Name: 개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 형광 현미경을 이용한 단일 리포좀 분석 기법으로 크기와 조성 불균질성을 정량화하는 방법을. 이 프로토콜은 약물 전달 및 막 단백질 상호작용 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 독립적 인 연구를위한 덴마크위원회에 의해 투자되었다 [보조금 번호 5054-00165B].

1. 리포솜 준비
참고 : 간단히, 리포솜의 준비는 일반적으로 세 가지 중요한 단계를 포함 : 1) 원하는 지질 조성물의 건조 지질 필름의 준비; 2) 리포좀 형성을위한 지질의 재수화; 및 3) 리포좀 인구의 크기와 라멜라성을 조절한다.
<ol><li>지질을 측정하고 테르-부탄올:물(9:1)에 유리 병에 녹입니다.<ol>
<li>용해 POPC (1-팔미토일-2-올레오일 글리세로-3-포스포콜린; MW = 760 g/mol) ~ 50mM.</li>
		<li>콜레스테롤(MW = 387 g/mol)을 25mMM으로 용해시면 됩니다.</li>
		<li>용해 도피-Atto488 (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-Atto488; MW = 1,316 g/mol) ~ 0.1 mM.</li>
		<li>용해 도피-Atto655 (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-Atto655; MW = 1,368 g/mol) ~ 0.1 mM.</li>
		<li>용해 DSPE-PEG2000-비오틴 (1,2-디스테릴-스니케로-글리세로-3-포스페이타놀라민-N-[바이오티닐(폴리에틸렌 글리콜)-2000]; MW = 3,017 g/mol) ~ 0.1mM. 참고: 지질을 55°C로 가열하고 자기 교반을 사용하여 지질의 완전한 용해를 보장합니다. 또는 초음파 처리 욕을 사용하십시오. 사용되지 않은 지질 스톡은 -20°C에서 몇 개월 동안 보관될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.1단계에서 준비된 지질 주식을 POPC:콜레스테롤:콜레스테롤:도페-아토488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-비오틴 68.95:30:0.5:0.5:0.05, POPC 138 μL, 콜레스테롤 120 μL, 형광으로 표지된 각 지질 500μL, 및 50 μL DSPE-PEG-비오틴을 신선한 유리 병으로. 참고 : 정확한 리포솜 조성물은 관심있는 특정 질문을 해결하기 위해 쉽게 수정 할 수 있습니다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.</li>
	<li>유리 병의 뚜껑을 풀고 액체 질소로 바이알을 스냅 동결시됩니다.</li>
	<li>하룻밤 동안 냉동 지질 혼합물을 동결 유구화.</li>
	<li>건조 지질에 200 mM D-소르비톨 완충제 (소르비톨 완충제)의 1 mL을 추가합니다.</li>
	<li>혼합물을 45°C로 가열하고 적어도 1시간 동안 자기 교반에 노출시다. 참고: 완충제는 해결되고 있는 특정 질문(예를 들면, 막 단백질 상호 작용을 공부하기 위한 생리적 조건, 또는 약물 전달 리포좀을 공부하기 위한 특정 임상적으로 승인된 완충제)를 반영해야 한다. 그러나, 특정 완충액이 연구에 필요하지 않은 경우, 리포솜의 다층성도를 감소시키기 위해 이온이 없는 버퍼를 재수화시키기 위해 적용될 수 있다.</li>
	<li>액체 질소에 바이알을 찍어 지질 현탁액을 동결하고 현탁액이 완전히 동결 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>혼합물이 완전히 해동 될 때까지 55 °C에서 가열 욕조에 냉동 현탁액을 담급니다.</li>
	<li>리포솜 현탁액이 총 11회 동결/해동 주기에 노출될 때까지 1.7 단계와 1.8단계를 반복합니다. 참고: 반복된 동결/해동 주기는 리포솜 다과체 분석의 정확도에 가장 중요한 리포솜다과멜화(23)를감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 다층계 리포솜이 리포좀의 형광 강도대 리포솜 크기 비율을 왜곡하기 때문에 가장 중요합니다. 다층부미성은 일반적으로 제형에서 0.5% 이상의 PEGylated 지질을 포함할 때 본질적으로 낮다(예: 약물 전달을 위한 리포좀에서 통상적으로 행함)(예컨대 약물 전달을 위한 리포좀에서행함).24.</li>
	<li>미니 압출 키트를 사용하여 800 nm 폴리 카보네이트 필터를 통해 리포솜 현탁액을 한 번 압출합니다. 압출 키트 조립에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오(재료 표참조).</li>
	<li>리포솜을 밤새 4°C에 보관합니다.</li>
</ol>2. 이미징 챔버의 표면 준비
<ol><li>소 혈청 알부민을 준비 (BSA; 1 mg / mL), BSA-비오틴 (1 mg / mL) 및 스트렙타비딘 (0.025 mg / mL) 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-피페라진에탄에설포닉산 95 mMCl NaPes (완충액). 참고: 리포좀 파열을 방지하기 위해, 재수화에 사용되는 소르비톨 버퍼와 표면 준비에 사용되는 HEPES 버퍼는 동위원소여야 합니다. 따라서 실험 전에 버퍼의 삼투압을 확인하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>BSA 1,200 μL과 BSA-비오틴 120 μL을 혼합하고 현미경 검사법용 8 개의 잘 슬라이드에 혼합물의 300 μL을 각각 잘 추가하십시오. 참고 : 여기에서 우리는 유리 바닥 (재료 표참조)이있는 시판 되는 8 개의 잘 현미경 슬라이드를 사용하지만 프로토콜은 맞춤형 현미경 챔버에 쉽게 적용 할 수 있습니다.</li>
	<li>실온(RT)에서 20분 동안 슬라이드를 인큐베이팅합니다.</li>
