Name: 쥐의 경내 합성 단백질의 정량적 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 배우세요 쥐 모델에서 뇌척수액과 혈액 수집을 통한 경내 단백질 합성 정량 측정법입니다. 이 프로토콜은 혈뇌장벽 기능 평가와 신경질환 연구에 필수적인 방법론을 제공합니다.

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저자는 비교 의학 및 연구 센터의 직원에게 감사 (CCMR) 이러한 연구에 사용되는 마우스의 그들의 전문가 치료에 대한 다트머스에서. 보른스타인 연구 기금은 이 연구에 자금을 지원했습니다.

모든 동물 작업은 다트머스의 가이젤 의과 대학에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인 된 프로토콜을 활용합니다.
1. 유체의 컬렉션
참고: 세럼과 CSF가 모두 필요합니다. 생존과 부검을 위해 각 유체 수집에 대한 두 개의 프로토콜이 필요합니다.
<ol><li>생존 절차를 이용한 세럼 및 CSF 수집 참고: 생존 유체 수집의 경우, 혈청 수집은 덜 침습적 인 절차이기 때문에 CSF 수집보다 선행되어야합니다. CSF는 혈청 추첨 후 1 주일 이내에 얻어야합니다.<ol><li>혈청 수집을위한 복고풍 궤도 출혈 절차. 참고 :이 절차는 마우스14의생존 출혈을위한 것입니다. 설명된 절차는 마우스의 모든 연령, 성별 및 균주에 적용됩니다. IACUC 규칙은 체중의 1 %의 최대 혈액 부피가 단일 혈액 무승부로 제거 될 수 있음을 규정하기 때문에, 절차는 15g 이상의 무게 마우스에서만 수행되는 것이 좋습니다.<ol>
<li>마우스가 포함된 케이지를 랙에서 적절한 작업 영역으로 이동합니다. 산소 유량계를 1L/min으로 켜서 마취 가스 기계를 준비합니다.</li>
			<li>동물을 유도 챔버에 넣고 뚜껑을 단단히 닫습니다. 이소플루란 기화기를 3.5%로 켜고 동물이 재발할 때까지 모니터링합니다.</li>
			<li>챔버에서 동물을 제거하고 페달 반사, 즉 단단한 풋 패드 핀치로 마취 수준을 평가하십시오. 절차를 수행하기 전에 마취의 적절한 깊이를 확인 : 회사 핀치에 대한 응답의 부족은 적절한 마취를 나타냅니다.</li>
			<li>비 지배적 인 손의 엄지 와 검지 손가락으로 귀 뒤의 느슨한 피부를 잡고 마취 된 마우스를 억제하십시오. 검지 손가락을 사용하여 눈 위와 엄지 손가락 위에 피부를 다시 그려 눈 아래 피부를 다시 그립니다.</li>
			<li>파운더 피펫 끝을 안구 아래 의 안구 소켓에 놓습니다(그림1,왼쪽 패널) 팁을 눈 소켓 의 중간쪽으로 약 45°로 향합니다(그림1,오른쪽 패널). 전진 통로 동안 손가락 사이에 파이펫을 회전시. 부드러운 압력을 가한 다음 혈액이 파이펫에 들어갈 때까지 풀어 놓습니다. 참고: 이 위치에서 한 번에 배출될 수 있는 최대 혈액량은 체중의 약 1%(예: 20g 마우스에서 0.2 mL)입니다.</li>
			<li>모세관을 부드럽게 제거하여 눈의 부상을 방지하고 수집된 혈액을 1.5mL 원심분리기 튜브에 넣습니다. 눈꺼풀을 닫고 추가 출혈을 방지하기 위해 거즈로 가벼운 압력을 가합니다. 일단 완전히 경고하고 모바일 (일반적으로 3-5 분), 그 보유 케이지에 마우스를 반환합니다.</li>
			<li>실온(RT)에서 30-60분 동안 혈액을 응고한 다음, 4°C 냉장 원심분리기에서 2,000 x g에서 10분 동안 혈액을 원심분리합니다. 깨끗한 파이펫 기술을 사용하여, 새로운에 세럼을 수집, 라벨 0.5 mL 바이알. -80 °C에서 혈청 의 바이알을 즉시 동결.</li>
		</ol></li>
		<li>생존 절차가 있는 CSF 수집 참고 : 이 절차는 생존 수술을위한 것이며, 2008 년 Liu와 Duff가 발표 한 프로토콜을 기반으로합니다.15. 마우스는 케타민 (20 mg/mL), 자일라진 (0.5 mg/mL), 그리고 아세프로마진 (0.5 mg/mL) 칵테일에 의해 마취된다.<ol><li>랙에서 마우스가 들어있는 케이지를 지정된 수술 작업 영역으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮 멸균 환경에서 수술 공간을 준비합니다. 사용되는 모든 기기와 재료가 수술 전에 멸균되었는지 확인하십시오.</li>
