Name: 엔터로이드에서 증식 및 죽은 세포의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 배우세요 마우스 회장에서 엔터로이드를 분리하고 유세포 분석으로 증식 및 죽은 세포를 정량화하는 방법을. 이 기술은 약물 및 염증성 사이토카인 효과 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단 (31971062, 31900322, 31600322), 장쑤성 자연 과학 재단 (BK20190043, BK20180838), 제약 생명 공학의 국가 핵심 연구소의 연구 기금, 난징 대학 (KF-GN-202004). 중국 장쑤 고등 교육 기관의 자연 과학 재단 (19KJB320003), 소주 시의 생계 및 기술 프로그램 (SYS2019030), 그리고 장쑤성 대학 졸업생을위한 연구 혁신 프로그램 (KYCX19-1981) . 이 작품은 또한 소차우 대학의 당학장에 의해 지원됩니다.

이 프로토콜은 수코 대학의 케임브리지 수다 게놈 자원 센터 (CAM-SU)의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 장 오르가노이드 분리 및 문화
<ol><li>장 지하실과 장 내 문화의 격리<ol>
<li>CO2 흡입으로 8주된 야생형 마우스를 안락사시. 티슈 집게와 미세 홍채 가위를 사용하여 약 8cm의 장틀을 해부하십시오.</li>
		<li>약 40 mL의 얼음 차가운 덜베코의 인산 완충 식염수 (DPBS)와 함께 주입식 바늘을 사용하여 주사기를 사용하여 씻어 낸 다음 가위로 세로로 자르고 장틀을 엽니다.</li>
		<li>작은 (0.5-1.0 cm) 조각으로 장수를 잘라. 멸균 된 얼음 차가운 DPBS 5 mL에 15 mL 원추형 튜브에 넣고 얼음에 5 분 동안 바위를 놓습니다.</li>
		<li>파이펫 컨트롤러를 사용하여 DPBS를 흡인하고 10mL의 콜드 버퍼 1(DPBS의 2mM EDTA)으로 교체합니다. 얼음에 30 분 동안 바위.</li>
		<li>파이펫 컨트롤러를 사용하여 버퍼 1을 흡인하고 10 mL의 콜드 버퍼 2 (54.9 mM D-소르비톨, DPBS에서 43.4 mM 자당)로 교체하십시오. 손으로 2-3 분 동안 흔들어주세요 (~80 쉐이크 / 분).</li>
		<li>흔들은 후 버퍼 2 내용물의 20 μL 방울을 가지고 현미경으로 검사하십시오.</li>
		<li>70 μm 멸균 셀 스트레이너로 2개의 내용을 필터한 다음 50 mL 원엽 튜브로 여과된 버퍼를 수집합니다.</li>
		<li>파이펫 20 μL의 여과액을 슬라이드 상에 토굴을 계산한다. 1.1.7 단계에서 충분한 양의 버퍼 2를 전송하여 ~ 500 개의 토굴 /well이 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>4 °C에서 10 분 동안 150 x g에서 아래로 돌입니다. 회전이 끝나면 상월체를 조심스럽게 흡인하십시오.</li>
		<li>지하실 멤브레인 매트릭스(예: 500개 토굴당)의 50 μL(예: Matrigel)에서 토굴을 일시 중단하고, 파이펫을 위아래로(기포를 피하기 위해 조심하다) 한 웰 플레이트의 중앙에 50 μL 의 액적을 놓습니다. 지하 멤브레인 매트릭스를 중합하기 위해 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>중합 30 분 후, 조심스럽게 미니 구트 매체의 600 μL을 추가 (고급 덜베코의 수정 독수리 매체 [DMEM]/F12, 2 mM L-알라닌 - L-글루타민, 펜 / 스트렙 [100 단위 / mL], 10 mM 헤페, N2 보충 [1:100], B27 보충 [1:50] 표피 성장 인자 [EGF; 50 ng/mL], 노긴 [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], 및 Y27632 [10μM]) 각각의 잘, 다음 Cc에 반환. 매일 현미경으로 관찰하고 2-3 일마다 미디어를 변경하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>엔터로이드 패시징 참고 : 긴 문화의 경우, 엔터로이드는 거의 매주 분할해야합니다.<ol>
<li>엔터로이드를 통과하려면 조직 배양판을 얼음 위에 놓습니다. 미디어를 흡인하고 각 우물에 1 mL의 차가운 DPBS를 추가합니다. P1000 팁을 사용하여 단단한 지하 멤브레인 매트릭스 덩어리가 남아 있지 않은 때까지 위아래로 파이펫을 피펫으로 만드실 수 있습니다.</li>
		<li>1 mL 인슐린 주사기 (27 G)를 통해 15 mL 원엽 튜브로 한 번 위아래로 전달하십시오. 4 °C에서 150 x g에서 5 분 동안 스핀 다운하십시오.</li>
		<li>파이펫을 사용하여 DPBS를 제거합니다. 지하 멤브레인 매트릭스/웰의 50 μL에서 다시 일시 중단하십시오.</li>
