Name: 인플루엔자 A 바이러스 감염 중 T 여포 도우미 세포 및 발아 센터 반응 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 배우세요 인플루엔자 A 바이러스 감염 시 T 여포 도우미 세포 및 발아 센터 B 세포 반응을 평가하는 방법을 C57BL/6 마우스 모델에서. 이 프로토콜은 면역학 연구자들이 고친합성 항체 생성에 필수적인 Tfh 세포 기능을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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우리는 흐름 세포측정 시설, ABSL2 시설 및 상하이 의 SPF 동물 시설의 직원들이 기술적 인 도움과 조언을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 중국 과학 아카데미 (XDB29030103), 중국 국립 핵심 R & D 프로그램 (2016YFA0502202), 중국 국립 자연 과학 재단 (31570886)의 전략적 우선 순위 연구 프로그램에 의해 지원되었습니다.

<ol><li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+Blimp-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+Bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Pedros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRAF-like+motif+of+the+inducible+costimulator+ICOS+controls+development+of+germinal+center+TFH+cells+via+the+kinase+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1.</a> Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+T-helper+cell+recruitment+governed+by+bystander+B+cells+and+ICOS-driven+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility.</a> Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).</li>
<li>Lee, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+priming+for+extrafollicular+antibody+responses+requires+Bcl-6+expression+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).</li>
<li>Zotos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+regulates+germinal+center+B+cell+differentiation+and+proliferation+through+a+B+cell-intrinsic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).</li>
<li>Vogelzang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fundamental+role+for+interleukin-21+in+the+generation+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells.</a> Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).</li>
<li>Ansel, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine-driven+positive+feedback+loop+organizes+lymphoid+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles.</a> Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+Controls+Follicular+T+Helper+Cell+Positioning+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function.</a> Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).</li>
<li>Methot, S. P., Di Noia, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Somatic+Hypermutation+and+Class+Switch+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+ImmunoChemical%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination.</a> Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Calame, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cells%3A+finding+new+light+at+the+end+of+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasma cells: finding new light at the end of B cell development.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).</li>
<li>Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAPCs+promote+follicular+helper+T+cell+differentiation+of+Ag-primed+CD4%2B+T+cells+during+respiratory+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).</li>
<li>Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3%2B+regulatory+T+cells+promote+influenza-specific+Tfh+responses+by+controlling+IL-2+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability.</a> Nature Communications. 5, 3495(2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+protein+1+promotes+follicular+helper+T+cell+differentiation+and+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).</li>
<li>León, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TH2+development+by+CXCR5%2B+dendritic+cells+and+lymphotoxin-expressing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells.</a> Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Foxp1+is+a+critical+negative+regulator+of+the+differentiation+of+follicular+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).</li>
<li>Bouvier, N. M., Lowen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+for+Influenza+Virus+Pathogenesis+and+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission.</a> Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).</li>
<li>Miyauchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+neutralizing+influenza+antibody+response+in+the+absence+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells.</a> Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).</li>
<li>Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+Virus+Studies+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li>
<li>Kitano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+protein+expression+shapes+pre-germinal+center+B+cell+dynamics+and+follicular+helper+T+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity.</a> Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).</li>
<li>Yusuf, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+T+follicular+helper+cell+IL-4+production+is+dependent+on+signaling+lymphocytic+activation+molecule+receptor+%28CD150%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150).</a> The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).</li>
<li>Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+help+and+innate-derived+IL-27+induce+Blimp-1-dependent+IL-10+production+by+antiviral+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs.</a> Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).</li>
</ol>

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높은 친화성 항체를 생성하기 위한 B 세포 도움을 제공하는 전문화한 역할 때문에 Tfh 세포는 백신 설계를 위한 새로운 전략을 제공하기 위하여 분화 및 조작의 기계장치에서 광범위하게 공부되었습니다. 인플루엔자 바이러스 감염은 활발한 Tfh 및 GC B 세포 반응을 유도하여 이 연구 분야에 적합한 모델이 됩니다. 본 논문에서, 우리는 비강 내 접종에 의한 인플루엔자 바이러스 감염의 프로토콜을 기술했습니다, 유동 세포측정에 의한 Tfh 관련 반응의 평가, 면역 형광 및 ELISA. 이 assays는 Tfh 분화, GC B 발달 및 인플루엔자 바이러스 특정 항체의 검출을 용이하게 하고 연구원이 면역 반응에 있는 새로운 중요한 분자를 탐구하고 확인하는 것을 도울 것입니다.
인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스 모형을 가진 연구 결과에서는, 체중 감소는 마우스 이환율의 일반적으로 이용된 표시기입니다. 인플루엔자 바이러스 감염 마우스에서 예상되는 체중 변화 운동학은 마우스에서 유도된 적절한 ...

