Name: Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 배우세요 마우스 크리마스터 근육에서 활체현미경법을 이용한 백혈구 침투 평가 방법을. 이 기술은 염증과 패혈증 연구에 활용되며 생체 내 백혈구-내피세포 상호작용을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

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이 연구는 PRIMAL 컨소시엄의 일환으로 독일 연방 교육 연구부 (BMBF) 01GL1746E에 의해 지원되었다. 저자는 숙련 된 기술 지원에 대한 브리타 헤크만과 실비아 페저를 인정합니다.

동물은 IBF(인터파쿨테르 바이오메디치니쉬 포르충세인리히퉁), 하이델베르크에서 통제되고 특정 병원균이 없는 조건 하에 수용되었다. 여기에 설명된 모든 절차는 현지 IRB와 독일 바덴뷔르템베르크의 레히에룽스프라에시듐 카를스루에에 의해 승인되었습니다.
1. 마취 관리
<ol><li>125 mg/kg 케타민과 12.5 mg/kg 자일라진의 복강 내 (즉) 볼러스 주사로 마우스를 마취시다.</li>
	<li>마우스의 체온을 유지하기 위해 가열 패드 상에 등쪽 재배치 위치에 마우스를 놓고 고정합니다(36.5-38°C). 흡수되지 않는 멸균 봉합사(6/0)를 사용하여 정면 치아 주위의 간단한 루프를 감고 봉합사의 접합 끝을 가열 패드에 테이프로 테이프로 보입니다. 이 고정은 호흡에 있는 방해를 피하기 위하여 입을 열어 두는 것을 목표로 합니다.</li>
	<li>디지털 발가락 핀치에 의해 마취의 적절한 깊이를 마우스를 확인 (철수는 볼 수 없습니다).</li>
	<li>충분한 마취에 도달하면 외과 준비를 진행합니다. 진행 중인 실험을 따라 30분마다 반복적으로 마취를 확인합니다.</li>
	<li>평형 생리염 용액 (PSS, 조성: 132 mmol/L NaCl, 4.7 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L MgS04,2.0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3)5% CO 2/95% N2를 15분 동안.2 실험 전반에 걸쳐 5%2CO 2/95%N2로 PSS를 지속적으로 포동 포동하게 하고 37°C에서 유지한다.</li>
</ol>2. 기관 및 경동맥의 외과 적 준비 (선택 사항)
<ol><li>중간선에 핀셋으로 피부를 부드럽게 당겨 목 부위에서 피부를 해부합니다. 가위를 사용하여 직경 1-2cm의 원형 컷을 적용하여 수술 준비를위한 충분한 공간을 제공합니다.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 주변 근육, 지방 및 결합 조직을 조심스럽게 해부하십시오.</li>
	<li>작은 수술 가위를 사용하여 기관에 횡방향 절단 (~ 1.3 mm)을 만들고 상부 기도를 고정하기 위해 기관의 꼬리 끝 내부에 폴리에틸렌 튜브 (I.D x O.D. 0.034"x 0.050")를 소개합니다.</li>
	<li>단일 원형 매듭 봉합사 (6/0 USP)에 의해 기관에있는 튜브를 고정합니다.</li>
	<li>기관의 오른쪽을 따라 경동맥을 찾아 경동맥 벽에서 주변 조직을 해부합니다. 양자택일로, 경정맥 또는 또한 꼬리 정맥은 i.v. 접근을 위해 이용될 수 있었습니다. 미갈 신경에 부상을 피하십시오.</li>
	<li>경동맥 아래에 봉합사 2개(6/0)를 전달합니다. 경동맥의 분기에 가까운 첫 번째 두개골 봉합사를 근위하게 배치하고 영구적으로 묶으하십시오. 제2 봉합사는 제1 봉기로부터 약 5-8 mm 말단에 위치하고 나중에 경동맥내의 튜브를 고정하는데 사용될 것이다. 아직 묶지 마십시오.</li>
	<li>식염수로 채워진 1 mL 주사기 바늘에 끝 부분을 구부려 30cm의 길이로 폴리에틸렌 튜브 (I.D x O.D. 0.011"x 0.024")를 준비합니다. 엄격한 홍조는 준비 하는 동안 공기 색증을 방지 하기 위해 중요 하다.</li>
	<li>7mm 용기 클립을 사용하여 두 번째 봉합사의 경동맥을 비탈리로 고정시다.</li>
	<li>경동맥에서 작은 횡방향 절단(~0.5 mm)을 수행하고 멸균 폴리에틸렌 튜브를 도입합니다. 전에 제조된 두 번째 봉합사를 사용하여 동맥 내의 튜브를 고정시다.</li>
	<li>용기 클립을 제거하고 폴리에틸렌 튜브에 연결된 주사기에 약간의 장력을 부드럽게 가합니다. 이 경동맥 카테터는 이제 약물을 투여하거나 필요한 경우 혈액 샘플을 채취하는 데 사용할 수 있으며, 각 장치에서 혈압 또는 맥박수의 모니터링도 가능합니다.</li>