		<li>37°C 인큐베이터에 플레이트를 30분 동안 놓고 지하 막 매트릭스가 중합되도록 합니다. ENR 용지(미니구트 매, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin)로 각 웰을 오버레이한 다음 플레이트를 인큐베이터로 되감습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 엔테로이드에서 EdU 양성 세포의 유동 세포 분석
참고: 그림 1은 엔터노이드에서 EdU 양성 세포의 유세포 분석 워크플로우를 보여줍니다.
<ol><li>EdU를 가진 장체의 인큐베이션<ol>
<li>5-7 일 동안 단계 1.2.4에서 엔터로이드를 성장. 1:2의 분할 비율로 새로운 24 웰 플레이트에 통로 엔터로이드. 각 우물에 ENR 배지 600 μL을 추가합니다. 37°C 인큐베이터에서 4-5일 동안 엔터노이드를 인큐베이팅하였다.</li>
		<li>대조군(치료되지 않은 엔터노이드) 및 실험군(5 ng/mL 인터류키친 22[IL-22])으로 처리된 엔터노이드)를 설정한다. 각 그룹에 대해 적어도 세 개의 복제를 준비합니다.</li>
		<li>ENR 배지에 EdU를 첨가하여 50 μM의 농도로 EdU 배지를 준비시다. 600 μL의 EdU 배지를 각 웰에 넣고 37°C 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다. 배경 뺄셈에 대한 부정적인 대조군으로 EdU 처리없이 엔터로이드의 하나의 웰을 설정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>지하 멤브레인 매트릭스에서 엔터로이드 수확<ol>
<li>파이펫 컨트롤러를 사용하여 EdU 매체를 흡인하고 DPBS로 1x를 세척합니다. DPBS 1mL를 추가합니다.</li>
		<li>단단한 지하 멤브레인 매트릭스 덩어리가 남아 있지 않은 때까지 P1000 파이펫 팁과 파이펫을 위아래로 사용하십시오. 15 mL 튜브로 옮기고 300 x g에서 5 분 동안 아래로 돌립니다.</li>
		<li>500 μL의 세포 해리 효소(재료 표)를넣고 37 °C에서 15 분 동안 배양하십시오. P200 파이펫 팁과 파이펫을 위아래로 사용하여 엔터노이드를 단일 셀로 분해합니다.</li>
		<li>10% 태아 소 혈청(FBS)을 함유한 DMEM 배지 3mL를 추가하고 P1000 파이펫 팁으로 반복적으로 파이펫을 추가합니다.</li>
		<li>300 x g에서 5 분 동안 스핀 다운하고 상한 매체를 흡인합니다. DPBS의 1 mL로 셀을 다시 일시 중단합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포의 고정 및 투과<ol>
<li>셀 서스펜션을 1.5 mL 튜브로 옮기고 300 x g에서 5 분 동안 회전시키고 상한을 버립니다.</li>
		<li>4% 파라포름알데히드(PFA)의 1mL로 세포를 다시 일시 중단하고, 실온(RT)에서 15분 동안 고정하고, 300 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다.</li>
		<li>0.5 % 요온 계면 활성제의 1 mL로 세포를 다시 일시 중단하십시오. RT에서 10 분 동안 인큐베이션하십시오.</li>
		<li>300 x g에서 5 분 동안 스핀 다운하고 상한을 흡인합니다. DPBS로 1x를 씻고 스핀다운하여 상류를 제거합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>EdU 검출<ol>
<li>사전에 각 구성 요소에 대한 재고 솔루션을 준비 : 1) 알렉사 플루오 아지드의 작업 솔루션, 2) 1 x EdU 반응 버퍼의 작동 솔루션, 3) EdU 버퍼 첨가제의 10 배 재고 솔루션.</li>
		<li>10x 용액을 탈이온수에서 1:10희석하여 1x EdU 완충첨가제를 준비한다. 이 솔루션을 신선하게 준비합니다.</li>
		<li>표 1에따라 반응 칵테일을 준비한다. 참고: 표에 나열된 순서대로 재료를 추가합니다. 반작용 칵테일을 준비 후 15분 이내에 사용하십시오.</li>
		<li>각 1.5 mL 튜브에 반응 칵테일 100 μL을 추가합니다. 세포를 다시 일시 중단하고 빛으로부터 보호하고 RT에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>300 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 파이펫 팁으로 반응 용액을 부드럽게 흡인합니다.</li>
		<li>각 튜브에 0.5% 난오계면활성제 를 추가하여 RT. Centrifuge에서 1x를 5분 동안 300 x g로 세척하고, 피펫 팁으로 상월제를 부드럽게 흡인하고, DPBS 의 1 mL에서 세포를 다시 일시 중단합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>유세포분석에 의한 세포 분석<ol>
<li>40 μm 스트레이너로 재중단 된 세포를 필터링 한 다음 15 mL 원엽 튜브로 필터링 된 세포를 수집합니다. 가능한 한 빨리 FACS 온머신 탐지를 수행합니다. 참고: 조건이 제한되는 경우, 세포 염색 샘플은 4 °C에서 어둠 속에서 저장하고 3 일 이내에 유동 테스트를 해야합니다.</li>