			<li>마우스를 계량하고 필요한 마취 부피 (20g 마우스의 경우 0.1 mL의 마취 칵테일)를 계산합니다. 복강 내 마취주사 16. 몇 분 후, 적절한 마취를 보장하기 위해 풋 패드를 꼬집어 마우스를 테스트합니다. 더 많은 마취제가 필요한 경우, 마취 칵테일0.01-0.03 mL을 추가로 주입하십시오.</li>
			<li>가위 나 면도기를 사용하여 머리의 작은 부분, 꼬리 끝, 두개골의 내측을 면도하여 CSF 컬렉션을위한 충분한 작업 영역을 노출하십시오. 마우스를 입체적 기기의 취약한 위치에 놓고 이어바(그림2A)를사용하여 머리를 안정시다. 참고: 마우스는 머리가 몸체와 거의 135° 각도를 형성할 수 있도록 배치됩니다(그림2A). 동물이 배치되면 수술 부위에서 멸균 장을 유지하기 위해 수술 용 드레이프가 사용됩니다. 명확한 접착제 커튼은 동물의 직접적이고 보다 집중적인 시각화를 허용하기 때문에 마우스에서 CSF 수집에 선호됩니다.</li>
			<li>30 % 클로르헨시딘 이과테이트로 수술 부위를 면봉하십시오. 멸균 메스를 사용하여, 시스터나 마그나 위에 근육을 노출하는 occiput에 열등 한 피부의 시상 절개를합니다.</li>
			<li>집게로 무딘 해부에 의해, 피하 조직과 근육을 분리하여 시스터나 마그나를 노출시다(도 2B). 마이크로트랙터를 사용하여 근육을분리(그림 2B)하고시스테르나 마그나 위에 경막 매터 수막층을 노출시다.</li>
			<li>멸균 인산완식염수(PBS)로 부드럽게 세척하여 혈액 오염을 제거합니다. 멸균 면봉으로 듀라 메이더를 건조시키고 30G 바늘로 시스터나 마그나를 덮는 멤브레인을 부드럽게 뚫습니다. CSF를 수집하기 위해 작은 유리 모세관을 신속하고 부드럽게 삽입합니다(도2C). 참고: 두개내 압력은 CSF가 모세관으로 자발적으로 흐르도록합니다(그림 2C). 마우스의 연령 및 크기에 따라, 각 마우스로부터 CSF의 약 5-12 μL이 얻어진다.</li>
			<li>조심스럽게 막에서 모세관을 제거합니다. 폴리에틸렌튜브(재료 표)를통해 튜브를 3 mL 주사기에 연결하고 수집된 CSF를 표지된 0.5 mL 튜브(그림2D)에주입합니다. 얼음에 유리병을 보관하십시오.</li>
			<li>일회용 바늘로 폴리디옥사논의 봉합사(PDS)를 사용하고 매장된봉합사(17)를사용하여 절개를 닫습니다. 말린 혈액이나 조직의 부위를 청소하십시오.</li>
			<li>진통제 처리로 buprenorphine 염산염의 0.05−0.1 mg/kg를 가진 마우스, 피하 또는 복강 내16를주입하십시오. 또한 탈수를 방지하기 위해 멸균 식염수 1 mL를 피하주사하십시오.</li>
			<li>회복을 위해 깨끗하고 따뜻한 케이지에 마우스를 다시 놓습니다. 마우스가 이동하여 음식과 물에 닿을 수 있게 되면 케이지를 랙에 다시 놓습니다.</li>
			<li>4°C 냉장 원심분리기에서 1,000 x g에서 10분 동안 원심분리기 CSF. 육안의 식별과 튜브 의 바닥에 붉은 펠릿의 존재에 대한 육안 검사에 의해 혈액 오염의 정도를 확인합니다. 혈액에 오염된 샘플을 버리십시오. 참고: 혈액 오염된 견본에 있는 CSF 단백질 양의 보정을 위해 이용된 공식은 CSF와 혈청, 헤마토크릿 (HCT) 및 적혈구 (RBC) 카운트에 있는 단백질 함량을 포함하는 방정식 매개변수를 기초로 합니다 CSF 및 혈액18. 그러나 이러한 보정 전략은 소량으로 인해 마우스 CSF 시편에 쉽게 적용할 수 없으므로 교정 전략을 육안으로 제한할 수 있습니다.</li>
			<li>깨끗한 파이펫 기술을 사용하여 CSF를 새로운 0.2 mL 튜브로 수집하고 펠릿을 세포로 남겨 둡습니다. 에어로졸로 인한 체적 손실을 줄이기 위해 PBS로 CSF 1:3을 희석하십시오. CSF의 바이알을 -80°C에서 즉시 동결시.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>비 생존 절차를 이용한 혈청 및 CSF 수집 참고: 생존이 아닌 유체 수집의 경우, CSF 컬렉션은 마우스에 펄스가 있어야 하므로 혈청 수집보다 먼저 합니다.<ol>
<li>부검에서 CSF 컬렉션 참고 : 이 절차는 비 생존 수술을위한 것이며, CSF의 약 10-20 μL은 각 마우스에서 얻어진다. 멸균 수술장은 권장되지만, 비생존 수술에는 필요하지 않습니다.<ol>
