Name: 자유롭게 수영 물고기에서 이동 식 Tetrodes에 의해 뉴런의 무선 전기 생리적 기록 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 학습하세요 자유롭게 수영하는 금붕어의 뇌에서 무선 전기생리학적 신호 기록 방법을 통해 행동 신경과학 연구를 수행하는 기법을. 이 방수 장치는 수중 환경에서 실시간 신경 활동 측정을 가능하게 합니다.

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우리는 나추움 울라노프스키와 울라노프스키 연구소의 모든 도움에 감사드립니다. 또한, 우리는 도움이 기술 지원을 탈 노보 플랑 스키 - Tzur에 감사드립니다. 우리는 이스라엘 과학 재단의 재정적 지원을 감사하게 생각합니다 - 첫 번째 프로그램 (부여 번호 281/15), 네게브의 벤 구리온 대학의 농업, 생물학 및 인지 로봇 이니셔티브를 통해 헬름슬리 자선 신탁.

모든 수술 절차는 동물 복지에 관한 지역 윤리 위원회(예: IACUC)의 승인을 받아야 합니다.
1. 마이크로 드라이브 하우징 의 건설
<ol><li>하우징을 구성하려면 1mm 너비의 황동 플레이트를 톱을 사용하여 19mm x 29mm x 1mm 플레이트로 자른다. 각 슬릿이 좁은 면에서 6.5 mm 떨어져 있도록 가장자리에 수직으로 긴 면각각에 두 개의 5.5 mm 슬릿을 잘라냅니다(그림 2A).</li>
	<li>펜치를 사용하여 긴 측면의 슬릿 사이의 영역을 안쪽으로 접은 다음 아래쪽 부분을 안쪽으로 접고 위쪽을 바깥쪽으로 접어 하우징을 얻습니다(그림2B,C).</li>
	<li>3mm 드릴 비트를 사용하여 마이크로 드라이브 하우징의 나사 구멍을 만듭니다. 참고: 이러한 구멍은 나중에 하우징을 로거 박스에 부착하는 데 사용됩니다(그림2D).</li>
	<li>하우징의 측면을 납땜합니다.</li>
	<li>미세한 원형 파일을 사용하여 하우징 하단에 반원형 슬릿을 반경 1.5 mm의 작은 생성합니다(그림2E). 참고: 이것은 전극을 안내하기 위해 스테인레스 스틸 튜브를 삽입하는 데 나중에 사용됩니다.</li>
	<li>1mm 드릴 비트를 사용하여 테트로드의 하우징 뒷면에 구멍을 뚫습니다(그림2F). 참고: 하우징의 3D 모델은 보조 housing.stl 파일에서찾을 수 있습니다.</li>
</ol>2. 마이크로 드라이브의 건설
<ol><li>커터를 사용하여 단일 행 남성 핀 헤더 스트립(그림 1H)에서3핀 조각을분리합니다. 펜치를 사용하여 가운데 핀을 당깁니다.</li>
	<li>커터를 사용하여 나머지 핀을 길이 10mm(나사 길이보다 2mm 낮음)로 자른다. 또 다른 가능성은 더 긴 나사를 사용하는 것입니다 (단계 2.4 참조).</li>
	<li>중간 핀 구멍을 통해 #65 드릴 비트를 사용하여 구멍을 뚫습니다. 00−99 탭을 사용하여 스레드를 드릴합니다.</li>
	<li>마이크로 드라이브와 황동 플레이트 (7.5 mm x 2.5 mm x 0.6 mm, 보조 그림 4참조)를 조립하여 황동 플레이트가 핀에 닿는 것을 확인하십시오. 첫 번째 황동 플레이트를 통해 나사 (#00-90 라운드 헤드, 12mm, 황동)를 삽입 한 다음 핀 헤더 스레드와 두 번째 황동 플레이트를 통해 삽입하십시오. 마지막으로 너트를 나사에 놓고 조립된 마이크로드라이브를 부드럽게 조입니다.</li>
	<li>황동 플레이트와 함께 핀을 납땜하고 나사 끝으로 너트를 납땜합니다.</li>
	<li>마이크로 드라이브 황동 플레이트의 측면에 있는 4개의 지점에서 마이크로드라이브 하우징에 마이크로드라이브를 납땜합니다.</li>
	<li>내경 1.5mm의 내경으로 6mm 길이의 스테인레스 스틸 튜브 1개를 자르고 내경 1.2mm의 다른 스테인레스 스틸 튜브를 3mm 길이로 자르십시오.</li>
	<li>에폭시를 사용하여 마이크로 드라이브 하우징 하단의 작은 반원형 슬릿에 6mm 길이의 튜브를 붙입니다. 3mm 길이의 스테인리스 스틸을 핀 헤더에 붙이고 하우징에 6mm 길이의 튜브를 부착합니다.</li>
	<li>직경 0.64mm의 5cm 길이의 실리콘 튜브 세그먼트 2개와 직경 0.250mm의 5cm 길이의 폴리이미드 튜브 1개를 잘라냅니다.</li>
	<li>세 개의 튜브를 두 개의 스테인리스 스틸 튜브에 삽입합니다. 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 핀 헤더에 부착된 스테인리스 스틸 튜브에 튜브를 붙입니다. 마이크로 드라이브를 끝까지 조이고 두 개의 강철 튜브의 상단과 하단에서 과도한 튜브를 차단합니다. 참고: 하우징이 있는 마이크로 드라이브를 사용할 준비가되었습니다(그림 1C).</li>
</ol>3. 테트로드 어레이 준비
<ol><li>각 tetrode에 4 개의 전극이있는 2 tetrode 임플란트를 제작하려면 직경 25 μm 의 텅스텐 와이어 중 12cm 길이의 Formvar 절연 된 8 개의 와이어를 준비하십시오. 참고: 동일한 디자인은 4 개의 테트로드를 수용 할 수 있습니다.</li>
	<li>현미경 아래에 16채널 전극 인터페이스 보드(EIB-16) PCB용 홀더를 놓습니다(재료 표참조).</li>
	<li>부드러운 팁 트위저와 라이터를 사용하여 불꽃을 사용하여 한쪽에 있는 8개의 전선각각에서 코팅을 제거합니다. 참고: 이는 나중에 와이어가 PCB 커넥터에 제대로 연결되도록 하기 위한 것입니다.</li>
	<li>구멍에 코팅 된 면으로 EIB-16의 구멍 중 하나에 와이어를 밀어 넣습니다. 핀을 놓고 펜치를 사용하여 누릅니다. 와이어의 핀과 코팅되지 않은 면 사이의 저항을 측정하여 연결을 확인합니다. 참고: 저항은 옴의 수십의 순서에있다.</li>
	<li>8개의 와이어를 모두 가지고 3.4 단계를 반복합니다.</li>
	<li>각 와이어의 끝에 덕트 테이프를 사용하여 함께 네 개의 와이어의 두 그룹을 테이프. 참고: 각 그룹은 나중에 함께 붙어 테트로드를 형성합니다.</li>
	<li>50 μm 직경으로 12cm 길이의 텅스텐 와이어 한 조각을 잘라냅니다. EIB-16 연결 중 하나에 연결합니다. 참고: 이 와이어는 기준 전극역할을 할 것이다.</li>
	<li>75 μm 직경으로 12cm 길이의 베어 실버 와이어 2개를 자르면 기록 로거의 근거가 됩니다. EIB-16의 접지 연결에 두 와이어를 납땜합니다.</li>
	<li>EIB-16을 전동 선삭 장치 위에 놓고 전동 튜닝 장치에 4개의 와이어로 구성된 한 그룹의 덕트 테이프 끝을 놓습니다. 시계 방향으로 130라운드를 적용한 다음 시계 반대 방향으로 20회 회전합니다. 티트로드를 덮기 위해 시아노아크릴레이트 접착제를 바친다.</li>
	<li>접착제가 치료될 때까지 기다립니다. 덕트 테이프 에 가까운 tetrode를 잘라.</li>
	<li>두 번째 tetrode와 3.9 및 3.10 단계를 반복합니다. 참고: 이렇게 하면 완성된 2-테로드어레이(도 1D)가생성된다.</li>
</ol>4. 임플란트 조립
<ol><li>마이크로 드라이브를 끝까지 나사로 조입니다.</li>
	<li>1 x 3M 필립스 라운드 헤드 나사를 사용하여 EIB-16을 PVC 플레이트에 부착하십시오.</li>
	<li>소프트 엔드 핀셋을 사용하여 로거 박스 커버 앞면의 구멍을 통해 모든 테트로디와 와이어를 당깁니다.</li>