		<li>유세포 분석 분석을 위해 적절한 채널(EdU 키트의 Alexa Fluor azide 의 유형에 따라 여기, 빨간색 채널) 및 전압(여기~ ~150-350V)을 선택합니다.</li>
		<li>게이팅 전략<ol>
<li>FSC-A(x축) 대 SSC-A(y축) 의사 색 플롯을 그리고 전압을 조정하여 대부분의 셀을 도트 맵의 가시 범위에 분산합니다. 셀 모집단(R1)을 선택하고 왼쪽 하단 모서리에 있는 셀 파편을 제외합니다.</li>
			<li>R1 셀 모집단에서 FSC-A(x축) 대를 설정합니다. FSC-H(y축) 의사색 플롯을 설정하고, 게이트를 설정하여 단일 셀(R2)을 선택하여 셀 덩어리를 배제한다.</li>
			<li>R2 세포 집단에서 형광 강도(x축) 대를 설정합니다. 셀 번호(y축) 플롯을 사용하고 음수 컨트롤을 사용하여 게이트를 설정합니다. 형광 신호의 영역은 양성 세포 영역(R3)이다. 실험군과 대조군 사이의 EdU 양성 세포(R3)의 비율을 비교한다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. 엔테로이드의 PI 양성 세포의 유동 세포 분석
참고: 그림 2는 엔터노이드의 PI 양성 세포의 유세포분석 워크플로우를 보여줍니다.
<ol><li>PI를 가진 장신구세포의 배양<ol>
<li>5-7 일 동안 단계 1.2.4에서 엔터로이드를 성장. 1:2의 분할 비율로 새로운 24 웰 플레이트에 통로 엔터로이드. 각 우물에 ENR 배지 600 μL을 추가합니다. 37°C 인큐베이터에서 4-5일 동안 엔터노이드를 인큐베이팅하였다.</li>
		<li>대조군(미처리) 및 실험군(IL-22 처리)을 설정하고, 각 그룹에 대해 적어도 3개의 복제를 사용한다.</li>
		<li>ENR 배지에 PI를 추가하여 3 μM의 농도로 PI 배지를 준비합니다.</li>
		<li>각 웰에 600 μL의 PI 배지를 넣고 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 배경 뺄셈에 대한 부정적인 대조군으로 PI 처리없이 엔터로이드의 하나의 웰을 설정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.2.1-2.2.5 단계 다음 지하 막 매트릭스에서 엔터로이드를 수확하십시오.</li>
	<li>유세포분석에 의한 세포 분석<ol>
<li>40 μm 스트레이너로 재중단 된 세포를 필터링하고 15 mL 원엽 튜브로 여과 된 세포를 수집합니다.</li>
		<li>가능한 한 빨리 FACS 온머신 탐지를 수행합니다. 참고: 조건이 제한되는 경우, 세포 염색 샘플은 4 °C에서 어둠 속에서 저장하고 3 일 이내에 유동 테스트를 해야합니다.</li>
		<li>유세포분석해석을 위해 적절한 채널(여기, 적색 채널) 및 전압(여기~ ~150-350V)을 선택합니다.</li>
		<li>섹션 2.5.3에 설명된 것과 동일한 게이팅 전략을 사용합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li>
<li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li>
<li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tales+from+the+crypt%3A+new+insights+into+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li>
<li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier%3A+a+fundamental+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li>
<li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094(2019).</li>
<li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li>
<li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜은 유세포측정에 의한 장내 EdU-및 PI 양성 세포의 시험관 내 및 정량화 및 엔테로이드의 배양에 필요한 단계를 상세히 설명한다. 이 전략에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, EdU 라벨링은 장체에서 증식 세포를 검출하는 데 사용됩니다. 기존의 BrdU 분석법에 비해 EdU 라벨링 방법은 더 빠르고 민감하며 더 정확합니다. EdU는 세포 분열 도중 DNA 종합에 있는 티민을 대체하는 티민 (T)와 아주 유사합니다. BrdU 항체에 비해, EdU는 세포 내로 확산하기 쉽고, EdU의 검출은 DNA 변성 및 항원 항체 반응을 필요로 하지 않는다. 둘째, 유세포 분석 분석은 장용체내의 증식(EdU+)및 죽은(PI+) 세포를 신속하고 정확하게 정량화할 수 있다.
전체 절차를 성공적으로 수행하기 위해 고려해야 할 중요한 측면이 있습니다. 첫째, 충분한 조건 하에서 장체를 배양하는 것이 중요하다. 잘 자란 엔터노이드는 증식 세포를 포함하...

