Name: 세포 구조 및 기능의 교란을 위해 게놈 편집 된 세포주 세포주 간의 세포 융합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 학습하세요 세포 융합 기법을 통해 세포 구조와 기능의 변화를 연구하는 방법을. 형광 현미경으로 세포 소기관의 기원을 추적하여 세포 항상성 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

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이 작품은 R.M.에 웰컴 트러스트 헨리 웰컴 펠로우십에 의해 투자되었다 (https://wellcome.ac.uk/grant 번호 100090 / 12 / Z). 자금 은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었다. 아쇼크 벤키타라만과 폴 프렌치가 프로젝트에 대한 중요한 조언과 안내를 해주신 것에 감사드립니다. 우리는 우수한 지원을위한 케임브리지 연구 흐름 세포 측정 시설에 대한 케임브리지 연구소의 키아라 코세티와 가브리엘라 Grondys-Kotarba 감사합니다. 리암 카시데이, 토마스 밀러, 지안마르코 콘티노에게 원고를 증명해 주신 것에 대해 감사드립니다.

1. 차등 형광 세포 라벨링
<ol><li>CRISPR Cas9로 유전자 태그 지정<ol>
<li>CRISPR Cas9 게놈 편집을 사용하여 인간 암 세포주에서 형광 단백질 meGFP 또는 mScarlet-I와 함께 뿌리 줄기 (또는 관심 있는 다른 유전자)를 태그합니다. 참고: 게놈 편집을 위한 상세한 프로토콜은 다른 곳에서24,25,26을다룹니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 염료 라벨링<ol>
<li>Dulbecco의 수정된 독수리 배지(DMEM)에서 Cal51 인간 암 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS), L-글루타민 및 100 μg/mL 페니실린/스트렙토마이신을 가습된 인큐베이터에서 37°C및 5%CO2로 성장시다. 참고: 세포가 mycoplasma 오염의 부재, 그리고 세포주의 정체성에 대해 정기적으로 검사되도록하는 것이 중요합니다. 배양에서 광범위하게 통과된 세포를 사용하지 마십시오(>15 구절). 세포는 건강하고 기하급수적으로 성장해야합니다. 과소 합류 또는 과잉 합류를 피하십시오.</li>
		<li>종자 각 세포 유형 (뿌리 -meGFP, 뿌리 - mScarlet-I 및 부모의 태그되지 않은 Cal51 세포) ~ 6 x 106 세포가 70-90 %의 합류에서 각 샘플에 대해 다음날 존재하도록합니다. 참고: 이것은 대략 1개의 T75 조직 배양 플라스크 또는 세포 모형 당 10 cm 접시입니다. 어버이날 태그가 지정되지 않은 셀은 프로토콜의 나중에 부정적인 제어로 필요합니다. 이 프로토콜은 ~ 20,000 개의 융합 된 셀을 생산 할 수 있지만 배치 수가 증가하여 프로토콜을 확장하여이 수를 늘릴 수 있습니다.</li>
		<li>다음날, 37°C에서 수조에 배치하여 DMEM, 트립신 및 1x 인산완충식염수(PBS)를 미리 따뜻하게 한다.</li>
		<li>피루레틴-meGFP 및 루틀레틴-mScarlet-I 세포를 PBS에서 2배 씻어 내거나 매질을 흡인하고 10 mL의 PBS로 교체합니다.</li>
		<li>라벨 Cal51 루레틴-meGFP 세포를 실온(RT)에서 1분 동안 PBS에 500 nM 바이올렛 세포 염료(재료표)를첨가하였다.</li>
		<li>라벨 Cal51 루틀레틴-mScarlet-I 세포를 RT에서 1분 동안 PBS에 200 nM 원거리 적혈구염료(물자 표)를첨가하였다. 참고: 형광 염색 후 가능한 한 빛으로부터 시료를 차폐하여 형광표백을 방지하십시오.</li>