	<li>2 x 6M Phillips 플랫 헤드 나사를 사용하여 PVC 플레이트를 로거 박스 커버에 부착합니다. EIB-16 에 로거를 장착할 수 있도록 EIB-16 커넥터를 올바른 방향으로 유지합니다. 기록된 신호의 모션 아티팩트를 피하기 위해 EIB-16이 제자리에 고정되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>에폭시를 사용하여 상자에 와이어를 밀봉합니다. 1차 밀봉은 나중에 실온 가황(RTV)에 의해 수행되기 때문에 가능한 한 적게 적용하십시오.</li>
	<li>2mm 나사를 사용하여 마이크로 드라이브 하우징을 로거 박스 커버에 부착합니다.</li>
	<li>마이크로 드라이브 하우징 뒤쪽의 구멍을 통해 테트로데스와 모든 와이어를 나사로 연결합니다. 마이크로 드라이브의 두 실리콘 튜브를 통해 테트로드를 스레드합니다. 마이크로 드라이브의 폴리이미드 튜브를 통해 50 μm 텅스텐 와이어를 스레드합니다.</li>
	<li>움직임이 마이크로 드라이브와 일치하는지 확인하기 위해 튜브의 상단끝에 시아노 아크릴레이트 접착제를 적용하여 테트로데스와 와이어를 튜브에 붙입니다. 마이크로 드라이브를 끝까지 나사로 조입니다.</li>
	<li>움직임을 방지하기 위해 노출 된 테트 로드 및 마이크로 드라이브 하우징 내부의 전선에 부드러운 석유 (재료 표참조)를 적용하십시오.</li>
	<li>가열 된 면도날을 사용하여 12mm x 14.5 mm 페트리 접시 바닥 창을 잘라냅니다. 에폭시가 있는 마이크로드라이브 하우징 전면에 창을 부착합니다. 접지 선을 창 외부에 보관하십시오.</li>
	<li>로거 박스 커버와 마이크로드라이브 하우징 사이에 노출된 테트로데스와 와이어에 RTV 코팅을 적용합니다.</li>
	<li>RTV가 경화되면 내부에 작은 무게로 상자를 닫고 밤새 물에 담그어 상자에 물이 새지 않도록하십시오.</li>
	<li>날카로운 가위를 사용하여 테로데스와 레퍼런스 와이어를 원하는 길이로 자른다.</li>
	<li>표시된 압출 폴리스티렌 폼(재료 표참조)을 상자에 부착합니다. 수조에 잠길 때 부력이 균형을 이루지 않도록 크기를 조정합니다.</li>
	<li>tetrode 팁을 백금 블랙 용액에 담그고 직접 전류 (-0.2 μA)를 사용하여 전극을 코팅하고 원하는 대로 전극의 임피던스를 설정하십시오. 코팅 및 임피던스 측정에는 다중 전극 임피던스 테스터(재료 표참조)를 사용합니다. 참고: 금붕어 골륨에서는 40 kOhm의 값이 가장 좋습니다. 용도에 따라, 전극 임피던스는 백금 블랙코팅(10,11)을변형시킴으로써 조절될 수 있다.</li>
</ol>5. 마취 준비 — 1% MS-222 주식 솔루션
주의 사항: 마취 제제에는 발암 물질인 분말 MS-222의 사용이 포함됩니다. 따라서 5.2 단계와 5.3 단계는 장갑을 사용하여 화학 후드에서 수행해야합니다.
<ol><li>100 mL 이상을 포함할 수 있는 튜브에 100 mL의 물을 추가합니다.</li>
	<li>화학 후드에 일회용 웨이트 플레이트를 스케일에 놓습니다. 주걱을 사용하여 MS-222 분말 1 g을 추가 한 다음 튜브에 분말을 추가합니다.</li>
	<li>튜브를 잘 흔들어주세요. 참고: 액체 형태로, MS-222장갑을 착용 화학 후드 외부에서 사용할 수 있지만 마스크를 필요로하지 않습니다.</li>
	<li>일회용 가중치 플레이트를 저울에 놓습니다. 주걱을 사용하여 중탄산나트륨 2 g을 추가 한 다음 튜브에 분말을 추가합니다. 튜브를 잘 흔들어주세요.</li>
</ol>6. 물고기 두개골 준비
참고: 이 단계에서 물고기는 임플란트 수술을받을 준비가되어 있습니다. 수술 전에 모든 구성 요소와 소모품이 적절한 절차에 의해 멸균되었는지 확인하십시오. 이 단계에서는 물 밖으로 U 자형 물고기 홀더가 필요합니다. 이 프로토콜에서는 머리에서 꼬리까지 15cm 길이의 긴 금붕어에 맞는 알루미늄 홀더가 사용됩니다. 이 시스템은 아가미를 산소로 정중시키면서 물고기를 물 밖으로 내보올 수 있습니다. 자세한 내용은 비바인핀스키 외8을참조하십시오.
<ol><li>물고기가 잠들 때까지 20 분 동안 0.02 % MS-222 수조에 물고기를 놓습니다.</li>
	<li>멸균 장갑을 사용하여 물고기를 물에서 꺼내 홀더에 놓습니다. 참고: 물고기를 정현으로 하는 산소화된 물은 0.02%의 농도로 MS-222를 함유하고 있어 수술 중 에도 물고기가 마취된 상태로 유지됩니다.</li>
	<li>멸균 주걱을 사용하여, 리도카인을 적용 5% 수술에 대한 지정된 장소 위의 피부에 페이스트 10 분, 다음 리도카인을 제거. 참고: 특정 뇌 영역을 대상으로 적절한 뇌 아틀라스를 참조하십시오.</li>
	<li>멸균 15 블레이드 메스를 사용하여 임플란트 부위의 두개골 위의 피부를 제거하십시오.</li>
	<li>0.7mm 드릴 비트가 있는 치과 드릴을 사용하여 두개골에 4개의 구멍을 뚫습니다. 각 구멍에 1mm 나사(길이 3mm)를 삽입하고 나사를 삽입하기 전에 구멍에 시아노아크릴레이트 접착제를 적용합니다.</li>
	<li>치과 용 버니셔를 사용하여 나사와 노출 된 두개골 주변에 치과 시멘트를 적용하십시오.</li>
	<li>치과 드릴을 사용하여 관심있는 뇌 영역 위의 두개골에 5mm 직경의 구멍을 만듭니다. 두개골과 뇌 사이의 지방 조직을 제거하고 미세 핀셋과 연조직 종이를 사용하여 뇌 영역 대상을 노출. 두개골 아래의 큰 혈관이 손상되지 않도록주의하십시오. 참고: 이 단계가 끝날 때까지 물고기는 프로브를 이식할 준비가 됩니다. 이 프로토콜과 관련된 주요 단계만 여기에 설명되어 있습니다. 몇 가지 수술 후 절차 (예 : 동물의 건강과 수술 도구 및 지역의 살균에 대한 자세한 문서)는 물고기 또는 작은 동물과 모든 수술에 적용 할 수 있기 때문에 제시또는 논의되지 않습니다.</li>
</ol>7. 프로브 이식
참고: 프로토콜의 마지막 단계를 완료하려면 뇌에 삽입되는 동안 임플란트를 제자리에 고정할 수 있는 조작자가 필요합니다.
<ol><li>조작기를 사용하여 로거 박스 덮개를 물고기 뇌를 향해 테트로드가 아래로 향하도록 합니다.</li>
	<li>테트로드가 뇌로 낮아질 때 참조가 뇌 외부에 유지되도록 기준 전극을 구부립니다.</li>
	<li>두개골에 맞도록 근거를 잘라냅니다. 선택적으로, 두개골 나사 중 하나에 하나의 접지 와이어를 연결합니다.</li>
	<li>마이크로 드라이브 하우징의 하단 부분이 두개골 근처에있는 동안 전극이 뇌에 삽입되도록 임플란트를 낮춥니다.</li>
	<li>하우징과 가장 가까운 두개골 나사 사이에 소량의 치과 시멘트를 적용하여 임플란트를 두개골에 부착하십시오.</li>
	<li>치과 시멘트의 첫 번째 부분이 경화 된 후 치과 시멘트를 적용하고 두개골 과 노출 된 두개골 위의 구멍을 닫습니다. 참고: 일반적으로 전체 노출 된 두개골을 덮기 위해 여러 라운드의 치과 시멘트 응용 프로그램이 필요합니다.</li>
	<li>로거와 배터리를 상자에 설치하고 모든 나사로 상자를 밀봉하십시오.</li>
	<li>실험에 사용되는 생선의 종류에 따라 항생제와 국산 진통제를 적용하십시오.</li>
	<li>물고기가 깨어나기 시작할 때까지 물고기의 아가미를 깨끗한 물로 씻어 내보섭습니다. 홀더에서 물고기를 제거하고 홈 탱크에 다시 놓습니다. 참고: 물고기는 수술 후 60 분 이내에 완전히 회복됩니다.</li>
	<li>물고기가 임플란트로 자유롭게 수영 할 수 있는지 확인하십시오(그림 3, 보조 비디오 1). 필요한 경우, 물고기가 쉽게 균형을 잡을 수 있도록 로거 박스 위의 압출 폴리스티렌 폼의 크기를 재조정하십시오.</li>
</ol>

