Name: 각막 내피 세포 손실의 비 침습적, 레이저 보조 실험 모델의 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: 학습하세요 Nd:YAG 레이저를 이용한 비침습적 각막 내피 세포 박리 기법으로 bullous keratopathy의 조기 질병 모델을 개발하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 줄기세포 및 유전자 치료 연구에 활용됩니다.

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실험적인 방법에 도움을 주신 크리스틴 외룬과 얀 A. M. 소추렉에게 감사드립니다.

동물 조직과 관련된 모든 절차는 지역 동물 관리 및 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
1. 장기 배양 및 레이저 치료 준비
<ol><li>현지 아바토이르에서 갓 핵을 얻은 돼지 눈을 얻으실 수 있습니다. L-글루타민, 피루비테 나트륨, 페니실린/스트렙토마이신(1%), 돼지 혈청(10%)으로 보충된 높은 포도당으로 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 시원하게(4°C) 유지하고, 돼지 혈청(10%)을 이 기사에서 전체 배지로 지칭합니다.</li>
	<li>가위로 세포 외 조직을 제거하고 사용할 때까지 멸균 된 인산 완충 식염수 (PBS)에 넣기 전에 5 분 동안 5 % 포비도 요오드 안과 용액에 눈을 담그십시오.</li>
	<li>각막 흉터, 부종 및 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 장치(재료표)와같은 주요 전방 세그먼트 병리에 대한 화면 눈.</li>
	<li>1,064 nm의 파장과 10 μm의 초점 공대 직경을 가진 Nd:YAG 레이저(재료 표)가장착 된 슬릿 램프 장치 앞에 눈을 배치하십시오. 참고 : 최적의 위치 지정을 위해 3D 인쇄 된 홀딩 장치가 사용되며, 이는 너무 많은 압력을 가하지 않고 눈을 단단히 고정하도록 설계되었습니다(그림 1).</li>
	<li>12배배의 배율을 사용하고 조명을 편향하여 개별 각막 층을 시각화합니다.</li>
	<li>내피 세포의 선택적 절제에 대한 펄스 에너지(예를 들어, 1.6 mJ) 및 초점 포인트(예를 들어, 0.16 mm)를 설정합니다.</li>
	<li>사지에 가까운 명확한 각막 파라센티스를 배치하고 점탄성(재료의 표)를주입하여 전방 챔버를 안정화시다.</li>
	<li>8mm 트레핀을 사용하여 레이저 처리 된 중앙 각막을 절제하십시오.</li>
	<li>절제된 각막을 내피 부위가 위쪽을 향하는 12웰 플레이트의 우물에 놓고 37°C에서 37°C에서 3 mL의 시편을 최대 3일 동안 배양한다. 참고: 이 단계에서 잠재적인 세포 보호 제는 배지에 첨가될 수 있습니다.</li>
</ol>2. 역학 준비
<ol><li>133 mM KH2PO4 및 133 mM Na2HPO4의80.4 mL의 19.6 mL를 포함하는 7.4의 pH로 소렌슨의 버퍼를 준비한다.</li>
	<li>메탄올이 함유된 배지를 잘 함유하고 실온(RT)에서 20분 동안 조직을 고정하여 메탄올이 없는 파라포름알데히드(4%)를 사용한다. 소렌슨의 버퍼에 있습니다.</li>
	<li>조직이 가라 앉을 때까지 PBS에서 20 % 자당에 조직을 놓고 (1 시간) 다음 RT에서 밤새 PBS에서 30 % 자당에. 기포와 공기 표면 인터페이스와의 접촉을 피하기 위해주의하십시오. 최적의 절삭 온도 (OCT) 화합물에 조직을 포함하고 -80 °C에서 저장합니다.</li>
	<li>-27°C에서 저온 중지를 사용하여 10 μm 두께의 절편을 절단합니다. 참고: 낙타 헤어브러시는 칼날 위로 새롭게 떠오르는 부분을 안내하는 데 유용합니다.</li>
	<li>슬라이드를 절단 한 후 1 분 이내에 조직에 슬라이드를 터치하여 현미경 슬라이드로 섹션을 옮겨 조직의 동결 건조를 피하십시오. 슬라이드를 -80°C에서 보관합니다.</li>
</ol>3. 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색
<ol><li>수분을 제거하기 위해 몇 분 동안 공기 건조 섹션.</li>
	<li>50 mL 튜브에서 10 분 동안 0.1 % 메이어 스 헤마톡클린을 걸러진 얼룩.</li>
	<li>코플린 항아리에 시원한 달리기 ddH2O로 5분간 헹구고 0.5% 에오신 10배로 찍어 드세요.</li>
	<li>ddH2O에 찍어 서신이 줄무늬를 멈출 때까지 담근 다음 50% (10x) 및 70% (10x) EtOH에 담급니다.</li>
	<li>자일렌에 여러 번 담그기 전에 95 % EtOH (30 s) 및 100 % EtOH (60 s)에서 평형화하십시오.</li>
	<li>마지막으로 가벼운 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하기 전에 시편을 장착하고 덮습니다.</li>
</ol>