		<li>5 분 동안 10 mL의 DMEM을 추가하여 염료 라벨링 반응을 중지하십시오.</li>
		<li>인큐베이터에서 라벨이 부착되지 않은 보호자 Cal51 세포를 제거합니다(1.2.2단계). 참고: 이러한 셀은 나중에 레이블이 지정되지 않은 음성 대조군으로 사용됩니다(단계 3.3.2).</li>
		<li>성장 배지를 붓고 PBS 10 mL로 교체하여 모든 세포를 한 번 씻어 내보시고.</li>
		<li>미리 데운 1x 트립신 1 mL로 배양 조건에서 PBS를 붓고 배양 조건에서 5 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>세포를 15 mL 플라스틱 원점 튜브와 원심분리기로 1000 x g에서 5 분 동안 옮긴다.</li>
		<li>조심스럽게 제거하고 파이펫세포 펠릿에서 트립신을 폐기.</li>
		<li>PBS의 1 mL에 보라색과 멀리 빨간 표지 된 세포 펠릿을 부드럽게 다시 일시 중단하십시오.</li>
		<li>DMEM 의 1 mL에서 부모 (비 형광) 세포 펠릿을 부드럽게 다시 중단하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 참고: 이 견본은 세포 세포 융합을 겪지 않을 것입니다 그러나 유세포 분석 도중 나중에 이용될 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세포 세포 융합
<ol><li>1mL 파이펫을 사용하여 각 세포 유형의 0.5 mL을 부드럽게 파이펫팅하여 3 x 10 6 106 원거리 적색 라벨셀을 15 mL 튜브에 혼합합니다.</li>
	<li>1,000 x g에서 5 분 동안 2.1 단계에서 나머지 혼합되지 않은 세포를 원심 분리한 다음 PBS를 부어 DMEM의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 참고: 이러한 나머지 혼합되지 않은 단일 라벨 샘플은 나중에 프로토콜의 섹션 3에서 음수 및 보정 제어로 사용됩니다.</li>
	<li>혼합 세포를 1,000 x g에서 1,000 x g에서 5분 동안 원심분리하고 1 mL 파이펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 흡인한다.</li>
	<li>0.7 mL의 50% 1450 PEG 용액을 30s의 기간에 걸쳐 1 mL 파이펫을 사용하여 세포 펠릿(단계 2.3)에 드롭와이즈 방식으로 첨가한다.</li>
	<li>RT에서 3.5 분 동안 둡니다. 참고: PEG를 가진 배양 시간은 세포 모형에 따라서, 더 긴 배양 시간이 세포 독성을 증가한다는 것을 주의하더라도, 최적화될 수 있습니다.</li>
	<li>30s에 대해 10 mL의 무혈청 DMEM을 넣고 10 분 동안 인큐베이터에 둡니다.</li>
	<li>1,000 x g에서 5분 동안 스핀다운하고, 상급물질을 버리고, 1mL의 완전한 매체(FBS를 함유한 DMEM)에서 부드럽게 다시 돌립니다. 참고: 섹션 3으로 바로 이동합니다. PEG 노출과 관련된 독성이 있고 유세포 분석 및 이미징이 뒤따르므로 단계 간에 빠르게 진행하여 배양 조건에서 세포를 가능한 한 많이 유지하십시오.</li>
</ol>3. 융합 세포를 풍부하게하는 형광 활성화 세포 선별 (FACS)
<ol><li>70 μm 필터를 통해 각 샘플을 FACS 튜브에 개별적으로 부드럽게 피펫팅하여 유세포 측정을 위해 모든 세포를 준비합니다. 참고: 4개의 견본은 요구됩니다: 융합한 세포, 단 하나 표지된 멀리 적혈구, 단 하나 표지된 보라색 세포, 표지되지 않은 부모 세포. 일단 멸균 조직 배양 후드에서 제거되면, 세포는 감염될 수 있는 능력을 가지므로, 여기에서부터 비멸균 환경에 대한 시료의 노출 시간을 최소화한다. 셀은 완전한 DMEM 배지로 정렬됩니다.</li>
