Name: 생체 외에서 인간 호중구 떼의 화학 및 분자 분석을 위한 생체 입자 미세어레이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 학습하세요 생체 입자 미세어레이를 이용한 인간 호중구 떼의 화학 및 분자 분석 방법을. 이 기술은 세포 이동 정량 이미징과 분비된 사이토카인 및 지질 매개체 접근을 가능하게 합니다.

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이 일은 오하이오 주립 대학에 있는 화학과 생물 분자 공학의 윌리엄 G. Lowrie 부 및 포괄적인 암 센터에서 자금조달에 의해 지원되었습니다. 이 보고서에 제시된 데이터는 오하이오 주립 대학의 캠퍼스 현미경 및 이미징 시설에서 사용할 수 있는 Imaris x64(9.3.0 비트플레인)를 사용하여 처리된 이미지에서 나왔습니다. 이 시설은 보조금 P30 CA016058, 국립 암 연구소, 베데스다, MD에 의해 부분적으로 지원됩니다.

저자는 친절하게 자신의 혈액을 기증 건강한 자원 봉사자를 인정합니다. 혈액 표본은 오하이오 주립 대학에 있는 생물 의학 과학 위원회에 의해 검토된 기관 검토 위원회 (IRB) 프로토콜 #2018H0268 에 따라 통보된 자원봉사자 동의 후에 장악되었습니다.
1. 생체 입자 마이크로 어레이의 미세 가공
<ol><li>표준 포토리소그래피 절차를 사용하여 마스터 실리콘 웨이퍼를 생성합니다.<ol>
<li>CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 원하는 설계 증명을 생성한 다음 포토마스크 제조업체로 보내 크롬 포토마스크를 생성합니다. 여기에 사용된 설계는 150 μm 센터-센터 간격으로 원형으로 채워진 직경 30μm의 4mm x 4mm 직사각형 어레이입니다. 이 디자인은 다른 응용 프로그램에 대해 원하는대로 수정할 수 있습니다.</li>
		<li>실리콘 웨이퍼에 음의 포토레지스트의 40 μm 두께의 층을 스핀 코팅합니다. 웨이퍼를 65°C에서 5분, 95°C에서 10분간 굽습니다.</li>
		<li>웨이퍼를 150-160mJ/cm2(그림1A)로크롬 포토마스크를 통해 UV 광에 노출시다.</li>
		<li>웨이퍼를 65°C에서 5분, 95°C에서 10분간 굽고, 포토레지스트 개발자에게 웨이퍼를 10분 간 담그고 이소프로필 알코올로 헹굽습니다. 이 단계에서 패턴은 웨이퍼에 표시되어야합니다(그림 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>폴리디메틸실록산 전합체와 그 경화제(즉, 프리폴리머 20 g 및 경화제 2g)의 10:1 비율을 철저히 혼합하고 페트리 접시에서 마스터 웨이퍼 위에 경화되지 않은 다디메틸실록산(PDMS) 혼합물을 부어 낸다(그림1C).</li>
	<li>마스터 웨이퍼 위에 기포가 없을 때까지 경화되지 않은 PDMS 혼합물을 진공 처리합니다. 밤새 65°C에서 경화합니다.</li>
	<li>메스를 사용하여 웨이퍼의 패턴 섹션의 외부를 절단하고 경화 된 PDMS 슬래브를 천천히 제거합니다. 패턴면이 위를 향하고 있는 깨끗한 도마 위에 PDMS 슬래브를 놓습니다(그림1D).</li>
	<li>8mm 생검펀치(그림 1E)로PDMS 슬래브에서 개별 스탬프를 펀치아웃합니다. 유리 슬라이드 1개에 대해 8개의 스탬프가 필요합니다.</li>
	<li>각 스탬프를 접착제 테이프에 아래로 향하게 놓아 이물질을 제거합니다.</li>
	<li>사전에 물에 CP의 1.6 mg/mL 용액을 준비하십시오.<ol>
<li>적절한 양의 CP 분말을 물에 첨가합니다(예: 0.8 g ~ 500 mL).</li>
		<li>밤새 실온에서 또는 모든 고체가 물에 용해될 때까지 저어 줍니다. CP 용액은 실온에서 6개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>원하는 경우, 플루오레세인 이소티오시아네이트(PLL-FITC)로 라벨이 부착된 폴리-L-리신을 첨가하여 CP 용액을 형광화시한다.<ol>
<li>CP 용액의 약 10 mL. Aliquoted 볼륨에 소량의 PLL-FITC(0.05 mg)를 추가합니다. 양을 변경하여 원하는 대로 형광의 밝기를 조정할 수 있습니다.</li>
			<li>20초 동안 FITC로 표지된 CP 용액을 소용돌이치거나, 용액이 균일하고 옅은 노란색이 될 때까지. 빛으로부터 보호하고 4°C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>스탬프를 향하게 하면 CP의 1.6 mg/mL 용액으로 각 스탬프를 프라임하여 CP 용액과 스탬프 사이에 기포가 형성되지 않도록합니다(그림 1F).</li>
	<li>스탬프를 CP 솔루션 레이어로 반전합니다(그림1G).</li>
	<li>1시간 후에 CP 용액에서 스탬프를 제거합니다.</li>
	<li>젖은 스탬프를 깨끗한 유리 슬라이드에 6-8x 로 두드려 여분의 액체를 제거합니다.</li>
	<li>진공 은 1-2 분 동안 우표를 처리합니다.</li>
	<li>스탬프 배치를 위한 가이드로서 깨끗한 유리 슬라이드 상단에 8개의 웰, 9mm 직경의 이미징 스페이서를 부착합니다. 이 스페이서를 사용하면 각 유리 슬라이드에 8개의 마이크로어레이가 있을 수 있습니다.</li>
	<li>이미징 스페이서의 각 웰 중앙에 있는 유리 슬라이드에 스탬프를 아래로 향하게 놓습니다(즉, 총 8개의 스탬프사용).</li>
	<li>각 스탬프 위에 5.6 ±0.1 g의 균형 잡힌 무게를 놓고 스탬핑을 위해 10 분 동안 허용하십시오(그림 1H). 스탬프가 유리 슬라이드에 고르게 눌러지고 CP를 유리 슬라이드로 균등하게 전달하기 위해서는 균형 잡힌 무게가 필요합니다.</li>