<li>랙에서 마우스가 들어있는 케이지를 편안한 작업 공간으로 옮습니다. CSF 컬렉션의 경우 1.1.2.2-1.1.2.7 단계 및 1.1.2.11-1.1.2.12 단계를 따릅니다. 세럼 수집을 위해 섹션 1.2.2로 진행하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>심장 내 천자를 통한 혈액 채취 (개방 접근법) 참고: 예상되는 혈액 량은 체중의 약 3%(예: 20g 마우스에서 0.6 mL)입니다.<ol>
<li>CSF 컬렉션을 따라 마우스가 풋패드를 꼬집어 충분히 마취되었는지 확인합니다. 어떤 반응이 관찰되면, 마취제의 두 번째 복용량을 투여하십시오. 반응이 관찰되지 않으면 계속진행하십시오.</li>
			<li>동물을 등에 놓고 70%의 알코올로 복부에 피부를 면봉합니다. 외과 용 가위로 흉강을 열고 심장을 노출시면됩니다. 좌심실에 25G 바늘(3 mL 주사기 부착)을 삽입하고 주사기 플런저에 음압을 부드럽게 가합니다. 혈액이 수집 된 후 바늘을 철회.</li>
			<li>동물이 죽임을 보장하기 위해 참수 또는 자궁 경부 탈구와 같은 안락사의 보조 방법을 수행합니다.</li>
			<li>주사기의 플런저를 아래로 밀어 넣고 수집된 혈액을 1.5 mL 바이알에 주입합니다. RT에서 30-60 분 동안 혈액을 응고 한 다음 4 °C 냉장 원심 분리기에서 2,000 x g에서 10 분 동안 원심 분리합니다.</li>
			<li>깨끗한 파이펫 기술을 사용하여, 새로운에 세럼을 수집, 라벨 0.5 mL 바이알. -80 °C 냉동고에서 혈청 의 바이알을 즉시 동결.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. 단백질 분석
<ol><li>바람직한 방법, 예를 들어, 루미넥스 기술을 사용하여, 일치하는 혈청 및 CSF 시편에서 표적 단백질(들) 및 알부민을 정량화한다. 참고: 여기서, Luminex 자기 기술로 주어진 예는, 그러나 효소 연결된 면역 흡착 분석 (ELISAs)를 포함하여 단백질 양을 측정하는 거의 모든 기술은, 현재 프로토콜에 적용될 수 있습니다. 이상적으로, CSF와 혈청 샘플은 동일한 플랫폼에서 알부민과 표적 단백질 모두에 대해 실행됩니다. 분석 조건은 항원 비드 커플링 농도, 혈청 및 CSF 샘플 희석, 각 분석물에 가장 적합한 표준 곡선 및 비특이적 반응성을 줄이기 위한 완충 조성과 같은 프로토콜의 중요한 단계에 최적화되어야 합니다. 상용 키트가 단백질 측정에 사용되는 경우, 예를 들어, 면역 글로불린 이소티핑 키트(재료 표)에 제시된 데이터를 얻는 데 사용됩니다.그림 3제조업체의 지침을 따라야 합니다.<ol><li>해동 시 및 분석 전에 원심 분리기 CSF 및 혈청 샘플(10분 동안 2,000 x g)을 사용하고 상판을 사용하여 필터 플레이트 및/또는 프로브의 막힘을 방지합니다. 적절한 샘플 희석을 위해 키트와 함께 제공된 분석 절차를 따르십시오. 그렇지 않으면 각 검사결과 및 유체에 대한 적절한 희석을 결정합니다. 그에 따라 PBS에서 샘플을 희석. 참고: 특정 지침이나 지침이 없는 경우, 각 측정기와 유체에 대한 희석은 연구 테스트 전에 가장 많이 속하는 농도 추정치를 얻는 데 필요한 적절한 희석 범위를 결정하여 확립되어야 합니다. 표준 곡선의 신뢰할 수 있는 범위. 분석할 생물학적 시료의 특성을 알면, 예를 들어 유체의 생리학적 및 병리학적 농도는 낮은, 중간 및 높은 분석물 함량의 샘플로 다른 희석을 시도할 수 있습니다. 시료의 예상 농도 범위가 선험적이라고 알려진 경우, 선택한 표준 곡선 범위 내에 있기 위해 샘플을 희석해야 하는 횟수를 계산한 후 희석을 선택할 수 있습니다. 주의: 희석 계수계산을 통해 CSF가 이미 희석된 경우 1:3을 기억하십시오.</li>
		<li>도 3에서데이터를 생성하는데 사용되는 바와 같이 관심 있는 각 단백질, 예를 들어, 알부민 및 IgG에 대한 표준 곡선을 준비하여, 직렬 희석 기준 표준 단백질에 의해. 표준 곡선을 준비하는 동안 다음 희석을하기 전에 각 높은 농도를 철저히 혼합하십시오. 참고: 선택된 정량화 방법에 관계없이, 시료에서 단백질(들) 농도를 추정하기 위해 분석이 수행될 때마다 표준 곡선을 포함하는 것이 필수적입니다. 기준 표준에 대한 최선의 선택은 관심 있는 단백질의 정제, 공지 농도이다. 표준 곡선을 정의하는 데 사용되는 데이터 포인트 및 복제수뿐만 아니라 특정 희석을 결정하는 것은 표준 곡선의 비선형도 정도에 따라 달라집니다.</li>
