Name: 거세 저항하는 전립선암 환자에게서 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 작은 비코딩 RNA를 시퀀싱 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-19T02:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 학습하세요 거세 저항성 전립선암 환자의 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 소량 RNA를 분리하고 cDNA 라이브러리를 최적화하여 차세대 시퀀싱을 수행하는 방법을. 이 기법은 신규 바이오마커 발굴과 종양 진행 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 미 육군 의학 연구 획득 활동 (USAMRAA)에 의해 지원된다 아이디어 개발 상을 통해 수상 번호. W81XWH-18-1-303 및 W81XWH-18-2-0013 및 추가 로 수상 번호. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, W81XWH-18-2-0018, 및 W81XWH-18-2-0019 전립선암 바이오리포시토리 네트워크(PCBN). 건강의 국가 학회에 있는 국립 암 학회에 의해 저자의 실험실에 자금 지원 (그랜트 번호 RO1CA177984) 또한 인정됩니다. Rajvir Dahiya는 재향 군인 업무부, BX004473의 수석 연구 경력 과학자이며 NIH-UO1CA199694 (RD)의 지원을 받습니다. 의견, 해석, 결론 및 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국방부 또는 미 육군의 승인을 받지는 않습니다. 샌프란시스코 VAMC의 핵심 시설 책임자인 주디 시게나가(Judy Shigenaga)가 NextSeq 500 시퀀서에 도움을 주신 것에 감사드립니다.