</ol>3. 크레마스터 근육의 외과 적 준비
<ol><li>가열 패드 (가열 패드와 함께)에 마우스를 나중에 현미경 검사를위한 무대를 들고 사용자 정의 플라스틱 프레임으로 전송합니다. 현미경 단계를 향한 음낭으로 마우스를 오리엔테이션하십시오.<ol>
<li>진행하기 전에 마취의 깊이를 재평가; 필요한 경우 마취의 절반 복용량에 분기를 다시 관리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>음낭을 현지화하고 핀셋을 사용하여 가장 단부 부분에 들고 부드럽게 당기고 직경이 약 5mm인 음낭 피부의 원형 부분을 잘라냅니다. cremaster 근육과 같은 기본 구조를 손상시키지 않도록하십시오. 식염수로 개방 조직을 잘 수화하십시오.</li>
	<li>두 개의 핀셋을 사용하여 느슨한 결합 조직을 해부하고 두 고환을 지역화하십시오.</li>
	<li>한 고환을 단수적으로 잡고 부드럽게 당겨서 주변 결합 조직을 단계적으로 제거하십시오.</li>
	<li>고환이 외부에 있으면 말단끝을 무대 를 둘러싼 고무 링에 고정합니다. 외장화 시, 전체 공정 중에 식염수로 조직에 수분을 공급하십시오.</li>
	<li>
중요 단계: 조심스럽게 기본 cremaster 근육을 해치지 않고 결합 조직을 제거. 과잉 결합 조직은 나중에 현미경 검사법에 있는 비전을 방해할 수 있고 흐릿한 심상을 생성할 수 있습니다.</li>
	<li>고환의 말단 부분을 아래로 고정하고 작은 횡방향 절단 (약 1mm)에 의해 cremaster 근육을 열고, 근위 끝까지 매우 원위절부에서 세로 절개. 결과적으로 cremaster 근육은 구형으로 열어야합니다. 거시적으로 보이는 혈관은 혈역학에 영향을 미칠 수 있기 때문에 절단해서는 안됩니다.</li>
	<li>조심스럽게 유리 단계에 근육을 확산하고 고무 링에 고정. 현미경 검사법은 여기에서 수행될 것이기 때문에 중앙 지역을 만지거나 해치지 않도록 하십시오. 주의: 과도한 스트레칭은 혈류를 방해할 수 있습니다.</li>
	<li>나머지 고환을 따로 고정하여 관심 영역에 액세스할 수 있도록 합니다. 건조를 방지하기 위해 PSS로 반복해서 적시십시오. 장착 된 근육은 이제 현미경 검사법에 대한 준비가되어 있습니다.</li>
</ol>4. 활력 내 현미경 검사법
<ol><li>장착된 cremaster 근육을 수직 현미경에 놓고 40x 목표를 사용하여 현미경 검사를 수행합니다.</li>
	<li>높은 처리량 이미징 관광을 사용하여 데이터를 획득하고 내보내기.</li>
	<li>예열 (35-37 °C) PSS17와연속 과급에서 녹음을 수행합니다. 근육 조직에 목표와 함께 PSS의 지속적인 물방울을 허용하기 위해 현미경의 직립 목표에 녹화 된 작은 튜브에 의해 수퍼 퓨전을 적용합니다.</li>
	<li>모세관 후 매실(두 개의 작은 용기의 합류)을 식별하고 직경 이 20-40 μm의 베누아의 미세 순환을 측정합니다.</li>
	<li>30 초의 시간 범위에서 cremaster 근육에서 미세 순환의 고해상도 이미지를 기록합니다. 기록 하는 동안 근육 조직의 약간의 수축 및 이완 있을 수 있습니다., 지속적으로 초점을 조정 해야 합니다. 일반적으로, 마우스는 약 2시간 동안 안정적인 순환을 나타내는 경향이 있다. 다른 지역에서 다른 선박의 여러 기록을 획득 할 수있다. 하나 또는 둘 다 고환을 나중에 사용할 수 있습니다. 참고 : 이것은 염증의 모델이기 때문에, 유도의 일반적인 방법은 다음과 같습니다 : 전신 응용 프로그램 또는 프로 염증 성 중재제의 국소 음낭 주입뿐만 아니라 예를 들어 N-Formylmethionyl-leucyl-페닐라닌 (fMLP)과 함께 수퍼퓨전. 국소 TNF-α 자극은 백혈구 모집을 유발하기 위해 일반적으로 사용된다; LPS-유도 내독증은 SIRS 가혹한 조직 염증의 모형입니다.</li>
</ol>5. 백혈구 시각화
참고: 추가 시각화 없이 백혈구를 쉽게 볼 수 있습니다. 자유롭게 움직이는 백혈구의 중심선 속도를 확인하려면 차동 염색을 수행합니다.
<ol><li>eGFP 표지된 마우스가 이용되는 경우에, 형광 현미경 검사법에 의해 직접 그(것)들을 분석하십시오.</li>
	<li>비 eGFP 라벨 마우스 균주에 대 한, 로다민 염색을 사용 하 여.<ol>
<li>0.2 mg/kg 체중에서 로다민 6G를 관리하십시오. 반복 된 복용량 충분 한 염색 강도를 달성 하기 위해 필요할 수 있습니다. 볼륨이 클수록 혈역학 매개 변수에 영향을 줄 수 있기 때문에 작은 볼륨을 유지해야 합니다.</li>