	<li>유리 슬라이드에서 분동 및 스탬프를 제거합니다(그림1I). 1.17단계에서 설명한 바와 같이, 생체 입자를 첨가하기 전에 CP 층이 실온에서 24시간 동안 건조되도록 한다. CP가 FITC로 태그된 경우, 1.17단계(도1M)로진행하기 전에 488 nm에서 형광 현미경으로 이 시점에서 스탬핑의 효과를 확인할 수 있다.</li>
	<li>이미징 스페이서의 크기로 빈 PDMS 슬래브를 잘라 내고 8mm 생검 펀치를 사용하여 이미징 스페이서의 우물과 일치하는 PDMS에 우물을 만듭니다. 이미징 스페이서(그림1J)를사용하여 유리 슬라이드에 PDMS 슬래브를 부착합니다.</li>
	<li>바이오 입자 (예를 들어, 대장균 또는 지모산)의 용액을 해동하고 주입 (WFI)을 위해 물에 500 μg / mL로 희석하십시오. 참고: 바이오 입자는 opsonized 할 필요가 없습니다. 호중구 표면 수용체는 이러한 생체 입자19,20,21에대한 분자를 직접 인식합니다.</li>
	<li>유리 슬라이드에 각 PDMS에 100 μL의 생체 입자 용액을 추가하십시오(그림 1K).</li>
	<li>유리 슬라이드를 30분 동안 흔들어 보입니다.</li>
	<li>우물을 물로 철저히 헹구십시오. 바이오입자 마이크로어레이는 4°C에서 먼지가 없는 환경에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다. 이 시점에서, 패턴은 2.1단계(도1N)로진행하기 전에 594 nm에서 형광 현미경으로 확인되어야 한다.</li>
</ol>2. 견본 준비
<ol><li>K2-EDTA 튜브에서 원하는 기증자로부터 적어도 2 mL의 신선한 혈액을 수집합니다. 호중구의 예상 수율은 1-2 x 106 세포/1 mL 전혈입니다. 화상 진찰 분석은 대략 1.5 x 105 호중구를 요구하고, 상구의 분석은 1 x 106 호중구를 요구합니다. 4 시간 이내에 혈액을 사용하십시오.</li>
	<li>적혈구 를 1:5 비율로 전혈에 적혈구 응집제를 첨가하여 적혈구(RBC)를 분리한다. 반투명 층(버피 코트)이 RBC 층에서 분리될 때까지 45분 간 기다립니다.</li>
	<li>버피 코트를 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 1 mL 버피 코트: 9 mL PBS를 사용하여 세척합니다.</li>
	<li>190 x g 및 20 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>상급을 흡인하고 5 x 107 세포 / mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.</li>
	<li>호중구를 분리하기 위해 음의 면역 자기 선택 키트를 사용합니다.<ol>
<li>항체 칵테일/1 mL 세포 현탁액 50 μL을 추가합니다. 10분 동안 기다립니다.</li>
		<li>자기 비드/1 mL 셀 서스펜션 100 μL을 추가합니다. 10분 동안 기다립니다.</li>
		<li>셀 서스펜션을 둥근 바닥 튜브에 추가하고 원통형 자석에 넣습니다. 10분 동안 기다립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원심 분리튜브에 상급물을 붓습니다. 최대 10mL의 PBS를 추가합니다. 190 x g 및 20 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>흡인 상피. 0.4% 휴먼 세럼 알부민으로 IMDM에 화이트 펠릿을 다시 놓습니다.</li>
	<li>37°C에서 10분 동안 20 μg/mL Hoechst 33342로 핵을 염색하였다.</li>
	<li>0.4% 인간 혈청 알부민과 함께 IMDM 5 mL을 추가하여 헹구어 보도록 합니다. 190 x g 및 20 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>0.4% 인간 혈청 알부민으로 IMDM에서 7.5 x 105 세포/mL에서 세포를 다시 중단시다.</li>
	<li>바이오입자 마이크로어레이를 함유하는 PDMS에 세포 현탁액의 100 μL을 추가한다. 셀 서스펜션이 PDMS 상단의 볼록하고 거품이 포함되어 있지 않은지 확인합니다.</li>
	<li>직경 12mm 커버슬립으로 밀봉합니다. 직경 12mm 커버슬립으로 PDMS의 개구부를 잘 덮습니다. 핀셋으로 커버슬립을 가볍게 눌러 여분의 셀 서스펜션이 우물 가장자리로 빠져나오도록 합니다. 조직을 사용하여 과잉 세포 현탁액을 제거하십시오.</li>
</ol>3. 분석 및 이미지 분석 실행
<ol><li>37°C, 5%CO2및 90% 상대 습도로 설정된 케이지 인큐베이터가 장착된 현미경으로 라이브 셀 이미징 스테이션에 세포와 함께 미립자 배열을 로드합니다.</li>
	<li>타임랩스 형광 및 브라이트필드 현미경을 사용하여 405 nm, 594 nm 및 브라이트필드에서 10초마다 10배 배율로 이미지를 기록합니다. 일반적인 실험에서 이미지는 최대 2시간까지 수집됩니다.</li>
	<li>자동화된 세포 추적 소프트웨어를 사용하여 개별 호중구가 바이오입자 클러스터로 이동하는 것을 추적합니다.<ol>
<li>스팟 감지 셀 추적 소프트웨어의 자동 회귀 모드를 사용합니다. 스팟 반경을 5 μm(호중구 핵의 대략적인 크기)로 설정합니다. 최소 트랙 길이를 120초로 설정하고 최대 간격 크기를 한 프레임으로 설정합니다.</li>