	<li>단일 셀 선별이 가능한 세포계를 사용합니다.<ol>
<li>무균 정렬을 위해 셀 선별기를 설정합니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 기기 품질 관리를 수행합니다.</li>
		<li>전방 분산 과 측면 분산 및 이중 분산 플롯의 플롯을 그립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>융합 된 셀을 식별하기 위해 게이트를 만듭니다.<ol>
<li>405 nm 및 635 nm의 파장에서 형광 염료를 흥분시킵니다. 450 nm 및 660 nm (보라색 및 원적 파장)에서 각각 감지합니다. 보라색 파장 대 멀리 빨간색을 플롯합니다.</li>
		<li>세포계를 통해 레이블이 지정되지 않은 부모 세포를 실행하고 형광 강도를 기록합니다. 참고: 이 기준선 위의 값은 염료 염색에 대한 양성을 정의합니다.</li>
		<li>세포계를 통해 단일 라벨 이표시된 보라색 세포를 실행합니다. 멀리 빨간 채널에 보라색이 흘러 넘치지 않는지 확인합니다.</li>
		<li>세포계를 통해 단일 라벨 멀리 적혈구를 실행하고 보라색 채널에 멀리 빨간색의 유출이 없는지 확인합니다. 참고: 도시된 대표적인 데이터의 경우, 세포는 100 μm 노즐이 장착된 선별기에서 20psi로 분류하였다.</li>
		<li>융합 샘플을 간략하게 실행하여 융합 된 세포가 3.3 단계에서 생성 된 게이트와 함께 보이는지 확인하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>선별 스트림을 중앙에서 8웰 이미징 접시에 맞춥습니다.</li>
	<li>FACS는 이중 양성 보라색으로 존재하는 융합 세포를 분류하고, 성장 배지의 100 μL을 포함하는 8 웰 이미징 접시에 직접 적색 라벨이 붙은 세포를 분류합니다. 참고: 세포의 최대 권장 수는 8 웰 접시 당 ~ 50,000입니다. 분류 하는 동안 세포 상태를 확인 합니다. 세포 융합은 세포 건강에 영향을 미칠 수 있으므로 이미징 접시에 대한 적절한 수의 세포를 분류하여 20-90 % 컨플루언스 사후 분류 사이에 세포를 유지합니다. 각 정렬 된 물방울에는 약 3 nL의 칼집 유체가 들어 있습니다. 선별 중에 칼집 유체가 성장 매체를 크게 희석시키지 않도록 하십시오.</li>
	<li>직접 선별 한 후 세포를 인큐베이터로 다시 가져 와서 >2 시간 또는 하룻밤 동안 둡니다. 참고: 부착 세포는 점차적으로 이 기간 도중 표지슬립에 다시 부착할 것이고, 따라서 그들의 형태는 현미경에 직접 취해지면 시간이 지남에 따라 변화할 것입니다.</li>
</ol>4. 세포 융합의 면역 형광 염색 및 이미징
참고: 융합 된 세포는 필요한 실험 및 측정에 따라 라이브 또는 고정 후 추가 형광 염색 (또는 둘 다)을 이미지 화 할 수 있습니다.
<ol><li>라이브 셀 이미징<ol>
<li>성장 배지를 페놀적색(재료표)이없는 이미징 배지로 교체하고 이미징으로 직접 진행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>고정 및 얼룩<ol>
<li>PBS에서 신선한 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비합니다.</li>
		<li>RT에서 15 분 동안 4 % PFA의 100 μL에서 세포를 배양하여 세포를 고정시고 15 분 후에 PFA를 제거하십시오. 주의 사항: PFA는 흡입시 독성이 있으므로 이 단계는 적절한 개인 보호 장비가있는 연기 후드에서 수행되어야합니다. 참고: 고정 후 실험을 일시 중지하고 필요한 경우 나중에 다시 시작할 수 있습니다. 필요한 경우 빛을 로부터 보호 된 4 °C에서 샘플을 저장합니다.</li>