	<li>HEPES 버퍼 300 μL로 슬라이드를 8x 세척합니다. 참고: 표면을 건조하면 손상될 수 있으므로 몇 초 이상 버퍼없이 우물을 방치하지 않도록 주의하십시오. 또한 파이펫 팁으로 표면이 긁히지 않도록 주의하십시오. 따라서 우물에서 버퍼를 흡입 할 때 가장자리 또는 모서리에서 수행하십시오.</li>
	<li>스트렙타비딘 250 μL을 넣고 RT에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>2.4단계에서 설명한 8개의 세차서를 반복한다.</li>
	<li>현미경 슬라이드를 300 μL의 소르비톨 완충액으로 각 우물에서 4°C로 저장합니다. 용매의 증발은 표면을 손상시킬 수 있으므로 현미경 슬라이드를 페트리 접시에 넣고 준비된 슬라이드를 즉시 사용하지 않는 한 파라필름으로 밀봉하십시오.</li>
</ol>3. 리포솜 고정
<ol><li>리포좀 현탁액을 소르비톨 완충액에서 약 20 μM 총 지질로 희석한다. 섹션 1의 절차는 약 10 mM 총 지질의 리포좀 현탁액을 산출할 것이다.</li>
	<li>슬라이드를 현미경에 놓고 유리/버퍼 인터페이스에서 증가된 레이저 반사 신호를 사용하여 챔버 표면에 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>신선한 HEPES 완충액300 μL로 챔버를 4x 세척합니다.</li>
	<li>희석된 리포솜 스톡 10 μL(총 지질 20 μM)을 미세원원지 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>챔버에서 완충액 100 μL을 꺼내, 3.4 단계에서 제조 된 미세 원심 분리튜브에 추가하고, 적절하게 혼합하고, 110 μL을 챔버에 다시 넣습니다.</li>
	<li>현미경의 밑에 표본을 놓고, 표면에 고정되는 리포좀을 관찰하기 위하여 리포좀 불소에서 신호를 검출할 수 있는 기초현미경 설정을 이용하십시오.</li>
	<li>개별 리포좀을 식별하기에 충분히 희소하고 높은 처리량 측정을 용이하게 할 만큼 조밀한 리포솜 표면 밀도를 목표로 합니다. 전형적으로 50 μm x 50 μm 시야각을 사용하여, 프레임당 300-400 리포솜이 최적이다(도2). 이것은 일반적으로 5-10 분 이내에 달성 될 수있다. 참고: 시야에서 빠르게 움직이는 형광 입자만 검출되는 경우, 고정 공정에 중요한 성분(BSA-비오틴, 스트렙타비딘, DOPE-PEG-비오틴)의 부재 또는 너무 낮은 농도가 원인일 수 있습니다. 리포좀이 검출되지 않으면 낮은 리포좀 농도, 형광 검출을 위한 부적절한 설정 또는 유리 표면에 없는 초점 평면으로 이미징할 수 있습니다.</li>
	<li>적절한 리포솜 표면 밀도에 도달하면 200 μL의 HEPES 버퍼로 챔버를 3x 세척하십시오. 참고: 고정 운동학은 크기 및 전하와 같은 리포좀 특성에 따라 달라지므로 항상 각 리포좀 제형에 최적화되어야 합니다.</li>
</ol>4. 이미지 획득
참고: 이 섹션은 실험을 수행하는 연구원이 사용할 수 있는 현미경 시스템에 많이 의존할 것입니다. 따라서, 이미징을 수행하는 방법에 대한 전반적인 가이드라인이 설명될 것이다. 그러나 정확한 설정과 적용 방법은 현미경 설정마다 다릅니다. 예를 들어, 일부 시스템은 원하는 방출 필터 조합을 선택할 수 있으며, 다른 현미경에는 특정 사전 설정 필터가 장착되어 있습니다.
<ol><li>단일 리포솜 이미징을 위한 현미경을 설치합니다. 최적의 이미지 품질과 후속 데이터 분석을 보장하기 위해 높은 그레이스케일 해상도와 개별 리포좀을 오버샘플링할 수 있는 픽셀 구성표를 사용합니다. 50 μm x 50 μm 영역에 대해 16 픽셀 및 최소 1,024 x 1,024 픽셀의 비트 깊이가 권장됩니다. 사용 가능한 경우 노이즈를 줄이기 위해 라인 평균을 유익하게 적용할 수 있습니다(예: 라인당 3회 스캔).</li>
	<li>중요하지 않은 프레임 대 프레임 표백과 배경에서 개별 리포좀을 명확하게 구별할 수 있는 강력한 신호를 보장하는 여기 레이저 파워를 선택합니다. 최적의 설정은 사용되는 특정 현미경뿐만 아니라 형광공 조합에 따라 달라집니다. 이 편향 강도 정량화로 인해 검출기가 포화되지 않았는지 확인합니다.</li>
	<li>리포좀에 있는 DOPE-Atto488 및 DOPE-Atto655 불소 둘 다 화상 진찰은 다중 채널을 화상 진찰을 요구합니다. 따라서 교차 여기를 피하기 위해 각 채널이 순차적으로 이미지화되어 있는지 확인합니다. 예를 들어, 먼저 488 nm에서 흥미 진진하고 495-560 nm에서 방출을 읽음으로써 하나의 이미지를 가져 가라. 그 후, 633 nm에서 흥미 진진한하지만 660-710 nm에서 만 방출을 읽고 다른 이미지를 가져 가라. 특이사항은 사용 가능한 현미경 시스템(예: 레이저 및 필터)에 따라 달라집니다.</li>
	<li>표면의 다른 영역을 커버해야, 샘플의 적어도 10 이미지를 획득, 따라서 적어도 이미징 3,000 개별 리포좀. 표면 밀도가 리포솜/프레임 300보다 낮으면 더 많은 이미지를 수집합니다. 모든 새 이미지에 대해 현미경을 다시 초점을 맞춥니다. 참고: 2채널 이미징의 경우 데이터 분석 중에 서로 다른 형광 채널에서 동일한 리포솜을 가진 이미지 쌍을 쉽게 식별할 수 있도록 이미지 파일의 이름을 지정해야 합니다.</li>
	<li>조성 불균질성의 측정과 관련된 실험적 불확도를 정량화하기 위해, 재초점 전후에 리포솜의 동일한 영역을 이미지화한다(도 3 및 텍스트의 설명 참조).</li>
	<li>현미경 소프트웨어에서 이미지를 .tiff 파일로 내보냅니다. 동일한 리포솜의 두 채널을 개별적으로 내보냅니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
참고 : 특별히 개발 된 자동화 된 2D 가우시안 피팅 루틴은 이전에6,11,12를사용했습니다. 그러나, 방법의 적용가능성을 높이기 위해 모든 실험실에서 용이하게 구현될 수 있는 데이터 분석 과정이 설명되어 있다.