<ol><li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cataract+and+Refractive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li>
<li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+balance+between+corneal+transparency+and+edema%3A+the+Proctor+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li>
<li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).</li>
<li>Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+corneal+endothelium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Biology of the corneal endothelium in health and disease.</a> Eye. 17, 912-918 (2003).</li>
<li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+map+of+the+human+corneal+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D map of the human corneal endothelial cell.</a> Scientific Reports. 6, 29047(2016).</li>
<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li>
<li>Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelium+following+complete+endothelial+cell+loss+in+rat+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty.</a> Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).</li>
<li>Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelial+cells+following+keratoplasty+in+rats+with+bullous+keratopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy.</a> Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).</li>
<li>Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Cell+Therapy+for+Corneal+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Ophthalmology+Reports%22%5BJournal%5D)">Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium.</a> Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).</li>
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<li>Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+bubble+dynamics+and+acoustic+transient+generation+in+ocular+surgery+with+pulsed+neodymium%3A+YAG+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers.</a> Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).</li>
<li>Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Nd%3AYAG+laser+surgery%3A+laser-tissue+interaction%2C+damage+range%2C+and+reduction+of+collateral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).</li>
<li>Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro.</a> International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+inhibits+corneal+endothelial+mesenchymal+transition+and+accelerates+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing.</a> Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).</li>
<li>Smeringaiova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Wound+Repair+of+the+Organ-Cultured+Porcine+Corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas.</a> Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).</li>
<li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rabbit+Corneal+Endothelial+Dysfunction+Model+Using+Endothelial-Mesenchymal+Transformed+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).</li>
<li>Schubert, H. D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+repair+following+Nd%3AYAG+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd%3A+YAG+Laser%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li>
<li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li>
<li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+damage+following+focal+laser+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 파일럿 연구의 결과는 Nd:YAG 레이저가 에너지 용량 및 초점 포인트 위치에 대한 적절한 매개 변수가 선택적으로 각막 내피 세포를 ablate하는 데 사용할 수 있음을 나타냅니다.
내피 기능은 각막 투명성과 기질 부종에서 각막을 보호하기 위해 중요하기 때문에, 내피 기능 장애의 모델은 항 부종 약물 이나 외과 적 절차의 개발에 중요한 역할을한다. 생체 내 상황10,,14,,15를모방하기 위한 몇 가지 확립된 시험관내 모델이 있지만, 일반적으로 공지된 바와 같이, 시험관내 모델은 효소 및 사이토카인의 영향 또는 세포-세포 상호작용의 효과를 완전히 모방할 수 없다. 대조적으로, 내피 세포 손실의 이 새로 개발된 생체 내 비보 모델은 자연 환경에서 질병의 상이한 상태 및 각막 하보상을 모니터링할 수 있는 가능성을 ...