		<li>백혈구의 즉각적인 염색을 위해 경동맥을 통해 얼룩을 관리하십시오. 경동맥 해부가 수행되지 않은 경우, 동일한용량(18)을사용하여 i.p. 적용에 의해 충분한 염색이 이루어질 수 있다. 경동맥 카테터화의 대안으로 다른 정맥 카테터화를 수행 할 수 있습니다. 참고: 로다민 염색은 eGFP 라벨링과 달리 형광 강도의 시간 감소뿐만 아니라 더 높은 농도에서 백혈구의 약 80 %의 전반적인 염색 최대를 보여줍니다.</li>
		<li>형광 현미경 검사법에 의해 자유롭게 움직이는 로다민 염색 백혈구를 시각화하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 실험 종료
참고: 이 프로토콜을 수행하는 데 는 전체 예상 시간이 90~150분이어야 합니다.
<ol><li>자궁 경부 탈구에 의한 안락사와 실험을 종료합니다.</li>
	<li>추가 분석을 위해, 이민과 같은, PFA에 있는 cremaster 근육을 아직도 무대에 뻗어 필요에 따라 운동학을 위해 염색하는 동안.</li>
</ol>7. 오프라인 분석
<ol><li>비디오 재생 중에 다음 매개 변수를 단순 개수로 분석합니다.<ol>
<li>롤링 플럭스 [수/분]: 가상 의 선/분통과 압연 셀의 수 계산</li>
		<li>접착 [숫자/mm2]: 시야 내의 혈관 벽에 접착된 셀의 수 ≥ 30 s/혈관 표면[mm2].2</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음의 혈역학 및 미세 혈관 파라미터를 측정하여 ImageJ를 사용하여 측정한다.<ol>
<li>용기 직경[μm]을 내벽 지름으로 계산합니다.</li>
		<li>용기 의 중심선 길이로 용기 길이 [μm]를 계산합니다.</li>
		<li>중심선에서 자유롭게 <img alt="과학 방정식의 속도 측정을 위한 초당 마이크로미터 기호[μm/s]." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> 움직이는 백혈구의 프레임 간 비디오 분석에서 얻은 중심선 속도를 계산합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 방정식을 추정으로 사용합니다.<ol>
<li>[mm2]에서혈관 표면을 계산합니다: 용기 길이 [μm] x 용기 직경 [μm] x π x10-6.</li>
		<li>벽 전단 <img alt="정적 평형 분석; ΣFx=0 기호; 컨셉 일러스트레이션; 물리학 교육." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> 속도 계산 : 4.9 x (8 x 중심 선 속도 <img alt="과학 방정식의 속도 측정을 위한 초당 마이크로미터 기호[μm/s]." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> x 0.625 / 용기 직경 [μm]).</li>
		<li>평균 혈류 속도 <img alt="과학 방정식의 속도 측정을 위한 초당 마이크로미터 기호[μm/s]." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> 계산 : 중심선 <img alt="과학 방정식의 속도 측정을 위한 초당 마이크로미터 기호[μm/s]." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> 속도 x 0.625.</li>
		<li>총 백혈구 플럭스 <img alt="실험 데이터 분석을 위한 분당 수 단위로 속도 측정을 나타내는 방정식입니다." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 4"> 계산 : 전신 백혈구 수 <img alt="실험실 계산에 사용되는 마이크로리터당 수[수/μL] 단위의 농도 측정." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 5"> x (평균 혈류 속도 <img alt="과학 방정식의 속도 측정을 위한 초당 마이크로미터 기호[μm/s]." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> x 60/1000) x π x. <img alt="혈관 직경 계산 공식, 미세혈관 측정 및 분석을 위한 다이어그램." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 6"> </li>
		<li>롤링 플럭스 분수 [%]: 롤링 플럭스/총 백혈구 플럭스 x 100을 계산합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