<ol><li>동일한 이미징 필드에 있는 두 개의 서로 다른 형광 채널의 .tiff 이미지 쌍을 FIJI(FIJI는 ImageJ) 소프트웨어에 로드합니다.</li>
	<li>이미지 메뉴에서 색상을선택하고 채널 병합 기능을 사용하여 두 채널의 합성을 만듭니다.</li>
	<li>두 개의 서로 다른 채널에서 이미지된 리포좀이 양호한 동지역화를 표시하는지 또는 눈에 보이는 드리프트가 발생했는지 관찰합니다. 참고 : 두 형광 채널 사이의 드리프트의 경우 (두 채널의 신호 사이의 체계적이고 동등한 X-Y 오프셋으로 인식), 프레임 중 하나는 피지의 이미지 메뉴에서 변환 > 번역 기능을 사용하여 변환 할 수 있습니다. 그러나 이러한 이미지 조작에는 주의를 기울여야 합니다. 따라서 리포좀을 이미징할 때 가능한 한 많이 표류하지 않는 것이 좋습니다.</li>
	<li>ComDet 플러그인(v.0.3.6.1 이상)이 설치되어 있는지 확인하거나 플러그인 메뉴에서 이 작업을 수행하십시오.</li>
	<li>ComDet 플러그인을 열어 플러그인 메뉴로 이동하여 ComDet v.0.3.6.1 > 파티클 감지를선택하여 파티클을 감지합니다.</li>
	<li>ComDet에서 두 채널에서 파티클 감지를 개별적으로 선택해야 합니다. 공동 지역화된 점 사이의 최대 거리를 대략적인 입자 크기와유사하게 설정합니다. 일반적으로 여기에 설명된 설정에 4픽셀이 적합합니다.</li>
	<li>신호 대 잡음 비는 형광량이 적은 희미한 입자도 감지할 수 있어야 합니다. ComDet에서 두 채널의 감지 감도를 매우 희미한 입자(SNR = 3)로설정하여 이 비율을 3으로 설정합니다. 참고: 이 SNR 값은 일반적으로 적절하지만 더 높게 설정해야 할 수 있습니다(예: 리포솜으로 식별되고 거짓 긍정으로 이어질 수 있는 이미지 노이즈가 많은 경우).</li>
	<li>확인을누르기 전에 두 채널에서 양방향 으로 계산되고 감지된 파티클계산이 있는 상자가 선택되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>분석을 실행하면 결과 및 요약이 있는 두 개의 팝업 창이 표시됩니다. 데이터를 내보내면 .txt 파일로 테이블을 저장하고 소프트웨어로 가져와서 선택한 데이터 처리 소프트웨어로 공동 지역화 데이터(파티클 좌표 및 감지된 각 파티클의 통합 강도)가 포함된 결과입니다.</li>
	<li>각 리포솜이 데이터 세트에 한 번만 포함되어 있고 채널1/channel2와 channel2/channel1 비율이 모두 포함되어 있지 않은지 확인합니다. 따라서 Abs_frame = 1만 단계 5.11에 플롯되도록 데이터를 필터링합니다. 참고 : 공동 지역화 = 1을선택하면 이미지의 노이즈에서 거짓 긍정을 분석에서 제거 할 수 있습니다. 그러나 두 개의 형광 성분 중 하나만 있는 리포좀도 분석에서 제외되므로 분석에서 중요한 데이터 요소를 잠재적으로 제거할 수 있습니다.</li>
	<li>감지된 각 리포솜에 대한 강도 비율을 포함하는 데이터로 열의 히스토그램을 플로팅합니다.</li>
	<li>연구된 리포좀 시스템에 대한 조성 불균질의 정도는 강도 비 분포의 폭으로 나타낸다. 불균질성을 정량화하기 위해, 강도 비율 히스토그램을 가우시안 함수에 맞추고 평균(μ) 및 표준 편차(sigma)를 추출한다. 대표 결과 섹션을 참조하십시오.</li>
	<li>불균질성(DI)에 대한 값은 이제 DI= 시그마/μ로 정의된 변동계수를 사용하여 계산할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 리포솜 크기 교정
<ol><li>리포솜 스톡의 일부를 꺼내, 단계 1.10에 기재된 바와 같이 50 nm 폴리카보네이트 필터를 통해 21x를 압출한다.</li>
	<li>미세원심지 튜브에 800 μL의 소르비톨 완충액에 리포솜 현탁액의 10 μL을 첨가하여 리포좀을 희석시다.</li>
	<li>희석된 리포솜 샘플을 폴리프로필렌 일회용 큐벳으로 옮김.</li>
	<li>동적 광 산란(DLS)을 사용하여 크기를 측정합니다. 리포솜 현탁액의 크기와 다분산성을 측정하기 위해 적어도 3개의 독립적인 실행을 수행한다. 참고: 필요한 경우 측정을 위해 더 농축된 리포솜 현탁액을 사용하십시오. DLS에 대한 대안(예를 들어, 나노입자 추적 분석)은 리포좀의 크기를 측정하기 위해 적용될 수도 있다. 이러한 입자 크기 측정을 실행하는 방법에 대한 설명은 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다.</li>
	<li>4.1 단계 와 4.2 단계에서 정의된 것과 정확히 동일한 실험 설정을 사용하여 현미경의 교정 리포솜을 이미지화합니다.</li>
	<li>캘리브레이션 이미지에서 각 교정 리포솜에 대한 통합 강도를 추출합니다: 단계 5.1-5.10에 기재된 바와 같이 리포솜 형광 강도를 포함하는 여과된 결과 시트를 추출합니다. 결과 테이블에서 "통합Int" 열을 추출합니다.</li>
	<li>그 막에 표지된 리포좀의 총 통합 강도는 리포솜의 표면적에 비례하기 때문에, 직경의 제곱에 비례하기 때문에, 형광 강도의 제곱근 강도 히스토그램을 플롯 교정 리포좀.</li>
	<li>6.7단계에서 생성된 일체형 히스토그램에 적당히 로그 정규 분포를 맞추고 캘리브레이션 리포좀의 평균 형광 강도를 추출한다.</li>
	<li>제곱근 강도(IntSqrt)와리포솜 크기 사이의 관계를 결정하기 위해, DLS 측정으로부터 얻어진 수에 의해 칭량된 평균 리포솜 직경(Dia)을 사용하여 보정 계수(C)를 계산한다: Dia = C x IntSqrt는 C= Dia/IntSqrt와동일하다.</li>
	<li>조성 불균질 성 실험에서 리포솜에 대한 IntSqrt 값을 계산하고 보정 계수를 곱하여 이를 직경으로 변환합니다.</li>
	<li>약 50 nm-800 nm에서 에 걸쳐 리포솜의 인구에 대한 리포솜 크기의 함수로서 불균질성을 달성, 조성 불균질 리포좀에 대한 직경의 함수로 강도 비 값을 플롯.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