		<li>셀 추적 소프트웨어에 의해 생성 된 데이터에서 호중구 위치 및 속도를 포함하는 파일을 추출하십시오. 이러한 파일은 각각 호중구 마이그레이션트랙(그림 2C)과속도 대 시간의 히트 맵을 생성하는 그래프 소프트웨어와 함께 사용할 수 있습니다(그림2D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>405 nm 형광 등 이미지를 사용하여 선택한 이미지 분석 소프트웨어에서 시간이 지남에 따라 군단 크기를 추적할 수 있습니다.<ol>
<li>호중구가 무리를 지어 각 생체 입자 클러스터 주위에 관심 영역(ROI)을 정의합니다. 동일한 크기의 ROI를 유지하여 각 생체 입자 클러스터를 분석합니다.</li>
		<li>시간이 지남에 따라 각 ROI 내에서 405 nm 이미지의 평균 형광 강도를 분석합니다.</li>
		<li>0 μm2에서 최대 군단 크기까지 다양한 군단 크기에서 수동 측정을 통해 평균 형광 강도의 교정 곡선을 군단 크기로 생성합니다. 이 보정을 사용하여 시간에 따라 군단 크기를 계산합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 상급 수집 및 단백질 검출
<ol><li>37°C및 5% CO2에서 37°C및 5%CO2를 함유하는 웰즈에서 호중구를 3시간 동안 배양한다. 원하는 시점에서 샘플을 채취하십시오. 전형적으로, 샘플은 0, 0.5, 1 및 3시간에서 채취됩니다. 단백질 어레이 분석법의 검출 한계를 극복하기 위해, 단일 웰(200 μL)의 상상부부부부량의 전체 부피를 각 시점마다 사용하였다. 각 시점은 삼중항으로 분석되었다.</li>
	<li>밝은 필드 현미경을 사용하여, 무리가 마이크로 어레이에 형성되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>200 μL 파이펫으로 상한체를 흡인하고 0.45 μm 원심 분리 필터 튜브에 하중합니다.</li>
	<li>상급체를 190 x g 및 20°C에서 5분 동안 5분 동안 원심분리하고 여과된 부피를 수집한다.</li>
	<li>시료를 가공 시간까지 -80°C로 저장한다.</li>
	<li>다양한 인간 단백질을 검출하여 샘플을 처리하는 마이크로어레이 키트를 사용합니다.<ol>
<li>키트와 함께 제공되는 별도의 투석 튜브에 각 샘플의 200 μL을 추가합니다.</li>
		<li>투석 튜브를 PBS의 500 mL 이상을 포함하는 비커에 놓습니다 (pH = 8.0). 4°C에서 3시간 이상 저어줍니다. 비커의 PBS를 변경하고 이 단계를 반복합니다.</li>
		<li>각 샘플을 깨끗한 원심분리기 튜브와 원심분리기로 9,000 x g에서 5분 동안 옮겨 침전물 제거합니다. 각 상급체를 깨끗한 튜브로 옮김.</li>
		<li>투석 시료의 총 단백질 1 mg당 키트로부터 36 μL의 1x 라벨링 시약을 180 μL에 첨가하여 각 시료를 바이오티니레이팅한다. 20°C에서 30분간 배양합니다.</li>
		<li>키트와 함께 제공된 스톱 솔루션 3 μL을 각 샘플 튜브에 추가합니다. 각 샘플을 신선한 투석 튜브로 옮기고 4.6.2-4.6.3 단계를 반복합니다. 이 단계에서, 시료는 진행준비가 될 때까지 -20°C 또는 -80°C에서 보관할 수 있다.</li>
		<li>키트와 함께 제공되는 유리 슬라이드는 -20°C에서 보관된다. 실온에 오도록 하십시오. 조립된 유리 슬라이드를 실온에서 1-2시간 동안 라미나 흐름 후드에 놓습니다.</li>
		<li>키트와 함께 제공된 블로킹 버퍼의 400 μL을 조립된 유리 슬라이드의 각 웰에 추가합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>9,000 x g에서 5분 동안 제조된 샘플을 원심분리하여 침전물 또는 미립자를 제거한다. 블로킹 버퍼로 5x 희석합니다.</li>
		<li>각 웰에서 차단 버퍼를 제거합니다. 희석된 시료 400 μL을 적절한 우물에 넣습니다. 흔들면서 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.</li>
		<li>각 우물에서 샘플을 장식합니다. 1x 세척 버퍼의 800 μL로 3x를 흔들면서 실온에서 5 분 동안 키트와 함께 제공했습니다.</li>
		<li>깨끗한 용기에 조립된 유리 슬라이드를 1x 세척 버퍼 I. 흔들면서 실온에서 각각 5분 동안 2x세척하십시오.</li>
		<li>각 서브 어레이에 1x Cy3 컨쥬게이드 스트렙타비딘 400 μL을 추가합니다. 플라스틱 접착제 스트립으로 덮습니다. 프로토콜의 나머지 부분에 대해 빛으로부터 보호합니다.</li>
		<li>흔들면서 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.</li>
		<li>용액을 데낸트하고 샘플 챔버에서 유리 슬라이드를 분해합니다.</li>
		<li>키트와 함께 제공되는 30 mL 원심 분리기 튜브에서 유리 슬라이드와 충분한 1x 세척 버퍼 I를 조심스럽게 추가하여 유리 슬라이드를 덮습니다. 흔들면서 실온에서 각각 3x를 10분 간 씻으소서.</li>
		<li>30 mL 원심 분리기 튜브에서 흔들면서 실온에서 각각 5 분 동안 1 x 세척 버퍼 II로 2 x를 씻으십시오.</li>
		<li>30 mL의 ddH2O로 유리 슬라이드를 5 분 동안 씻으십시오. 원심 분리관에서 유리 슬라이드를 제거하고 층류 후드에서 20 분 동안 건조시키십시오. 제조된 유리 슬라이드는 스캔준비가 될 때까지 -20°C에서 보관될 수 있다.</li>
		<li>555 nm의 형광 방출에서 마이크로 어레이 스캐너로 유리 슬라이드를 스캔하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