		<li>적절한 항체 결합 자기 비드 세트를 선택한다(재료표). 구슬의 개별 유리병에 대해, 1 분 동안 30 s와 소용돌이에 대한 각 바이알을 초음파 처리. 분석 / 세척 버퍼 (PBS, 1 % 소 혈청 알부민 [BSA])에서 각 세트 / μL의 최종 농도로 비드 주식을 희석하여 "작업 구슬 혼합물"을 준비하십시오. 혼합 된 구슬의 50 μL을 평평한 바닥 96 웰 플레이트(재료 표)에각 우물에 추가합니다. 주의: 형광 비드는 빛에 민감합니다. 따라서 절차 전반에 걸쳐 빛에 장시간 노출되지 않도록 보호해야합니다.</li>
		<li>잘 지도 워크시트에 배경, 표준 및 샘플의 배치를 다이어그램으로 가져옵니다.</li>
		<li>각 배경에 50 μL의 분석/세척 버퍼를 추가하고 각 표준의 50 μL을 표준 곡선의 웰에 추가합니다. 각 희석된 시료의 50 mL를 적절한 우물에 적재하십시오. 호일로 접시를 감싸고 RT에서 30 분 동안 플레이트 셰이커에 교반 (~ 800 rpm)으로 배양하십시오.</li>
		<li>접시를 핸드헬드자석(재료 표)에놓고 자석에 60년대동안 자석을 놓아 마그네틱 비드를 완벽하게 설정합니다. 잔류 액체를 제거하기 위해 흡수 패드에 플레이트와 탭 플레이트를 부드럽게 디캔팅하여 잘 내용물을 제거합니다.</li>
		<li>자석에서 제거하여 플레이트를 세척하고, 분석/세척 버퍼 200μl을 추가하고, ~30s를 흔들어 서, 마지막으로 자석에 다시 부착하여 플레이트를 세척합니다. 3회 세탁을 반복합니다.</li>
		<li>단백질 숙주 종에 대해 제기된 생체측검출 항체, 즉 비오틴 표지 항체를 분석/세척 완충액에서 4 μg/mL로 희석한다. 각 우물에 희석 검출 항체의 50 μL을 추가합니다. 접시를 덮고 ~ 800 rpm에서 플레이트 셰이커에 RT에서 30 분 동안 배양하십시오. 자석에 접시를 놓고 2.1.6 및 2.1.7 단계를 반복합니다.</li>
		<li>희석 피코에리트린 (PE)-컨쥬게이트 스트렙타비딘 (SAPE) 에 4 μg / mL 분석 / 세척 버퍼. 희석된 SAPE 50 μL을 각 우물에 넣으세요. 접시를 덮고 ~ 800 rpm에서 플레이트 셰이커에 RT에서 30 분 동안 배양하십시오. 자석에 접시를 놓고 2.1.6 및 2.1.7 단계를 반복합니다.</li>
		<li>자석에서 플레이트를 제거하고 분석 / 세척 버퍼의 100 μL에서 구슬을 다시 일시 중단하십시오. PE 형광 강도(FI)의 크기를 감지할 수 있는 이중 레이저 유동 계 측탐지 기기로 웰을 판독합니다. 참고: 생성된 신호는 비드의 표면에 부착된 표적 항원의 양에 비례한다.</li>
		<li>원시 데이터를 내보내고 표준 단백질 농도대비 검출 신호 FI를 그래프로 표시하여 표준 곡선을 생성합니다. 표준 곡선을 사용하여 샘플에서 의 aalyte(들)의 농도를 계산합니다. 참고: 알부민은 g/dL로 우선적으로 발현되며, 관심 있는 단백질은 mg/dL로 우선적으로 발현됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 인트라테칼 인덱스 계산
<ol><li>단백질 농도 값을 스프레드시트로 구성하고 다음 수식을 적용하여 결과를 분석합니다.</li>
	<li>Q알부민계산 : <img alt="알부민 지수 방정식, Q_albumin 공식, CSF 및 혈청 알부민 수치 관계." src="/files/ftp_upload/60495/60495eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> CSF알부민과 세럼알부민은 각각 일치하는 세럼과 CSF 표본에서 알부민의 농도입니다.</li>
	<li>Q단백질계산 : <img alt="단백질 농도 비율 방정식Q_protein=(CSF_protein/Serum_protein), 생화학적 분석." src="/files/ftp_upload/60495/60495eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> 여기서 CSF단백질과 혈청단백질은 각각 일치하는 혈청 및 CSF 견본에 있는 표적 단백질의 사격량입니다.</li>
	<li>단백질 지수 계산: <img alt="단백질 지수 공식, 방정식, Q_protein/Q_albumin, 생화학적 분석." src="/files/ftp_upload/60495/60495eq3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3">
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