이 연구는 미국 공통 규칙의 윤리 적 지침에 따라 수행되었으며 인간 연구에 대한 기관위원회의 승인을 받았습니다.
1. 미세 해부
참고: 선암 기능(CRPC-Adeno) 또는 NE 분화(CRPC-NE)를 가진 FFPE 전이성 CRPC 조직은 전립선암 생체 분석 네트워크(PCBN)로부터 수득되었다. 유리 슬라이드에 10 미크론 PCa 섹션은 이전에 논의 된 바와 같이 수동 미세 해부를 위해 제조되었다18. 간략하게 요약하려면 다음을 수행하십시오.
<ol><li>자일렌 (2 x, 10 분 각)에 슬라이드를 담가 조직 섹션을 분리합니다. 그런 다음 등급이 매겨진 에탄올 (100 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 %)에서 슬라이드를 5 분 동안 인큐베이팅한 다음 증류수 세척및 헤마톡실린 (30 s soak)으로 염색하여 섹션을 재수화합니다.</li>
	<li>헤마톡실린 염색 후 조직 부분을 물로 씻으하십시오. 그런 다음 등급이 매겨진 에탄올 (70 %, 80 % 90 %, 95 %, 100 %)에 배치하여 조직 섹션을 탈수 (각 5 분) 자일렌 (5 분).</li>
	<li>해당 헤마톡신 및 에오신(H&E) 슬라이드를 분석하여 종양 부위(즉, 선암 또는 NED)를 식별하고 보드 인증 병리학자의 도움을 받아 이러한 종양 영역과 정상적인 인접 부위를 표시합니다. 이러한 H&E 슬라이드를 로드맵으로 사용하여, 종양과 정상 영역을 구별하기 위해 위의 단계에서 얻은 헤마톡실린 염색 조직을 표시합니다.</li>
	<li>메스 블레이드를 사용하여 현미경 으로 표시된 조직 슬라이드를 조심스럽게 해부하십시오.</li>
	<li>정전기 충전 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 별도의 튜브에서 정상 및 암 영역에서 해부 된 조직을 수집합니다. 충전 된 팁은 해부 된 조직을 끌어 당기고 해부 후 최대 조직 회복을 허용합니다. 티슈가 충전된 팁에 달라붙으면 팁을 빈 2mL 수집 튜브로 자릅니다.</li>
</ol>2. 세럼 유래 EV 분리
참고: 선암 특성(CRPC-adeno) 또는 NE 분화(CRPC-NE)를 가진 전이성 CRPC 환자로부터 채취한 냉동 환자 혈청 샘플을 승인된 IRB 프로토콜을 사용하여 PCBN으로부터 조달하고 사용 전에 -80°C에서 저장하였다. 혈청 샘플은 해당 조직과 혈청 유래 EV 사이의 비교를 허용하기 위해 미세 해부 조직에 사용되는 것과 동일한 환자 세트로부터 수집되었다. 시판되는 혈청 EV 절연 시약을 사용하여 EV를 수집하였습니다.
<ol><li>4 °C에서 냉동 환자 혈청 샘플을 해동.</li>
	<li>해동 된 혈청 샘플 110 μL을 사용하고 30 분 동안 2,000 x g에서 돌루습니다.</li>
	<li>후속 EV / 엑소좀 격리에 대한 상류를 수집하고 파편 펠릿을 폐기. 30 μL의 혈청 엑소좀 분리 시약을 상체에 넣고 4°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>10,000 x g에서 10분 간 회전합니다.</li>
	<li>뉴클레아제 없는 물에 제조된 인산완충식염수(PBS)의 70 μL에서 EV 펠릿을 다시 중단시켰다. 파티클 추적 분석 시스템에 대한 알리쿼트상태를 유지하여 파티클의 품질과 수를 평가합니다. 나머지 시료는 추가 분석이 될 때까지 -80°C에서 보관합니다.</li>
</ol>3. 미세 해부 된 전립선 조직 및 전기 자동차로부터의 RNA 분리
참고: 총 RNA는 몇 가지 수정으로 제조자의 지시에 따라 시판되는키트(표의 재료)를 사용하여 미세 제해 조직 및 정제된 전기 자동차로부터 분리하였다. 다음 섹션에서는 중요한 단계를 특히 강조하여 이러한 절차를 간략하게 설명합니다.
<ol><li>미세 해부 조직에서 RNA를 분리하십시오.<ol>
<li>150 μL의 단백질분해제 K 완충액에서 미세 해부된 FFPE 조직을 재중단시. 팁에서 잔류 조직을 소용돌이와 파이펫으로 섞어 넣습니다. 1분 동안 11,000 x g에서 회전합니다.</li>
		<li>펠릿에 10 μL의 단백질나아제 K를 넣습니다. 펠릿이 하얗게 변할 때까지 2분 동안 기다립니다. 피펫을 위아래로 몇 번.</li>
		<li>56°C에서 16분 동안 소용돌이를 3분간격으로 배양합니다.</li>
		<li>샘플을 제거하고 열 블록이 80 °C에 도달하게하십시오. 3분마다 16분 동안 블록에 샘플을 배양합니다.</li>
		<li>얼음에 3분 동안 배양합니다.</li>
		<li>15 분 동안 20,000 x g에서 회전.</li>
		<li>DNase 부스터 버퍼 16 μL을 넣고 10 μL의 DNase I. 튜브를 부드럽게 반전시키고 실온(RT)에서 15분 동안 배양하여 혼합합니다.</li>
		<li>적혈구 (RBC) 라시스 완충액의 320 μL을 추가합니다. 튜브를 뒤집어 섞은 다음 100% 에탄올 1,120 μL을 첨가합니다. 4 °C에 저장된 스핀 컬럼에 즉시 전달하십시오. 30s에 대한 8,000 x g에서 회전.</li>
		<li>세척 버퍼로 컬럼을 2x 세척하고 20,000 x g에서 5분 동안 컬럼을 회전하여 잔류 세척 버퍼를 제거합니다.</li>
		<li>스핀 컬럼을 2-3분 동안 공기 건조시키면 19 μL의 RNase 불물로 용해됩니다. 분광광도계에서 정제된 RNA를 정량화하고 샘플을 40 ng/μL로 정규화합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혈청 유래 전기 자동차로부터의 RNA 분리.<ol>
<li>키트를 사용하여 외형 RNA를 분리합니다. 75 μL의 용해 완충액 A 및 9.3 μL의 용해 완충액 B를 정제된 EV 현탁액의 50 μL에 첨가한다. 참고: EV의 완전한 용해가 허용되도록 약 10 분 동안 튜브를 반전시켜 샘플을 혼합하십시오.</li>
		<li>100% 에탄올 130 μL을 넣고 시료를 뒤집어 즉시 섞습니다. 스핀 컬럼에서 옮긴 다음 3,300 x g에서 1분 동안 회전합니다.</li>
		<li>세척 버퍼로 컬럼을 2x 세척합니다. 1,300 x g에서 3분 동안 열을 회전하여 세척 버퍼를 완전히 제거합니다.</li>
		<li>컬럼이 2분 동안 공기 건조되도록 허용 버퍼 18 μL을 추가하고 2분 동안 2분 간 기다립니다. 400 x g에서 1분 간 회전한 다음 5,800 x g에서 3분 동안 두 번째 스핀을 합니다.</li>
		<li>3.2.4 단계를 샘플로부터 RNA의 수율을 높이기 위해 키트에 포함된 용출 버퍼를 반복한다.</li>
		<li>분광광도계에서 시료를 정량화하고 40 ng/μL로 정규화합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 작은 RNA 염기서열 분석용 도서관 준비
참고: 작은 RNA 라이브러리 준비키트(표 오브 머티리얼)를사용하여 단리된 RNA 샘플로부터 cDNA 라이브러리를 생성하였다. 시퀀서에서 실행하기 전에 라이브러리를 생성하고, 정화하고, 품질을 확인하는 단계는 결국 실행에서 출력 데이터의 품질을 결정할 때 모든 시퀀싱 프로토콜에 매우 중요합니다. 따라서 각 단계를 신중하게 진행하십시오. 제조 업체에서 지침 RNA의 최소 50 ng를 사용 하 여 제안. 이 두 샘플 소스에서 일반적으로 얻은 총 RNA의 품질이 좋지 않으며 낮은 양을 감안할 때, 이 프로토콜은 100 ng의 낮은 RNA 농도에 최적화되어 있습니다. 아래 프로토콜은 라이브러리의 한 샘플에 대한 것입니다.
<ol><li>어댑터 결찰 cDNA를 생성합니다.<ol>
<li>정규화된 RNA 샘플(40 ng/μL)의 5 μL을 사용하십시오. 3' 어댑터 1μL을 추가합니다. 샘플을 인큐베이션하기 전에 열 사이클러를 70°C로 예열합니다. 2 분 동안 배양. 다음 단계로 이동하기 전에 즉시 얼음에 샘플을 전송합니다.</li>
		<li>별도의 튜브에서, 결찰 완충제 2 μL, RNase 억제제의 1 μL, 및 T4 RNA Ligase 2의 1 μL, 결실 돌연변이를 혼합한다. 위아래로 파이펫팅하여 혼합하고 RNA/3' 어댑터로 튜브에 이 혼합물의 4 μL을 추가합니다.</li>
		<li>28°C로 예열된 열 사이클러로 전달하고 1시간 동안 배양한다.</li>
		<li>열 블록에 샘플을 유지하면서 스톱 솔루션 1 μL을 추가합니다. 28°C에서 15분 동안 배양합니다.</li>
		<li>튜브를 제거하고 이 단계 직후얼음을 유지하십시오.</li>
		<li>별도의 튜브에 5' 어댑터 1 μL을 추가합니다.</li>