		<li>RT에서 PBS의 200 μL에서 세포를 3 배 세척하십시오.</li>
		<li>RT에서 10분 동안 투과세포를 0.1% nonionic 계면활성제(재료표)와 0.1% 난오성 세제(재료표)로 희석하였다.</li>
		<li>RT에서 30 분 동안 PBS에서 3 % 소 혈청 알부민의 200 μL에서 차단하십시오.</li>
		<li>3% 소 혈청 알부민 및 0.1% 난오계면활성제 및 0.05% 난오성 세제를 함유하는 PBS의 150 μL에서 항체와 배양RT에서 1시간 동안 배양하였다. 참고: 대표적인 결과를 생성하는 데 사용되는 1차 항체는 형광공반-GFP 나노노(1:400 희석에서 사용됨)와 형광공태 반-mScarlet-I 나노노(1:500 희석에서 사용됨)이다. 이들은 이미 형광 성 단백질의 신호를 향상시킵니다.</li>
		<li>PBS 300 μL에서 5분 동안 2x를 씻은 다음 200 μL의 PBS에 둡니다. 참고: 샘플은 PBS로 이미지화됩니다. 시료는 빛으로부터 보호된 4°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지 수집<ol>
<li>4색 이미징이 가능한 적절한 형광 현미경으로 이미지를 획득합니다(예: 공초점, 광시야, 구조화 조명).</li>
		<li>meGFP 및 mScarlet-I 채널을 각각 488 nm 및 561 nm 파장 레이저로 자극합니다. 검출기를 ~505−550 nm 및 ~590−650 nm에서 감지하도록 설정합니다. 각각 405 nm 및 633 nm 레이저로 보라색 및 원거리 적색 염료 채널을 자극합니다. 검출기를 ~430−500 nm 및 ~660−750 nm에서 감지하도록 설정합니다.</li>
		<li>경험적으로 중요한 광 표백이 발생하지 않고 세포가 건강하게 유지되도록 레이저 강도를 결정합니다 (살아있는 세포 이미징의 경우).</li>
		<li>픽셀 값을 포화하거나 인위적으로 클리핑하지 않고 신호가 얻어지는지 여부에 따라 경험적으로 게인을 결정합니다.</li>
		<li>~500 μm 스텝 크기와 20-60 μm의 범위를 포함하는 이미지가 3차원이되도록 Z 스택 데이터를 수집합니다. 참고: 대표적인 자료에 나타난 이미지는 공초점(도2B),Airyscan(도2C)또는 구조화 조명 현미경(도2D)에의해 획득되었다. 각 세포는 세포질에 겹치는 보라색과 멀리 빨간 염료를 모두 포함하는 경우에 선의의 이종입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리는 세포를 융합하고 현미경 검사법으로 세포 하이브리드의 후속 아키텍처를 시각화하기 위한 효과적이고 비용 효율적인 프로토콜을 시연하며, 처음부터 끝까지 약 2일이 소요됩니다. 이 프로토콜의 중요한 부분은 세포 선별 (프로토콜 섹션 3)에 의한 융합 세포의 농축 및 현미경 검사법에 의한 융합 세포의 신중한 검증 (프로토콜 섹션 4)입니다. 이 단면도는 융합한 세포가 쉽게 장악되고 선의의 이종인 것을 보장합니다. 농도 및 배양 시간은 준수해야합니다. 예를 들어, 더 높은 농도에서 또는 더 긴 배양 시간에 사용될 때, 세포 염료는 너무 밝고 유세포 분석 또는 형광 현미경 검사법 도중 검출기를 포화시킬 수 있고, 화상 진찰 조건에 따라서 교차 방출을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 유세포계가 없는 경우, 이중 항생제선택(27) 및 미세유체 트래핑장치(28)를포함하는 융합 세포를 풍부하게 할 수 있는 다른 기술들이있다. 그러나 이러한 기술은 느리거나...