각막의 투명성은 망막과 광수용체에 빛의 투과에 필수적이다1. 이와 관련하여, 탈수의 상대적인 상태는 각막 기질 내의 콜라겐 섬유를 정확하게 정렬시키는 데 중요합니다. 이 항상성은 Descemet의 막에 있는 각막 내피 세포 (CEC)에 의해 유지됩니다 (DM)2. 내피는 가장 안쪽 각막 층입니다. 그것은 각막 투명성에 중요한 장벽과 펌프 기능을 가지고3. 상피와는 달리, 내피는 자기 갱신 할 수 없습니다4. 따라서 질병 이나 외상으로 인한 임의의 세포 손상은 남은 내피 세포를 자극하여 확대 및 마이그레이션하고, 그로 인한 결함을 커버하고 각막 기능을 유지한다5. 그러나 CEC 밀도가 임계 값 이하로 떨어지면 내피의 부전이 발생하여 시력이 흐려지고 불편함이 생기거나 심한통증이 발생합니다 4. 증상을 완화하는 약물의 가용성에도 불구하고, 현재 이러한 경우 유일한 확실한 치료는 각막 이식이며, 이는 전체 두께 이식 또는 라멜라 내피 이식의 형태로 수행 될 수 있습니다. 후자의 절차는 Descemet의 막 내피 각막 각질 성형술 (DMEK)뿐만 아니라 Descemet의 스트리핑 자동화 된 내피 각막 성형술6(DSAEK)6으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 남아 있는 CEC의 보호 및 그들의 생존을 강화하는 것은 잠재적인 치료 약을 시험하기 위하여 적당한 질병 모형을 필요로 하는 대체 표적이 될 수 있었습니다.
현재 CEC 손실 질환 모델은 침습적 데시메터헥시스 기술을 사용하여 전위 챔버 내로 또는 세포의 기계적 마모에 의한 독성 제제(예를 들어, 벤잘코늄 염화물)의 주입을 통한 내피의 파괴에 초점을 맞추고있다.,8 이 모형은 잘 설치되는 동안, 일반적인 선동적인 반응 및 부정확한 부수적인 손상과 같은 단점이 존재합니다. 따라서, 이 모형은 전술한 외과 선택권이 불가피할 때 질병의 마지막 단계를 나타낼 확률이 높습니다.
줄기 세포 및 유전자 치료와 같은 세포 치료 전략의 발전과 함께, 이러한 세포 치료법의 적용은 CEC 손실9의초기 단계에서 유용 할 수 있습니다. 그 후, 우리는 질병의 이 초기 단계를 더 적당하게 나타내는 모형이 필요합니다. 이와 관련하여, 세포 배양 모델은 지난 10년 동안 개선되었지만, 시험관내 세포가 각막내의상이한 세포 유형 사이에서 발생하는 복잡한 상호작용을 복제하는 데 근접할 수 없기 때문에 그들의 타당성은 여전히 제한적이다. 따라서, 생체내 및 생체내 질환 모델은 여전히 수요가 많고 기존 것들을 개선하는 것이 가장 큰 관심사이다.
네오디뮴을 사용하여 사진 파괴에 의한 비침습적, 안구 내 수술:YAG (Nd:YAG) 레이저는 1970년대 후반11에도입된 이래 전 세계 안과 의사를 위한 일상적인 절차가 되었습니다. 광파괴는 적용 부위가 액체 환경에 위치할 때마다 플라즈마의 형성, 음향 충격파의 생성 및 캐비테이션 기포의 생성으로 이어지는 비선형 광 흡수에 의존한다12. 일반적으로, 이러한 과정은 정확한 조직 절단의 의도 된 효과에 기여한다. 그러나, 이들은 또한 레이저수술(13)의국소 감금을 제한하는 불필요한 부수적 손상의 원인이 될 수 있다.
충격파 전파 및 캐비테이션 과정의 특성화를 통해 기계적 효과의 예측이 크게 향상되었습니다. CEC 손실의 초기 단계에 대한 비침습적, 레이저 보조 실험 적 질병 모델을 제공하기 위해 가능한 한 주변 조직에 대한 손상이 적은 CEC를 대상으로하는 것이 우리의 목표입니다. 이를 위해, 최적의 펄스 에너지와 레이저의 초점 반점의 위치를 결정할 필요가있다.