우리는 시험관 내 호중구 무리를 자극하기 위해 균일 한 바이오 입자 배열을 생성하는 마이크로 스탬핑 플랫폼을 개발했습니다. 우리의 플랫폼의 체외 특성은 우리가 생체 내 무리 실험으로 발생하는 합병증을 우회 할 수 있습니다, 즉 호중구를 무리에 의해 방출 중재자를 분석 할 수있는 가난한 능력5. 또한 생체 내 모델은 일반적으로 설치류11,12,13,15,22,23, 또는 제브라피시11,12,<sup class="xr...

혈류에서가장 풍부한 백혈구인 호중구는 1,3,2,3, 구획4,패혈증3,외상5,6,암1,7,8,각종 자가면역 질환5,9등 다양한 의료 조건에 관여할 수 있기 때문에 잠재적 진단 및 치료 표적으로 주목받고 있다. 호중구 떼는 연구5,10,11의특히 흥미로운 초점을 만드는 복잡성과다단계,엄격하게 규제 과정입니다. 무리 동안 호중구는 주변의 건강한 조직으로부터 염증 부위를분리5,10,11. 호중구 무리의 적절한 조절은 상처 치유와 궁극적으로 염증 해결을 촉진하는 데 필수적이다5,12. 호중구 떼는 주로 설치류12,13,14,15 및 제브라피시10,11,12,15 모델에서 생체 내에서 연구되었다. 그러나, 이러한 생체 내 동물 모델의 특성상 한계를 야기한다5. 예를 들어, 무리 동안 호중구에 의해 방출 된 중재자는 분석5에쉽게 접근 할 수 없습니다. 추가적으로, 생체 내에서 주어진 중재자에 대한 많은 잠재적인 공급원이 존재하므로 생체 내 실험은 주어진 프로세스에서 그 중재자의 역할을 조사하기 위해 세포 생산 및/또는 상호작용을 억제하는 유전적 결핍을 도입해야 한다13. 시험관 내 실험은 추가 세포의 맥락없이 호중구 관찰을 가능하게하여이 합병증을 우회. 추가적으로, 인간 호중구 조정한 이주를 기술하는 연구는16. 생체 외에서 무리 플랫폼에서, 인간의 호중구는 직접 분석 할 수 있습니다. 생체 외에서 떼지어 플랫폼은 생체 내 연구의 한계에 의해 남겨진 격차를 채울 수있는 기회를 제공함으로써 생체 내 연구에서 얻은 지식을 확장 할 수 있습니다.
생체 내 호중구 떼를 모방하는 체외 플랫폼의 필요성을 해결하기 위해, 우리는 공간적으로 제어 된 방식으로 호중구 떼를 자극하는 바이오 입자 마이크로 어레이를 패턴화 할 수있는 마이크로 스탬핑 플랫폼을 개발했습니다. 우리는 2 단계 공정에서 유리 슬라이드에 생체 입자 마이크로 어레이를 생성합니다. 첫째, 마이크로스탬핑을 사용하여 양이온폴리전해질(CP) 반점의 마이크로어레이를 생성합니다. 둘째, 정전기 상호 작용을 통해 CP 반점에 부착되는 바이오 입자 용액을 추가합니다. 먼저 CP 층을 패터닝함으로써, 우리는 원하는 호중구 군집 패턴을 생성하기 위해 음전하 바이오 입자를 선택적으로 패턴화 할 수 있습니다. 양전하층은 CP가 없는 유리 슬라이드의 영역에서 바이오입자를 제거하는 활발한 세척 단계를 통해 음전하된 바이오입자를 보유합니다. 그것은 유리 슬라이드에 미론 크기의 바이오 입자를 고정시키는 매우 높은 표면 전하를 가지며, 따라서 유리 슬라이드의 패턴 위치에서 입자를 제거하는 호중구를 억제합니다. 이로 인해 마이크로어레이로 배열된 생체 입자 클러스터가 생성됩니다. 우리가 마이크로어레이에 호중구를 추가했을 때, 그들은 생물입자 클러스터 주위에 안정된 무리를 형성했습니다. 호중구 이동추적을 통해, 우리는 호중구떼가 생체입자 클러스터로 적극적으로 이동한다는 것을 발견했습니다. 또한, 우리는 호중구가 떼지어 다니는 동안 방출되는 특정 중재자를 분석하기 위해이 플랫폼을 사용했습니다. 우리는 무리를 지어 다니는 동안 차별화된 16개의 중재자를 발견했습니다. 그들의 농도 는 시간이 지남에 따라 세 가지 일반적인 추세를 따릅니다: 증가, 감소, 또는 스파이크. 우리의 체외 호중구 떼 플랫폼은 공간적으로 제어 된 인간 호중구 무리의 분석뿐만 아니라 호중구 무리에 의해 발표 된 중재자의 수집 및 분석을 용이하게합니다. 이전 간행물에서, 우리는 특정 건강 상태 (외상, 자기 면역 질병 및 패혈증)를 가진 환자가 건강한 기증자에서 그것과 다르게 작동하는 호중구가 있었다는 것을 보여주었습니다5. 향후 연구 연구에서, 우리의 플랫폼은 다양한 환자 집단 사이에서 호중구 기능을 분석하는 데 사용될 수 있습니다. 이 플랫폼은 호중구 무리에 관련된 복잡한 조정을 정량적으로 분석할 수 있다. 추가 연구는 관심있는 병원체에 대한 특정 환자 집단 또는 호중구 반응의 호중구 기능에 대한 통찰력을 제공하기 위해 수행 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>"The Big Easy" EasySep 자석</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18001</td><td>호중구 분리 키트와 함께 사용하는 자석</td></tr><tr><td>세포 인큐베이터</td><td>Okolab</td><td>777057437 / 77057343</td><td>온도 및 CO2 제어를 위한 Okolab 케이지 인큐베이터</td></tr><tr><td>EasySep 인간 호중구 분리 키트</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17957</td><td>인간 호중구</td></tr><tr>의 면역자기 음성 선택을 위한 키트<td>Eclipse Ti2</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA54010 / MEF55037</td><td>Inverted research microscope</td></tr><tr><td>Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>E2863</td><td>Bioparticle