세포 구조의 적시성 유지는 삶에 매우 중요합니다. 세포에는 특징적인 형태, 세포 소기관 수 및 내부 생화학 적 조성이 있습니다. 이러한 근본적인 특성이 어떻게 생성되는지, 그리고 질병 중에 어떻게 엉망이 되는지 이해하려면 실험실 도구가 필요합니다.
세포 융합은 2개 이상의 분리된 세포의 병합이다. 세포 융합은 진핵 생명의 출현에 중요했을 수 있습니다1. 인체에서 세포 융합은 비교적 드물며, 수정 또는 근육, 뼈 및 태반의 형성과 같은 제한된 발달 상황 및 조직 유형 동안 발생한다2. 이 프로토콜은 세포 구조 및 기능을 제어하는 메커니즘을 이해하는 도구로 서, 분별적으로 표지 된 세포기관과 조직 배양 세포 주에서 세포 융합의 유도를 설명합니다.
시험관내 유도 세포-세포 융합은 생물학적 연구 및 질병 치료를 위한 중요한 도구인 단일클론 항체3의생산의 중심이다. 세포 융합은 또한 세포 주기 우호에 관하여 많은 다른 근본적인 세포 생물학 질문을 하기 위하여 이용되었습니다4,aneuploidy5,6,세포 재프로그래밍7,8,손상된 신경의 수선9,바이러스성 증식10,세포증11,종양발생12,세포골격역학13,및 막 융합14,15. 세포-세포 융합을 유도하는 실험실 기반 방법16,17,18,19는 두 개의 이중층의 물리적 병합을 통해 지질막 유착을 유도한다. 세포 융합은 전기18,바이러스 기반 방법17,열플라스모닉 가열20,트랜스젠 발현19,폴리에틸렌 글리콜(PEG)16,21,22에의해 유도될 수 있다.
중원체는 세포 모양, 운동성, 편광 및 분열23을제어하는 미세소관 조직 센터입니다. 중심도 뿌리는 단백질뿌리줄기(24)를 함유하는 중심으로부터 연장되는 섬유질 구조이다(유전자 CROCC에의해 인코딩). 우리는 최근에 세포 세포 융합을 사용하여 부모 세포24에비해 중도위치및 수가 이종내의 다른 지 를 이해했습니다. 이 방법의 사용 뒤에 근거는 차별적으로 형광 태그 부모 세포의 융합 후 이종 내 뿌리의 기원의 세포를 추적하고, 따라서 이미지 세포 간 융합 및 핵분열이다. 형광 태그단백질 뿌리레틴-meGFP 또는 rootletin-mScarlet-I는 PEG 매개 세포 융합에 의해 융합되는 별도의 세포주에서 게놈 편집에 의해 생성됩니다. 우리는 유세포분석및 유래세포의 후속 형광 현미경 식별에 의한 융합세포를 식별하기 위해 세포염료(자료표)의사용을 설명한다(그림1). 이 접근은 세포 기관 번호를 포함하여 세포 상태에 있는 중요한 변경이 세포 항상성에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 강력하고 유일한 방법입니다.