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<li>Zottoli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+the+startle+reflex+and+Mauthner+cell+auditory+responses+in+unrestrained+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlation of the startle reflex and Mauthner cell auditory responses in unrestrained goldfish.</a> Journal of Experimental Biology. 66 (1), 243-254 (1977).</li>
<li>Canfield, J. G., Rose, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Mauthner+neurons+during+prey+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%22%5BJournal%5D)">Activation of Mauthner neurons during prey capture.</a> Journal of Comparative Physiology A. 172 (5), 611-618 (1993).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜은 자유롭게 수영 금붕어의 말살망에 tetrode 배열을 이식에 관련된 단계를 자세히 설명합니다. 이 기술은 뇌의 테트로드 위치를 조정할 수있는 마이크로 드라이브와 함께 최대 16 채널에서 획득 한 신호를 증폭하고 기록하는 신경 로거를 구현합니다. 마이크로 드라이브는 기록을 최적화하기 위해 뇌의 위치를 조정할 수 있습니다.
이 프로토콜은 다른 뇌 영역(유사한 기술을 사용하여 광학 지각에서 기록하기 위한 Vinepinsky et al.8 참조) 또는 15cm 길이 이상의 다른 수생 동물(금붕어 머리에서 꼬리까지 거의 100그램 무게)에서 기록을 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 물에 침투할 수 있는 주파수에서 통신하는 한 모든 데이터 로거와 함께 작동하도록 수정할 수 있습니다. 여기서 사용되는 로거는 900MHz의 무선 주파수를 사용하여 통신하며 약 20cm의 물을 통해 통신할 수 있습니다. 2.4 GHz의 무선...