powder, dissolve in water before addition to Zetag&reg; array</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 8-mm 생검 펀치</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z708925</td><td>PDMS 스탬프를 절단하려면</td></tr><tr><td>HetaSep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7906</td><td>신선한 인간 혈액에서 적혈구에서 버피 코트를 분리하기위한 적혈구 응집제</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>핵 형광 염색</td></tr>제 <tr><td>Human L1000 Array</td><td>Raybiotech Inc.</td><td>AAH-BLG-1000-4</td><td>1000개의 인간 단백질을 검출하기 위한 고밀도 어레이</td></tr><tr><td>인간 혈청 알부민(HSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5843</td><td>저내독소 HSA, 분리된 호중구를 위해 IMDM에서 2% 용액</td></tr><tr><td>준비 Iscove's Modified Dulbeccos' Medium(IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440053</td><td>분리된 호중구</td></tr><tr><td>K2-EDTA 튜브</td>를 재현탁하기 위해 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-657-32</td><td>혈액 채취 용 튜브</td></tr><tr><td>저 반사 크롬 포토 마스크</td><td>전면 범위 포토 마스크</td><td>N / A</td><td>치수 5 "x 5"x 0.09 "(L x W x D)</td></tr> <tr><td>마이크로 어레이 스캐너</td><td>Perkin Elmer</td><td>ASCNGX00</td><td>단백질 패턴 마이크로 도메인의 형광 리더</td></tr><tr><td>현미경 이미지 Analsysis 소프트웨어 - Imaris</td><td>Bitplane</td><td>9.3.0</td><td>자동 세포 추적 분석</td></tr><tr><td>을위한 소프트웨어NiS Elements Advanced Research Software Package</td><td>Nikon Instruments</td><td>MQS31100</td><td>자동 라이브 셀 이미징 및 스웜 크기 계산을 위한 소프트웨어</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3069-10MG</td><td>30,000 - 70,000 MW PLL FITC로 라벨링, CP 솔루션</td></tr><tr><td>SecureSeal 8-well 이미징 스페이서</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>8-well, 9-mm 직경, 접착 이미징 스페이서</td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>대학 웨이퍼</td><td>590</td><td>실리콘 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 &mu; m SSP 테스트</td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>Laurell</td><td>WS-650MZ-23NPPB</td><td>40-&micro를 스핀 코트하는 데 사용됩니다. 실리콘 웨이퍼</td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td>2025</td><td>네거티브 포토레지스트</td></tr> 상의 포토레지스트 m 층은 실리콘 마스터 웨이퍼 <tr><td>SU-8 현상액</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td>포토레지스트 현상액을 만듭니다. 실리콘 웨이퍼</td></tr><tr><td>Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)</td><td>Dow</td><td>1673921</td><td>마이크로스탬프 및 PDMS 웰 UV 노출 마스킹 시스템 Klo&eacute를 만들기 위한 2파트 실리콘 엘라스토머 키트</td></tr>에서 비가교 SU-8 2025 제거<tr><td></td><td>;</td><td>UV-KUB 2</td><td>UV 광선으로 크롬 마스크를 통해 실리콘 웨이퍼의 포토레지스트를 가교하는 데 사용</td></tr><tr><td>물</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1287303</td><td>바이오 입자를 희석하기 위한 고품질 물</td></tr><tr><td>Zetag 8185</td><td>BASF</td><td>8185</td><td>양이온 성 고분자 전해질(CP), 분말, 아크릴아미드 및 쿼터너화 양이온 단량체의 공중합체는 물에</td></tr> <tr><td>용해될 때 마이크로스탬핑을 위한 "잉크 솔루션"을 형성합니다.Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>Z2843</td><td>바이오 입자 분말, Zetag 어레이에 첨가하기 전에 물에 용해</td></tr></tbody></table>