최근 10 년 동안, 수많은 연구는 새로 확인 된 CD4+ T 세포 서브 세트에 초점을 맞추고있다, Tfh 세포 하위 집합, 발아 센터 (GC) B 개발에 필수적인 역할에 대한. B세포 림프종 6(Bcl6)은 주로 유전자 억압자로 간주되는, Bcl6의 자궁외 발현이 Tfh 분화를 유도하기에 충분하다는 증거를 위해 Tfh 세포의 계보-정의 인자이며 Bcl6의 결핍으로 인해 Tfh 분화1,2,3이사라졌다. 다른 CD4+ T 도우미 서브세트가 염증 부위로 이동하여 이펙터 기능을 수행하는 것과 달리, Tfh 세포는 주로 비장 및 림프절의 B 세포 여포 영역에서 B 세포 도움을 제공한다. 공동 자극 분자 ICOS 및 CD40L, Tfh와 GC B 세포 사이의 상호 작용에 중요한 역할을한다. Tfh 분화 동안, ICOS는 코그네이트 B 세포로부터 필요한 신호를 전송하고 또한 B 세포 영역국소화4,5에대한 방관자 B 세포로부터 이동 신호를 수신 수용체 역할을한다. CD40L은 B 세포 증식 및 생존6을위한 Tfh 세포로부터의 신호 의 중재자이다. CD40L과 유사한 역할을 하는 또 다른 요인은 주로 Tfh 세포에 의해 분비되는 사이토카인 IL21이다. IL21은 GCB 세포의 개발 및 고친화항체의 생산을 직접 규제하지만 Tfh 분화에서의 역할은 여전히 논란의 여지가있는7,8. 현재 유동 세포 분석에서 Tfh 세포를 식별하는 데 가장 빈번하게 사용되는 PD-1 및 CXCR5는 이 하위 집합의 분화 및 기능에 중요한 역할을 합니다. CXCR5는 B 세포 여포 케모키인의 수용체이며 B 세포 여포9에서Tfh 세포의 국소화를 중재한다. PD-1은 이제 여포 유도 기능을 가질 뿐만 아니라 GC B 세포 친화 성숙 과정에서 중요한 신호를 전송하는 것으로 확인된다10. 이러한 사실 인정에 근거하여, 이 분자의 발현을 평가하는 것은 기본적으로 Tfh 세포의 성숙 그리고 기능을 반영할 수 있었습니다.
GC는 이차 림프구 기관에서 유도된 일시적인 미세 해부학 구조이며 Tfh 세포에 크게 의존하므로 Tfh 반응을 평가하기에 완벽한 판독값입니다. GC에서, 세포사화학 및 공동 자극 분자에 의해 매개되는 신호를 수신한 후, B 세포는고친화항체(11)를생성하기 위해 클래스 스위칭 및 체세포 초열의 대상이 된다. 차동 항체 클래스 스위칭은 INγ가 IgG2 급 스위칭12를유도하는 동안 IL4 및 IL21이 IgG1 급 스위칭을 유도하는 차동 사이토카인 틈새 시장에서 발생한다. 혈장 세포는 분비 항체의 생산자이며 말단 분화 세포입니다. Tfh 세포 같이, GC에 있는 B 세포의 발달은 많은 중요한 분자의 동적 발현과 연관됩니다. 현재 연구에 기초하여, GC B 세포는 B220+PNA+Fas+ 또는 B220+GL7+Fas+ 세포 및 혈장 세포로 식별 될 수있다, 자신의 전구체에 비해, B220의 표현을 다운 조절 및 UPregulate CD138 발현13. 더 구체적으로, 이들 특성은 유동 세포측정 및 면역형광 분석에서 검출될 수 있으므로 GC 반응의 적절한 평가가 된다.
강력한 세포 및 유머 반응은 인플루엔자 바이러스 감염에서 유도되며, Tfh 및 Th1 세포가 CD4+ T 세포 반응14를지배하여 Tfh 세포 분화 연구를위한 완벽한 모델입니다. 인플루엔자 A/푸에르토리코/8/34 H1N1(PR8)은 일반적으로 사용되는 마우스 적응 균주이며, 이 연구에서 자주 사용된다14,15,16. 여기에서, 우리는 인플루엔자 바이러스 감염에 있는 Tfh 연구 관련 분석의 몇몇 기본적인 프로토콜을 기술합니다: 1) PR8 바이러스의 비강 내 접종; 2) 항원 특이적 Tfh 세포, GC B 및 혈장 세포 및 유동 세포측정을 갖는 IL21 검출; 3) GC의 조직학적 시각화; 4) ELISA와 혈청에서 항원 특이적 항체 티터의 검출. 이 프로토콜은 Tfh 관련 연구 결과에 있는 새로운 연구원을 위한 필요한 기술을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Tfh 세포, NP 특이적 Tfh 세포 및 Bcl-6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 마우스</td>의 Immunostaining <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bcl-6 PE</td><td>Biolegend</td><td>358504</td><td>클론:7D1</td></tr><tr><td>Biotin-CXCR5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-7185-82</td><td>클론: SPRCL5</td></tr><tr><td>CD4 Percp-eFluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-0041-82</td><td>클론:GK1.5</td></tr><tr><td>CD44 eVolve 605</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>83-0441-42</td><td>클론:IM7</td></tr><tr><td>CD44 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>11-0441-82</td><td>클론:IM7</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553150</td><td>클론 : MEL-14</td></tr><tr><td>ICOS BV421</td><td>Biolegend</td><td>564070</td><td>클론 : 7E.17G9</td></tr><tr><td>PD1 PE / Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135216</td><td>클론 : 29F.1A12</td></tr><tr><td>Streptavidin BV421</td><td>BD Pharmingen</td><td>563259</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>554081</td><td></td></tr><tr><td>IL21< / strong의 세포 내 염색></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>시그마</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>항인간 IgG</td><td>잭슨 면역연구소</td><td>109-605-098</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>시그마</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>인간 FCc IL-21 수용체</td><td>R& D 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이오노마이신</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead 고정성 아쿠아 데드 셀 염색 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>MP</td><td>102855</td><td></td></tr><tr><td>GC B 및 형질 세포 염색</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B220 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-0452-81</td><td>클론:RA3-6B2</td></tr><tr><td>CD138 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>561070</td><td>클론:281-2</td></tr><tr><td>CD95 (FAS) PE/Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557653</td><td>클론:Jo2</td></tr><tr><td>IgD eFluor 450</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5993-82</td><td>클론:11-26c</td></tr><tr><td>PNA FITC</td><td>Sigma</td><td>L7381</td><td></td></tr><tr><td>ELISA를 사용한 HA 특이적 항체 역가의 분석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PR8-HA</td><td>Sino Biological</td><td>11684-V08H</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SSBC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 Ig (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgM (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG1 (SBA 클로노타이핑 시스템-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG2b (SBA 클로노타이핑 시스템-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG2c (SBA 클로노타이핑 시스템-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>TMB 기질 시약 세트</td><td>BD Pharmingen</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>조직학</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG</td><td>Life Technology</td><td>A21434</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse IgD</td><td>Biolegend</td><td>405702</td><td></td></tr><tr><td>biotinylated PNA</td><td>Vector laboratories</td><td>B-1075</td><td></td></tr><tr><td>묽은 Alexa Fluor 488-streptavidin</td><td>Life Technology</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>SouthernBiotech</td><td>0060-01</td><td></td></tr><tr><td>Pro-long gold 안티페이드 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3630</td><td></td></tr><tr><td>STREPTAVIDIN/BIOTIN 차단 키트</td><td>Vector laboratories</td><td>SP-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