<table><tbody><tr><td>BARRON VACUUM TREPHINE</td><td>Katena</td><td>K20-2058</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체 - 고포도</td>당 <td>PAA</td><td>E-15009</td><td></td></tr><tr><td>아이 홀더</td><td>자체</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Leica</td><td>DMI 6000 B</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG 레이저</td><td>Zeiss Meditec</td><td>visuLAS YAG II plus</td><td></td></tr><tr><td>OCT Tissue Tek</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td></td></tr><tr><td>돼지 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C</td><td></td></tr><tr><td>스펙트럼 도메인 광간섭 단층촬영</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트 12-well</td><td>Sarstedt</td><td>833921</td><td></td></tr><tr><td>Two-Photon Microscope</td><td>JenLab</td><td>DermaInspect</td><td></td></tr><tr><td>Viscoelastic</td><td>OmniVision</td><td>Methocel</td><td></td></tr></tbody></table>

각막 내피 세포 손실의 비 침습적, 레이저 보조 실험 모델의 개발

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG 레이저는 지금 수십 년 동안 capsulotomy와 같은 비침범성 안구 수술을 수행하는 데 사용되었습니다. 절개 효과는 레이저 초점의 광학 고장에 의존합니다. 음향 충격파와 캐비테이션 버블이 발생하여 조직 파열을 일으킵니다. 기포 크기와 압력 진폭은 펄스 에너지와 초점 위치에 따라 달라집니다. 본 연구에서, 핵핵 돼지 눈은 시판되는 Nd:YAG 레이저 앞에 위치시켰다. 가변 펄스 에너지뿐만 아니라 각막에 대한 초점 반점 후방의 상이한 위치를 시험했다. 결과 병변은 최소한의 부수적 손상으로 각막 내피 세포 (CEC)의 독점적 인 분리를위한 최상의 매개 변수를 결정하기 위해 2 광자 현미경 검사법과 조직학에 의해 평가되었다. 이 방법의 장점은 CEC의 정밀한 절제, 감소된 부수적 손상, 그리고 무엇보다도 비접촉 식 치료입니다.

여기에 제시된 절차를 사용하여, 우리는 Nd:YAG 레이저로 눈을 치료하고, 다른 펄스 에너지 (1.0-4.6 mJ)와 초점 의 위치 (각막의 후방 표면에서 의 거리 : 0.0-0.2 mm)를 평가하여 최적의 매개 변수를 찾습니다. 다중 복제(n=3)는 레이저 파라미터(12 x 21)의 각 별자리에 대해 평가되었다.
전술한 프로토콜 이외에, 시편은 고정 및 H&amp;E 염색 전에 2광자 현미경으로 분석되었다. 2광자 현미경은 690-1b040 nm의 튜닝 범위와 800 nm에서 800 nm의 평균 레이저 출력을 가진 고체, 모드 잠금 80 MHz Ti: 사파이어 레이저를 사용했습니다. 그것은 샘플에 약 150 fs의 폭으로 펄스를 전달했다. 730 nm 및 30 mW의 레이저 전력파장에서 현미경 대물량(20x/0.95)으로 이미지를 촬영했습니다.
2 광자뿐만 아니라 가벼운 현미경 이미지는 실험 설정에 눈이 멀고 (1) 손상 없음...

여기에서, 우리는 네오디뮴을 사용하여 Descemet의 막 (DM)에서 각막 내피 세포 (CEC)를 분리하는 프로토콜을 제시합니다:YAG (Nd:YAG) 레이저는 bullous 각화증 (BK)를 위한 전 생체 내병 모형으로.