우리는 단일 리포솜 분석이 개별 리포좀 사이의 조성 불균질성을 연구하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 자세히 설명하지만 플랫폼은 매우 다재다능하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이전에 소개에서 도시되고 논의된 바와 같이, 프로토콜은 막-막 융합, 단백질 막 상호 작용, 또는 리포좀 약물 담체 특성화의 양상을 연구하기 위해 용이하게 적응될 수 있다. 해결되는 모든 과학적 질문에 대해, 단일 리포솜 분석의 힘은 앙상블의 개별 구성 요소를 감지하고 따라서 앙상블 평균 효과에 의해 편향되지 않은 정량적 판독을 갖는 능력에 있다.
단일 리포솜 분석법은 Z 방향 단면이 리포솜 층 위의 용액에서 원치 않는 배경 형광을 제거 할 수있는 전체 내부 반사 또는 공초점 현미경과 같은 표면 이미징 양식에 최적으로 적합합니다. 그러나, 이 양상은 펩티드, 단백질 또는 그밖 리포좀과 같은 형광표지된 화합물이 해결책에 추가되고 화상 진찰 도중 거기 남아 있는 연구 결과를 위해 가장 중요합니다. 예를 들어...

리포솜은 기초와 응용 연구 에서 둘 다 무겁게 이용되는 구형 인지질 기지를 둔 소포입니다. 이들은 우수한 멤브레인 모델 시스템으로 기능하며, 이들의 생리화학적 특성은 리포좀1,2를구성하는 지질 성분을 변화시킴으로써 쉽게 조작될 수 있기 때문이다. 또한, 리포솜은 향상된 약동학 및 약력학뿐만 아니라 높은 생체 적합성3을제공하는 가장 많이 사용되는 약물 전달 나노 캐리어 시스템을 구성합니다.
몇 년 동안, 리포솜은 주로 대량 기술을 사용하여 연구되어 앙상블 평균 판독 값에만 액세스 할 수 있습니다. 이것은 앙상블에 있는 모든 리포좀이 동일하다는 것을 가정하기 위하여 이 연구 결과의 대다수를 지도했습니다. 그러나 이러한 앙상블 평균 값은 기본 데이터 집합이 평균 값 주위에 균일하게 분포되어 있는 경우에만 정확하지만 데이터 집합에 여러 독립 모집단이 포함된 경우 거짓및 편향된 결론을 나타낼 수 있습니다. 또한, 전체 인구를 나타내는 앙상블 의미를 가정하면 리포솜 사이의 불균질성 내에 있는 정보를 간과할 수 있다. 최근에는 단일 리포좀을 조사할 수 있는 정량적 분석이 등장하여, 리포좀 크기4,지질조성5,6,및 캡슐화 효율7을포함한 중요한 물리화학적 특성에 대하여 개별 리포좀 들 사이의 큰 불균질성을 드러내며, 단일 리포좀 수준에서 리포좀을 연구하는 것의 중요성을 강조하고 있다.
리포솜 성질의 앙상블 평균화가 편향된 결과로 나타난 연구 영역은 리포솜 크기 의존성 단백질 막 상호작용을 연구하고있다8,9. 전통적으로, 이러한 과정을 연구하는 연구원은 다른 기공 크기9필터를통해 압출에 의해 다른 앙상블 평균 직경리포솜을 준비하는 것으로 제한되었습니다. 그러나, 단일 리포좀 어세스를 사용하여 개별 리포좀의 직경을 추출하는 것은 큰 인구 중복을 밝혀, 리포솜을 사용하여 압출 100 nm 및 200 nm 필터는 그들의 크기 분포에 70% 중첩까지 표시4. 이것은 리포솜 크기 의존성 단백질 막 상호작용10의대량 측정을 심각하게 편향시킬 수 있었다. 단일 리포솜 분석법을 사용하여 막 단백질 상호 작용 연구를 수행, 연구원은 대신 샘플 내에서 크기 다분산성을 활용, 각 단일 실험 내에서 리포좀 직경의 넓은 범위를 연구 할 수 있도록, 막 곡률과 조성이 막에 단백질 모집에 영향을 미칠 수있는 방법의 새로운 발견을 촉진4,11,12. 단일 리포솜 분석에 의한 또 다른 분야는 단백질 매개 막융합13,14의기계적 연구에 있다. 이러한 운동 측정의 경우 개별 융합 이벤트를 연구하는 능력은 융합 프로세스의 실험 적 동기화의 필요성을 완화하여 대량 앙상블 측정에서 수행되는 주공간 평균화에서 손실되었을 새로운 기계적 통찰력을 허용했습니다. 추가적으로, 단 하나 리포솜은 개별 적인 단백질의 측정을 허용하고 막 단백질 구조 역학15,16에새로운 지식을 제안하는 막 스캐폴드로 이용되었습니다. 더욱이, 이러한 프로테올리포좀 기반 설정은 개별 막 트랜스멤브레인수송기(17) 및 모공 형성 단백질복합체(18)의 기능뿐만 아니라 생리활성막-투과펩타이드(19)의 기전을 연구하는 것을 가능하게 하였다. 단일 리포솜은 또한10-19 L의 부피에서 효소 반응을 위한 챔버로서 사용되는 표면 고정된 단일 리포솜을 가진 연질 나노유체학으로서 사용되어 왔으며, 최소한의 제품소비로스크리닝 검거및 복잡성을 증가시키고 있다.
최근, 단일 리포솜 검사에서는 이전에 는 미리 정연하지 않은 수준의 세부 사항에서 약물 전달 리포좀을 특성화하는 데 사용되었습니다. 연구자들은 개별리포좀(21)의표면에 부착된 중합체의 양에서 유의한 불균질성을 정량화할 수 있었다. 단일 리포좀 검사는 또한 혈장과 같은 복합 매체에서 약물 전달 리포좀의 측정을 허용하고, 지질 앵커를 통해 리포좀 표면에 고정된 원소가 생체 내 순환 중에 경험한 조건을 모방하는 조건에 노출될 때 해리에 취약할 수 있는 방법을밝혀냅니다 22. 전반적으로, 단일 리포솜 assays의 다양성과 유용성은 이 설치가 해결하기 위하여 채택된 문제의 큰 다양성에 의해 입증되고, 우리는 방법론이 새로운 과학적인 필드에서 계속 개발되고 사용을 찾아내려고 구상합니다.