인플루엔자 a 바이러스 감염 중 t 여포 도우미 세포 및 발아 센터 반응 평가

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T 여포 도우미 (Tfh) 세포는 발아 센터 (GC) 개발 및 높은 친화도 항체의 생성에 대한 도움을 제공하는 데 전문화 된 독립적 인 CD4+ T 세포 하위 집합이다. 인플루엔자 바이러스 감염에서, 강력한 Tfh 및 GC B 세포 반응은 Tfh 관련 연구를 위한 자격을 갖춘 마우스 모형을 부여하는 효과적인 바이러스 박멸을 촉진하기 위하여 유도됩니다. 이 논문에서, 우리는 마우스에 있는 인플루엔자 바이러스 감염 도중 기본적인 Tfh 관련 면역 반응의 검출에 있는 프로토콜을 기술했습니다. 이러한 프로토콜포함: 인플루엔자 바이러스의 비강 내 접종; 폴리클론 및 항원 특이적 Tfh 세포, GC B 세포 및 혈장 세포의 유동 세포 피진 및 분석; GC의 면역 형광 검출; 혈청에서 인플루엔자 바이러스 특이적 항체의 효소-연결된 면역흡혈구 분석(ELISA). 이러한 분석체는 기본적으로 인플루엔자 바이러스 감염에서 Tfh 세포의 분화 및 기능을 정량화하여 분화 메커니즘 및 조작 전략을 해명하는 연구에 도움을 제공합니다.

인플루엔자 바이러스 감염에서 마우스 이환율의 특성화 인플루엔자 바이러스 감염 후, 마우스는 질병으로 인해 덜 활동적이고 식욕 부진이며, 이는 심각한 체중 감소에 의해 반영되며, 마우스 이환율을 모니터링하는 데 일반적으로 사용되는증상(19). 도 1에도시된 바와 같이, PR8 바이러스 감염 마우스는 6일째에 체중 감량을 시작하여 8일째 가장 높은 손실 수준에 도달하고 10일째에 초기 수준으로 돌아왔다. 예상대로, 체중 감소는 PBS 처리된 대조군 마우스에서 의 기간 내내 모두 관찰되지 않았다. 생체 내 증상의 경우, 바이러스 감염은 배수 림프절, mLN에서 강력한 림프구 확장으로 이어집니다. 따라서, MLNs의 크기가 훨씬 큰 크기는 대조군마우스(도 1b)보...

이 논문은 인플루엔자 바이러스 감염의 마우스 모형에 있는 Tfh 및 GC B 반응을 평가하는 프로토콜을 기술합니다.