증가된 CSF 단백질 농도의 평가를 위한 정량적 방법은 CNS의 생리적 및 병리학적 상태의 특성화에 유용한 도구이다. 그러나, CSF 단백질 수준의 신뢰할 수 있는 정량화를 넘어, CSF 단백질의 검출은 CSF에서 혈액과 CNS 유래 분획을 구별하는 결과의 발현을 필요로 한다. 그러나, 현재까지, 일반적으로 사용되는 단백질 정량 화 분석제는 높은 처리량 공구의 도움으로조차, 2개의 단백질 분대 사이 차별을 허용하지 않습니다. 따라서, CNS 구획 내에서 합성된 단백질과 혈액으로부터 유래된 단백질을 구별하기 위해 단백질 측정에 대한 특이적 교정이 제안되었다. 이러한 교정은 혈청 농도와 장벽 무결성 모두에서 개별적인 가변성을 보상합니다. 전반적으로, 이러한 교정은 CSF/혈청 지수(Q단백질)의계산을 기반으로 하며, 이는 혈청 단백질의 개별 농도의 차이로 인한 변동성을 감소시킵니다. 배리어 기능에서의 개별적인 차이와 관련된 Q단백질의 변이는 CsF/혈청 알부민 지수(Q알부민)에</sub...

뇌척수액(CSF)은 뇌와 척수를 둘러싼 맑고 무색의 액체로 임상적이고 기본적인 과학적 중요성을 지니고 있습니다. CSF는 중추 신경계 (CNS)의 전해 환경을 보존하고, 전신 산 염기 상태의 균형을 맞추고, 신경 세포 및 신경 교세포 세포에 영양분을 공급하고, CNS를 위한 림프계로서의 기능을 공급하고, 호르몬, 신경 전달 물질, 사이토카인 및 기타 신경 펩타이드를 CNS1전반에 걸쳐 수송합니다. 따라서, CSF 조성물은 CNS의 활성을 반영함에 따라, 이 유체는 CNS의 생리적 및 병리학적 상태를 특성화하기 위해 간접적이지만 귀중한 접근을 제공한다.
CSF는 백 년 이상 동안 CNS에 영향을 미치는 조건을 진단하기 위하여 이용되었습니다, 그리고 이 시간의 대부분을 위해, 진단 공구로 임상의에 의해 1 차적으로 공부되었습니다. 그러나, 최근 몇 년 동안 신경 생물학자는 CNS의 병리생리학을 공부하기위한 CSF의 잠재력을 인식했습니다. 특히, 신경과학 분야에서 는 여러 고처리량 단백질 분석 도구가 도입되어 CSF의 단백질 조성에 대한 상세한 연구를 가능하게 되었으며, 이러한 분석이 동적 변화에 대한 통찰력을 제공하는 데 도움이 될 수 있다는 기대를 가지고 있습니다. CNS 내에서 발생합니다.
Luminex 및 Simoa 기술2,3과같은 멀티플렉스 면역 분석 기술의 기술 개발은 오늘날 연구원들에게 매우 낮은 농도에서 수백 개의 단백질을 검출 할 수있는 능력을 제공합니다. 더욱이, 이러한 기술은 작은 샘플 부피를 사용하여, 따라서 CSF의 제한된 샘플 볼륨이 최근까지 유체의 상세한 특성화를 배제한 마우스를 포함한 작은 동물에 대한 연구를 촉진합니다.
그럼에도 불구 하 고, 한 가지 주의할 점은 CSF에서 측정 된 단백질 손상 된 혈액-뇌 인터페이스 (BBI)로 인해 혈 청에서 경막 합성 및/또는 transudation에서 파생 될 수 있습니다. 불행히도, CSF의 단백질 분석만으로는 이 두 성분의 합만을 결정할 수 있다. 트랜스페더와 신경계 생산 단백질을 구별하기 위해 사용 가능한 단백질 분석 도구를 사용하는 CSF 단백질 측정은 혈청 농도의 개별 적인 가변성과 장벽 무결성에 맞게 조정되어야 합니다. 그러나, 이러한 조정은 임상 실습에서 일반적으로 사용되지만, 예를 들어, CSF IgG 지수는 경막 내 IgG 합성4,5,6을검출하기 위한 높은 민감도를 가지며, 현재까지 극소수의 연구 연구가 혈청 농도 및 장벽 무결성에 대한 CSF 단백질 농도를 보정한7,8.
현재, Reibergram 접근은 단백질의 장벽 기능 그리고 intrathecal 합성을 결정하는 가장 좋은 방법입니다. 이는 CSF/혈청 지수 다이어그램에서 그래픽 평가로서, 통합된 방식으로, 장벽(dys) 기능 과 경내 단백질 합성을 모두 분석하며, 독점적으로 혈액 유래 단백질9,10을지칭한다. 고농축 단백질 알부민은 일반적으로 간에서만 생산되기 때문에 기준 단백질로 선택되며 그 크기는 약 70 kDa이며, 작고 큰 단백질11사이의 중간기이기 때문이다. 분석 도면은 1987년 라이버와 펠겐하우어에 의해 처음 정의된 면역글로불린(Igs)11의주요 클래스에 대해, 수천 개의 인간 샘플의 분석으로부터 얻은 결과에 기초하여 경험적으로9. 이 접근법은 분자확산/유량(12)의이론에서 두 픽의 확산 법칙의 적용에 의해 이후에 확인되었다. 이러한 이론은 장벽을 통한 단백질의 확산을 입증하고 과장분포를 가지며 CNS9,13에서단백질의 역학을 정량적으로 설명할 수 있다. 전반적으로, 경막 내 단백질 합성을 입증하기 위한 Reibergram을 사용하는 이점은 혈청에서 CSF에 들어가는 단백질 분획뿐만 아니라 국소 생산으로 인해 CSF에서 발견되는 단백질의 양을 동시에 식별한다는 것입니다.
본 기사 및 관련 프로토콜은 CSF 및 혈액 채취에서 부터 CSF 단백질 수준을 교정하는 최종 계산에 이르기까지, 신경학상 마우스 모델에서 의학적 단백질 합성의 정량적 측정에 대한 전체 절차를 설명합니다. 장애. 이 절차는 (1) 임의의 CSF 단백질의 병리생리학적 기원및 (2) 장벽 무결성의 안정성 및 기능적 중요성을 평가하는 기준을 제공한다. 이 절차 및 프로토콜은 마우스 CSF 샘플을 평가하는 데 유용할 뿐만 아니라 신경 질환 및 인간 환자의 다양한 동물 모델에서 CSF를 분석하는 데에도 유용합니다.