장 상피 세포의 기본 기능은 병원성 박테리아 및 독소와 같은 발광 내용물의 진입을 보호하는 것입니다1,2. 이러한 기능을 수행하기 위해, 장줄기세포는 연속적으로 증식하고, 장세포 및 분비세포를 포함한 다양한 상피세포로 분화하며, 이는 단단한 연결을 형성하여 장벽을 형성한다3. 장 상피 세포의 급속한 갱신은 세포 증식, 세포 분화 및 세포 사멸의 엄격한조정을필요로4,5. 감소된 세포 증식 또는 과도한 세포 사멸은 상피 손상 및 손상된 장벽 기능1,6. 장 장벽의 기능 장애는 염증성 장 질환7,8과관련이 있습니다.
장 내 지하실을 배양하는 방법이 이전에 개발되었습니다. 이 기술을 사용하여, 고립 된 마우스 토굴은 구조와 같은 토굴 - 융모를 가지고 모든 장 상피 세포 계보를 포함하는 장 오르가노이드 (enteroids)로 성장,10. 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)은 세포 증식 중에 복제를 받고 있는 DNA에서 티민(T)을 대체할 수 있는 티미딘 유사체이다. 증식 세포는 EdU 염색에 의해 신속하고 정확하게 표지될 수 있다. 프로피듐 요오드화물 (PI)는 이중 가닥 DNA로 삽입시 붉은 형광을 방출하는 에티듐 브로마이드의 유사체입니다. PI는 손상된 세포막을 통해서만 통과하기 때문에 죽은 세포를 구체적으로 감지합니다.
이 프로토콜에서는 먼저 무린 소장으로부터 토굴을 분리한 다음 시험관내 엔터로이드로 배양하는 방법을 설명합니다. 그런 다음 EdU 및 PI 통합 및 유세포 분석에 의한 장신구의 증식 및 죽은 세포를 분석하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>15 ml 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 G gavage needle</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>40 mm sterile cell strainer</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원심분리기 tube</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>70 mm sterile cell strainer</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>고급 DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT 음향 집속 유세포분석기</td><td>Invitrogen</td><td>A24863</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>GIBCO</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Buffer 1</td><td></td><td></td><td>DPBS Buffer 2</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>의 2 <td>mM EDTA 54.9 mM D-sorbitol, DPBS</td>C57/B6</tr><tr><td>마우스</td><td>의 43.4 mM 자당난징 대학교 난징 생물</td><td></td><td></td>의학 연구소</tr><tr><td>세포 해리 효소(TrypLE)</td><td>Life technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td><td>Life 과학 기술</td><td>C10639</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr> 14190144 <tr><td>D-소르비톨</td><td>BBI</td><td>SB0491</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BBI</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>ENR 배지</td><td></td><td></td><td>미니거트 배지, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>미세 홍채 가위</td><td>Tansoole</td><td>2037454</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>생명 기술</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>HDMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Minigut 배지</td><td></td><td></td><td>Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>R& D</td><td>AR009</td><td></td></tr><tr><td>비이온 성 계면 활성제 (Triton X)</td><td>BBI</td><td>TB0198-500ML</td><td></td></tr><tr><td>작동 가위 (12.5cm)</td><td>Tansoole</td><td>2025785</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드 (PFA)</td> <td>시그마</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>Penn / Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>위상차 현미경</td><td>Nikon</td><td>TS1000</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물</td><td>시그마</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>재조합 EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 R-Spondin 1</td><td>R& D</td><td>3474-RS-050</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 IL-22</td><td>PeproTech</td><td>210-22-10</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td></td><td>BBI SB0498</td><td></td></tr><tr><td>조직 겸</td>자 <td>Tansoole</td><td>2026704</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 2HC1</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