여기에서 우리는 개별 리포솜이 높은 처리량 방식으로 공부될 수 있도록 하는 형광 현미경 계 단 하나 리포좀 분석법을 기술합니다(그림 1). 이 방법을 설명하기 위해, 우리는 앙상블 내에서 개별 리포좀 사이의 크기와 조성 불균질성을 정량화하는 데 사용합니다. 이 분석은 통과 유리 표면에 고정된 단일 리포좀의 형광 현미경 이미징을 사용합니다. 우리는 먼저 적절한 형광 리포솜 라벨링 및 고정을 보장하는 리포솜 제조 공정의 중요한 단계를 설명합니다. 그런 다음, 적절한 리포솜 표면 밀도를 보장하기 위한 절차를 개략적으로 설명하기 전에 리포솜 고정을 용이하게 하는 데 필요한 표면 준비를 설명합니다. 우리는 고품질의 이미지를 획득하는 데 중요한 현미경 매개 변수에 대해 논의하고 간단한 데이터 분석을 수행하는 방법을 설명하여 리포솜 크기와 조성 불균질성을 추출 할 수 있습니다. 이 일반적인 프로토콜은 관심 있는 연구원이 그 또는 그녀의 특정 연구 관심사를 위한 분석학을 더 개발하기 위한 좋은 기초를 제공해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>8-well microscopy slides (&micro; slides)</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>유리 바닥이 있는 현미경 슬라이드</td></tr><tr><td>Avanti Mini Extrusion kit</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td>소모품(Whatman 필터)은 GE Healthcare</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotin</td><td>Sigma</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Avanti Polar에서 구할 수 있습니다. Lipids</td><td>700000</td><td>Traded trough Sigma</td></tr><tr><td>Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td><td></td><td></td><td>ComDet 플러그인이 설치되어 있어야 합니다. 또한 .txt 파일을 로드할 수 있는 데이터 처리 소프트웨어(Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism 등)가 필요합니다.</td></tr><tr><td>DOPE-Atto488</td><td>Atto-Tech</td><td>AD488-165</td><td></td></tr><tr><td>DOPE-Atto655</td><td>Atto-Tech</td><td>AD655-165</td><td></td></tr><tr><td>DOPE-PEG-Biotin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880129</td><td>Traded trough Sigma</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma</td><td>S-6021</td><td></td></tr><tr><td>동결 건조기</td><td></td><td></td>(<td>예: Labogene Glass 바이알의 ScanVac Coolsafe</td></tr>), <tr><td></td><td>갈색 크로마토그래</td><td>피 150903</td><td>액체 질소의 급속 동결에 견딜 수 있는 유리 바이알. 바이알의 8 mL 버전은 압출 키트</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Honeywell Fluka</td><td>258148</td><td></td></tr> 가열 수조 <tr><td></td><td></td><td></td> 의 주사기에도 맞는 크기를 가지고 있습니다<td>. 최소 65°C까지 가열 가능; </td></tr><tr><td>자석이 교반</td><td></td><td></td>하는 C 가열판 <td>최소 65°C까지 가열 가능; C</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td>보관용 용기 포함(예: 고무 욕조</td></tr><tr><td>마그네틱 교반기 VWR</td><td></td><td>442-4520 (EU)</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086 (EU)</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td></td><td></td><td>이 프로토콜의 이미지를 위해 Leica SP5 컨포칼 현미경에는 다음이 있습니다. 사용된 적이 있습니다</td></tr>: <tr><td>Na HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Honeywell Fluka</td><td>71686</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td>Traded trough Sigma</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S4762</td><td></td></tr><tr><td>tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)</td><td>Honeywell Riedel-de Ha&euml; n</td><td>24127</td><td></td></tr><tr><td>초순수</td><td></td><td></td><td>(예: MilliQ)</td></tr></tbody></table>