물고기는 척추동물의 가장 크고 가장 다양한 그룹이며, 다른 척추동물과 마찬가지로 탐색, 사교, 수면, 사냥 등과 같은 복잡한 인지 능력을 발휘합니다. 그럼에도 불구 하 고, 물고기 행동을 지배 하는 신경 메커니즘 은 대부분 알 수 없는 남아.
지난 수십 년 동안, 고정 된 물고기에서 세포 외 기록은 주로 행동1,2의신경 기초의 다른 측면을 조사하기 위해 구현되었습니다. 이 기술은 일부 감각 시스템에 적합하지만, 고정화 동물에서 불가능하지 않은 경우 행동의 신경 기초의 전체 스펙트럼의 조사는 어렵다. 첫 번째 발전은 테더 드 수영 물고기3,4의Mauthner 세포에서 녹음을 포함. 그러나 Mauthner 셀은 불균형적으로 크고 몇 mV만큼 높게 갈 수있는 기록 된 동작 전위 진폭은 기록을 용이하게합니다. 나중에 Canfield 등은물고기5의 말레전성에서 기록하기 위해 테더된 동물을 사용할 때 개념 증명을 설명했습니다. 물고기에서 신경 활동을 기록 하기 위한 또 다른 최근 기술은 칼슘 이미징 (오거와 드 폴라비에야6에의해 리뷰를 참조, 그리고 Vanwalleghem외. 7). 이 기술은 피부와 두개골이 애벌레 단계 동안 투명하기 때문에 얼룩말 유충과 함께 사용하기 위해 개발되었다. 그러나 이 기술은 개발 의 후반 단계에서 복잡한 행동을 연구하는 데 사용할 수 없습니다.
여기에서, 우리는 자유롭게 수영 물고기의 두뇌에서 세포 외 신경 활동을 기록하기위한 새로운 기술을 제시한다. 이것은 Vinepinsky 외8에설명 된 프로토콜의 수정 된 버전입니다. 주요 혁신은 수술 후 전극의 위치를 제어 할 수 있게하는 마이크로 드라이브의 추가입니다. 이 기술은 마이크로 드라이브를 통해 신경 데이터 로거에 연결된 테트로데스 세트를 사용하여 금붕어의 말살망에서 기록하도록 설계되었습니다. 전체 설정은 무선이며 물고기의 두개골에 고정되어 있습니다. 시스템의 특정 무게는 물고기가 자유롭게 수영 할 수있는 작은 플로를 추가하여 물 특정 무게에 균등화됩니다.
이 기술은 온보드 메모리 장치에 신호를 증폭, 디지털화 및 저장하는 신경 데이터 로거를 사용합니다. 로거 원격 분석 시스템은 레코딩을 시작하고 중지하고 비디오 카메라와 동기화하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜에서는 마이크로드라이브와 함께 방수 상자에 내장된 16채널 신경 로거가 사용됩니다.
마이크로 드라이브 어셈블리는 마이크로 드라이브 자체와 마이크로 드라이브 하우징(그림 1A, B)의두 가지 주요 구성 요소에서 제작됩니다. 하우징은 마이크로드라이브와 테트로젠을 보유하며, 또한 두개골과 로거 박스 사이의 앵커역할을한다(도 1C). PVC 로거 박스는 기계 공정을 사용하여 제작되고 O-링(도1E-G, 보조 도 1, 보충 도2 및 3차원 [3D] 다이어그램에 대한 보충 도면 3참조)을 사용하여 밀봉됩니다. 한쪽 끝에서, 폴리스티렌 폼의 조각은 임플란트의 무게를 보상하고 부력 중립 임플란트와 물고기를 제공하기 위해 로거 상자에 부착된다. 프로토콜에 기재된 마이크로드라이브의 구성은 Vandecasteele등 9에 의해 제시된 절차를 따르며, 하우징에 마이크로드라이브를 부착하는 변형을 갖는다(도1A). 모든 주요 단계가 표시됩니다.
물고기 두개골을 준비하는 프로토콜에 기재된 절차는 Vinepinsky etal.8에 제시된 것과 유사하며 프로토콜에 간략하게 설명된다. 수술 후 하루, 물고기는 일반적으로 완전히 마취의 효과에서 회복하고 행동 실험에 대한 준비가되어 있습니다. 마이크로 드라이브 나사를 돌려 테트로드 위치를 조정할 수 있습니다. 나사는 전체 회전당 300 μm의 간격을 가지며 목표 뇌 위치에 도달 할 때까지 75 μm의 전진을 권장합니다. 적절한 뇌 아틀라스는 관심있는 특정 뇌 영역을 대상으로 상담해야합니다. 배터리 또는 메모리 카드 교체를 위해 물고기를 마취 할 때마다 전극 임피던스를 테스트하는 것이 좋습니다.