엔터로이드에서 증식 및 죽은 세포의 정량화

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

장 상피는 병원성 미생물및 독소와 같은 발광 체질이 신체의 나머지 부분으로 들어가는 것을 방지하는 장벽 역할을합니다. 상피 장벽 기능은 장 상피 세포의 무결성을 필요로한다. 상피 세포 증식 장벽을 형성 하는 세포의 지속적인 층을 유지 하는 동안, 상피 손상 장벽 기능 장애에 이르게. 그 결과, 발광 내용물제한없는 통로를 통해 장 장벽을 가로 질러 수 있습니다. 장 장벽의 기능 장애는 염증성 장 질환과 같은 많은 장 질환과 관련이 있습니다. 고립 된 마우스 장 지하실배양 및 창 자-villus 같은 구조로 유지 될 수 있습니다., 장 오르가노이드 또는 "엔터 로이드"라고. 엔터로이드는 시험관 내에서 장 상피 세포의 증식 및 세포 사멸을 연구하는 데 이상적입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 배양된 장체에서 증식 및 죽은 세포의 수를 정량화하는 간단한 방법을 기술한다. 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU) 및 프로피듐 요오드화물은 장신구의 증식 및 죽은 세포에 라벨을 붙이기 위해 사용되며, 증식 및 죽은 세포의 비율은 유세포측정에 의해 분석됩니다. 이것은 장 상피 세포 증식 및 세포 생존에 대한 약물 치료의 효과를 테스트하는 유용한 도구입니다.

소장 지하실은 지하 막 매트릭스에서 장내 세균으로 분리되고 배양되었다. 엔터로이드는 격리 후 2 일 싹을 형성하기 시작했다. 6 일째에 엔터로이드는 루멘에 많은 파편 (죽은 세포)이많은 싹을 가지고 있었습니다. 엔터로이드는 이 단계에서 통과될 준비가되었다(그림 3).
수많은 연구에 따르면 염증성 사이토카인은 장 상피 항상성의 유지에 필수적입니다. 염증성 사이토카인의 비정상적인 발현은 염증성 장 질환의 발생과 밀접한 관련이 있다11. 예를 들면, 우리의 이전 연구 결과는 IL-22가 수송 증폭 세포의 증식을 승진시키는 그러나 또한 Lgr5+ 줄기 세포12를고갈한다는 것을 보여주었습니다.
엔터로이드는 3일 동안 IL-22로 처리되었고, 그 후 합성 DNA를 세포 증식을 나타내기...

제시된 프로토콜은 유세포측정을 사용하여 배양된 마우스 장용체에서 증식 및 죽은 세포의 수를 정량화합니다. 이 방법은 약물 치료가 오르가노이드 증식 및 생존에 미치는 영향을 평가하는 데 도움이 된다.