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

막 모형 시스템 또는 약 납품 운반대로 리포솜을 채택하는 대부분의 연구는 대량 판독 기술에 의존하고 따라서 본질적으로 앙상블의 모든 리포솜이 동일하다고 가정합니다. 그러나 단일 입자 수준에서 리포솜을 관찰할 수 있는 새로운 실험 플랫폼은 개별 리포좀에 대한 단백질 막 상호 작용 또는 약물 담체 특성에 대한 매우 정교하고 정량적인 연구를 수행할 수 있게 해 주었으며, 따라서 앙상블 평균에서 오류를 방지. 여기에서 우리는 형광 기지를 둔 현미경 분석법을 사용하여 단 하나 리포좀을 준비, 검출 및 분석하기 위한 프로토콜을 제시하고, 그 같은 단 하나 입자 측정을 촉진하. 이 설정은 개별 리포솜을 대규모 병렬 방식으로 이미징할 수 있게 하며 샘플 내 크기와 조성 불균질성을 드러내기 위해 사용됩니다. 추가적으로, 프로토콜은 단 하나 리포솜 수준에서 리포솜 공부의 이점, 분석결과의 한계 및 그밖 연구 질문을 공부하기 위하여 그것을 수정할 때 고려될 중요한 특징을 기술합니다.

기재된 프로토콜에 따라 단일 리포솜을 대규모 병렬 방식으로 이미지화할 수 있게한다(도 1). 리포좀의 성공적인 표면 고정은 회절 제한된 강도 반점이 이미지에 나타나야함에 따라 챔버(프로토콜에서 3.6단계)에 리포좀 용액을 첨가한 즉시 명백해야한다(도 1B 및 도 1C).
좋은 통계를 달성하고 분석의 높은 처리량 능력을 이용하기 위해, 수천 리포솜을 이미지화해야합니다. 적당한 수의 이미지로 이 작업을 수행하려면 샘플당 이미지 수가 ~10으로 감소하여 획득 및 분석해야 하는 이미지 수를 제한하므로 프레임당 300-400 리포좀의 밀도를 달성하기 위해...

이 프로토콜은 리포솜의 제조를 설명하고 이들이 어떻게 표면에 고정되고 형광 현미경 검사법을 사용하여 거대한 병렬 방식으로 개별적으로 심상될 수 있는지 설명합니다. 이는 집단의 단일 리포좀 들 사이의 크기 및 조성 불균질의 정량화를 허용한다.