인플루엔자 A 바이러스 감염 중 T 여포 도우미 세포 및 발아 센터 반응 평가

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

T 여포 도움 세포는 친화성이 높은 동물 생산에서 B 세포에 도움을 제공하는 새로 확인된 CD4 T 세포 하위 집합입니다. 인플루엔자 바이러스 감염에서 Tfh 세포의 식별을 입증하는 것은 새로운 연구자들이 Tfh 관련 연구에 필요한 기술을 수행하는 방법을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 부적절한 바이러스 역가는 폐사를 유발하거나 면역 반응이 너무 약할 수 있으므로 실험을 수행하기 전에 역가를 결정하는 것이 좋습니다.8주 된 수컷 C57 검은색 6마리의 마우스에 대한 PR8 바이러스 접종용. 생물 안전성 레벨 2 조건에서 얼음 위에서 섭씨 영하 80도의 저장된 PR8 바이러스 스톡을 해동합니다. 균질한 용액을 얻기 위해 바이러스를 소용돌이치십시오.미리 냉각된 1.5ml 튜브에 바이러스를 PBS 마이크로리터당 2개의 플랫폼 유닛으로 희석하고 마취된 동물에서 발가락 꼬집음에 반응이 없음을 확인합니다. 바이러스를 다시 소용돌이치게 합니다. 20마이크로리터 피펫 팁에 10마이크로리터의 바이러스를 로드합니다.최대 3마리의 진정제를 투여한 동물의 나리 하나에 바이러스 방울을 조심스럽게 떨어뜨린 후 다른 쪽에서도 접종을 반복합니다. 그런 다음 흉골 누운 모든 마우스를 완전히 회복될 때까지 모니터링하면서 따뜻한 케이지에 놓고 10일 동안 매일 각 마우스의 무게를 잰다. 실험이 끝나면 생쥐를 생물 안전성 레벨 2 층류 후드에 넣고 첫 번째 동물을 흡수성 종이로 덮인 폼 해부 보드에 고정합니다.해부 가위를 사용하여 복부 정중선을 따라 피부를 자르고 핀셋으로 피부를 늘리고 피부를 해부 보드에 고정합니다. 복막을 열어 비장을 채취하고 1% FBS가 보충된 5ml의 DMEM이 들어 있는 6cm 접시가 있는 70마이크로미터 필터에 비장을 넣습니다. 횡격막과 갈비뼈를 흉선까지 분리하고 갈비뼈를 옆으로 고정하여 흉강을 노출시킵니다.폐와 심장을 움직여 기관의 복부 쪽 근처에 있는 종격동 림프절을 찾습니다. 그런 다음 5ml의 배지가 들어 있는 두 번째 6cm 접시에 자체 거름망에 있는 림프절을 놓고 3ml 주사기 플런저를 사용하여 두 거름망의 그물망을 통해 두 조직을 부드럽게 으깬다. 각 스트레이너를 1ml의 새 DMEM과 FBS로 헹구고 세포 현탁액을 개별 15ml 원심분리 튜브로 옮깁니다.원심분리로 세포를 수집하고 튜브당 1ml의 새로운 DMEM과 FBS에 펠릿을 완전히 재현탁합니다. 그런 다음 비장 세포 현탁액에 배지 4ml를 더 넣고 두 튜브를 얼음 위에 놓습니다. CXCR5 발현을 위해 세포를 염색하려면 튜브를 여러 번 뒤집어 샘플당 6개의 세포에 2배 10개를 혼합하고 개별 FACS 튜브로 이동합니다.각 튜브에 2ml의 염색 완충액을 추가하고 와류로 세포를 혼합합니다. 원심분리로 세포를 펠렛화하고 상등액을 버립니다. 흡수성 종이에 각 튜브를 두 번 부드럽게 두드리고 두 개의 바닥을 부드럽게 튕겨 잔류 상층액의 세포를 다시 현탁시킵니다.튜브당 0.2마이크로리터의 Fc 수용체 블록으로 비특이적 결합을 차단하고 튜브를 부드럽게 두드려 섞은 후 튜브를 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 배양이 끝나면 각 튜브에 0.3 마이크로 리터의 비오틴 안티 마우스 CXCR5를 넣고 부드럽게 튕겨서 섞습니다. 튜브를 얼음 위에 1시간 동안 놓고 30분씩 부드럽게 튕깁니다.배양이 끝나면 2ml의 염색 완충액을 튜브에 추가하고 와류를 혼합하여 원심분리로 세포를 침전시키기 전에 혼합합니다. 상등액을 버리고 플릭하여 잔류 완충액의 세포를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 놓고 방금 설명한 대로 표에 설명된 대로 관심 표면 마커에 대한 항체로 세포를 표시합니다.배양이 끝나면 2ml의 염색 완충액으로 세포를 세척하고 유세포 분석을 위해 각 펠릿을 400μl의 새로운 염색 완충액에 재현탁합니다. PR8 바이러스에 감염된 마우스는 6일째부터 체중 감량을 시작하여 8일째에 가장 높은 체중 감량에 도달하고 10일째에 초기 체중 수준으로 돌아갑니다. 예상대로, 체중 감소는 PBS 처리된 대조군 마우스에서 관찰되지 않았다.바이러스 감염은 또한 배출되는 림프절 내에서 강력한 림프구 확장을 유도합니다. 유세포 분석에서 관찰된 바와 같이, T 여포 도움 세포 분화는 대조군 동물에 비해 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스에서 유도된 T 여포 도움 세포의 강력한 수로 감염 후 5일째에 초기화되고 10일째에 최고조에 달합니다. 또한, 종격동 림프절과 비장 모두에서 인플루엔자 항원 특이적 CD4 양성 T 세포 수는 PR8 동물에서 PD-1 양성 CXCR5 양성 세포의 개체군이 증가한 대조군 마우스에서 관찰된 것과 비교하여 유의하게 유도됩니다.또한, IL-21에 대한 세포 내 염색은 PR8 감염이 바이러스 감염에 대한 반응으로 이 사이토카인의 생산을 현저히 높게 유도한다는 것을 밝혔습니다. 면역형광 염색은 PR8에 감염된 마우스에서 유도된 생식 중심 반응의 존재를 나타내고, ELISA는 바이러스에 감염된 동물에서 인플루엔자 바이러스 특이적 항체의 생성을 나타냅니다. 얼룩의 품질은 염색 온도와 시간의 영향을 받기 때문에 한 시간 동안 얼음에서 CXCR5 염색을 수행하는 것이 중요합니다.CXR5 및 IL-21 염색을 입증했지만, 이 방법으로 다른 표면 마커, 전사 인자 및 사이토카인을 평가하여 Tfh 분화 및 기능에 대한 다양한 정보를 제공할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

