 튜브로 옮기고 하룻밤 동안 배양합니다. 헹폐용 용액으로 세초를 반복하고 샘플을 극성 용매 추출 용액15-25 밀리리터를 포함하는 신선한 튜브로 전송합니다.흔들리는 동안 하룻밤 동안 샘플을 배양. 극성 용매 용액을 사용하여 배양 후 지질 제거를 위한 샘플을 검사하는 것이 중요합니다. 지질의 대부분이 제거되지 않는 경우, 이 단계를 반복할 필요가 있을 수 있습니다.잠복기 시간이 짧을수록 사용될 수 있다. 인큐베이션 후, 헹굴 버퍼 용액의 15-25 밀리리터를 포함하는 신선한 튜브로 샘플을 전송하고 셰이커에 샘플을 세 번 세척한다. 그런 다음 70% 에탄올 용액으로 샘플을 세 번 세척하고 세척 후 에탄올을 부어 주세요.수납 용액으로 샘플을 한 번 세척한 다음 멸균 집게를 사용하여 15-25 밀리리터의 저장 솔루션이 들어있는 신선한 튜브로 전달하여 완전히 침지하십시오. 그런 다음 샘플은 최대 한 달 동안 섭씨 4도에 보관할 수 있습니다. 이소프로판올과 에탄올은 인화성이며 실온에 있어야 하며 인화성 폐기물로 폐기되어야 합니다.인간의 폐기물은 일반적인 생물학적 위험 폐기물과 별도로 폐기되어야 합니다. 저장된 ECM 조각을 계획된 다운스트림 에세이에 필요한 만큼 의기식 집게를 추가하여 멸균 집게를 사용하여 24웰 플레이트의 개별 우물로 옮습니다. 궤도 셰이커에 70%에탄올의 500 마이크로리터로 세 번 씻은 다음 PBS로 세 번 세척하여 수분을 보충합니다.멸균 가위를 사용하여 ECM을 100 밀리그램 조각으로 자른다. 각 조각을 24웰 플레이트의 한 우물에 넣고 접시를 섭씨 25도에서 15분 동안 배양하여 초과 PBS가 조각에서 돌출되도록 합니다. 그런 다음 파이펫으로 우물에서 남은 PBS를 조심스럽게 제거하십시오.세포를 ECM으로 직접 피펫하여 20마이크로리터의 프리디포사이클 세포 현탁액을 가진 각 단편을 시드한다. 파이펫 팁을 ECM에 넣고 매트릭스의 중앙으로 부드럽게 추방하여 셀 서스펜션이 오버플로되지 않고 우물 의 바닥에 끝납니다. 셀 서스펜션이 ECM에서 오버플로되는 경우 해당 위치에서 파이펫 팁을 제거하고 ECM의 다른 곳에 삽입합니다.세포 파종 후, 섭씨 37도에서 40 분 동안 ECM을 배양하십시오. 종자 ECM 조각을 커버하기 위해 성장 매체의 500 마이크로 리터로 각 우물을 채웁니다. 세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 72시간 동안 배양합니다.72시간 후, ECM 단편을 방해하지 않고 성장 매체를 조심스럽게 흡인시합니다. 분화 매체의 마이크로리터 500개를 추가하고 2~3일마다 미디어를 14일 동안 배양한다. 가벼운 현미경 검사를 사용하여 차별화를 확인합니다.세포는 지질을 축적하고 갈색 - 노란색을 색상으로 바꾸고 분화할 때 더 구형이됩니다. 지방 조직 ECM의 준비, preadipocytes로 시드, 성숙한 지방세포로 체외 분화는 ECM의 탈세포화 및 재종 및 분화 시 지방을 포함하는 지질의 후속 회수를 밝혀 스캔 전자 현미경 검사로 모니터링되었다. 콜라겐 1 특이적 면역조직화학은 콜라겐 마이크로 아키텍처의 유지보수를 보였으며, 오일 레드-O 염색은 살아있는 및 고정된 3D ECM-아디포사이클스 구조의 지질을 나타내고 지방세포가 함유되어 있었다.ECM에서 분화된 아디포세포는 이러한 유전자가 ECM에서 배양된 미분화 된 프리디포사이클에 비해 분화 된 세포에서 강화된다는 것을 입증한 정량적 실시간 PCR을 사용하여 아디포겐 성 유전자를 선별하였다. 성적 증명서 수준의 전체 차이점이 표시됩니다. 당뇨병 과 비 당뇨병 과목에서 ECM과 지방 세포의 네 가지 조합은 대사 phenotyping을 실시하였다.lipolytic 기능에 있는 손상한 포도당 upup는 당뇨병 조직에서 구조물에서 발견되었습니다. 중요한 것은, 비당뇨병 ECM이 당뇨병 성 지방 세포에서 인슐린 자극 포도당 섭취및 lipolytic 용량을 구출한다는 것을 발견했습니다. 분리된 지방세포의 오염, 탈세포화된 조직 및 재시드 ECM은 드물지 않다.불임은 프로토콜 전체에 걸쳐 부지런히 유지되어야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

표준 배양 방법에 세포 생리 학적 환경 꺼내하고 접시의 플라스틱 표면에 성장합니다. 일차 인간 골수 세포의 거동을 연구하기 위해, 우리는 세포가 조직의 미세 환경을 네이티브 recapitulating 조건에서 재배되는 3-D 배양 시스템을 만들었다.