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

리포솜을 가진 대부분의 연구는 모든 리포솜이 동일하다고 본질적으로 가정하는 대담한 기술에 의존합니다. 단일 리포솜을 연구함으로써, 중요한 불동성을 관찰할 수 있습니다. 여기에 제시된 단 하나 liposome 기술은 우리가 동시에 리포솜의 수백을 공부하고 그들의 규모 및 조성에 있는 불균일성을 검출하는 것을 허용합니다.이 방법은 단백질 막 상호 작용과 같은 단일 리포솜 수준에서 다른 시스템을 연구하도록 쉽게 조정할 수 있다. 당신이 필요로하는 것은 형광으로 표시될 연구 화합물입니다. 이 비디오를 통해 연구원들에게 단일 리포솜 연구를 수행하는 방법에 대한 도구를 제공합니다.우리는 분석이 다른 과학적 주제의 범위를 연구하기 위해 쉽게 수정 할 수 있다는 것이 분명하기를 바랍니다. 시작하려면 준비된 지질 주 138마이크로리터의 POPC와 120마이크로리터의 콜레스테롤을 신선한 유리 유리 바이알에 섞는다. 그런 다음 형광으로 표시된 지질 2개와 DSPE-PEG-비오틴 50마이크로리터 각각 500마이크로리터를 추가합니다.유리 유리 병의 뚜껑을 느슨하게하고 1 ~ 2 분 동안 액체 질소에서 유리병을 고정 스냅. 냉동 건조기에서 하룻밤 동안 냉동 지질 혼합물을 lyophilize합니다. 아침에는 200 밀리미터 D-소르비톨 버퍼를 마른 지질에 1밀리리터를 넣습니다.혼합물을 섭씨 45도로 가열하고 적어도 한 시간 동안 자기 교반에 노출시십시오. 그런 다음 유리병을 액체 질소에 담그고 현탁액이 완전히 얼어 붙을 때까지 기다립니다. 다음으로, 혼합물이 완전히 해동 될 때까지 냉동 서스펜션을 섭씨 55도에서 가열 욕조에 담급니다.혼합물을 총 11개의 동결 해동 사이클에 노출시다. 그 후, 미니 압출 키트를 사용하여, 800 나노 미터 폴리 카보네이트 필터를 통해 한 번 리포솜 현탁액을 돌출. BSA의 1, 200 마이크로리터와 120 마이크로리터의 BSA 비오틴을 혼합합니다.8웰 슬라이드에 혼합물 300 마이크로리터를 각 웰에 넣고 실온에서 20분 동안 슬라이드를 배양합니다. 슬라이드를 약간 기울이고 각 가장자리에서 배지를 흡인합니다. 즉시 세척각 웰에 HEPES 버퍼 300 마이크로리터를 추가합니다.총 8회 잘 씻으시면 됩니다. 250 마이크로리터의 스트렙타비딘을 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 이전에 설명한 대로 8개의 세서히를 반복합니다.현미경에 슬라이드를 놓고 현미경 조이스틱을 조정하여 챔버 표면에 집중합니다. 이는 유리 버퍼 인터페이스에서 증가된 레이저 반사 신호를 가이드로서 사용하여 쉽게 수행할 수 있다. 마이크로센심분리기 튜브에 20 마이크로몰라 총 지질을 함유한 희석 된 리포솜 육수의 마이크로리터 10 마이크로리터를 추가합니다.챔버에서 마이크로센심분리기 튜브로 완충제 100마이크로리터를 옮기고 제대로 섞어 110마이크로리터를 챔버로 다시 옮킨다. 현미경의 밑에 챔버를 놓고 표면에 고정되는 리포솜을 관찰하기 위하여 리포솜 형광에서 신호를 검출할 수 있는 기본적인 현미경 설정을 이용합니다. 원고에 설명된 대로 현미경을 설정합니다.리포솜에서 DOPE ATTO488 및 DOPE ATTO655 형광을 모두 이미지화하려면 여러 채널을 이미지합니다. 교차 흥분을 피하기 위해 각 채널이 순차적으로 이미지화되었는지 확인합니다. 예를 들어, 먼저 488 나노미터에서 흥미 진진하고 495 ~ 590 나노미터에서 방출을 읽는 것으로 하나의 이미지를 취하십시오.그 후, 설정을 변경하고 633 나노 미터에서 흥미 진진한에 의해 또 다른 이미지를 가지고 있지만 660 ~ 710 나노미터에서 만 배출을 읽는다. 분석. 이미지 메뉴에서 색상을 선택하고 병합 채널 함수를 사용하여 두 채널의 복합체를 만듭니다. 두 개의 서로 다른 채널에서 이미지된 리포솜이 양호한 공동 지역화를 표시하는지 또는 보이는 드리프트가 발생했는지 관찰한다.입자를 감지하려면 플러그인 메뉴를 열고 ComDet을 선택하고 파티클 을 클릭합니다. ComDet에서 설정이 올바른지 확인하고 확인을 누릅니다. 분석을 실행한 후 결과와 요약이 있는 두 개의 팝업 창이 표시됩니다. 결과 테이블에는 두 채널 간의 강도 비율이 포함되어 있습니다.공동 지역화 데이터가 포함된 데이터 테이블 결과를 내보냅니다. 강도 비율 히스토그램에 가우시안 기능을 장착하고 평균 및 표준 편차를 추출합니다. 평균 및 표준 편차는 불균일성의 정도를 계산하는 데 사용할 수 있습니다.50 나노미터 필터를 통해 여러 번 압출된 리포솜 제형을 준비한다. 형광 강도를 DLS의 크기 데이터와 비교하여 리포솜의 크기를 보정합니다. 이전과 동일한 실험 현미경 설정을 통해 교정 리포솜을 이미지화합니다.교정 리포솜의 형광 강도의 제곱근 강도 히스토그램을 플롯한다. 히스토그램에 로그 노멀 분포를 맞추고 교정 리포솜의 평균 형광 강도를 기하학적 의미로 추출합니다. 제곱 근강도와 리포솜 크기 사이의 관계를 결정하기 위해 동적 광 산란 측정에서 얻은 평균 리포솜 직경을 제곱 근강도의 기하학적 평균으로 나누어 보정 계수를 계산한다.조성 불균일성 실험에서 리포솜에 대한 제곱 근강도 값을 계산하고 보정 계수와 곱하여 이 두 직경을 변환합니다. 조성 불균일성 리포좀에 대한 직경의 함수로서 강도 비율 값을 플롯하여 약 50 나노미터에서 800 나노미터에 이르는 리포솜 의 집단에 대한 리포솜 크기의 함수로서 불균일성을 달성한다. 이 프로토콜에서, 리포솜의 성공적인 표면 고정은 회절 한강도 반점에 의해 표시된 챔버에 리포솜 용액을 첨가한 즉시 명백했다.프레임당 300~400개의 리포솜의 밀도를 달성하기에 충분한 리포솜을 고정하는 것이 좋습니다. 밀도가 낮으면 데이터 분석시간이 더 많이 소요되는 반면 밀도가 높을수록 단일 리포솜을 구별하기가 어렵습니다. 전체 시야가 적절한 초점에 있지 않으면 샘플 플레이트가 기울어질 수 있습니다.또한 리포솜이 크고 흐릿해 보이는 경우 챔버의 버퍼가 증발하고 표면이 건조되었을 수 있음을 나타냅니다. 강도 비율 히스토그램은 일반적으로 평균 비율 값 주위에 가우시안 분포를 드러낸다. 가우시안 분포에서 강한 편차가 관찰되는 경우, 약한 신호를 나타내는 리포솜의 하위 집합이 제외되었음을 시사하는 검출 감도 문제를 나타낸다.강도 비율 히스토그램을 가우시안 기능으로 피팅한 후, 0.23의 불균일성 값의 정도는 앙상블의 평균 어금니 비율과 23% 이상 다른 인구의 32%로 변환되었다. 실험적 불확실성의 정량화는 0.1로 나타났다. 분석은 당신이 사용하는 재료보다 더 나은 되지 않습니다 그래서 높은 품질의 unilaminar 리포솜은 필수적이다.따라서 이 것들을 준비할 때 동결 해동 주기를 떠나는 것과 같은 모서리를 자르지 마십시오. 이미지가 좋지 않으면 실험적인 불확실성이 높고 불균일성을 과대 평가하므로 집중력이 좋은 이미지를 얻는 데 시간이 걸릴 수 있습니다. 분석이 기본적으로 하는 일은 형광 라벨의 표면 밀도를 연구하는 것입니다.이 형광 라벨이 회귀 된 지질에 있는 경우에, 이 분석은 약 납품을 위한 질 테스트 liposomes에 이용될 수 있습니다. 이 설정은 펩티드가 멤브레인에 결합하고 곡률을 감지하는 방법을 연구하기 위해 적용되었습니다. 이것은 펩티드가 세포 안쪽에 분류되는 방법을 통제하는 분자 단서에 연구원에게 유일한 통찰력을 주었습니다.