<table><tbody><tr><td>15mL 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8875</td><td></td></tr><tr><td>880 레이저 스캐닝 컨포칼 에어리스캔 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8웰 이미징 접시</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP 알파카 GFP 부스터 나노바디</td><td>Chromotek</td><td>gba-488</td><td></td></tr><tr><td>BD 유입 Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>세포 필터 (70 &mu; m)</td><td>Biofil</td><td>CSS010070</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34572</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FluoTag-X2 anti-mScarlet-I 알파카 나노바디</td><td>NanoTag Biotechnologies</td><td>N1302-At565</td><td></td></tr><tr><td>L15 CO2 독립 이미징 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red free DMEM, high glucose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(1x PBS)</td><td></td><td></td><td>8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O 최대 1L</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 Hybri-Max 1450</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7181</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>비이온성 계면활성제</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337</td><td>비이온성 세제</td></tr></tbody></table>

세포 구조 및 기능의 교란을 위해 게놈 편집 된 세포주 세포주 간의 세포 융합

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

생활은 세포와 세포기관 내부의 뚜렷한 분자 상태의 분리된 형성을 허용하기 위하여 지질 막 내의 공간적으로 분할됩니다. 세포 융합은 단일 세포를 형성하기 위해 2개 이상의 세포를 합병하는 것이다. 여기에서 우리는 2개의 다른 세포 모형의 세포 융합을 위한 프로토콜을 제공합니다. 융합된 하이브리드 세포는 유세포분석 기반 선별에 의해 농축되고, 하이브리드 세포 구조 및 기능의 형광 현미경 검사법에 이어 풍부하다. 게놈 편집에 의해 생성된 형광 태그가 붙은 단백질은 융합된 세포 안쪽에 심상하게, 세포 구조물이 형광 방출에 근거를 둔 확인되고 기원의 세포 모형에 다시 참조되는 것을 허용합니다. 이 강력하고 일반적인 방법은 기본적인 생물학 질문의 범위에 걸쳐 세포 구조 및 기능을 이해하기 위하여 관심있는 다른 세포 모형 또는 세포기관에 적용될 수 있습니다.

적절하게 표지된 세포는 표지되지 않은 대조군 세포보다 더 높은 형광 신호에 의해 유세포분석 중에 볼 수있다(도 2A). 게이츠는 이중 양성 세포의 선별을 위해 설정되어 있으며, 이 집단을 이미징 접시에 직접 풍부하게 하여 추가적인 현미경 분석을 제공합니다. 융합된 세포는 뚜렷한 이중 형광 양성 세포로서 검출가능하며 인구의 약 ~1%를 구성한다.
융합은 두 세포를 하나로 혼합하여 세포 아키텍처의 주요재배열을유도한다(그림 2B). 헤테로카리온은 현미경에서 단일 세포 내부에 혼합된 형광 염료 신호를 모두 포함하는 세포로 확인됩니다(혈장 막을 개입하지 않고). 추가적으로, 2개의 핵은 밝은 필드/차동 간섭...

이 프로토콜의 목적은 하이브리드 셀을 만들기 위해 두 개의 서로 다른 세포 유형을 융합하는 것입니다. 융합 된 세포의 형광 현미경 분석은 세포 소기관의 기원의 세포를 추적하는 데 사용됩니다. 이 분석은 세포 구조와 기능이 세포 융합에 의한 교란에 어떻게 반응하는지 탐구하는 데 사용될 수 있습니다.