방법으로서 IVM은 다른 기관에서 다른 세포 유형을 연구하는 데 널리 사용되어 왔으며 광범위하게 기술되고논의된 19. 이 연구의 주요 목적은 cremaster 근육에서 IVM을 설정하고 수행하는 효율적인 접근 방식을 제공하는 것입니다. 이 방법을 연습하면 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 따라서 계획 및 표준화는 기술을 마스터하는 핵심 요소입니다. 무엇보다도 이 기술은 혈역학 및 미세 혈관 파라미터에 매우 의존하며, 이를 면밀히 모니터링하고 제어해야 합니다. 이와 같이, 그룹 간의 다른 혈역학 오해의 소지가 결과 얻을 것 이다.
생리적 및 병리학적 상태를 연구하는 역할에도 불구하고, IVM 만으로는 염증에서 백혈구 모집에 대한 특정 세포 유형의 개별 적인 기여를 완전히 해명하지 않을 수 있습니다. 이를 위해, 다른 상보적인 방법은 IVM과 결합될 수 있다. 예를 들어, 유동 챔버 실험과 같은 생체 내 외 방법은 내피...

Intravital 현미경 검사법 (IVM)는 백혈구 생물학의 필드에 있는 일반적으로 적용되는 공구입니다. 백혈구 모집은 백혈구 포획, 압연 및 내피 벽에 의한 접착에 의해 시작된 잘 정의된 사건의 연속을 따르며, 마지막으로 염증의 실제 부위로 백혈구의 이주 및 사치를이월한다 1. 각 단계는 다양한 케모카인(예를 들어, IL-8/CXCL8), 수용체(예를 들어, LFA-1, Mac-1) 및 상응하는 내피 세포 접착 분자(예를 들어, ICAM-1, VCAM-1 및 E-Selectin)에 의해 매개및 조절된다2,,3. 상이한 조절 부위의 상호작용은, 백혈구 모집의 조절인자 및 중재자가 고급 당화 말단 제품(RAGE), 세포간 접착 분자 1(ICAM-1), C-X-C 모티프 리간드(CXCL)1/2 및 수용체 CXCR2를 사용하여 IVM,4,5,6,6,,7,,8,9를사용하여 발견하였다.
IVM의 방법은 장10,피부11,림프절12,배아 노른자 자루13 등과 같은 많은 상이한 장기 및 조직에 대해 기술되었다. 그러나, IVM의 가장 널리 연구된 방법은 래트14에서처음 기술된 크레마스터 모델이다. 쥐15에서아직도 아직도 이용되는 동안, 방법은 다른 형질전환 선의 높은 풍부 때문에 마우스에서 주로 최근에 적용됩니다. 우리 그룹은 최근 듀첸 근 이영양증 (DMD)과 같은 염증성 muscolopathies의 분야에서 cremaster IVM의 잠재적 인 역할을 강조하고 있다 dystrophin 결핍 mdx 마우스 를 공부16. 얇은 결합 및 쉽게 접근 할 수있는 섬유 조성으로 인해, cremaster 근육은 빛 또는 형광 현미경 검사법을 사용하여 전체 마운트로 연구 할 수있는 이상적인 후보 근육을 나타냅니다. 백혈구 모집 및 사치는 주로 cremaster 근육에 있는 연속적인 근육 층에 쉽게 확인될 수 있는 포스트 모세관 매경에서 일어날 것입니다.
생체외 에서 의 외 세포 내 세포 화상 진찰의 이점은 살아있는 유기체에 있는 그것의 생물학 문맥이다. 동시에, 변경된 백혈구 모집에 세포 특정 기여를 delineating 는 유동 실 또는 내피 검술과 같은 추가 시험관내 모형을 요구할 수 있습니다. 여러 메서드의 조합은 가장 설득력있는 데이터를 생성합니다. 어떤 외과 조작든지 증가한 백혈구 인신 매매 및 모집으로 이끌어 낼 것이기 때문에 과학자는 cremaster 모형의 한계를 알고 있어야 합니다. 따라서, 기준 모집은이 방법으로 추정하기 어렵다. 광범위한 응용 에도 불구하고, cremaster의 IVM은 도전이 될 수 있으며, 새로운 설정은 설정하는 데 시간과 자원이 걸릴 수 있습니다. 우리는 지금 IVM에서 일반적인 실수의 일부를 방지하는 데 도움이 될 것입니다 쉬운 프로토콜을 제공합니다. 또한 제한 사항에 대해 논의하고 해당되는 경우 무료 방법이 강조 표시됩니다.