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

각막 내피 세포 손실에 대한 현재 질병 모델은 내피의 파괴에 초점을 맞추고 각막 이식이 불가피할 때 질병의 최종 단계를 나타낼 가능성이 높습니다. 줄기 세포 또는 유전자 치료를 사용 하 여 새로운 치료, 그러나, 질병의 초기 단계에 대 한 더 유용 할 수 있는 지금 사용할 수 있습니다., 부족 하는 모델. Nd:YAG 레이저를 이용한 광분열에 의한 비침습적 안구 수술은 안과 의사를 위한 일상적인 절차가 되었습니다.현지 아바토이르로부터 갓 포신한 돼지 눈을 얻은 후, 샘플을 섭씨 4도에 전체 배지로 놓습니다. 가위를 사용하여 세포외 조직을 제거하고 5 분 동안 5 %의 포비도네 요오드 안과 용액으로 눈을 흡수하십시오. 다음으로, 소독된 샘플을 실온에서 멸균 PBS에 놓습니다.스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 장치를 사용하여 각막 흉터, 부종 및 기타 불투명성과 같은 주요 전방 세그먼트 병리를 검사합니다. 스크리닝 후, 1, 064 나노미터의 파장을 가진 Nd:YAG 레이저가 장착된 슬립 램프 유닛 앞에 눈을 배치하고 공기 중10 마이크로미터의 초점 지점 직경을 배치합니다. 12X 배율을 선택하고 조명을 편향하여 개별 각막 레이어를 시각화합니다.각막 내피 세포의 선택적 절제를 위한 적절한 파라미터에 펄스 에너지 및 초점 지점을 설정한 후 조직에 여러 레이저 주사를 적용한다. 그런 다음 해부 현미경하에서 명확한 각막 기생충을 림두에 가깝게 놓고 점성탄성을 주입하여 전방 챔버를 안정화시하십시오. 그런 다음 8mm 트레핀을 사용하여 레이저 처리 된 중앙 각막을 절제하고 고립 된 각막을 12 웰 플레이트 내피 측의 한 우물에 놓습니다.각막이 모두 수집되면 각 샘플에 3밀리미터의 전체 배지를 잘 추가하고 37°C에서 최대 3일 동안 표본을 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 소렌슨의 버퍼에서 메탄올이 없는 4%파라포름알데히드로 각각 의 배지를 실온에서 20분 간 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 정류관이 가라앉을 때까지 PBS에서 약 1시간 동안 고정 샘플을 PBS에 20% 자당에 놓습니다.샘플을 PBS에서 하룻밤 사이에 30% 자당으로 옮김한 후 최적의 절삭 온도에 조직을 포함하여 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 영하 27도로 설정된 저온을 사용하여 1분 이내에 현미경 슬라이드에서 각 부분을 수집하는 냉동 조직의 10 마이크로미터 두께 섹션을 얻습니다. 그런 다음 슬라이드를 영하 80도에서 스테인딩할 때까지 보관합니다.헤마톡슬린과 에오신 염색의 경우, 공기는 50 밀리리터 튜브에서 0.1%의 메이어의 헤마톡슬린으로 염색하기 전에 몇 분 동안 냉동 섹션을 건조시켜 수분을 제거합니다. 인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 이중 증류수로 5분간 헹구십시오. 다음으로, 슬라이드를 0.5%에 10번 찍어 두 번 증류수로 헹구고, 에오신이 줄무늬가 멈출 때까지 이중 증류수에 헹구십시오.헹구는 슬라이드를 50%에탄올로 10회, 70%에탄올에 10회 찍어 보세요. 마지막 70%에탄올 딥 후, 95%에탄올로 30초 간 구간을 한층 더 보정한 후, 100%에탄올에서 60초가 지나자 자일렌에 몇 번 의욕을 불어넣습니다. 그런 다음 가벼운 현미경에 이미지를 얻기 전에 커버 슬립으로 표본을 장착합니다.두 개의 광자 및 가벼운 현미경 이미지는 손상, 너무 많은 손상 또는 정확한 손상량으로 독립적으로 평가되어야 합니다. 이러한 평가에 기초하여, 열지도는 주변 조직에 최소한의 손상으로 각막 내피 세포의 선택적 절제를 위한 레이저 파라미터의 올바른 별자리를 선택하도록 계산될 수 있다. 이전 분석은 레이저의 초점이 테스트 된 가장 낮은 펄스 에너지에 대한 각막 내피의 뒤에 적어도 0.15 밀리미터이어야한다는 것을 결정했다.2.9 밀리줄보다 높은 펄스 에너지의 경우, 테스트된 가장 긴 초점 거리는 여전히 내피에 너무 가깝습니다. 절제된 견본이 문화에 있는 동안 각종 세포 보호 제는 시험될 수 있습니다. 성공이 입증되면 치료를 위한 관개 솔루션에 추가할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 돼지 눈의 각막 내피 세포를 선택적으로 손상시키는 비침습적 레이저 보조 절차를 보여줍니다. 개발된 내피 세포 손상 생체 외 모델은 각막 내피 질환을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

돼지 각막 내피 세포의 레이저 보조 선택적 절제: 생체 외 연구를 위한 집속 돼지 각막 내피 손상을 유도하는 기술

각막의 혈관 신생 (NV)는 여러 시각 병리를 복잡하게 할 수 있습니다. 제어, 알칼리 화상을 입지 모델을 활용, 각막 NV의 정량화 수준은 신생 혈관 질환에 대한 잠재적 인 치료의 각막 NV 및 평가의 기계 론적 연구를 위해 생성 될 수있다.