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

이 방법은 세포 구조와 기능이 세포 수의 변화에 반응하는 방법과 같은 질문을 해결하기 위해 두 개의 서로 다른 세포 유형의 융합을 통해 혼란을 수 있습니다. 융합된 세포 내의 형광태그 단백질을 이미징함으로써 세포 구조는 세포 간장성 및 기능의 메커니즘을 연구하기 위해 그들의 세포 유형의 기원에 다시 언급될 수 있습니다. 형광염 염료 라벨링의 경우, 각 배양이 다음 날 아침까지 70~90%의 인플루언서에서 6세포로 적어도 6배10으로 확대될 정도로 관심있는 인간 암세포 집단을 참조한다.라벨링 당일, 충청식 eGFP와 루트레틴-mScarlet 세포를 세척당 PBS 10밀리리터로 두 번 세척합니다. PBS및 파레드 셀 염료에서 500 나노몰러로 바이올렛 세포 염료를 PBS에서 200 나노몰러로 희석시. 뿌리 줄기 eGFP 세포를 희석된 바이올렛 세포 염료와 루트레틴-mScarlet 세포에 실온에서 1분 동안 희석된 파 레드 셀 염료로 라벨을 붙입니다.인큐베이션이 끝나면 5분 동안 DMEM의 10밀리리터로 반응을 중지합니다. 라벨이 부착된 세포 배양과 10밀리리터의 신선한 PBS를 세척한 후 예동 트립신1밀리리터로 모든 배양을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 분리된 세포 용액을 개별 15 밀리리터 원심분리튜브로 옮기고 PBS의 1밀리리터와 DMEM의 1밀리리터로 표지되지 않은 세포로 염료 표지펠릿을 부드럽게 재연한다.그런 다음 모든 세포 샘플을 세포 배양 인큐베이터로 반환합니다. 세포 융합 실험을 위해, 새로운 15 밀리리터 튜브에 파 레드 염료 표지 세포의 500 마이크로 리터와 바이올렛 염료 표지 세포의 500 마이크로 리터를 혼합하고 원심분리에 의해 나머지 혼합되지 않은 표시 되지 않은 세포를 퇴적. 신선한 DMEM의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 중단하고 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다.원심분리에 의해 혼합 된 세포를 수집하고 30 초 동안 펠릿에 드롭 현명한 방식으로 50%1450 PEG의 700 마이크로 리터를 추가합니다. 실온에서 3.5분 후, 30초 동안 10밀리리터의 세럼 없는 DMEM 드롭와이즈를 추가하고 튜브를 인큐베이터에 10분 간 넣습니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의한 혼합 세포를 침전시키고 완전한 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 부드럽게 재분리한다.FACS에 의해 융합된 세포 인구를 위해 모든 세포를 70 마이크로미터 여과기를 통해 개별 FACS 튜브로 부드럽게 필터링하고 사이토미터 소프트웨어의 측면 분산 및 이중 차별 플롯에 대한 전방 산란을 만듭니다. 레이블이 없는 세포를 실행하여 형광 강도를 기록하고 융합된 세포를 식별하기 위해 게이트를 만듭니다. 다음으로, 단일 양성 바이올렛 염료 표지 세포를 실행하여 보라색 신호가 파 레드 채널로 유출되지 않고 단일 양성 극적 염료 표시 세포에 유출되지 않는지 확인하여 바이올렛 채널에 극적 신호가 없음을 확인한다.그런 다음 융합 샘플을 짧게 실행하여 융합된 세포가 이러한 게이트와 함께 보이는지 확인합니다. 선별 매개 변수가 설정되면 선별 스트림을 100 마이크로리터의 성장 배지를 포함하는 8웰 이미징 접시에 중앙집중식으로 정렬하고 이중 양성 융합 세포를 접시에 직접 정렬합니다. 모든 세포가 정렬되면 즉시 2 ~ 16 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다.면역형 염색의 경우, 먼저 실온에서 15분 동안 4%파라포름알데히드의 200마이크로리터로 세포 배양 상류체를 대체한다. 고정의 끝에서, 실온에서 10 분 동안 0.1 %의 nonionic 계면 활성제의 200 마이크로 리터에서 세포를 투과화하기 전에 세척 당 PBS의 200 마이크로 리터로 세포를 세 번 세척한다. 다음으로, 실온에서 30분 동안 PBS에서 3%소 세럼 알부민의 200마이크로리터를 적재하고, 150마이크로리터에 대한 관심 있는 항체로 라벨을 부착하여 염색 버퍼의 150마이크로리터로 비특이적 결합을 차단한다.실온에서 1 시간 후, 세척 당 5 분 동안 PBS의 300 마이크로 리터에 세포를 두 번 세척. 마지막 세척 후, 신선한 PBS의 200 마이크로 리터로 세척을 교체하십시오. 융합된 세포의 심상을 취득하려면 4색 이미징이 가능한 적절한 형광 현미경을 사용하고 3차원 이미지를 수집합니다.적절하게 표지된 세포는 표지되지 않은 대조군 세포보다 높은 수준에서 형광 신호에 의해 유동 세포 측정 중에 볼 수 있습니다. 게이트는 이중 양성 세포 집단을 더 현미경 분석을 위해 이미징 접시에 직접 풍부하게 분류하도록 설정할 수 있습니다. 융합은 두 세포의 혼합을 통해 세포 아키텍처의 주요 재배열을 유도한다.이종은 혈장 막을 개입하지 않고 단일 세포 내부에 혼합된 두 형광 염료 신호를 포함하는 세포로 확인된다. 추가적으로, 2개의 핵은 또한 브라이트필드 화상 진찰에 의해 융합된 세포에서 보일 수 있습니다. 세포 구조 및 기능은 meGFP 및 mScarlet 태그 단백질을 포함하는 세포의 병합을 통해 더 조사될 수 있다.융합은 백중구 백센토리올 성분 NEDD1이 형광으로 태그될 때 적어도 4개의 pericentriolar 물질 로 보이는 이종 내부의 중척추 수의 두 배로 증가시다. 내인성 형광표 뿌리제와 세포의 융합은 각 중구의 기원의 세포가 이종에서 확인될 수 있게 한다. 이 프로토콜은 차별화된 라벨이 부착된 세포주를 융합하는 방법과 세포기관을 이미지하여 구조와 기능을 이해하는 방법을 보여줍니다.이 강력한 프로토콜은 유사한 방법에 비해 비교적 쉽고 상대적으로 저렴합니다. 이 기술은 세포세포 융합이 어떻게 규제되는지, 세포가 세포 세포 외 세포 수의 변화에 어떻게 반응하는지와 같은 다양한 질문을 하는 데 사용할 수 있습니다.