두 가지 유세포 분석 기반 방법인 체외 T 세포 프라이밍 분석 및 세포 내 사이토카인 염색을 사용하여 수지상 세포의 항원 제시 능력과 마우스의 웨스트 나일 바이러스 돌연변이 감염에 대한 항원 특이적 T 세포 반응을 측정했습니다.

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

백신이 어떻게 작용하는지에 대한 전반적인 지식이 부족합니다. 여기에서는 수지상 세포와 T 세포 면역에 특히 중점을 두고 백신에 대한 초기 숙주 면역 반응에 대한 통찰력을 얻기 위해 역유전학과 골수 키메라 마우스를 함께 사용할 것을 제안합니다.

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

인플루엔자 A 바이러스 (IAVs)는 중요 한 인간의 호흡기 병원 균. IAVs pathogenicity 이해 하 고 새로운 백신 접근의 전 임상 시험 수행 인간의 생리를 흉내 낸 동물 모델은 필요. 여기, 우리가 IAV pathogenesis, 체액 성 반응과 감염 마우스 모델을 사용 하 여 백신 효능을 평가 하는 기법을 설명 합니다.

감염 마우스 모델에서 인플루엔자 A 바이러스 연구

항 체에 의해 그 대상 인플루엔자 바이러스 조류 Fc 중재 effector 기능 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 또한 Fc 중재 면역 유도의 단일 클론 항 체 또는 polyclonal 세라 다른 바이러스 표면 glycoproteins를 대상으로 능력을 평가 하기 위해 적응 수 있습니다.

독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법

Zika 바이러스 (ZIKV) 감염에 대 한 Ifnar1-/- murine 모델의 immunoprivileged 장기에 항 원 특정 T 세포 응답을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 보호의 셀룰러 메커니즘 및 immunopathogenesis ZIKV 백신의 조사에 대 한 중추적인 이며 또한 그들의 효능 평가 위한 귀중 한.

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

이 연구에서는 선물이 인플루엔자 바이러스 감염 후 murine tracheal 점 막에서 2 광자 intravital 이미징 및 세포 상호 작용 분석을 수행 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 호흡기 감염 시 면역 세포 역학을 공부 하는 연구자와 관련이 있을 것입니다.

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

이 논문은 바이러스 감염 동안 폐렴구균이 무증상 집락 상태에서 질병을 유발하는 병원체로 전환하기 위한 새로운 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 질병 진행의 여러 단계 동안 다양한 숙주에서 다미생물 및 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

바이러스 동시 감염 시 콜로니자에서 병원체로 Streptococcus pneumoniae 의 전환을 위한 마우스 모델은 연령 악화 질병을 요약합니다.

현재 연구는 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신을 평가하고 이러한 세포에서 유전자 발현을 조작하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근

이 프로토콜은 IAV의 비강내 투여 및 마우스 폐 손상 및 폐 세포 유형에 대한 관련 전사 변화의 다운스트림 분석에 대한 지침을 제공합니다.

인플루엔자 감염 후 이형성 및 기능적 폐포 복구 모델링

배우세요 인플루엔자 A 바이러스 감염 시 T 여포 도우미 세포 및 발아 센터 B 세포 반응을 평가하는 방법을 C57BL/6 마우스 모델에서. 이 프로토콜은 면역학 연구자들이 고친합성 항체 생성에 필수적인 Tfh 세포 기능을 이해하는 데 도움을 줍니다.

인플루엔자 A 바이러스 감염 중 T 여포 도우미 세포 및 발아 센터 반응 평가

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