		<li>70°C로 예열된 열 사이클러로 옮기고 2분 동안 배양하였다.</li>
		<li>즉시 어댑터의 재어닐링을 방지하기 위해 얼음에 튜브를 놓습니다.</li>
		<li>변성된 5' 어댑터 튜브에 1μL의 10mMATP를 추가합니다. 파이펫팅하여 혼합하고 혼합에 T4 RNA 리가제 1 μL을 첨가한다. 파이펫팅으로 혼합하고 3'어댑터 결찰 RNA를 함유하는 튜브에 이 혼합물의 3 μL을 첨가한다. 28°C로 예열된 열 사이클러상에 전사하고 1시간 동안 배양한다.</li>
		<li>즉시 얼음으로 옮기고 시료를 더 진행하거나 향후 사용을 위해 -20°C에 보관하십시오.</li>
		<li>RT-PCR을 수행하려면 각 어댑터 결찰 RNA의 6 μL을 사용하고 RNA RT 프라이머 1 μL을 추가하십시오. 70°C로 예열된 열 사이클러로 이송합니다. 2 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>별도의 튜브에서 5x 스트랜드 버퍼의 2 μL, 0.5 μL의 12.5 mM dNTP, 100 mM DTT의 1 μL, RNase 억제제 1 μL 및 역전사 1 μL을 혼합합니다. 이 혼합물의 5.5 μL을 어댑터 결찰 RNA에 넣고 50°C로 예열된 열 사이클러로 옮니다. 1 시간 동안 배양하십시오.</li>
		<li>어댑터 결찰된 cDNA를 즉시 얼음으로 옮김을 옮김을 옮김.</li>
		<li>별도의 튜브에서, PCR 혼합물 25 μL, RNA PCR 프라이머 2 μL, RNA PCR 프라이머 지수 2 μL, 그리고 8.5 μL의 RNase-free 물을 혼합합니다. 이 혼합물의 37.5 μL을 12.5 μL의 어댑터 결찰 cDNA에 추가합니다. 98°C로 예열된 열 사이클러로 이송합니다. 제조업체의 프로토콜에 제안된 대로 열 주기기를 11대신 15로 수정하여 프로그래밍합니다. 참고: 사용된 모든 프라이머의 시퀀스는 재료 표아래에 나열됩니다.</li>
		<li>완료 후 샘플을 4 °C에서 유지합니다. 계속 진행하거나 -80°C에서 보관하여 나중에 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>결찰된 cDNA에 대한 품질 관리를 정화하고 수행한다. 참고: 증폭된 cDNA는 아래에 설명된 바와 같이 정제된 cDNA 샘플의 품질 및 수율을 개선하기 위한 몇 가지 변형을 제외하고 제조자의 프로토콜을 따짐으로써 겔 정제되었다.<ol>
<li>증폭 된 cDNA를 정화하기 위해 6 % TBE 폴리 아크릴 아미드 젤을 사용합니다. DNA 로딩 염료의 동일한 부피로 고해상도 사다리 (HRL) 및 사용자 정의 RNA 사다리 (CRL)를 희석하십시오.</li>
		<li>각 cDNA 샘플에 DNA 로딩 염료 10 μL을 추가합니다. CRL 및 HRL과 인접한 두 개의 개별 차선에서 각 샘플의 30 μL을 두 개의 서로 다른 샘플 사이의 중간 공간에서 실행합니다.</li>
		<li>젤을 1x TBE 버퍼에서 약 30-40분 동안 145V로 실행합니다. 참고: 적재 염료의 낮은 파란색 앞면을 추적합니다. 젤의 바닥에 접근 할 때 전기 동극을 중지합니다.</li>
		<li>0.5 μg EtBr/1 mL 1x TBE에서 에티듐 브로마이드(EtBr)로 1x TBE 완충액으로 겔을 옮긴다. 주의 사항: EtBr은 알려진 발암 물질이며 여기에서 부터 겔에서 절제 될 때까지 각 단계는 극도의주의를 기울여 수행해야합니다.</li>
		<li>트랜스일루미에이터에서 겔을 시각화하고 145 bp 및 160 bp 마커 사이에 겔을 정밀하게 절단하였다. 참고: 어댑터 다이머는 145bp 마커에 매우 가깝게 실행됩니다. 따라서 어댑터 이디머로 오염을 방지하기 위해 겔을 145 bp 마커 위로 약간 잘라냅니다.</li>
		<li>겔을 2 mL 수집 튜브에 보관된 DNA 브레이킹 튜브로 옮긴다. 20,000 x g에서 2분 간 회전합니다. RNase가 없는 물 300 μL을 추가하고 RT에서 밤새 로커에서 부드럽게 회전할 수 있습니다.</li>
		<li>DNA 침전을 수행하기 위해, 다음날 튜브의 내용물 5 μm 필터 튜브로 옮김을 옮김을 전달한다. 10s에 대한 600 x g에서 회전. 참고: 겔이 필터를 통과할 때 튜브가 10s 이상 회전하지 않도록 하십시오.</li>
		<li>글리코겐 2 μL, 3M NaOAc 30 μL, 0.1x 펠릿 페인트 2 μL, 용출 된 DNA에 100 % 에탄올 975 μL을 추가합니다. 4°C에서 17,000 x g에서 20분 간 회전합니다.</li>
		<li>상급제를 버리고 75% 에탄올을 첨가하여 펠릿을 세척합니다. 4°C에서 17,000 x g에서 5분 간 회전합니다.</li>
		<li>10 mM Tris-HCl pH 8.5의 12 μL로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.</li>
		<li>정제된 cDNA를 10x(1:10)로 희석하고 희석된 cDNA 1 μL을 사용하여 바이오 분석기에서 실행하여 라이브러리 품질 검사를 수행합니다.</li>
		<li>cDNA 제품 크기가 전기 전형체내의 작은 RNA(136-160 bp)의 범위에 해당하는지 확인합니다. 각 샘플에 대한 총 몰치를 계산합니다. Tris-HCl pH 8.5를 사용하여 각 샘플을 2 nM으로 정규화합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>정제된 cDNA를 변성하고 서열화한다.<ol>
<li>단일 200 μL PCR 튜브에 각 2 nM 샘플의 동일한 볼륨을 혼합하여 라이브러리를 풀링합니다. 새로 준비된 0.2 N NaOH 의 10 μL을 풀린 라이브러리의 10 μL에 추가합니다.</li>
		<li>소용돌이로 즉시 섞고, 280 x g에서 1분 동안 1분 간 회전합니다.</li>
		<li>변성 라이브러리의 200 mM Tris-HCl pH 7 ~ 20 μL의 10 μL을 추가합니다. 소용돌이로 섞어서 1분 동안 280 x g으로 돌이면서 섞으세요.</li>
		<li>라이브러리에 970 μL의 미리 냉각된 하이브리드화 버퍼를 추가하고 소용돌이로 잘 혼합합니다. 라이브러리는 20 pM의 농도입니다. 마침내 희석될 때까지 얼음을 유지하십시오. 참고: 최종 희석은 시퀀서에서 실행하기 직전에 수행됩니다.</li>
		<li>변성 라이브러리의 117 μL을 미리 냉각된 혼성화 버퍼의 1,183 μL에 추가합니다. 튜브와 펄스 원심분리기를 뒤집어 혼합합니다. 라이브러리의 최종 농도는 이제 1.8 pM입니다.</li>
		<li>최종 라이브러리의 1.3 mL에 PhiX 의 1.3 μL을 추가합니다. 시퀀서에서 실행을 시작하려면 소프트웨어 인터페이스의 화면 단계를 따르고 읽기 유형(단일 읽기), 읽기 길이(각 읽기주기 수), 라이브러리 ID 를 비롯한 실행 매개 변수를 검토하고 시작을선택합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>시퀀서 실행의 끝에서, fastQ 파일로 결과 시퀀싱 데이터를 가져옵니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 결과 시퀀싱 데이터를 분석합니다.</li>
	<li>fastQ 툴킷 응용 프로그램을 열고 시작 버튼을 누릅니다.</li>
	<li>소프트웨어의 샘플 목록에서 파일을 선택하고 데이터가 저장될 위치를 선택합니다.</li>
	<li>잘린 각 시퀀스에 적용되는 문자열 이름을 추가합니다. 엄격성을 0.9로 유지합니다. 어댑터 시퀀스를 입력하여 각 시퀀스 샘플의 3' 끝에서 "TGGAATTCTCGGGCCAAGG"로 트리밍합니다. 필터링 읽기 탭을 확장하고 최소 읽기 길이를"5"로선택합니다. 승인 상자를 선택하고 계속 버튼을 눌러 트리밍을 시작합니다. 잘린 파일은 분석이 끝나면 프로젝트 폴더에 저장됩니다.</li>
	<li>소프트웨어에서 작은 RNA v.1.0 응용 프로그램을 열고 시작 버튼을 누릅니다.</li>
	<li>분석 후 파일을 저장하고 전송할 프로젝트를 선택합니다.</li>
	<li>응용 프로그램에서 신규 miRs 및 차동 miRs 함수를 선택합니다. 차동 분석을 위해 그룹을"제어"및"테스트"로분리하고 해당 그룹에서 분석할 잘린 파일을 추가합니다.</li>
	<li>해석을 시작할 시작 단추를 선택합니다. 분석 후 결과 파일을 다운로드합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언할 이해상충이 없습니다.