cremaster의 IVM은 염증성 및 전염성 연구 분야에서 구현되는 이상적인 접근법을 나타낸다. 보다 구체적으로, cremaster 모형은 선동적인 질병의 맥락에서 골격 근육 생물학을 공부하는 과학자에 높은 관심사일지도 모릅니다.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketanest S</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td>PZN: 08509909</td><td>마취. 일반 / IUPAC 이름 : ketamine</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>CP-Pharma GmbH</td><td>기사 번호 : 1205&nbsp;</td><td>마취. 제네릭 / IUPAC 이름: xylazine (as hidrochloride)</td></tr><tr><td>Saline Solution</td><td>B. Braun Melsungen&nbsp;</td><td>PZN 02737756</td><td>수술 준비. 일반 / IUPAC 이름: sodium chloride</td></tr><tr><td>주사기 바늘 Omnican F</td><td>B. Braun Melsungen&nbsp;</td><td>REF 9161502</td><td>수술 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>봉합사 6/0 USP</td><td>Resorba</td><td>REF 4217</td><td>수술 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜브 #10&nbsp;</td><td>BD GmbH</td><td>공급 업체 번호 427401</td><td>수술 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜브 #90&nbsp;</td><td>BD GmbH</td><td>공급 업체 번호 427421</td><td>수술 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>CAS 번호 989-38-8&nbsp;</td><td>백혈구 염색. 일반 / IUPAC 이름: 에틸 2-[3-(에틸아미노)-6-에틸이미노-2,7-디메틸잔텐-9-일]벤조에이트</td></tr><tr><td><강한>설치 장비</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수직 현미경&nbsp;</td><td>올림푸스&nbsp;</td><td>BX51W1</td><td>현미경</td></tr><tr><td>40배 대물렌즈&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Achroplan 40 &times; /0.80 W</td><td>현미경</td></tr><tr><td>ImSpector 소프트웨어</td><td>Lavision Biotec GmbH</td><td>ver. 4.0.469</td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health, USA</td><td>ver. 1.51j8</td><td>소프트웨어</td></tr></tbody></table>

intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 cremaster 근육의 백혈구 침투

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Intravital 현미경 검사법 (IVM)는 생체 내에서 백혈구 모집 계단식 내의 생리적 및 병리생리학적 과정을 모니터링하는 데 널리 사용됩니다. 현재 프로토콜은 마우스의 손상되지 않은 유기체 내에서 골격 근 유래 조직에서 백혈구 모집으로 이어지는 백혈구 내피 상호작용을 시각화하는 실용적이고 재현 가능한 방법을 나타낸다. 이 모델은 과립구 활성화와 질병에서의 역할에 초점을 맞춘 모든 연구 분야에 적용됩니다.
우리는 방법을 안내하고 잠재적 인 함정과 기술적 인 어려움을 강조하기 위해 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 실험 설정 및 필수 물질, 마우스 마취, 크레마스터 근육 의 해부뿐만 아니라 기관 및 경동맥 통조림, IVM 기록 및 오프라인 분석을 다룹니다. 부착 백혈구, 롤링 플럭스(RF) 및 롤링 플럭스 분획(RFF)과 같은 데이터 형식에 대해 자세히 설명하고 적절한 응용 분야에 대해 설명합니다. 디스트로핀 결핍 mdx 마우스로부터의 대표적인 결과는 결과 섹션에 제공된다.
IVM은 생체 내 환경에서 백혈구 모집을 평가하는 강력한 도구입니다. 그러나, 예를 들어 내피 및 백혈구 기능을 delineating 유동 챔버 실험과 같은 전 생체 설정과 조합을 요구할 수 있습니다. 더욱이, 관심 있는 동물의 유전적 배경은 기준선 모집에 크게 영향을 미칠 수 있으며, 제공된 프로토콜의 개별적인 미세 조정을 요구한다. 그것의 한계에도 불구하고, IVM은 살아있는 척추 동물 유기체로 시험관 내 사실 인정을 쉽게 번역하는 단상으로 봉사할 수 있습니다.

제공된 프로토콜에 따라 IVM은 골격 근에서 백혈구 모집의 폭포에 대한 독특한 통찰력을 얻을 것이다. 결과 섹션에서는 IVM에서 얻은 일반적인 결과에 중점을 두고 발생할 수 있는 잠재적인 문제를 강조 표시합니다.
위활력 현미경 검사법에 대한 실험 설정은 그림 1에설명되어 있습니다. cremaster 근육의 준비 및 결합 조직의 제거는 균일 한 표면으로 집중된 현미경 이미지를 얻기 위해 중요합니다. 과잉 결합 조직은 결국 IVM을 수행할 때 흐릿한 현미경 이미지(보충 비디오 1)로이어집니다. 도 2는 IVM을 사용하여 얻을 수 있는 대표적인 현미경 이미지를 나타낸다. 첫째, 직경이 20-40 μm 사이여야하는 모세관 후 매블은 두 개의 작은 혈관의 합류로 식별됩니다. 부착물 및 롤링 백혈구만 시각화할 수 있으며, 순환 백혈구는 녹화된 비디오의 슬...

여기에서, 우리는 마우스 cremaster 근육의 포스트 모세관 정맥에 intravital 현미경 검사법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 일반적으로 염증과 패혈증의 다른 모델, 특히 케모카인과 사이토 카인에 의해 유도 된 모델에 적용, 우리는 과장 된 근육 백혈구 침투를 포함하는 muscolopathies의 연구에서 그 관련성을 강조.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