<table><tbody><tr><td>1mL 인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>1mL 주사기</td><td>BD</td><td>329622</td><td></td></tr><tr><td>25 게이지 바늘</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 주사기</td><td>BD</td><td>309582</td><td></td></tr><tr><td>30 게이지 인슐린 바늘</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>흡수 패드</td><td>적합한 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPlex 휴대용 자기 세척기</td><td>BioRad</td><td>171020100</td><td>자석</td></tr><tr><td>BioPlex MAGPIX 멀티플렉스 리더</td><td>BioRad</td><td>171015001</td><td></td></tr><tr><td>BioPlex Pro Flat Bottom Plates</td><td>BioRad</td><td>171025001</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilated 검출 항체</td><td>적절한 출처</td><td></td><td>항체는 다음 종에 대해 지시되어야 합니다. 관심 단백질.</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀 염산염</td><td>PAR 제약</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>모세관</td><td>셔터 기기</td><td>B100-75-10</td><td>OD: 1.0mm, ID: 0.75mm 붕규산 유리 10cm; ID를 더 작게 만들기 위해 분젠 위로 그려졌습니다.</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브, 0.2 mL</td><td>VWR</td><td>20170-012</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브, 0.5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브, 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>클로르헥시딘 디아세테이</td>트 <td>Nolvasan</td><td>E004272</td><td></td></tr><tr><td>일회용 피펫 팁</td><td>적합한 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이어바</td><td>KOPF Instruments</td><td>1921 또는 1922</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Kopter</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>냉동고</td><td>VWR</td><td>VWR32086A</td><td></td></tr><tr><td>거즈</td><td>Medline</td><td>NON25212</td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Sunbeam</td><td></td><td>XL 킹 사이즈 SoftTouch, 자동 꺼짐으로 4 가지 열 설정, 청록색, 12 인치 x 24 인치</td></tr><tr><td>유도 챔버</td><td>VETEQUIP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td>NDC 14043-704-06</td><td></td></tr><tr><td>케타민(KetaVed)</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagPlex 마이크로스피어(항체 결합)</td><td>BioRad</td><td></td><td>항체 결합 마그네틱 비드</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 쉐이커</td><td>Southwest Scientific</td><td>SBT1500</td><td></td></tr><tr><td>마이크로리트랙터</td><td>Carfill Quality</td><td>ACD-010</td><td>Blunt - 1 mm</td></tr><tr><td>Microsoft Office (Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MilliPlex MAP 마우스 면역글로불린 이소타이징 마그네틱 비드 패널</td><td>EMD Millipore</td><td>MGAMMAG-300K</td><td>마우스 체액의 면역글로불린 이소형체 패널 및 하위 분류의 Luminex를 통한 정량화를 위한 상용 키트.</td></tr><tr><td>마우스 알부민 캡처 ELISA 키트</td><td>Novus Biological</td><td>NBP2-60484</td><td>마우스 유체에서 알부민의 ELISA를 통한 정량화를 위한 상용 키트.</td></tr><tr><td>멀티채널 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3125000060</td><td></td></tr><tr><td>비멸균 면봉</td><td>MediChoice</td><td>WOD1002</td><td>멸균을 위해 고압멸균 필요</td></tr><tr><td>산소</td><td>AIRGAS</td><td>OX USPEA</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-678-20A</td> 일회용 바늘이 있는 5 <td>& 3/4"</td></tr><tr><td>PDS 봉합사, 6-0 Prolen</td><td>Patterson Vet</td><td>8695G</td><td>P-3 리버스 커팅, 18"</td></tr><tr><td>PE-Streptavidin</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf</td><td>Research 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>ALLEGRA X-12R</td><td></td></tr><tr><td>스케일</td><td>Uline</td><td>H2716</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>깃털</td><td>EF7281</td><td></td></tr><tr><td>Shaver</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-5204</td><td></td></tr><tr><td>표준 단백질</td><td>적합한 공급원</td><td></td><td>참조 표준물질에 대한 최선의 선택은 관심 단백질의 정제되고 알려진 농도입니다.</td></tr><tr><td>입체 요법 기기</td><td>KOPF Instruments</td><td>Model 900LS</td><td>Standard Accessories</td></tr><tr><td>Sterile 1 x PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>멸균 식염수</td><td>Baxter</td><td>0338-0048-02</td><td>0.9 % 염화나트륨 관개 USP</td></tr><tr><td>수술 겸자 곡선, 7 (2)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td>Dumont</td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>스테인레스 25x</td></tr><tr><td>기화기 + 유량계</td><td>Moduflex 무헤스테시아 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>온난화 패드</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>RT-JR-20</td><td></td></tr><tr><td>수음파기</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-08895-01</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