이 문서에서는, 우리는 격리된 RNA의 수율 그리고 질을 증가시키기 위하여 최적화된 키트를 사용하여 FFPE 조직 및 혈청 유래 EV에서 RNA를 격리하는 프로토콜을 기술합니다. 또한, 정제된 RNA는 작은 RNA 염기서열 분석용 cDNA 라이브러리를 생성하는데 사용되었다. 나열된 두 단계는실행(24)의최종 결과인 시퀀싱 판독의 품질 및 깊이를 결정하는 데 필수적이다. 따라서 이러한 중요한 단계를 최적화하는 것은 성공적인 시퀀싱 실행에 매우 중요합니다.
FFPE 유래 RNA의 격리에 있는 중요한 단계는 조직에서 가교된 포르말린의 제거를 허용하는 단백질분해제 K를 가진 소화입니다. 이 단계는 각각 약 16-18분 동안 55°C 및 80°C에서 샘플을 배양함으로써 최적화되었다. 이것은 260/280 비율에 있는 증가에 의해 고립된 RNA의 질에 있는 효과적인 증가 귀착되었습니다. 시퀀싱 읽기는 여러 샘플을 포함하는 런에 대해 종종 변수입니다...

전립선암은 AR 신호를 통해 작용하는 안드로겐에 의해 구동됩니다. 따라서, AR 통로를 표적으로 하는 것은 질병1에대한 주된 치료이다. 그러나, 저항은 표적으로 한 치료의 결과로 수시로 계속되고 질병은 향상된 전이성 CRPC2로점진합니다. CRPC는 엔잘루타미드와 아비라테론2,3을 포함하는 2세대 AR 요법에 의해 치료되며, 이는 초기에 생존을 향상시킨다. 그러나, NEPC와 같은 치명적인 이체는 수시로 증가한사망3로이끌어 내는 한정된 처리한 CRPC 케이스의 25-30%에서 나타납니다. NEPC는 NED로 알려진 가역적 분화 과정을 통해 발생하며, 여기서 PCa 세포는 선암으로부터 계보 전환을 거치고 AR의 대사감소 및 에놀라제 2(ENO2), 염색그라닌 A(CHGA) 및 시냅토피신(SYP)을 포함하는 NE 계보 마커의 발현 증가를 보여준다. 이러한 저항 변이체는 치료 적 개입의 결과로 발생 감안할 때, PCa의 형태를 치료하기 어려운이 치명적인 의 생성으로 이어지는 경로를 해독하는 것이 필수적이다.
NEPC의 유전체학은 최근 Beltran 등에서 수행한 철저한 연구에서 해독되었으며, 이에 의해 카피 수 변경, 돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs), 및 환자 유래 전이성 조직으로부터의 DNA 메틸화를 분석하였다5. PCa의 이 공격적인 양식의 유전체학의 이해에 있는 중요한 전진에도 불구하고, NEPC에 CRPC 선암의 전환에 관여하는 작은 비코딩 RNA (microRNAs)를 포함하여 후성적인 요인에 관하여 거의 알려지지 않습니다. MicroRNAs(miRNAs)는 22 bp 길이, 이중 가닥 RNA로, 코그네이트 mRNA 표적의 3'-번역되지 않은 영역(UTRs)과의 서열 특이적 상호작용에 의해 유전자 발현 후 전사를 억제함으로써 주로 작용한다6. 몇몇 oncomirs 및 종양 억제제는 지금 확인되고, 질병 개시 및 전이 조절에 있는 그들의 역할은 다른암6,7에서잘 공부되었습니다. 이러한 작은 비코딩 RNA는 종종 질병 사망률6,8,9를조절하는 데 매우 중요한 표적으로 작용한다. 보다 최근의 연구는 엑소좀과 같은 엑소좀에서의 수송을 통해 암 전이에서 miRNAs의 파라크린 효과를 이해하는 데 초점을 맞추고 있으며, 이는 혈류에서 흐르고 종양 세포가 이러한 이차 메신저를 뉴클레아제 없는 환경에서 전이성 위치로 보낼 수 있도록하는 10,11,12. EV는 숙주세포(12)로부터형질전환 효과를 전달하기 위해 종양 세포로부터 miRNAs를 운반한다. 따라서 종양 세포의 이차 메신저로서 EV의 식별은 질병 중증도의 비침습적 검출에 유용할 수 있다.
miR-1246은 공격적인 PCa로부터 전기자동차에서 고도로 상승조절되며, 질병 중증도13을나타낸다. 이 EV 관련 miRNAs는 질병의 비침범성 biomarkers로 봉사할 뿐 아니라, 또한 종양 발생을 운전에 있는 기능적으로 중요한 역할을 합니다. 따라서, 비침습적 바이오마커의 더 나은 식별뿐만 아니라 그들의 기능적 중요성을 더 잘 식별할 수 있도록 PCa의 내성 형태와 연관되는 miRNA 레퍼토리의 중요성을 이해하는 것이 필수적이다.
차세대 염기서열 분석의 출현은 돌연변이, 염색체 재배치, 염색체 및 메틸화와 같은 게놈의 변경을 수반하는 종양 경관의 세부 사항을 연구하는 가장 포괄적인 플랫폼을 제공했으며, 이들 모두는 암의 형태와 특성에 크게 기여하고있다 14,15,16. 마찬가지로, 종양 세포에서 발생하는 광대한 후성 유전체 학적 변화를 이해하는 데 필수적인 도구이며 질병 중증도17에서종종 중요한 선수입니다. NEPC의 생성과 관련된 miRNA 레퍼토리를 이해하기 위한 목적으로, FFPE 전이성 CRPC 조직 및 이들의 상응하는 혈청 유래 EV에서 작은 RNA 염기서열 분석이 수행되었습니다. 이들 두 샘플 공급원 중 어느 하나에서 유래된 RNA는 (1) 수율이 낮고 (2) 포르말린 고정 및 EV 격리로 인해 종종 발생하는 열화로 인한 품질 불량이다. 또한 cDNA 라이브러리를 생성하는 것은 중요하지만 번거로운 순서 실행 단계입니다. 따라서 이러한 RNA를 격리하고 이를 사용하여 작은 RNA 시퀀싱을 위한 라이브러리를 생성하는 방법은 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성하기 위한 최적화가 필요합니다.
RT-PCR, 마이크로어레이 및 인-시트 혼성화(ISH)를 포함하여 상이한 샘플에서 miRNA 발현을 프로파일화하는 몇 가지 방법이 있다. RT-PCR 및 ISH에 의한 miRNA 발현을 평가하기 위해 FFPE 조직 유래 RNA를 이용한 프로토콜은 최근18일발표되었다. 최신 기술은 샘플에서 miRNA 발현을 프로파일링하기 위한 보다 철저하고 포괄적인 플랫폼을 제공합니다. NanoString nCounter는 민감한 miRNA 검출플랫폼(19)을제공하지만, 검출은 종종 어레이에서 이용 가능한 miRNAs의 수에 의해 제한된다(~2,000). 이러한 시나리오에서, 차세대 시퀀싱과 같은 보다 민감하고 철저한 플랫폼은 상이한 샘플20에서훨씬 더 넓은 깊이의 miRNA 식별 및 동시 프로파일링을 제공한다. 상기 방법은 PCa환자21,22,23으로부터소변 또는 혈장에서 miRNA 서명을 결정하는 데 사용되어 왔다. 현재 기사에서, 프로토콜은 FFPE 조직 및 혈청 유래 EV RNA를 사용하여 공격적인 CRPC와 관련된 miRNA 프로파일을 연구하기 위해 차세대 염기서열 분석 플랫폼을 사용하여 제시된다.