<table><tbody><tr><td>0.7mm 원형 드릴 비트</td><td></td><td></td><td>드릴과 호환됩니다.</td></tr><tr><td>15 블레이드 메스</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 채널 PCB 보드</td><td>Neurlynx</td><td>EIB-16</td><td></td></tr><tr><td>1x3M 필립스 플랫 헤드 나사</td><td></td><td></td><td>스테인레스 스틸. 모든 유형.</td></tr><tr><td>1x3M 필립스 라운드 헤드 나사</td><td></td><td></td><td>스테인레스 스틸. 모든 유형.</td></tr><tr><td>27cm x 19cm x 1mm 황동 플레이트</td><td></td><td></td><td>그림 2</td></tr><tr><td>참조 2x6M 필립스 납작머리 나사</td><td></td><td></td><td>스테인리스 스틸. 모든 유형.</td></tr><tr><td>3140 RTV 코팅</td><td>Dow Crowning</td><td>2767996</td><td></td></tr><tr><td>75 &micro; m 은 철사</td><td>A-M 체계</td><td></td><td></td></tr><tr><td>금관 악기 기계 나사 #00-90</td><td></td><td>947-1006</td><td></td></tr><tr><td>금관 악기 판 7.5 mm x 2.5 mm x 0.6 mm</td><td></td><td></td><td>3D 그림은 제공됩니다. 보충 1</td></tr><tr><td>코팅 텅스텐 와이어 25&micro 참조; m</td><td>California Fine Wire Company</td><td>5000160</td><td>응용 프로그램에 따라 사극체는 모든 유형의 전선으로 제작될 수 있습니다. 인기 있는 전선은 더 낮은 직경에서 찾을 수 있는 니크롬 전선입니다(예: AM 시스템, 762000)</td></tr> <tr><td>코팅 텅스텐 와이어 50 &마이크로; m</td><td>A-M Systems</td><td>795500</td> 저임피던스 Cyanoacrilic glue <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dental Burnisher</td><td>ComDent UK</td><td></td>의 다른 전선으로 교체 가능 <td>모든 소형 멸균 스테인리스 스틸 도구가 가능합니다.</td></tr><tr><td>치과용 시멘트 - GCFujiPLUS</td><td>GC</td><td>431011</td><td>다른 치과용 시멘트는 다른 것을 시도한 적이 없지만 아마도 잘 작동할 것입니다.</td></tr><tr><td>치과 드릴 또는 매니큐어 드릴</td><td></td><td></td><td>치과 드릴은 비싸고 매니큐어 드릴은 저렴한 대체품이 될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>드릴 비트 #65</td><td></td><td>947-65</td><td></td></tr><tr><td>빠른 경화 에폭시</td><td></td><td></td><td>5분 경화 에폭시를 여기에 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>O-링 씰링</td><td></td><td></td>이 있는 로거 상자 <td>3D 도면이 제공됩니다. 보충 1-3을 참조하십시오. 상자는 기계로 제작되어야 합니다(3D 프린터를 사용하지 마십시오). 로거의 표시기 LED를 볼 수 있도록 투명 재료를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>전동 터닝 장치</td><td></td><td></td><td>"open ephys" 웹사이트에 설명된 대로 맞춤 제작되었습니다. neurolynx ( "Tetrode Spinner 2.0")에서 구매하거나 다른 방법으로 bulit을 구입할 수도 있습니다.</td></tr><tr><td>Mouselog-16 신경 로거</td><td>Deuteron Technologies Ltd</td><td></td><td>시장에는 SpikeGadget(UH32 32채널) 및 Alexei Vyssotski의 Neurologger 2/2A/2B를 포함하여 여러 신경 로거가 있습니다. 무게는 떠 다니는 스티로폼</td></tr><tr><td>MS-222</td>, <td>시그마 알드리치</td><td>E10521</td>, <td>Ethtl 3- 아미노 벤조 에이트 메탄 설포 네이트 98 %</td></tr> <tr><td>나노 -Z 도금</td><td>백질 LLC</td><td></td>와 균형을 이룰 수 있기 때문에 주요 제약이 아니라는 점에 유의해야합니다<td>. 예를 들어 IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics와 같은 모든 임피던스 미터를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>PCB 핀</td><td>Neurlynx</td><td>Neuralynx EIB 핀</td><td></td></tr><tr><td>폴리미드 튜빙 250 &마이크로; m</td><td>AM 시스템</td><td>822000</td><td></td></tr><tr><td>충전식 배터리</td><td></td><td></td><td>3.7 Lipo 배터리, 370mAh. 약 6시간 분량의 녹음을 할 수 있습니다. 더 작거나 더 큰 배터리를 사용하여 무게를 줄이거나 녹음 시간을 연장할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>실리콘 튜빙 0.64mm</td><td>AM 시스템</td><td>806100</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스강 1.5mm</td><td>AM 시스템</td><td>846000</td><td></td></tr><tr><td>중탄산</td>수소 <td>수듐 시그마 Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>탭 #00-90</td><td></td><td>947-1301</td><td></td></tr><tr><td>바셀린</td><td></td><td></td><td>모든 유형의 연질 석유 피부 보호제를 여기에 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