이 실용적이고 재현 가능한 방법은 그대로 마우스 내에서 백혈구 모집으로 이어지는 내피성 백혈구 상호 작용을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 또한 생체 내에서 백혈구 모집 폭포 내에서 생리및 병리학 적 과정의 모니터링을위한 강력한 도구를 제공합니다. 이 방법은 상이한 염증 및 정화조 모델에 적용될 수 있다.예를 들면, 우리는 최근에 과장된 근육 백혈구 침투를 관련시키는 근육병증의 연구 결과에 있는 그것의 관련성을 강조했습니다. 이 기술을 사용하는 것을 고려하고있는 동료 과학자들에게 우리의 제안은 방법이 사소한 편차에 매우 취약할 때 가능한 한 많은 실습 경험을 얻는 것입니다. 절차를 보여주는 사이먼 크라니그, 내 실험실에서 임상의 및 수석 과학자 될 것입니다.마취된 실험 동물의 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 37°C의 섭씨 가열 패드에서 등쪽 재림 자세로 마우스를 고정하고 흡수할 수 없는 멸균 6-0 봉합사를 사용하여 정면 치아 주위에 간단한 루프를 감습니다. 봉합사의 결합 끝을 가열 패드에 테이프로 사용하고 핀셋을 사용하여 중간라인에서 피부를 부드럽게 들어 올립니다. 다음으로, 목과 상부 흉부 위에 1~2센티미터 직경 절개를 하고 핀셋을 사용하여 주변 근육, 지방 및 결합 조직을 조심스럽게 해부합니다.기관 아래에 봉합사를 놓습니다. 작은 수술 가위를 사용하여 약 1.3mm의 횡반을 기관으로 자르고 상부 기도를 확보하기 위해 기관의 caudal 끝에 폴리에틸렌 튜브를 도입하십시오. 하나의 원형 매듭 봉합사로 위치한 튜브를 수정하고 기관의 오른쪽을 따라 경동맥을 찾습니다.경동맥 벽에서 주변 조직을 해부하고 동맥 아래에 봉합사의 두 조각을 전달합니다. 첫 번째 두개골 봉합사 근위를 경동맥의 양면에 묶고 두 번째 봉합사를 묶지 않고 첫 번째 봉합사에서 약 5~8밀리미터 의 결산한다. 다음으로, 30센티미터 분량의 폴리에틸렌 튜빙을 식염수로 채워진 1밀리리터 주사기 바늘에 부착하고 7mm 용기 클립을 사용하여 경동맥을 두 번째 봉합사에 분해합니다.경동맥에서 약 0.5mm 의 횡반절단을 만들고 멸균 폴리에틸렌 튜브를 동맥에 도입한다. 두 번째 봉합사로 튜브를 고정하고 선박 클립을 제거합니다. 그런 다음 주사기 플런저를 부드럽게 우울하여 식염수를 용기에 넣습니다.크레마스터 근육을 준비하려면 현미경 단계를 향한 음낭이있는 맞춤형 플라스틱 현미경 프레임으로 마우스를 옮기고 핀셋으로 가장 황당한 끝

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

조직 준비는 시각화와 생활 엑기스의 실험 조작에 대해 설명합니다. anesthetized 남성 생쥐에서 얇고 높은 vascularized cremaster 근육이 arterioles, 모세 혈관 및 venules 포함한 microvascular 네트워크를 공부 intravital 현미경을위한 준비가되어 있습니다. 이 준비는 즉시 쥐와 햄스터에 대한 적응이다.

엑기스의 Intravital 이미징을위한 마우스 Cremaster 근육 준비

우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

cremasteric microcirculation의 postcapillary venules 디지털 intravital epifluorescence 현미경은 백혈구 - 내피 상호 작용에 대한 통찰력을 얻을 수있는 편리한...

쥐 Cremaster 근육의 국소 빈혈 reperfusion의 - 상해에서 백혈구 - 내피 상호 작용의 실시간 디지털 이미징 (IRI)

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

마우스 M.의 cremaster 미소 순환의 intravital 현미경은 독특하고 주변 골수 줄기 세포 이동의 분석을위한 생체 모델에서 잘 표준화을 제공합니다.

주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

마우스의 장간막 정맥에 대한 이 단순화된 생체 내 현미경 검사는 백혈구-내피 및 혈소판-백혈구 상호 작용을 관찰하기 위해 다양한 염증 모델에 사용할 수 있습니다.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

여기, 우리는 CD11c.DTR 마우스의 기관 내 디프테리아 독소 치료에 의해 유도되는 무균 성 심근염의 쥐 모델에서 심장 CD45 + 백혈구 침윤을 시각화하기위한 가벼운 시트 현미경 접근법을 설명한다.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

백혈구와 혈소판의 모집은 동맥 형성 동안 측부 동맥의 효과적인 성장에 필요한 필수 구성 요소를 구성합니다. 다광자 현미경은 동맥 형성 중 백혈구 모집 및 유출을 연구하기 위해 생체 내에서 높은 시공간 분해능과 더 적은 광독성으로 세포 역학을 추적하는 효율적인 도구입니다.

쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징

관절의 생체 영상 촬영은 염증이 생긴 관절 내 백혈구의 이동 행동과 분자 역학을 밝히는 데 매우 유용한 기법입니다. 여기서는 제2형 콜라겐 유발 관절염(CIA) 마우스 모델을 사용한 관절의 생체 내 영상 검사에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 영상 검사는 관절 내 백혈구의 이동 행동을 밝혀냅니다

배우세요 마우스 크리마스터 근육에서 활체현미경법을 이용한 백혈구 침투 평가 방법을. 이 기술은 염증과 패혈증 연구에 활용되며 생체 내 백혈구-내피세포 상호작용을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

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