<table><tbody><tr><td>3M NaOAc pH 5.5</td><td>USB Corp.</td><td>75897 100 mL</td><td></td></tr><tr><td>5 &마이크로; m 필터 튜브</td><td>IST 엔지니어링 Inc.</td><td>5388-50</td><td></td></tr><tr><td>6% TBE 폴리아크릴아미드 겔</td><td>Novex</td><td>EC6265BOX</td><td></td></tr><tr><td>BaseSpace</td><td>Illumina</td><td></td><td>분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>바이오 분석기</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA loading dye</td><td>Novex</td><td>LC6678</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermostat plus</td><td>Eppendorf 1.5 mL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EtBr</td><td>Pierce</td><td>17898</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올 200 proof</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>엑소솜 RNA 분리 키트</td><td>Norgen</td><td>58000</td><td></td></tr><tr><td>겔 브레이킹 튜브</td><td>IST Engineering Inc.</td><td>3388-100</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐 분자 생물학 등급</td><td>Thermo Scientifc</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin Select</td><td>Stat lab</td><td>SL401</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td>accuSpin Micro 17R</td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE 키트</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientifc</td><td>Nano Drop 1000</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight NTA</td><td>Malvern</td><td>LM14</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500 Sequencer</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)</td><td>Illumina</td><td>FC-404-2001</td><td></td></tr><tr><td>펠렛 페인트</td><td>Millipore</td><td>70748-3</td><td></td></tr><tr><td>Superscript II Reverse Transcriptase</td><td>Invitogen</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant</td><td>Lucigen</td><td>LR2D11310K</td><td></td></tr><tr><td>TBE 러닝 버퍼(5개)</td><td>Novex</td><td>LC6675</td><td></td></tr><tr><td>열 순환기</td><td>MJ Research</td><td>PTC100</td><td></td></tr><tr><td>총 엑소좀 분리 시약(혈청에서 추출)</td><td>Invitrogen</td><td>4478360</td><td></td></tr><tr><td>TrueSeq 소형 RNA 라이브러리 준비 키트-세트 A(인덱스 1-12)</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P- 1GAL</td><td></td></tr><tr><td>RNA 3' 프라이머</td><td></td><td></td><td>GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC</td></tr><tr><td>RNA 5' 프라이머</td><td></td><td></td><td>TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG</td></tr><tr><td>Stop Oligo</td><td></td><td></td><td>GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG</td></tr><tr><td>RNA RT 프라이머</td><td></td><td></td><td>GCCTTGGCACCCAGGAGGCCA</td></tr><tr><td>RNA PCR 프라이머</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA</td></tr><tr><td>RNA PCR 인덱스 프라이머</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGAAGAACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCAGAATTCCA</td></tr><tr><td>-</td><td></td><td>-</td><td>어댑터 RNA</td></tr><tr><td>PCR 인덱스 프라이머 1</td><td></td><td></td><td>CGTGAT</td></tr><tr><td>RNA PCR 인덱스 프라이머 2</td><td></td><td></td><td>ACATCG</td></tr><tr><td>RNA PCR 인덱스 프라이머 3</td><td></td><td></td><td>GCCTAA</td></tr><tr><td>RNA PCR 인덱스 프라이머 4</td><td></td><td></td><td>TGGTCA</td></tr><tr><td>RNA PCR 인덱스 프라이머 5</td><td></td><td></td><td>CACTGT</td></tr><tr><td>RNA PCR 인덱스 프라이머 6</td><td></td><td></td><td>ATTGGC</td></tr><tr><td>RNA PCR 인덱스 프라이머 7</td><td></td><td></td><td>GATCTG</td></tr><tr><td>RNA PCR 인덱스 프라이머 8</td><td></td><td></td><td>TCAAGT</td></tr><tr><td>RNA PCR 인덱스 프라이머 9</td><td></td><td></td><td>CTGATC</td></tr><tr><td>RNA PCR 인덱스 프라이머 10</td><td></td><td></td><td>AAGCTA</td></tr><tr><td>RNA PCR 인덱스 프라이머 11</td><td></td><td></td><td>GTAGCC</td></tr><tr><td>RNA PCR 인덱스 프라이머 12</td><td></td><td></td><td>TACAAG</td></tr></tbody></table>

거세 저항하는 전립선암 환자에게서 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 작은 비코딩 rna를 시퀀싱