쥐의 경내 합성 단백질의 정량적 측정

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

뇌척수액(CSF)은 뇌와 척수에서 발견되는 유체로서 기초 과학과 임상 과학 모두에 매우 중요합니다. CSF 단백질 조성물의 분석은 신경 질환뿐만 아니라 기초 신경 과학 연구에서 중요한 정보를 제공합니다. 한 가지 주의해야 할 점은 CSF에서 측정된 단백질은 혈청에서 의한 경막 합성 및 과장 둘 다에서 파생될 수 있으며, CSF의 단백질 분석은 이 두 성분의 합만을 결정할 수 있다는 것입니다. 인간뿐만 아니라 동물 모델에서 단백질 과 단백질 을 생산한 단백질을 구별하기 위해, CSF 단백질 프로파일링 측정은 기존의 단백질 분석 도구를 사용하여 알부민 CSF/혈청 지수(Q알부민),혈액-뇌 인터페이스(BBI) 및 단백질 지수(Q 단백질/Q알부민)의 무결성의 마커인 단백질 의 계산을 포함해야 한다. 이 프로토콜은 CSF 및 혈액 수집에서 지수 및 지수 계산에 이르기까지 신경 장애의 마우스 모델에서 의 단백질 합성 및 BBI 손상의 정량적 측정에 대한 전체 절차를 보여줍니다.

이 대표적인 실험은 다발성 경화증(MS)의 두 가지 임상적으로 관련된 설치류 모델에서 IgG의 경내 합성을 비교하기 위한 것이었다: PLP139-151-유도된재발 실험적 자가면역 뇌척수염(R-EAE) 및 만성 진행성, 테일러의 뮤린 뇌척수염 바이러스 유도 데미엘린 질환.. R-EAE는 재발-송금 MS를 이해하는 데 유용한 모델이지만 TMEV-IDD 모델은 만성 프로그레시브 MS19를특징으로 합니다.
본 연구에서는 R-EAE(n=12) 및 TMEV-IDD(n=28)에서의 경막 내 IgG 합성의 정량적 분석이 수행되었다. 두 그룹 모두 질병의 절정에 분석되었다. 10개의 마우스의 추가 그룹은 샴 처리되었고 연령일치 대조군(cR-EAE n = 4, cTMEV-IDD sham n=6)으로 제공되었다.
시판되는키트(표)를이용한 마그네틱 비드 계 접...

높은 척수액 단백질 수준은 변경된 혈액 뇌 장벽 또는 신분 합성을 통해 혈장 단백질의 확산의 결과일 수 있습니다. 최적화된 테스트 프로토콜은 두 경우를 모두 구별하는 데 도움이 되며 합성된 단백질의 정량적 측정을 제공하는 이 문서에 제시되어 있습니다.

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

이 프로토콜은 CSF 단백질 수준의 정량적 교정에서 CSF 및 혈액 수집이 신경 장애의 마우스 모델에서 단백질 합성으로 측정할 수 있게 합니다. 이 절차는 CSF 단백질의 병리학적 기원이 관심있는 기준을 제공하고, 혈액 CSF호의 안정성 및 기능적 중요성을 평가할 수 있다. 인터테칼 단백질 합성 및 장벽 무결성분석은 다른 동물 모델 및 인간 연구에 적용될 수 있다.예를 들어 중추 신경계의 질병을 확인하십시오. 상당한 양의 깨끗한 CSF를 수집하는 것은 마우스에서 기술적으로 어려울 수 있으므로 오염되지 않은 시료의 대량이 얻을 수 있을 때까지 기술을 연습하는 것이 좋습니다. 절차를 보여주는 것은 우리의 새로운 면역학 연구 단에 있는 다트머스에 있는 실험과 분자 의학에 있는 프로그램에서 대학원 학생인 미셸 린지, 일것입니다.복고풍 궤도 출혈을 통해 혈청 수집. 15그램 이상의 마취 마우스에서 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 엄지손가락과 집게 손가락으로 귀 뒤쪽의 느슨한 피부를 잡고 검지 손가락을 사용하여 눈 위에 피부를 다시 그립니다. 엄지 손가락을 사용하여 눈 아래 피부를 다시 그릴 수 있으며, 약 45도 각도로 유지되는 파스퇴르 파이펫의 끝을 눈알 아래 의안 소켓에 놓고 손가락 사이에 파이펫을 회전시합니다.그런 다음 짧고 부드러운 압력을 가하고 혈액이 파이펫에 들어갈 수 있도록 방출합니다. 혈액 샘플을 채취하면 눈을 손상시키지 않고 모세관을 부드럽게 제거하고 혈액을 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기습니다. 눈꺼풀을 닫은 후, 더 이상의 출혈을 방지하기 위해 거즈로 가벼운 압력을 가하십시오.원심분리에 의해 시료를 아래로 회전하기 전에 실온에서 30-60 분 동안 혈액응고를 허용합니다. 깨끗한 파이펫 기술을 사용하여 분리된 세럼을 500 마이크로리터 바이알로 새 혈청을 수집하고 즉시 섭씨 80도에서 혈청을 동결합니다. 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 마취 마우스의 두개골의 caudal 끝에 즉시 뇌 척수액의 수집을 허용하기 위해 머리의 큰 영역을 제거합니다.멸균 조건하에서 입체 장치에 마우스를 배치하고 이어 바으로 머리를 안정시하십시오. 30%클로르헤시딘이 변조하여 수술 부위를 면봉하고, 시스테나 마그나위에 겹쳐진 근육을 노출시키기 위해 산소에 열등한 시상 피부 절개를 합니다. 집게를 사용하여, 무딘 피하 조직과 근육을 해부하고, 떨어져 심폐 소동 마그나 위에 dura mater 수