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

이 프로토콜은 장로이드에서 세포 증식 및 생존을 조사하는 것 외에도 배양에서 장내 절연에 유용합니다. 과학자들은 이 기술을 배양 장로이드에 적용하고 약물과 염증성 사이토카인이 시험관 내 상피 세포에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 염증성 장 질환의 물 치료로 확장됩니다.우리는 몇 가지 치료 세포 사동을 찾기 위해이 방법을 적용합니다. 이 방법은 장 상피 증식 및 생존에 대한 통찰력을 제공합니다.이 방법은 내장 이외의 조직 주위에 배양된 오르가노이드에서도 사용될 수 있습니다. 장 내 지하실을 분리하고 장성 문화를 수행하려면 조직 집게를 사용하고 홍채 가위를 찾아 안락사 된 8 주 된 야생 형 마우스에서 약 8 센티미터의 ileum을 해부하십시오.가공 먹이 바늘을 가진 주사기를 사용하여 얼음 차가운 덜베코의 인산염 완충 식염수약 40 밀리리터로 일루를 플러시한 다음 가위로 길게 자르고 장위를 엽니다. 일루를 작은 조각으로 자르고 15 밀리리터 원추형 튜브에 멸균 얼음 차가운 DPBS 5 밀리리터에 넣습니다. 그런 다음 얼음에 5 분 동안 샘플을 바위.파이펫 컨트롤러를 사용하여 DPBS를 흡인하고 콜드 버퍼 10 밀리리터로 교체하십시오. 얼음에서 30분 동안 흔들린 후 파이펫 컨트롤러를 사용하여 버퍼 버퍼 하나를 흡인하고 콜드 버퍼 2의 10 밀리리터로 교체하십시오. 그런 다음 분당 약 80 쉐이크에서 손으로 2~3분간 흔들어 줍니다.흔들린 후 현미경으로 2개의 내용물을 버퍼링한 2개의 미세 리터 액자를 검사하여 세분화된 창구 세포가 있는 토굴이 있는지 확인합니다. 70미크론 멸균 세포 스트레이너로 두 가지 내용을 필터로 버퍼링하고 50 밀리리터 원내 튜브에서 여과된 버퍼를 수집합니다. 피펫 20 마이크로리터가 슬라이드에 여과되어 토굴을 계산합니다.필터링된 버퍼 두 컨텐츠의 충분한 볼륨을 전송하여 웰당 약 500개의 암호화가 있는지 확인합니다. 섭씨 4도에서 150회 G로 회전한 다음, 수퍼네이트도 조심스럽게 흡인합니다. 500 개의 지하실 중구 당 지하 막 매트릭스의 50 마이크로 리터에서 토굴을 다시 일시 중지합니다.거품을 피하기 위해 주의하는 파이펫 위아래로. 지하 멤브레인 매트릭스의 50 마이크로 리터 액자를 놓고 24 웰 플레이트의 한 우물의 중앙에 토굴 믹스를 놓습니다. 지하 막 매트릭스를 중합하기 위해 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.중합 30분 후, 각 웰에 600마이크로리터의 미니구트 미디어를 조심스럽게 추가하십시오. 플레이트를 섭씨 37도인큐베이터로 되돌리고 매일 현미경으로 관찰하여 2~3일마다 미디어를 변경합니다. 엔테로이드를 통과하려면 조직 배양판을 얼음 위에 놓고, 미디어를 흡인하고, 각 웰에 1밀리리터의 차가운 DPBS를 넣습니다.P1000 팁을 사용하여 매트릭스 청크가 남아 있지 않은 때까지 위아래로 파이펫을 사용합니다. 샘플을 1밀리리터 인슐린 주사기를 통과하여 15밀리리터 원뿔형 튜브로 내려갑니다. 150회 G와 섭씨 4도에서 5분간 회전한 후 파이펫을 사용하여 DPBS를 제거합니다.잘 당 지하 막 매트릭스의 50 마이크로 리터에서 엔테로이드를 다시 중단합니다. 지하 멤브레인 매트릭스가 중합할 수 있도록 30분 동안 37도의 섭씨 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 그런 다음 ENR 미디어의 600 마이크로리터로 각 우물을 오버레이하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.엔테로이드를 5~7일 동안 늘라 한 후 1~2개의 분할 비율을 사용하여 새로운 24웰 플레이트로 패싱합니다. 각 우물에 600 마이크로리터의 ENR 배지를 추가한 다음, 37°C인 인큐베이터에서 4~5일 동안 엔테로이드를 배양합니다. 치료되지 않은 엔테로이드의 대조군과 인터류키인-22의 밀리리터당 5나노그램으로 처리된 장로이드의 실험군을 설정한다.각 그룹에 대해 적어도 세 개의 복제를 준비합니다. 배경 뺄셈에 대한 음의 제어로 사용하는 것을 제외하고 엔테로이드의 각 웰에 EdU 배지 600 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 37도 인큐베이터에서 접시를 2시간 동안 배양합니다.지하 멤브레인 매트릭스에서 엔테로이드를 수확하려면 파이펫 컨트롤러를 사용하여 EdU 배지를 흡인하고 DPBS로 한 번 세척하십시오. 