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

안 드로 겐 수용 체의 절제 (AR) 안 드로 겐 박탈에 의해 신호는 처음 암 회귀 결과 전립선 암에 대 한 치료의 첫 번째 라인의 목표. 그러나 상당수의 경우, 이 질병은 치료 옵션이 제한되어 있고 종종 공격적인 고급 거세 저항성 전립선암(CRPC)으로 진행됩니다. 먼 전이는 주로 공격적인 질병의이 단계에서 관찰됩니다. CRPC는 초기에 생존을 향상시키는 2세대 AR 통로 억제제에 의해 치료되고, 치료 저항성의 출현이 뒤따랐다. 신경 내분비 전립선암 (NEPC)은 종종 신경 내분비 분화 (NED)로 알려진 분화 과정을 통해 치료 저항의 결과로 발생하는 전립선 암 (PCa)의 드문 변이체이며, PCa 세포는 계보 스위치를 겪는다. 선암에서 신경 내분비 (NE) 계보 마커의 증가 된 발현을 보여줍니다. NEPC에 진행및 분화를 유도하는 게놈 변경 이외에, 후성 유전학 요인 및 미세 환경 단서는 질병 진행을 구동에 필수적인 선수로 간주됩니다. 이 원고는 고급 PCa와 연관된 후성 유전학 드라이버(즉, 작은 비코딩 RNA)를 식별하기 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 포르말린 고정 파라핀-임베디드(FFPE) 전이성 조직과 그에 상응하는 혈청 유래 세포외 소포(EV)의 정제된 마이크로RNA를 사용하여 시퀀싱에 적합한 품질 관리를 통해 라이브러리를 준비하는 방법을 설명합니다. 이러한 샘플 소스에서 microRNA. FFPE와 EV 모두에서 RNA를 분리하는 것은 종종 도전적이다 그것의 대부분은 저하 또는 수량에 제한되기 때문에. 이 프로토콜은 RNA 입력 및 cDNA 라이브러리를 최적화하여 시퀀싱 시 가장 구체적인 판독 및 고품질 데이터를 산출하는 다양한 방법에 대해 자세히 설명합니다.

라이브러리는 RNA 격리 후 제조되었고 품질 검사를 수행하였다. 미세 해부 조직 및 혈청 유래 EV로부터 분리된 RNA로부터 제조된 증폭된 cDNA 라이브러리에 대한 겔 정제는 도 1 및 도 2에나타내고 있다. 어댑터-결찰 miRNAs의 제품 크기는 각 샘플에 대해 약 136-160 bp에 해당합니다. 도 1A-B는 작은 RNA 라이브러리 준비를 위해 정밀하게 절제되어야 하는 겔의 범위를 나타내기 위해 표시된다. 도 2A-B는 미세 해부 조직 및 혈청 유래 EV에 대한 겔 전기 영동 및 전기 전형체를 나타낸다. 보충도 1은 전기영동기계로부터의 대표적인 결과와 몰도를 계산하는 방법을 나타낸다.
<p class="jove_c...

치료 저항은 수시로 향상된 전립선암을 가진 환자에서 발전하고, 어떤 경우에는, 암은 신경 내분비 전립선암에게 불린 치명적인 특수형으로 점진합니다. 이 전이를 촉진하는 작은 비 코딩 RNA 매개 분자 변경을 평가하면 신경 내분비 전립선암의 발달로 이어지는 인과 메커니즘의 더 나은 질병 계층화 및 식별이 가능합니다.

거세 저항하는 전립선암 환자에게서 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 작은 비코딩 RNA를 시퀀싱