quantitative-measurement-of-intrathecally-synthesized-proteins-in-mice

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

AD의 형질 (TG) 마우스 모델을 어떻게 그리고 왜 Aβ 또는 타우 수준 CSF의 변화에​​ 질병이 인간의 환자에서 진행됨에 따라 조사를 위해 좋은 기회를 제공합니다. 여기, 우리는 마우스 시리얼 CSF 샘플링을위한 세련된 cisterna 마그나 찔린 기법을 보여줍니다.

Cisterna 마그나 마우스에서 뇌척수의 직렬 그룹에 대한 기술

이 프로토콜은 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 계량하는 방법 세부 사항. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다.

Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

이 비디오는 특정 시냅스전 단백질의 분포를 정량화하기 위해 마우스 뇌 절편의 면역형광 염색을 보여줍니다. 이 프로세스에는 비특이적 부위를 차단하고, 표적 단백질에 대한 1차 항체와 참조 마커를 적용한 다음, 2차 항체 라벨링 및 핵 counterstaining이 포함됩니다. 참조 마커는 일관된 기준선을 제공하여 정확한 정량화를 보장하며, 공초점 현미경을 사용하여 뇌 영역 전반에 걸쳐 시냅스전 단백질의 분포를 분석합니다.

면역형광을 이용한 쥐 뇌의 시냅스전 단백질 분포 정량화(Quantifying the Distribution of a Presynaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence)

시냅스 가소성과 기억을 제어하는 분자와 경로를 식별하는 것은 여전히 신경 과학의 주요 과제입니다. 여기에서는 청각 학습 패러다임에서 학습 및 기억 통합 중 시냅스의 분자 재편성에 관여하는 것으로 추정되는 시냅스 단백질의 상대적 정량화를 다루는 워크플로우에 대해 설명합니다.

청각 차별 학습 한 후 마우스 뇌 영역의 높은 해상도 양적 시냅틱 프로테옴 프로파일

고체상 추출 및 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법을 기반으로 한 인간 CSF에서Aβ 1-42의 절대 정량화를 위한 참조 측정 절차에 대해 설명합니다.

Aβ의 절대 정량<sub&gt; 1-42</sub&gt; CSF의 질량 분석 참조 측정 절차를 사용하여

우리는 성공적으로 두 기판 전용 γ-secretase 분석 생성 된 있다. 여기에 제시 된 두 세포 기반 분석은 계량 반딧불 luciferase 기자 들의 출력을 통해 γ-secretase 효소 활동 설계 되었습니다.

Γ-Secretase 중재 녹말 체 선구자 단백질 및 세포 기반 Luciferase 기자 시험 플랫폼에 노치 분열의 정량적 측정

단백질 합성은 세포에 대 한 중요 한 생물학적 과정. 뇌에서는 적응 적 변화에 필요합니다. 그대로 뇌에서 단백질 합성의 속도의 측정은 신중한 방법론고려가 필요합니다. 여기에서 우리는 생체 내에서 대뇌 단백질 합성의 국소 비율의 측정을 위한 L-[1-14 C]-류신 정량적 자가 방사선 측정 방법을 제시한다.

생체 내 뇌 단백질 합성의 지역 비율 측정을 위한 정량적 자가 방사선 측정 방법

여기, 우리 면역 형광 염색 법을 사용 하 여 마커 단백질, confocal 현미경 검사 법 및 컴퓨터 기반 분석 시 냅 스 단백질의 분포를 결정 하는 양적 접근 방식을 설명 합니다.

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

이 방법은 단백질 레벨과 다른 조직에서 표준화 된 양적 서쪽 더 럽 히 접근을 사용 하 여 다른 발달 timepoints에서의 비교에 대 한 강력 하 고 재현 가능한 방식을 설명 합니다.

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

이 프로토콜은 설치류 뇌의 다른 세포 구획에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS) 활성을 효율적으로 정량화하도록 설계되었습니다. 사용자는 동일한 동물의 핵, 세포질 및 시냅스 분획에서 작동하는 UPS를 검사하여 이러한 복잡한 분석을 수행하는 데 필요한 동물의 수와 시간을 줄일 수 있습니다.

설치류 뇌의 세포외 유비퀴틴-프로테아솜 활동 정량화

이 연구는 고립된 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용하여 전역 히스톤 변형의 정량화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 작업에는 데이터 수집에 사용된 미세아교세포 격리 프로토콜도 포함되어 있습니다.

분리된 마우스 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용한 글로벌 히스톤 번역 후 변형의 정량화

배우세요 쥐 모델에서 뇌척수액과 혈액 수집을 통한 경내 단백질 합성 정량 측정법입니다. 이 프로토콜은 혈뇌장벽 기능 평가와 신경질환 연구에 필수적인 방법론을 제공합니다.

쥐의 경내 합성 단백질의 정량적 측정

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