자유롭게 수영 물고기에서 이동 식 tetrodes에 의해 뉴런의 무선 전기 생리적 기록

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

물고기는 모든 척추 동물의 대부분을 구성하지만 물고기 행동을 지배하는 신경 메커니즘은 대부분 알 수없는 남아있다. 자유롭게 움직이는 물고기에서 뇌 활동을 기록하는 능력은 상당히 물고기 행동의 신경 기초에 연구를 진행합니다. 또한, 뇌의 기록 위치를 정밀하게 제어하는 것은 물고기 뇌의 영역에서 조정 된 신경 활동을 연구하는 데 중요합니다. 여기서는 자유롭게 수영하는 물고기의 뇌에서 무선으로 기록하는 기술을 제시하면서 기록 위치의 깊이를 제어합니다. 이 시스템은 마이크로 드라이브 제어 테트로드에 의해 기록 위치를 조정할 수있는 새로운 수성 호환 임플란트와 관련된 신경 로거를 기반으로합니다. 시스템의 기능은 금붕어의 텔렌세팔론에서 녹음을 통해 설명된다.

녹음 세션 동안 금붕어는 사각 물 탱크에서 자유롭게 수레를 수레로, 말렌세팔론의 신경 활동은 기록되었습니다. 이 실험의 목표는 단 하나 세포의 신경 활동이 물고기의 행동을 결정하는 방법을 연구하는 것이었습니다. 이렇게 하려면 기록된 데이터에서 스파이크 활동을 식별해야 했습니다. 뇌 활동은 기록되는 동안 31,250 Hz에서 디지털화되었으며 데이터 로거에 의해 300 Hz에서 필터링된 하이 패스입니다. 이어서, 오프라인, 밴드 패스 필터(300-5,000 Hz)를 신호에 적용하고, 플루시드 원시 데이터를 각 테트로드의 채널 및 기준 채널로 분리하였다(도4A). 다음으로, 일반적인 스파이크 정렬알고리즘(12)은 단일 세포 활성을 특성화하기 위해 사용되었다. 먼저 각 채널은 최소 스파이크 진폭 임계값(각 채널의 노이즈 레벨에 따라)에 의해 수동으로 필...

자유롭게 수영하는 금붕어의 뇌에서 세포 외 신경 신호를 기록하기위한 새로운 무선 기술이 제시됩니다. 기록 장치는 두 개의 테트로데스, 마이크로 드라이브, 신경 데이터 로거 및 방수 케이스로 구성됩니다. 데이터 로거와 커넥터를 제외한 모든 부품은 맞춤 제작됩니다.

자유롭게 수영 물고기에서 이동 식 Tetrodes에 의해 뉴런의 무선 전기 생리적 기록

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...