그런 다음 DPBS의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다. P1000 파이펫 팁을 사용하여 고체 지하 멤브레인 매트릭스 덩어리가 남아 있지 때까지 위아래로 파이펫을 사용하십시오.샘플을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 5분 동안 300회 G로 회전한 후 상퍼를 폐기합니다. 세포 해리 효소 500마이크로리터를 넣고 섭씨 37도에서 15분간 배양합니다. 그런 다음 P200 파이펫 팁을 사용하여 피펫을 위아래로 피펫하고 엔테로이드를 단일 셀로 분해합니다.다음으로, 10%의 태아 소 세럼을 함유한 덜벡코의 수정된 이글 매체 3밀리리터를 추가하고 P1000 파이펫 팁이 있는 파이펫을 반복적으로 넣습니다. 5 분 동안 300 회 G에서 원심 분리하고 상체를 경각한 후 DPBS의 1 밀리리터에서 세포를 중단합니다. 세포의 고정 및 투과화를 수행하기 위해 먼저 세포 현탁액을 1점 5 밀리리터 튜브로 옮기고, 5분 동안 300회 G로 회전하고, 상복부을 폐기한다.우리는 4 %의 파라 포름 알데히드의 1 밀리 리터에서 세포를 중단하고 실온에서 15 분 동안 고정합니다. 원심분리 후 5분 동안 300회 G로 피펫 끝으로 상퍼를 흡인시합니다. DPBS로 세포를 한 번 씻고 다시 회전하여 상체를 제거합니다.0.5%의 비이온 계면활성제의 1밀리리터로 세포를 다시 중단하고, 이전과 같이 DPBS로 세포를 세척하기 전에 실온에서 10 분 동안 배양합니다. EdU를 감지하려면 각 1.5 밀리리터 튜브에 100 마이크로리터의 반응 칵테일을 추가합니다. 세포를 다시 중단하고 빛으로부터 보호하여 실온에서 30분 동안 배양합니다.5분 동안 300회 G에서 원심분리한 후 파이펫 끝으로 반응 용액을 부드럽게 흡인한 후, 각 튜브에 0.5% 비이온 계면활성제 관통제를 추가하여 실온에서 한 번 세척합니다. 이전과 같이 원심 분리에 따라, 우리는 DPBS의 1 밀리리터에서 세포를 중단합니다. 40 미크론 여과기를 통해 다시 중단된 세포를 걸러내고 15밀리리터 원내 튜브에서 여과된 세포를 수집합니다.가능한 한 빨리 기계 감지에 대한 사실을 수행합니다. 유동 세포 분석에 적합한 채널 및 전압을 선택합니다. 게이팅 전략의 경우, FSC-A 대 SSC-A 의사 색상 플롯을 그리고 대부분의 셀을 전압을 조정하여 도트 맵의 가시 범위에 분배합니다.세포 집단을 R1로 선택하고 왼쪽 하단 모서리에 있는 셀 이물질을 제외합니다. R1 세포 집단에서 FSC-H 의사색상 플롯대 FSC-A를 설정합니다. 게이트를 설정하여 R2로 지정된 단일 셀을 선택하고 셀 덩어리를 제외합니다.R2 세포 집단으로부터, 형광 강도를 세포 수 플롯대 확립하고 네거티브 컨트롤을 사용하여 게이트를 설정한다. 형광 신호의 영역은 R3.실험 및 대조군 사이의 이러한 EdU 양성 세포의 비율을 비교하는 양양성 세포 영역지정입니다. 작은 장 지하실은 지하 막 매트릭스에서 장로이드로 분리되고 배양되었다.엔테로이드는 고립 후 이틀 후에 싹을 형성하기 시작했습니다. 6일째에는 루멘에 많은 파편이 있는 장신봉오리가 많았다. 엔테로이드는 이 단계에서 통과할 준비가 되어 있었습니다.엔테로이드는 3일 동안 IL-22로 치료되었고, 그 후 합성 DNA는 세포 증식을 나타내기 위해 EdU로 적색으로 표지되었다. IL-22 치료 된 엔테로이드는 EdU 양성 세포의 증가 수를 나타냈다. IL-22는 유동 세포측정에 의해 분석된 바와 같이 증식 세포를 40.1%에서 83.5%로 증가시켰습니다.IL-22 치료는 또한 적색으로 염색하는 프로피듐 요오드에 의해 표시된 장내 세포 사멸을 증가시다. IL-22는 유동 세포측정에 의해 분석된 대로 죽은 세포를 4.9%에서 16.2%로 증가시켰습니다. 충분한 토굴이 흔들리도록 버퍼를 추가한 후 토굴 격리 진행 과정에서 공정흔들림이 필요합니다.현미경으로 내용을 검사하는 것이 좋습니다. 이 절차에 따라, 우리는 또한 특정이 방법을 사용하여 차별화 된 상피 유형과 엔테로이드를 정량화 할 수 있습니다 연구원은 장 상피 분화를 조사하는 데 도움이 될 것입니다 장 상피 분화엔트. 개발 후이 질문은 절단에 발달 또는 병리학 적 질문을 탐구하는 위장학 분야의 연구원을위한 방법을 포장합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 수술 조직과 생검에서 수집한 결장 소굴에서 인간 장류를 확립하고 결장 소굴에서 콜로노이드를 확립하는 방법을 설명합니다. 이 방법론적 기사에서는 인간 장 및 콜로노이드의 성공적인 성장과 유지에 필수적인 배양 방식을 제시합니다.