마우스의 각막 신생 혈관의 알칼리 화상 상해 모델

내피 이식에서는 모든 레이저 시술이 제안됩니다. 이 수술 기법은 펨토초 레이저를 사용하여 기증자 조직을 준비하는 것을 기반으로 합니다. 그런 다음 레이저 용접 기술을 사용하여 기증자 내피를 올바른 위치에 고정합니다.

&quot;모든 레이저&quot;내피 세포 이식

여기에서는 신생혈관 연령 관련 황반변성(AMD)의 혈관 특징을 재현하는 실험 모델인 마우스 레이저 유도 맥락막 신생혈관화(CNV) 프로토콜을 제시합니다. 일단 마스터하면 다양한 실험 측정을 테스트하기 위한 모델 시스템으로 CNV를 안정적이고 효과적으로 유도할 수 있습니다.

레이저에 의한 맥락막 신생 혈관에 대한 마우스 모델

소 각막 내피 세포의 일차 배양 각막 내피 간엽 전이의 메커니즘을 조사 하였다. 또한, 래트 각막 내피 cryoinjury 모델 생체 내 각막 내피 간엽 전환을 증명 하였다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기

다음 문서에서는 효과적으로 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)의 지속 가능한 마우스 모델을 만들 수있는 쉬운, 재생 가능한 기술을 제공한다. 이 동물 모델 시험 및 윤부 줄기 세포 질환에 대한 치료 효능을 비교하기에 유용하다.

간단한 기계 절차 마우스에서 윤부 줄기 세포 결핍을 만드는 방법

여기, 선물이 쥐에서 안 neovascularization 레이저 유도의 형태학 변화의 후속에서 경도 vivo에서 화상의 유용성.

Vivo에서 복합 이미징 및 마우스 레이저 유도 안 Neovascularization 모델의 분석

여기서, 돼지 분할 각막 버튼의 제조 및 재배를 위한 단계별 프로토콜이 제시된다. 이 오르가노-전형적으로 재배된 장기 배양 모델은 인간 기증자 각막에 필적하는 15일 이내에 세포 사망률을 나타내므로, 독성 덱젠을 첨가하지 않고 비인간 각막의 장기 재배를 허용하는 첫 번째 모델을 나타낸다.

분할 각막 단추를 사용하여 돼지 각막 내피 내피 기관 문화 모형

Descemet's Stripping Only는 Fuchs 내피 각막 이영양증으로 인한 중앙 각막 굿태를 가진 환자가 말초 세포가 내피층을 재생시키기 위해 Descemet의 막을 벗겨내는 실험 절차입니다. 우리는 eFGF1 (NM141)에 의해 자극된 가속화된 치유와 함께 영양 장애 인간 각막 생체외 에서 DSO를 시뮬레이션하는 새로운 방법론을 제시한다.

조작된 섬유아세포 성장 인자 1에 의해 자극된 가속화된 치유를 통해서만 Descemet의 스트리핑의 인간 각막 배양 모델

이 프로토콜은 마우스 모델에서 정확하고 재현 가능한 각막 및 윤부 알칼리 손상을 유도하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 고도로 구부러진 쥐의 각막과 변두리에 고르게 분포된 손상을 허용하기 때문에 유리합니다.

마우스 모델에서 펀치-트레핀 기술을 사용한 각막 및 변막 알칼리 손상 유도

여기서는 각막을 자극하는 감각 섬유를 손상시키는 세 가지 방법을 제안합니다. 이러한 방법은 생쥐의 축삭 재생에 대한 연구를 용이하게 합니다. 다른 동물 모델에 적용할 수 있는 이 세 가지 방법은 각막 신경 분포 생리학 및 재생 연구에 이상적입니다.

쥐 각막의 신경 영양성 각막염 및 신경 재생을 유도하는 세 가지 전략

학습하세요 Nd:YAG 레이저를 이용한 비침습적 각막 내피 세포 박리 기법으로 bullous keratopathy의 조기 질병 모델을 개발하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 줄기세포 및 유전자 치료 연구에 활용됩니다.

각막 내피 세포 손실의 비 침습적, 레이저 보조 실험 모델의 개발

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