우리는 자유롭게 수영 물고기의 뇌에서 세포 외 신경 신호를 기록하는 새로운 방법을 개발했다. 이것은 하루 물고기 행동의 끝에 신경 기계장치를 공부에 문을 엽니다. 이 방법은 유효하고 방수이므로 물고기가 물 탱크에서 자유롭게 수영하는 동안 녹음할 수 있습니다.또한, 기록 위치는 내장 된 마이크로 드라이브에 의해 제어 될 수있다. 우리의 실험실 기술자 인 Tal Zoor-Novoplansky는이 절차를 시연하는 데 도움이 될 것입니다. 하우징을 구성하려면 19mm x 29밀리미터의 치수를 가진 황동 플레이트를 1밀리미터 x 1밀리미터로 사용하십시오.긴 면에 5.5밀리미터 슬릿 2개가 있으며 가장자리에 수직으로 맞습니다. 슬릿은 좁은 면에서 6.5밀리미터 떨어져 있어야 합니다. 펜치를 사용하여 긴 면의 슬릿 사이의 영역을 안쪽으로 접습니다.그런 다음 하우징을 얻기 위해 바닥 부분을 안쪽으로 접고 상부를 바깥쪽으로 접습니다. 다음으로, 나사에 대한 마이크로 드라이브 하우징에 구멍을 만들고 하우징의 측면을 납땜하기 위해 3밀리미터 딜 비트를 사용합니다. 미세 원형 파일을 사용하여 반경이 1.5mm인 하우징 하단에 작은 반원형 슬릿을 만듭니다.1밀리미터 드릴 비트를 사용하면 테트로드용 하우징 뒷면에 구멍이 뚫려 있습니다. 먼저 커터를 사용하여 한 행 남성 핀 헤더 스트립에서 3개의 핀 조각을 분리합니다. 펜치를 사용하여 중간 핀을 가져옵니다.다음으로 커터를 사용하여 나머지 핀을 길이가 10밀리미터로 자른다. 숫자 65 드릴 비트를 사용하여 중간 핀 구멍을 뚫고 더블 제로 99 탭을 사용하여 스레드를 드릴링합니다. 마이크로 드라이브와 황동 플레이트를 조립합니다.핀 헤더 스레드를 통해 두 번째 황동 플레이트를 통해 나사를 삽입합니다. 마지막으로, 나사에 너트를 놓고 조립된 마이크로 드라이브를 부드럽게 조입니다. 황동 플레이트와 함께 핀을 납땜하고 나사의 끝과 함께 너트를 납땜.그 후 마이크로 드라이브의 측면에 있는 4개의 지점에서 마이크로 드라이브 하우징으로 마이크로 드라이브를 납땜합니다. 에폭시 접착제를 사용하여 6mm 길이의 스테인레스 스틸 튜브를 마이크로 드라이브 하우징 의 하단에있는 작은 반 원형 슬릿에 사용하십시오. 3mm 길이의 스테인리스 스틸 튜브를 핀 헤드에 붙이면 하우징에 6mm 길이의 튜브가 줄지어 있습니다.준비된 실리콘 및 폴리이미드 튜브를 두 개의 스테인리스 스틸 튜브에 삽입하고 시아노아크라일트 접착제를 사용하여 핀 헤더에 부착된 스테인리스 도용 튜브에 접착제를 부착합니다. 그런 다음, 마이크로 드라이브를 끝까지 나사로 만들고 두 개의 강철 튜브의 상단과 아래에서 과도한 튜브를 차단합니다. 다음으로 직경 75마이크로미터의 맨손으로 두 개의 베어 실버 와이어를 길이 12cm로 자르고 전극 인터페이스 보드의 지상 연결과 모든 사용되지 않는 채널에 모두 납땜합니다.준비된 텅스텐 와이어 중 하나를 16 채널 전극 인터페이스 보드의 구멍 중 하나에 밀어 넣습니다. 핀을 구멍에 넣고 펜치 한 쌍으로 누릅니다. 연결을 확인하기 위해 핀과 와이어의 코드되지 않은 측면 사이의 저항을 측정합니다.레퍼런스 전극을 위한 50마이크로미터 와이어 1개를 포함하여 준비된 모든 전선에 대해 이 과정을 반복한다. 그런 다음 전극 와이어를 각각 4개의 와이어로 구성된 두 그룹으로 그룹화하고 각 와이어의 끝에 있는 덕트 테이프를 사용하여 함께 테이프를 사용하여 레퍼런스 와이어를 단독으로 남깁니다. 전극 인터페이스 보드를 전동 선회 장치 위에 놓고 장치에 4개의 와이어로 구성된 한 그룹에서 덕트 테이프 끝을 배치합니다.시계 방향으로 130라운드를 적용한 다음 20개의 반시계 방향으로 회전합니다. 그런 다음 시아노아크라일트 접착제를 적용하여 테트로드를 덮습니다. 접착제가 경화 된 후, 덕트 테이프에 가까운 테트로드를 잘라.이 회전, 접착 및 절단 공정을 다른 테트로드에 반복합니다. 먼저 마이크로 드라이브 하우징을 2mm 나사로 로거 박스에 부착합니다. 마이크로 드라이브 하우징 의 뒤쪽 구멍을 통해 테트로다 및 기준 전극을 스레드합니다.두 개의 실리콘 튜브를 통해 테트로드를 스레드하고 폴리이미드 튜브를 통해 50 마이크로 미터 텅스텐 와이어를 스레드. 마이크로 다이빙을 끝까지 나사로 놓고 튜브 상단에 시아노아크라일트 접착제를 적용하여 테로데와 와이어를 튜브에 붙이고 움직임이 마이크로 드라이브와 일치하는지 확인합니다. 마이크로 드라이브를 끝까지 상단으로 나사로 나사.노출 된 테트로드에 부드러운 석유를 적용하고 움직임을 방지하기 위해 마이크로 드라이브 하우징 내부의 와이어. 창 외부에 접지 와이어를 유지하면서 에폭시와 마이크로 드라이브 하우징의 전면에 미리 절단 된 페트리 접시 바닥 창을 부착합니다. 다음으로, 로거 박스 커버와 마이크로 드라이브 하우징 사이에 노출된 테트로데 및 와이어에 실온 을 저속하게 코팅합니다.날카로운 가위를 사용하여 테트로데및 레퍼런스 와이어를 원하는 길이로 자른다. 이 후 마크 된, 상자에 폴리스티렌 폼을 발산. 수조에 잠겼을 때 부력이 균형을 이루게 크기를 조정합니다.물고기를 마취 한 후, 물에서 물고기를 꺼내 홀더에 놓습니다. 멸균 주걱을 사용하여 지정된 수술 부위 위의 피부에 5 % 리도카인 페이스트를 10 분 동안 적용하십시오. 그런 다음 리도카인을 제거합니다.멸균 번호 15 블레이드 메스를 사용하여 임플란트에 지정된 지역의 두개골 위의 피부를 제거하십시오. 그런 다음 두개골에 4 개의 구멍을 뚫기 위해 0.7 밀리미터 드릴 비트가있는 치과 훈련을 사용합니다. 구멍 중 하나에 시아노아크라일트 접착제를 바르고 즉시 1mm 나사를 삽입합니다.나머지 드릴 구멍에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 그 후, 치과 용 화상을 사용하여 나사와 노출 된 두개골 의 주변에 치과 시멘트를 적용하십시오. 치과 드릴을 사용하면 뇌 영역보다 직경 5밀리미터인 구멍이 있습니다.미세 핀셋과 연조직 종이를 사용하여 두개골과 뇌 사이의 지방 조직을 제거하고 두개골 아래 큰 혈관을 손상시키지 않도록 주의되는 뇌 영역 표적을 노출하십시오. 첫째, 마이크로 드라이브 하우징의 하단 부분이 두개골 근처에있는 동안 전극이 뇌에 삽입되는 임플란트를 낮춥니다. 하우징과 가장 가까운 두개골 나사 사이에 소량의 치과 시멘트를 적용하여 임플란트를 두개골에 부착하십시오.치과 시멘트의 첫 번째 부분이 경화 된 후 추가 치과 시멘트를 적용하고 두개골과 전체 노출 된 두개골 위의 구멍을 닫습니다. 물고기를 담수로 씻어낸 후, 물고기를 홀더에서 꺼내 홈 탱크에 다시 놓습니다. 물고기가 임플란트와 함께 자유롭게 수영 할 수 있는지 확인하십시오.이 실험의 목표는 단 하나 세포의 신경 활동이 물고기의 행동을 부각하는 방법을 연구하는 것입니다. 이를 달성하기 위해 테트로드 어레이는 자유롭게 수영하는 금붕어의 텔렌스폴론에 이식되어 신경 활동을 기록할 수 있습니다. 기록되는 동안 뇌 활동은 데이터 로거에 의해 300 Hertz에서 필터링 31, 250 Hertz 및 높은 패스에 디지털화된다.그런 다음 오프라인에서 금지 패스 필터가 신호에 적용되고 양면 된 원시 데이터는 각 테트로드의 채널 및 참조 채널로 분리됩니다. 다음 일반적인 스파이크 정렬 알고리즘은 단일 셀 활성을 특성화하는 데 사용됩니다. 먼저 각 채널은 최소한의 스파이크 진폭 임계값에 의해 수동으로 필터링됩니다.둘 이상의 테트로드 또는 참조 채널에 나타난 스파이크도 필터링됩니다. 그런 다음 감지된 스파이크는 셰이프, 길이, 인터 스파이크 간격 및 원리 구성 요소 분석에 의해 수동으로 클러스터링되고 필터링됩니다. 수술 전에 임플란트 무결성을 확인하는 것이 중요합니다.테트로드는 표준 임피던스 미터를 사용하여 확인할 수 있으며 수중 누출을 확인해야합니다. 이 방법은 시스템을 보유할 만큼 큰 만큼 많은 수생 동물과 함께 작동하도록 수정할 수 있습니다. 이것은 그들의 행동의 기초가 되는 신경 기계장치를 공부할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜에서는 쥐에서 만성 electrophysiological 레코딩을 위해 설계되었습니다 마이크로 드라이브 어레이와 함께 사용하기 위해 조작 및 조건 tetrodes하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 지상 설치 와이어 및 보호 원추형을 포함 마이크로 드라이브 배열 건설의 마지막 단계를 보여줍니다.