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

이 프로토콜의 사용으로 연구원은 고급 전립선 암을 위한 새로운 exome 또는 세포외 소포 기지를 둔 및 조직 기지를 둔 마이크로 세포를 확인할 수 있습니다. F-F-B 조직과 세포외 소포 모두에서 RNA를 분리하는 것은 대부분의 조직이 만들어지거나 제한된 수량이기 때문에 이 입자는 차세대 시퀀싱을 위한 가장 구체적인 자유롭고 고품질의 데이터를 유전자에 R-N-A 입력 및 C-D-N-A 라이브러리를 최적화하는 다양한 방법에 대해 정교하게 설명할 것입니다. 차세대 시퀀싱은 종양 진행의 근간이 전립선암 임상 샘플에 최적화되어 종양 진행의 근간을 이해하는 가장 포괄적인 플랫폼을 제공하며, 첨단 공격적인 전립선암의 근본적인 생물학에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있다.낮은 입력 재질에서 C-D-N-A 라이브러리를 최적화하는 것은 성공적인 시퀀싱 실행을 위한 중요한 단계이므로 정확한 결과를 얻기 위해 고품질 C-D-N-A 라이브러리를 생성하는 것이 매우 중요합니다. 이전에 수행 된 조직의 마이크로 해부를 수행 한 후 4 섭씨에서 환자 혈청 샘플의 E-V의 해동 행을 분리하는 진행. 해동세럼 샘플 110마이크로리터를 튜브로 옮기고 30분 동안 2천 회 G로 회전합니다.후속 E-V 또는 엑소솜 절연슈퍼 나덴을 선택하여 데브리 펠릿을 폐기한다. 30 마이크로레터에서 혈청 엑소솜 절연 시약에서 슈퍼 나텐트에. 30 분 동안 섭씨 4도를 인큐베이션합니다.10분 동안 1만 회 G에서 회전합니다. 별도의 1.5 밀리리터 튜브에 펠릿을 방해하지 않고 E-V 슈퍼 네이덴트를 신중하게 선출하고 향후 분석을 위해 영하 80도를 저장하십시오. 그런 다음 뉴클레아제 프리 워터에서 제조된 70마이크로 리터의 P-B-S에서 E-V 펠릿을 다시 중단한다.마이크로 해부 된 조직에서 총 R-N-A를 분리한 후, 상용 키트를 사용하여 정제 된 E-V는 3 개의 프라임 어댑터 의 한 마이크로 리터에서 마이크로 리터 R-N-A 샘플당 정규화된 40 나노그램의 5 마이크로 리터로 라이브러리 준비를 수행합니다. 열 순환기를 섭씨 70도로 예열하고 샘플을 2분간 배양합니다. 즉시 얼음에 샘플을 전송합니다.별도의 튜브에서 결찰 버퍼의 두 마이크로 리터, RNase 억제제 1 마이크로 리터 및 T4 RNA 리개세 2, 삭제 돌연변이의 1 마이크로 리터를 혼합합니다. 바이 파이 침구를 위아래로 섞는다. 그런 다음 얼음에 R-N-A 3 프라임 어댑터와 함께 튜브에 믹스의 4 마이크로 리터를 추가합니다.열 순환기를 섭씨 28도로 예열합니다. 그리고 튜브를 열 사이클러에 1 시간 동안 배양합니다. 그 후, 열 사이클러에 샘플을 유지하면서 튜브에 정지 용액 의 마이크로 리터 를 추가합니다.섭씨 28도에서 15분 간 배양하세요. 그런 다음 즉시 튜브를 제거하고 얼음을 유지합니다. 별도의 튜브에서 5개의 프라임 어댑터의 마이크로리터 1개를 추가합니다.섭씨 70도로 예열된 열 사이클러로 옮김합니다. 그리고 2 분 동안 배양. 즉시 어댑터의 재annealing을 방지하기 위해 얼음에 튜브를 배치합니다.D 특성 5 프라임 어댑터의 튜브에 10 밀리몰 A-T-P의 마이크로 리터 를 추가합니다. 바이 파이 페딩을 혼합하고 믹스에 T4 R-N-A 리갈아의 마이크로 리터 1 개를 추가합니다. 안녕 파이 페딩을 섞는다.이 믹스의 3개의 마이크로리터를 3개의 프라임 어댑터 계각 R-N-A를 포함하는 튜브로 옮기. 예열된 열 사이클러에 튜브를 섭씨 28도로 예열하고 1시간 동안 배양합니다. 그 후 즉시 튜브를 얼음으로 옮기고 샘플을 더 진행하거나 향후 사용을 위해 영하 80도에서 저장합니다.R-T-P-C-R을 수행하려면 각 어댑터 리게트 R-N-A의 6개의 마이크로 리거를 사용하고 R-N-A R-T 프라이머의 마이크로 리거 1개를 추가합니다. 튜브를 예열된 열 사이클러로 옮기고 섭씨 70도로 옮기고 2분 동안 배양합니다. 튜브를 얼음으로 옮기습니다.별도의 튜브믹스5X, 가닥 버퍼, 5 마이크로 리터 12.5 밀리몰러 DNTP, 100 밀리몰러 DTT의 1 마이크로 리터, R-N-A의 억제제 1마이크로 리터, 그리고 역전사 1 마이크로 리터. 어댑터 리게팅 된 RNA에이 믹스의 5 마이크로 리터를 추가하고 1 시간 동안 배양하기 위해 섭씨 50도로 예열 된 열 사이클러로 전송합니다. 1시간 후 어댑터가 무료 DNA를 얼음으로 즉시 래그드했습니다.별도의 튜브에서 PCR 믹스 25 마이크로리터, RNA PCR 프라이머 2개, RNA PCR 프라이머 지수 2개, RNA 자유 수분 8.5마이크로리터를 혼합합니다. 어댑터 리게싱 CDNA의 12.5 마이크로리터에 이 믹스의 37.5 마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 예열된 열 사이클러로 98°C로 옮기습니다.제조업체의 프로토콜에서 제안된 대로 열 순환기를 15로 수정한 사이클 번호를 프로그래밍합니다. 완료 후 샘플을 섭씨 4도로 유지하십시오. 진행 하거나 향후 사용을 위해 영하 80도에서 저장.ligated 무료 DNA를 정화하려면 각 무료 DNA 샘플에 DNA 로딩 염료 10 마이크로리터를 추가합니다. 및 고해상도 후자 및 사용자 정의 RNA 후자의 10 마이크로 리터에. 6% TBE 폴리아크릴아미드 젤에서 서로 인접한 두 개의 별도 차선에서 각 샘플의 30 마이크로리터를 실행합니다.사용자 지정 RNA 후자 및 고해상도 후자를 사용하면 두 개의 서로 다른 샘플 사이의 중간 공간이 있습니다. 젤을 145볼트에서 약 30~40분간 1X TBE 버퍼로 실행합니다. 로딩 염료의 아래 파란색 전면을 추적합니다.젤 바닥에 접근할 때 전기전도를 중지합니다. 밀리미터 에디듐 브로마이드당 5 마이크로그램으로 하나의 X TBE 버퍼로 젤을 전달합니다. 겔을 트랜실루미네이터로 시각화하고 145개의 베이스 쌍과 160개의 베이스 쌍 마커 사이를 정밀하게 겔을 잘라내고 145개의 베이스 쌍 마커 보다 약간 높은 어댑터 이질로 오염을 방지합니다.중요한 단계는 어댑터 디머가 원하는 브랜드에 매우 손실실행으로 정확하게 젤을 절단하여 수행되는 정제 계각 CDNA입니다. 젤 조각을 2밀리미터 수집 튜브에 보관된 DNA 브레이킹 튜브로 전달합니다. 2분 동안 20,000회 G로 회전합니다.그리고 300 마이크로 리터의 RNase 없는 물을 추가하고 실온에서 하룻밤 동안 로커에서 부드럽게 회전 할 수 있습니다. 다음 날에 DNA 강수량을 수행하기 위해 튜브의 내용을 5 미크론 필터 튜브로 전송한다. 엄격하게 10 초 동안 600 배 G를 회전합니다.그런 다음 3개의 어금음 나트륨 아세테이트의 글리코겐 30 마이크로리터의 2개의 마이크로리터, 1X 펠릿 페인트 및 100% 에탄올의 975마이크로리터를 경례된 DNA에 추가합니다. 섭씨 4도에서 17, 000배 G에서 20분간 회전합니다. 상체를 버리고 75 %의 에탄올을 추가하여 펠릿을 씻습니다.섭씨 4도에서 17,000회 G에서 5분간 회전한 후 상류제를 버리고 열 블록에서 37°C의 튜브를 배양하여 에탄올을 완전히 증발시다. 다시 펠릿을 12 마이크로리터의 10 밀리머 트리피더 염화물PH 8.5에서 중단합니다. 다음으로 정제되고 무료 DNA를 10회 희석하고 희석된 CDNA의 마이크로리터 1개를 사용하여 생체 분석기에서 실행하여 라이브러리 품질 검사를 수행합니다.무료 DNA 제품 크기가 136과 160 개의 염기 쌍 사이의 전기 페로그램의 작은 RNA 범위에 해당하는지 확인하십시오. 각 샘플에 대한 총 어금니를 계산합니다. 각 샘플을 PH 8.5에서 염산염삼액을 사용하여 2나노몰러로 정규화한다.단일 200 마이크로 리터 PCR 튜브에 각 두 나노 몰라 샘플의 동일한 볼륨을 혼합하여 라이브러리를 유지합니다. 원고에 설명된 대로 단계를 따르는 변성 및 시퀀스. 이 연구에서 라이브러리는 RNA 격리 후 제조되었고 품질 검사가 수행되었다.어댑터 리게트 마이크로 Rnase의 제품 크기는 각 샘플에 대해 약 136 에서 160 염기 쌍에 대응하였다. 강조 된 섹션은 정확하게 준비의 작은 RNA 라이브러리에 대한 절제 된 젤의 범위를 보여줍니다. 이 수치는 정제 된 무료 DNA 라이브러리용 젤 전기 전구 및 전기 페로그램을 보여줍니다.마이크로 해부 FFPE 조직 및 혈청 파생 EV의. 작은 RNA 시퀀싱 실행의 대표적인 메트릭은 예상 클러스터 밀도, Q 점수, 클러스터 통과 필터 백분율 및 마이크로 해부된 FFP 조직 및 혈청 파생 EV에 대한 예상 수율 및 오차 비율을 보여줍니다. 두 샘플의 Q 점수는 기본 호출 정확도의 99.9%를 나타내는 3개 이상의 값을 보여 주였습니다.그리고 오류 율은 모두 하나 이하였다. 도서관 준비의 각 단계는 신중하게 실행되어야하며 각 배양 후 튜브를 즉시 얼음으로 옮겨야합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 어댑터가 없고 순수한 CDNA 라이브러리를 보장하기 위해 젤을 정확하게 절단하는 것입니다.CDNA 라이브러리를 생성하려면 고품질 시퀀싱 실행에 최적화가 필요합니다. 이 프로토콜을 이해하면 제한된 소스 샘플에서 다른 시퀀싱 라이브러리 준비에 이러한 미세 세부 정보를 추정하는 시청자가 혈청 및 세포 외 소포를 제안합니다. 이 기술은 전이성 전립선암 환자에서 종양 공격성 및 치료 저항과 연관되는 새로운 micronase를 확인하는 데 도움이되었습니다.이 기술은 새로운 biomarker 발견에 원조할 수 있는 그밖 질병 모형으로 추정할 수 있습니다. 이 기술은 striation 파생 혈청 및 조직 샘플과 같은 생물학적 물질을 사용하기 때문에 적절한 예방 조치를 취해야합니다. 또한, 에디듐 브로마이드는 알려진 발암물질이며 이 프로토콜을 사용하여 매우 신중하게 처리되어야 한다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