a-quantitative-fluorescence-microscopy-based-single-liposome-assay

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 그램이시딘 채널 활동의 조치로 형광 담금질의 속도를 모니터링 빠른 형광 기반의 분석을 소개합니다. 그램이시딘 채널 지질 이중층 속성의 변화로 이중층 스패닝 단백질에 의해 감지를 모니터링하는 분자 힘 변환기로 사용됩니다.

그램이시딘 기반의 형광 분석, 지질 이중층의 속성을 수정하는 작은 분자 잠재 결정

원형질막 단백질과 지질의 공간 분포와 시간 역학은 생물학에서 뜨거운 주제입니다. 여기서 이 문제는 개념적으로 동일한 단일 입자 추적의 물리량을 제공하지만 작은 분자 레이블과 표준 현미경 설정을 사용하는 시공간 이미지 변동 분석을 통해 해결됩니다.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

생체 내 이미징을 위한 형광단의 사용은 옵소니화, 빠른 제거, 낮은 검출 감도 및 숙주에 대한 세포 독성 효과로 인해 크게 제한될 수 있습니다. 필름 수화 및 압출에 의한 리포솜 내 형광단의 캡슐화는 형광 소멸 및 보호로 이어져 높은 검출 감도로 in vivo 이미징을 가능하게 합니다.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질 생체 광학 이미징

제시된 프로토콜은 공극 스패닝 무용매 지질 이중층을 사용하여 단일 수송체 수준에서 막 단백질 매개 수송을 분석하는 방법을 설명합니다. 이는 대단히 병렬적인 데이터 수집 및 분석과 결합된 대량 생산된 나노포어 어레이 칩을 생성함으로써 달성되며, 향후 멤브레인 단백질 이펙터 스크리닝의 확립을 가능하게 합니다.

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

우리는 옵신으로 재구성된 큰 단층 리포좀에서 인지질 스크램블을 측정하기 위한 형광 기반 분석을 설명합니다.

인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

여기, 우리는 예를 들어 시 토 크롬 보3  를 사용 하 여 단일 리의 지질 막에 걸쳐 양성자 전 좌의 분자 메커니즘을 연구 하는 프로토콜 제시. 전기 화학 및 형광 현미경 검사 법, 단일 소포, 포함 하는 단일 또는 여러 효소의 루멘에서 pH 변화를 결합 수 있습니다 감지 되며 개별적으로 분석.

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

여기, 선물이 단일 분자 수준에서 복잡 한 단백질 견본에서 각 단백질 종에 대 한 라벨 동질성을 평가 하는 프로토콜.

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

이 프로토콜은 지방산으로 자극시 인간의 장 유기 체에서 지질 방울 (LD) 형성의 특성에 대한 분석서를 설명합니다. 우리는 이 분석제가 LD 형성의 정량화를 위해 어떻게 이용되는지, 그리고 어떻게 LD 대형에 영향을 미치는 약에 대한 높은 처리량 검열을 위해 사용될 수 있는지 토론합니다.

인간 장 유기체에서 지질 방울 형성의 특성화 및 정량화를 위한 형광 기반 분석

이 프로토콜의 목표는 형광 표지된 리포솜을 합성하고 유세포 분석을 사용하여 세포 수준에서 리포솜의 생체 내 국소화를 식별하는 것입니다.

형광 염료 표지 리포솜의 In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake의 준비, 투여 및 평가

여기에서는 단일 분자 전반사 형광(smTIRF) 현미경을 사용하여 인공 군집 지질 막에서 단일 분자의 결합, 이동성 및 조립을 수행하고 분석하는 프로토콜이 제시됩니다.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

이 글은 고체 지지 지질 이중층에서 단일 단백질 추적용 샘플을 만드는 방법에 대해 상세히 설명합니다. 또한 단일 분자 감도와 빠른 프레임 속도를 가진 단순한 형광 현미경을 설명해 줍니다. 마지막으로, 단일 단백질 궤적을 추출하는 절차를 개괄합니다.

형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

배우세요 형광 현미경을 이용한 단일 리포좀 분석 기법으로 크기와 조성 불균질성을 정량화하는 방법을. 이 프로토콜은 약물 전달 및 막 단백질 상호작용 연구에 활용됩니다.

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

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