만성에 대한 마이크로 드라이브 배열 생체내에 녹화 : Tetrode 조립

anesthetized 쥐의 실리콘 프로브를 사용하는의 연결 활동의 세포외 녹음이 설명됩니다. 이 기법은 동시에 100 개 이상의 뉴런에서 여러 뇌 영역에 걸쳐 정보를 얻을 수 있습니다. 그것은 여러 지역의 회로에의 연결을 ensembles 역학에 대한 단세포 해상도 정보를 제공합니다.

Anesthetized 쥐의 실리콘 프로브와 함께 대규모의 연결 Ensembles 녹음하기

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형질 전환 생선의 본래 뇌에서 발견 뉴런의 전기적 활동을 기록

우리는 자유롭게 기적 감각 내부 특별히 설계된 수조의 모두 정확하고 안정적​​으로 동물의 전기 기관 방전 타이밍, 상체 위치 자세를 측정함으로써, 장기간에 걸쳐 약하게 전기 물고기 수영의 자발적 행동을 연구하기위한 기술의 집합을 설명 격리 실.

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이 논문은 성인 제브라 피쉬는, 고정 삽관 및 녹음 및 손상 동물에서 신경 활동의 조작을 허용하는 생체 전기 생리학 실험에 사용 할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

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새로운 자극 - 반응 연관성 학습 궁극적 개별 뉴런의 스파이크 출력 변화에 반영 신경 다양한 프로세스를 결합한다. 여기에서 우리는 동물, 취득 소화하고, 하나의 실험 세션 내에서 조건 반응을 재 취득하는 동안 단일 신경 세포의 활동을 지속적으로 등록을 허용하는 행동 프로토콜을 설명합니다.

자유롭게 학습의 세 단계에 걸쳐 비둘기를 이동에서 단일 신경 세포 &#39;활동 전위를 기록

우리는 이전에 우리가 닿는 바퀴벌레의 개별 단위의 활동을 모니터링 할 수 있습니다 바퀴벌레 뇌의 중심 단지로 사극 전선을 주입하는 기술을 개발했다. 여기에서 우리는 우리가 자유롭게 곤충을 움직이는 뇌 활동을 기록 할 수 있도록하는 기술의 수정 된 버전을 제시한다.

자유롭게 곤충 워킹 뇌 세포 와이어 사극 기록

무선, 멀티 채널 신경 녹음 및 자유롭게 쥐 행동에 자극에 대 한 양방향 시스템 도입. 시스템은 가볍고 콤팩트, 따라서 animal´s 행동 레 퍼 토리에 최소한의 영향을 미치고. 또한,이 양방향 시스템 두뇌 활성화 패턴 및 행동 간의 인과 관계를 평가 하는 정교한 도구를 제공 합니다.

무선, Vivo에서 녹음 하 고 자유롭게 행동 하는 쥐에서 신경 활동의 자극에 대 한 양방향 인터페이스

이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스에서 두 개의 뇌 영역에서 9개의 독립적으로 조정 가능한 테트로데스와 하나의 조정 가능한 광실리콘 프로브를 이식할 수 있는 하이브리드 마이크로드라이브 어레이의 구성을 설명합니다. 또한 광실리콘 프로브를 여러 목적으로 안전하게 회수하고 재사용하는 방법이 입증되었다.

자유롭게 움직이는 마우스에서 이중 사이트 고밀도 레코딩을 위한 회수 가능한 광실리콘 프로브 및 Tetrode가 있는 하이브리드 마이크로드라이브 시스템

여기에서는 설치류의 만성 전기 생리학을 위한 가볍고 비용 효율적인 프로브 임플란트 시스템을 소개하며, 사용 편의성, 프로브 회수율, 실험적 다양성 및 행동과의 호환성에 최적화되어 있습니다.

DREAM Implant: 머리가 고정되고 자유롭게 행동하는 마우스의 만성 전기생리학을 위한 가볍고 비용 효율적인 모듈식 임플란트 시스템

학습하세요 자유롭게 수영하는 금붕어의 뇌에서 무선 전기생리학적 신호 기록 방법을 통해 행동 신경과학 연구를 수행하는 기법을. 이 방수 장치는 수중 환경에서 실시간 신경 활동 측정을 가능하게 합니다.

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