cell-cell-fusion-genome-edited-cell-lines-for-perturbation-cellular

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 아연-핑거 뉴클레아제 기반 게놈 편집 기술을 보여줍니다. hPSC는 잠재적으로 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있기 때문에 이 기술은 환자 맞춤형 방식으로 체외 병리학 및 약리학 연구에 도움이 됩니다.

Zinc Finger Nuclease-based genome editing: double-stranded homology dependent repair mechanism에 의한 인간 만능 줄기세포의 게놈 수정 기법

CRISPR/Cas9는 유전자와 유전적 요소를 파괴하는 강력한 시스템입니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9을 사용하여 포유류 세포주에서 게놈 결실을 효율적으로 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR / Cas9를 통해 포유 동물 세포주의 게놈에 삭제 세대

인간 만능 줄기 세포(hPSC)의 게놈 편집을 빠르고 효율적으로 수행할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 EGFP를 발현하고 항생제 내성을 도입하기 위해 AAVS1 세이프 하버 유전자 자리를 편집하여 예시된 바와 같이 hPSC를 유전적으로 조작하는 강력한 실험 절차입니다.

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

프로토콜은 iCRISPR 플랫폼을 사용 hPSC 돌연변이 라인을 생성하고 설명하는 글루코스 응답 형 β 세포로 hPSCs 차별화. hPSC 지시 분화와 게놈 편집 기술을 결합하면 인간 발달 및 질병 진행의 계보 결정의 역할의 체계적인 분석을위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.

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이 프로토콜 편집 시스템 복구에 대 한 포유류 세포에 있는 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 기반 유전자의 워크플로 설명 합니다. 여기, 우리 유전자 편집 대상 사이트에서 indel 형성을 측정 하기 위한 상세한 후속 실험 전략으로 조합 방식을 사용-본질적으로, 현장 mutagenesis 분석.

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소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

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CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

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여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

RNA로서 게놈 편집자를 전달하는 것은 1차 포유류 세포와 세포주의 게놈을 변형하는 데 특히 강력한 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 유전체 편집기를 mRNA로 1차 포유류 세포와 세포주에 전달한 후, 표적 Illumina 시퀀싱과 분석을 통해 편집 결과를 정량화하는 것입니다.

1차 포유류 세포에서 편집자 RNA의 전기천공을 통한 유전체 편집

학습하세요 세포 융합 기법을 통해 세포 구조와 기능의 변화를 연구하는 방법을. 형광 현미경으로 세포 소기관의 기원을 추적하여 세포 항상성 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

세포 구조 및 기능의 교란을 위해 게놈 편집 된 세포주 세포주 간의 세포 융합

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