생체 외에서 인간 호중구 떼의 화학 및 분자 분석을 위한 생체 입자 미세어레이

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

호중구 떼는 호중구가 감염 부위를 봉인하고 조직 재구성을 촉진하는 협력 과정입니다. 떼는 세포 이동의 특징적인 패턴을 보여주는 동물 모델에서 생체 내에서 고전적으로 연구되었습니다. 그러나 생체 내 모델에는 접근 및 분석이 어려운 세포간 중재자뿐만 아니라 인간 호중구를 직접 분석할 수 없는 등 여러 가지 한계가 있습니다. 이러한 제한 때문에, 인간 호중구로 떼지어 연구하고 떼지어 다니는 동안 생성되는 분자 신호에 쉽게 접근할 수 있는 시험관 내 플랫폼이 필요합니다. 여기서, 다단계 마이크로스탬핑 공정은 생체 내 감염을 모방하여 떼지어를 자극하는 생체 입자 마이크로어레이를 생성하는 데 사용된다. 생체 입자 마이크로 어레이는 호중구가 제어되고 안정적인 방식으로 무리를 유도합니다. 마이크로어레이에서 호중구는 속도가 증가하고 생물입자 클러스터 주변에 안정된 무리를 형성합니다. 추가적으로, 호중구에 의해 생성된 상온제는 분석되고 16개의 단백질은 무리의 과정을 통해 분별적으로 표현된 것으로 밝혀졌습니다. 이 시험관 내 무리 플랫폼은 재생 가능한 공간 제어 방식으로 호중구 이동 및 단백질 방출에 대한 직접적인 분석을 용이하게 합니다.

호중구가 바이오 입자 마이크로 어레이에 추가되면, 생체 입자 클러스터와 접촉하는 호중구가 활성화되어 무리 반응을 시작합니다. 바이오입자 마이크로어레이는 타임랩스 형광 현미경을 사용하여 생체입자 클러스터를 향한 호중구 이동을 추적하는 것으로 검증되었습니다(비디오S1). 개별 호중구 핵의 이동은 생물입자 클러스터로 이동함에 따라 추적됩니다. 호중구가 생체 입자 클러스터에 도달하면 핵이 클러스터의 다른 핵과 겹칩니다. 따라서, 이 방법을 사용하여 클러스터 내의 호중구를 정확하게 추적할 수 없다. 자이모산과 대장균 생체 입자 클러스터는 모두 호중구 무리의 생성을 초래합니다. 결과를 위해 그림 2B는 대장균 입자에 의해 생성된 호중구 군단의 데이터를 사용합니다. 도 3 및 도 2의 다른 ...

이 프로토콜은 공간적으로 제어된 호중구 무리를 제공하는 생체 입자 마이크로어레이를 생성합니다. 그것은 호중구가 마이그레이션 하는 동안 해제 하는 중재자에 쉽게 액세스를 제공 하 고 정량적 이미징 분석을 허용 합니다.