양적 실시간 중합 효소 사슬 반응 (qPCR)는 종양 샘플에서 여러 microRNA의 표현 수준 (miRNA) 분자를 조사하기 위해 신속하고 민감한 방법입니다. 다른 miRNA 분자의 수백이 메서드 표현식을 사용하면, 증폭 계량, 같은 cDNA 템플릿에서 분석할 수 있습니다.

정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지

인간 게놈의 8 %를 차지 인간 내인성 레트로 바이러스 (HERV)는, 부족한 코딩 능력 만 십만 긴 터미널 반복 (LTR에 의해 둘러싸) 유지. 사용자 지정 Affymetrix의 마이크로 어레이는 개별 HERV의 궤적 표현을 식별하도록 설계되었으며, 향후 임상 연구에 대한 개념의 증거로 전립선 암 조직에 사용되었다.

전립선 암의 바이오 마커 발견에 신청 : 개인 HERV 궤적 발현 마이크로 어레이 기반의 식별

이 프로토콜은 인간 혈청에서 작은 RNA를 추출하는 방법을 설명합니다. 우리는 DNA 배열에 사용하기 위해 암 혈청에서 마이크로 RNA를 분리하고 또한 singleplex 정량 PCR이 방법​​을 사용했습니다. 프로토콜은 고품질의 RNA를 수득 수정하여 페놀 및 아니 디늄 티오 시아 네이트 시약을 이용한다.

인간 혈청에서 작은 비 암호화 RNA를의 분리

여기에서는 정량적 실시간 PCR(RT-PCR) 및 ISH(in situ hybridization)를 사용하여 보관된 포르말린 고정, 파라핀 내장(FFPE) 또는 신선 냉동 전립선암(PCa) 임상 조직에서 microRNA(miRNA) 발현 분석을 위한 간소화된 프로토콜을 설명합니다.

전립선 암 임상 조직에서의 miRNA 식 분석

이 프로토콜의 목표는 다운스트림 RNA 분석을 위해 이질적인 전립선 조직에서 세포 유형의 순수한 집단을 분리하는 효과적인 방법으로 레이저 캡처 미세 해부를 사용하는 것입니다.

RNA 분석을위한 인간의 전립선 상피 세포의 레이저 캡처 이외에 Microdissection

이 프로토콜은 순환하는 miRNA 오염을 방지하고 NSCLC에서 miRNA의 바이오마커 기능을 평가하기 위해 Proteinase K 및 RNAse 처리와 함께 상용 엑소좀 분리 키트를 통해 NSCLC 환자의 혈장에서 방출되는 엑소좀에서 miRNA 프로파일링을 수행할 수 있는 가능성을 설명합니다.

qPCR을 통해 비소 세포 폐암 (NSCLC) 환자 &#39;플라즈마에 Exosomal의 miRNA 분석 : 실현 가능한 액체 생검 도구

이 수정 추출 프로토콜은 조직 병리학 적 조직 블록에 대한 관심이 더 정확하게 대상 지역의 RNA 및 DNA 수율을 향상시킨다.

RNA 및 DNA 추출 모두 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 조직 코어의 제조

이 원고는 실시간 PCR 방법을 사용 하 여 혈 청 또는 플라스마 DNA에서 복사 번호 유사 분석을 설명 합니다. 이 방법은 거세 저항 전립선 암 환자에서 약물 저항의 예측에 적합 하지만 그것은 또한 다른 질병에 대 한 정보 수 있습니다.

혈 청 및 혈장 복사 번호 검출 실시간 PCR를 사용 하 여

포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 표본 인간의 질병의 분자 biomarkers의 귀중 한 소스를 나타냅니다. 여기 우리는 실험실 기반 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜, 처음 신선한 냉동된 RNA로 설계 하 고 최적화 된 조직에서 보관 된 microRNAs 분석 저장 최대 35 년 제시.

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

이 프로토콜에서는 작은 RNA 도서관 건설 및 다음 세대 시퀀싱에 대 한 세포 배양에서 세포 외 microRNAs 정화 하는 방법을 보여 줍니다. 다양 한 품질 관리 검사점 작업 exRNAs 같은 낮은 입력된 샘플을 할 때 기대 하는 것을 이해 하는 독자 수 있도록 기술 된다.

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

이 방법은 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) RNA 샘플로부터 얻을 수 있는 서열 데이터의 질 및 양을 개선하는 단계를 설명한다. 우리는 FFPE-RNA 샘플의 품질을 보다 정확하게 평가하고, 시퀀싱 라이브러리를 준비하고, FFPE-RNA 샘플의 데이터를 분석하는 방법론을 설명합니다.

저하된 FFPE-RNA 시료의 시퀀싱 및 분석을 위한 최적화

학습하세요 거세 저항성 전립선암 환자의 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 소량 RNA를 분리하고 cDNA 라이브러리를 최적화하여 차세대 시퀀싱을 수행하는 방법을. 이 기법은 신규 바이오마커 발굴과 종양 진행 메커니즘 연구에 활용됩니다.

거세 저항하는 전립선암 환자에게서 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 작은 비코딩 RNA를 시퀀싱

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