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

성숙한 지방세포는 역분화를 통해 줄기세포의 풍부한 공급원을 나타낼 수 있으며, 이는 섬유아세포와 같은 세포의 균질한 집단으로 이어집니다. 콜라겐분해효소 소화는 인간 지방에서 성숙한 지방세포를 분리하는 데 사용됩니다. 우리 프로토콜의 목표는 인간의 성숙한 지방 세포에서 다분화능, 역분화된 지방 세포를 얻는 것입니다.

천장 문화 성숙한 지방 세포의 탈분화를 통해 인간 된 지방 줄기 세포의 생성

흰색 adipose 조직 (WAT) 약물 개발 및 대사 연구를 방해, 그것의 현재 기본 문화 모델에 중요 한 결함을 있다. 여기, 선물이 stromal 세포 시트 사이 붙여 와트에 의해 많은 microphysiological 시스템을 생산 하는 프로토콜. 이 구조는 기본 와트 문화에 대 한 안정적이 고 융통성 있는 플랫폼을 제공합니다.

인간 지방 Microphysiologic 플랫폼: 백색 지방 조직에 끼여

The aim of this method is to obtain fibroblast-derived 3D matrices as a natural scaffold for subsequent cellular assays. 섬유아세포는 전처리된 배양판에 씨를 뿌리고 매트릭스 생성을 위한 아스코르브산으로 자극된다. 행렬은 탈세포화되고 관련 세포(예를 들어, 내피 세포)를 배양하도록 차단된다.

섬유 아세포 유래 3D 매트릭스 시스템은 내피 튜브 형성 분석에 적용

막 성숙한 지방세포 골재 배양(MAAC)은 성숙한 인간 지방세포배양하는 새로운 방법이다. 여기서 우리는 인간의 지방에서 지방세포를 분리하는 방법과 MAAC를 설정하는 방법을 자세히 설명합니다.

인간 성숙한 지방세포의 고립과 문화는 막 성숙한 지방 세포 골재 배양 (MAAC)를 사용하여

여기에 제시된 것은 단백질과 마이크로 RNA 발현을 조절하기 위해 성숙한 아디포사이클로 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA 모방(miRs), 또는 항마이크로RNA(anti-miR)와 같은 올리고뉴클레오티드를 전달하는 프로토콜이다.

아디포세포 기능에 대한 단백질 및 마이크로 RNA 변조의 영향을 연구하는 세포 배양 모델

여기에서는 인간 피하 지방 조직(hSATMVECs)에서 미세혈관 내피 세포를 분리, 배양 및 표현형으로 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 hSATMVEC-지방 세포 누화의 실험 모델을 설명합니다.

인간 피하 지방 조직에서 지방 내피 세포/지방 세포 누화 연구

이 프로토콜은 메타크릴화 젤라틴(GelMA) 하이드로겔에 박힌 인간 골세포를 이용해 탈세포화된 세포외기질을 보충하여 3D 골 구조물을 제작하는 과정을 설명합니다. 이 방법은 저비용, 확장 가능, 기본 실험실 장비와 호환되어 근골격계 질환 과정을 연구할 수 있는 번역 플랫폼을 제공합니다.

인간 골격계와 탈세포화된 세포외기질을 이용한 근골격계 질환 모델링을 위한 3D 골배양 플랫폼

체외 이식 모델을 사용하여, 저지방 쥐의 내장 백색 지방 조직의 앞부분 일부를 7일에서 10일간 배양하여, 고지방 식이 섭취 중 지방 조직 염증을 유도하고 연구할 수 있게 합니다.

고지방 식이와 유사한 지방 조직 염증을 위한 체외 마우스 모델

우리는 세포 - 세포 상호 작용의 차이를 수치 3D 조직 같은 spheroids 및 잠재적인 응용 프로그램을 생성하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다.

3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

배우세요 인간 3D 세포외 매트릭스-지방세포 배양 모델을 이용한 지방조직 대사 연구 방법을. 이 기법은 세포외 매트릭스와 지방세포 간 상호작용을 분석하여 제2형 당뇨병 연구에 활용됩니다.

매트릭스 세포 대사 크로스토크 연구를 위한 인간 3D 세포외 세포외 매트릭스-세포세포 배양 모델

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