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

이 프로토콜은 호중구 무리의 체외 분석을 허용하기 때문에 중요하며, 이는 현재 실험할 수 없는 많은 한계를 극복합니다. 이 기술의 주요 장점은 호중구가 무리 중에 방출되고 정량적 이미징 분석을 허용하는 분비된 사이토카인 및 지질 중재자에 쉽게 접근할 수 있다는 것입니다. 우리는 호중구에 이 기술을 적용하는 동안, 단핵구 및 T 세포 같이 그밖 백혈구의 이동을 분석하기 위하여 확장될 수 있었습니다.밀리리터 양이온 폴리일라이트 또는 CP 용액당 1.6밀리그램을 준비하여 적절한 양의 CP 분말을 물에 추가하고 밤새 또는 모든 고형물이 용해될 때까지 교반판에 혼합하여 시작합니다. 원하는 경우 FITC로 표시된 폴리 L-리신을 추가하여 용액을 형광할 수 있습니다. 표준 포토리소그래피 절차를 사용하여 마스터 실리콘 웨이퍼를 생성합니다.여기서 사용되는 디자인은 30 마이크로미터 직경의 4mm리터 직사각형 배열로, 150 마이크로미터 중심을 중심으로 간격을 두고 있지만, 다른 용도에 대해 원하는 대로 수정할 수 있다. 실리콘 웨이퍼에 네거티브 포토레지스트의 40 마이크로미터 두께층을 스핀 코트. 그런 다음 웨이퍼를 섭씨 65도에서 5분간 굽습니다.그리고 10 분 동안 섭씨 95도. 150~160밀리미터곱미터의 크롬 포토마스크를 통해 웨이퍼를 UV 광에 노출시다. 웨이퍼를 섭씨 65도에서 5분간, 섭씨 95도에서 10분간 다시 구워줍니다.그런 다음 포토레지스트 개발자에게 10분 동안 담급됩니다. 그리고 이소 프로필 알코올로 헹지. 이제 웨이퍼에 패턴이 표시됩니다.다음으로, 폴리디메틸실록산 또는 PDMS, 프리폴리머 및 그 경화제의 10 대 1 비율을 철저히 혼합한다. 그리고 페트리 접시에 마스터 웨이퍼 위에 경화되지 않은 혼합물을 붓습니다. 진공은 기포가 없을 때까지 경화되지 않은 PDMS 혼합물을 처리합니다.그런 다음 섭씨 65도에서 하룻밤 동안 치료하십시오. 다음 날, 웨이퍼의 패턴 섹션의 외관 주위를 잘라 메스를 사용합니다. 그리고 경화 된 PDMS 슬래브를 천천히 제거하고 패턴 면이 위로 향하는 깨끗한 도마에 놓습니다.PDMS 슬래브의 개별 스탬프를 8mm 생검 펀치로 펀치하고 각 스탬프를 접착제 테이프에 엎드려 이물질을 제거합니다. 이러한 스탬프가 위향을 향하도록 미리 준비된 CP 솔루션의 100마이크로리터가 있는 각 스탬프를 프라임하여 솔루션과 스탬프 사이에 기포가 형성되지 않도록 합니다. 그런 다음 스탬프를 CP 솔루션 레이어에 반전시키고 1시간 후에 제거합니다.젖은 각 스탬프를 깨끗한 유리 슬라이드에 6~8번 내려 놓고 여분의 액체를 제거합니다. 그런 다음 스탬프를 1~2분 동안 진공 청소기로 처리합니다. 스탬프 배치를 위한 가이드로서 깨끗한 유리 슬라이드 위에 8밀리미터 직경의 이미징 스페이서를 부착합니다.이미징 스페이서의 각 웰 의 중앙에 유리 슬라이드에 스탬프를 아래로 놓습니다. 그런 다음 각 스탬프 위에 5.6 그램의 균형 잡힌 무게를 놓고 스탬핑을 위해 10 분을 허용하십시오. 슬라이드에서 무게와 우표를 제거하고 CP 층이 생체 입자를 추가하기 전에 실온에서 24 시간 동안 건조 할 수 있습니다.CP가 FITC로 태그된 경우 형광 현미경으로 스탬핑의 효과를 확인하십시오. 빈 PDMS 슬래브를 이미징 스페이서 크기로 자르고 8mm 생검 펀치를 사용하여 스페이서의 우물과 일치하는 PDMS의 우물을 만듭니다. 그런 다음 PDMS 슬래브를 유리 슬라이드에 부착합니다.바이오 입자의 용액을 해동하고 주입을 위해 물에서 밀리리터 당 500 마이크로 그램으로 희석하십시오. 유리 슬라이드에 각 PDMS에 100 마이크로리터의 생입자 용액을 넣고 30분 동안 슬라이드를 흔들수 있습니다. 우물을 물로 철저히 헹구고 형광 현미경으로 슬라이드의 패턴을 확인하십시오.생체 입자 마이크로어레이는 최대 3개월 동안 섭씨 4도에서 먼지가 없는 환경에 보관할 수 있습니다. IMDM에서 밀리리터당 5번째 세포에 7.5배 10회에서 0.4%의 인간 혈청 알부민으로 세포를 재연하여 세포를 준비한다. 생체 입자 마이크로 어레이를 잘 포함하는 PDMS에 서스펜션 100 마이크로리터를 추가하여 세포 현탁액이 PDMS 상단에 잘 볼록하고 거품이 포함되어 있지 않은지 확인합니다.12 밀리미터 직경의 커버 슬립으로 우물을 밀봉하고 핀셋으로 부드럽게 눌러 과도한 세포 현탁액이 우물 가장자리로 빠져 나간 다음 조직을 사용하여 과잉을 제거하십시오. 세포를 이미지화하기 위해, 현미경의 살아있는 세포 이미징 스테이션에 세포와 함께 마이크로 입자 배열을 로드하 37섭씨, 5%의 이산화탄소 및 90%의 상대 습도로 설정된 케이지 인큐베이터가 장착되어 있습니다. 시간 경과, 형광 및 밝은 필드 현미경 검사를 사용하여 405 나노미터, 594 나노미터 및 밝은 필드에서 10 초마다 10배배율로 이미지를 기록합니다.생체 입자와 함께 우물의 호중구를 37도, 이산화탄소 5%를 3시간 동안 배양하여 원하는 시점에서 샘플을 채취합니다. 밝은 필드 현미경을 사용하여 소열이 마이크로 어레이에 형성되는지 확인합니다. 단일 웰의 전체 상체체 를 수집하고 0.45 마이크로미터 원심분리기 필터 튜브에 적재하여 트리플리케이트의 매 시간 지점을 분석하십시오.원심 분리는 5 분 동안 190 배 G와 섭씨 20도에서 튜브를 원심 분리하고 여과 된 볼륨을 수집합니다. 그런 다음 처리 시간까지 샘플을 영하 80도에서 보관하십시오. 이 프로토콜을 시도할 때는 연기 후드에서 포토레지스트 및 개발자와 함께 작업합니다.인간 기증자에게서 혈액을 취하기 전에 장소에 IRB 승인 프로토콜이 있습니다. 인간의 혈액에서 파생 된 물질은 BSL2 것을 기억하십시오. 호중구가 생입자 마이크로어레이에 첨가되면 생체 입자 클러스터에 접촉하는 호중구가 활성화되어 서집 반응을 시작합니다.생체 입자 마이크로어레이는 시간 경과 형광 현미경 검사를 사용하여 생체 입자 클러스터로의 호중구 이동을 추적하여 검증되었습니다. 안정적인 호중구 군단은 30~60분 동안 노출된 후 각 클러스터 주위에 형성됩니다. 대조적으로, 호중구는 생물 입자 클러스터의 부재에 집단 이주를 표시하지 않습니다.스테인드 호중구 핵의 형광 강도는 생체 입자 클러스터 주위의 평균 떼 크기가 약 1490 마이크로미터 제곱된 것을 결정하기 위해 사용되었다. 클러스터가 없는 경우, 관심의 주어진 영역의 형광은 시간이 지남에 따라 일정하게 유지. 호중구 이동의 트랙은 호중구가 존재할 때 생입자 클러스터에 수렴되었음을 보여 주지만 제어 시스템에서는 수렴이 관찰되지 않았습니다.무리와 비활성화 호중구의 속도를 측정하고, 속도 분포에서 통계적으로 유의한 차이가 발견되었다. 호중구 를 무리에 대 한 평균 속도 는 분 당 20.6 마이크로 미터, 제어 호중구에 대 한 평균 속도 분 당 2 마이크로 미터 동안. 호중구가 무리 중에 방출되는 16가지 단백질의 농도는 시간이 지남에 따라 분석되었다.10 단백질 농도 증가. 2개가 감소했습니다. 그리고 나머지 네 는 무리의 첫 번째 시간 동안 증가하지만 그 후 감소.이 절차를 수행하는 동안 세균 성 입자의 성공적인 패터닝에 필수적이기 때문에 모든 것이 깨끗하고 우표가 제대로 건조되었는지 확인하십시오. 이 기술의 발달은 유중구 성 소동의 필드에 있는 새로운 질문을 탐구하는 연구원을 가능하게 할 것입니다, 어떻게 자유로운 중재자 및 세포외 소포가 호중구 세포 간 통신에 관련되는가를 포함하여.