전체 조직과 조직 검사에서 인간 상피 Enteroids과 Colonoids 설립

Enteroids 인간 질병의 연구에 새로운 모델로 떠오르고 있다. 프로토콜 신생아 조직에서 생성 된 enteroids의 lipopolysaccharide (LPS) 치료를 사용 하 여 인간의 necrotizing enterocolitis에의 enteroid 모델을 시뮬레이션 하는 방법을 설명 합니다. 수집 된 enteroids 그 인간의 necrotizing enterocolitis에 본 유사 염증 성 변화를 보여 줍니다.

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이 프로토콜은 극성이 역인 작은 장 장내염을 활용하여 정점 표면에 접근 할 수있는 apical-out 괴사 장염 (NEC) 인 - 접시 모델을 설명합니다. 우리는 NEC 관련 상피 파괴를 검출하기위한 면역 형광 염색 프로토콜 및 NEC-in-a-dish 프로토콜을 실시한 apical-out enteroids의 생존력을 결정하는 방법을 제공합니다.

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이 프로토콜은 질병 발병에 대한 기계론적 연구에 사용할 수 있는 괴사성 장염(NEC)의 시험관 내 모델을 설명합니다. 인간 신생아 장, 내피 세포 및 중증 NEC가 있는 신생아의 장내 마이크로바이옴에서 추출한 장내 장내형 칩을 파종한 것이 특징입니다.

인간 신생아 장 장내염과 디스바이오틱 마이크로바이옴을 통합한 괴사성 장염의 미세유체 모델

엔테로이드는 조직 생리학 및 병태생리학, 약물 개발 및 재생 의학을 연구하기 위한 새로운 모델로 부상하고 있습니다. 여기서는 관련 조직 세포 유형과의 공동 배양을 허용하는 소 일차 세포 2D 장내 유래 배양 시스템에 대해 설명합니다. 이 모델은 위장 연구 모델링을 위한 중개적 이점을 제공합니다.

중개 생물의학 연구에 응용하기 위한 소 1차 장내염 유래 2차원 단층 배양 시스템 생성

이 프로토콜은 사이토카인(cytokine)과 같은 세포독성 섭동(cytotoxic perturbagens)에 반응하여 인간 결장 오가노이드에서 세포 사멸을 조사하고 정량화하는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 접근법은 형광 세포 사멸 염료(SYTOX Green Nucleic Acid Stain), 생 형광 현미경 및 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 세포독성 자극에 대한 단일 오가노이드 반응을 정량화합니다.

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이 연구는 소장과 대장에서 유래한 돼지 오가노이드의 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 단층의 성장은 TEER 값의 증가로 표시되며, 이는 견고한 상피 무결성을 나타냅니다. 게다가, 이 단층은 forskolin의 신청에 따르는 Ussing 약실 실험에 있는 생리적인 분비 반응을 전시합니다.

토종 장의 생리학적 특성을 반영하는 2차원 돼지 장 오가노이드(Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids)

여기에서는 표준 매트릭스 내장 오가노이드 배양에서 정점 아웃 장 오가노이드를 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 활발하게 증식하는 세포에 EdU를 통합하고 EdU 양성 세포의 반자동 정량화를 간략하게 설명합니다.

정점 아웃 장 오가노이드 생성 및 EdU-라벨링을 사용한 오가노이드 증식 속도 평가

배우세요 마우스 회장에서 엔터로이드를 분리하고 유세포 분석으로 증식 및 죽은 세포를 정량화하는 방법을. 이 기술은 약물 및 염증성 사이토카인 효과 연구에 활용됩니다.

엔터로이드에서 증식 및 죽은 세포의 정량화

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