bioparticle-microarrays-for-chemotactic-molecular-analysis-human

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

이 동영상은 all-on-chip 방법을 사용한 호중구 화학주성 분석을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 면역자기 음성 선택에 의해 전혈에서 호중구를 직접 분리한 후 미세유체 칩에서 화학주성 분석을 수행할 수 있습니다.

전혈을 이용한 신속한 호중구 화학요법 분석을 위한 미세유체 칩 기반 방법

이 프로토콜은 강력한 재현성 전체 혈액 한 방울에서 인간 호중구의 화학 주성을 측정하기위한 분석을 자세히 설명합니다. 이 접근법은 호중구의 분리의 필요성을 우회하고 분석 준비 시간의 몇 분을 필요로한다. 마이크로 유체 칩은 유아 또는 샘플의 양이 제한되어 작은 포유 동물에 시간이 지남에 따라 호중구의 화학 주성의 반복 측정을 가능하게합니다.

처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

카메라 화학 주성 분석 화학 주성은 매개 세포 이동 방향을 제어하는​​ 방법에 진핵 세포의 이해에 필수적이다. 1) 실시간 다중 화학 주성 분석법 고해상도 모니터링 및 2)에 동시에 화학 유인 그라데이션 시각화 및 호중구와 같은 HL60 세포의 이벤트 신호의 시공간 역학 : 여기서는 대한 구체적인 방법을 설명한다.

이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합

이 기사에서는 전혈에서 온 칩 호중구 분리와 단일 마이크로 유체 칩의 화학 주성 테스트를 통합하여 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을 수행하는 자세한 방법을 제공합니다.

혈액 방울로부터의 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을위한 올 온칩 (all-on-chip) 방법

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

여기에서 우리는 마우스 모형에 있는 혈액 단핵구의 화학전술 활동을 정량화하고, 혈액 단핵구에 영양, 약리학 및 유전 내정간섭의 효력을 평가하고 혈액 단핵구 파생된 대식세포특성화하기 위하여 프로토콜을 제시합니다 단핵구 화학 유도제 단백질-1 (MCP-1)을 사용하여 마우스 모델 - 로드 지하 막 유래 젤 플러그.

생체 내에서 단핵구 화학 적 활동의 정량화 및 혈액 단핵구 유래 대식세포의 특성화

이 프로토콜은 다양한 신호 전달 경로의 기능을 포괄하는 스크리닝 방법으로 사용되는 호중구 기능 분석 세트를 특징으로 합니다. 이 프로토콜에는 세포 생존율, 순도, 활성 산소 종 생산, 실시간 이동, 식세포작용 및 호중구 세포외 트랩에 대한 예비 제안에 대한 초기 및 간단한 평가가 포함됩니다.

호중구 기능에 대한 간략한 개요를 위한 일련의 스크리닝 기법

이 정의된 프로토콜은 in vitro에서 인간 호중구 세포외 트랩(NET) 방출을 시각화하고 정량화하기 위한 실시간 고처리량 현미경 접근 방식을 설명합니다. 재현 가능한 방법을 통해 뚜렷한 NETosis 유도 인자를 자극 시 NET 방출의 특성과 동역학을 조사할 수 있으며 NETosis 길항제의 약리학을 평가할 수 있습니다.

Human Neutrophil Extracellular Trap release의 실시간 고처리량 현미경 정량화 및 길항제의 약리학 평가

우리는 topoisomerase 단백질에 의해 구동되는 분자 규모의 장치의 조립 및 응용 프로그램을 보여줍니다. 구조는 끝이 두 가지 다른 fluorophores을 첨부하여 조직 섹션에서 DNA 나누기의 두 가지 주요 유형의 레이블 생체 분자 센서이다.

DNA 손상 감지를위한 세미 인공 분자 기계 및 이용 체외 조립에

학습하세요 생체 입자 미세어레이를 이용한 인간 호중구 떼의 화학 및 분자 분석 방법을. 이 기술은 세포 이동 정량 이미징과 분비된 사이토카인 및 지질 매개체 접근을 가능하게 합니다.

생체 외에서 인간 호중구 떼의 화학 및 분자 분석을 위한 생체 입자 미세어레이

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