Name: 해삼 장 세포의 1 차적인 배양에 있는 세포자멸 유도 그리고 탐지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 학습하세요 해삼 Apostichopus japonicus 장 세포의 1차 배양 및 증식 방법을 통해 해양 무척추동물 세포 배양 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 해양 생물학 연구에 필수적인 장기 배양과 세포자멸 유도 실험을 가능하게 합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 그의 기술적 조언과 사용하기 위해 자신의 실험실의 장비를 만들기위한 절강 대학에서 Naiming 저우 교수에게 감사드립니다. 이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 41876154, 41606150, 및 41406137)과 절강 성 대학 및 연구 기관의 기초 연구 기금 [보조금 번호 2019JZ00007)에 의해 재정적으로 지원되었습니다. ].

1. 세포 배양 배지 준비
<ol><li>
Coelomic 유체 준비
	<ol>
<li>
Coelomic 유체 수집: 멸균 조건하에서 건강한 해삼 (85-105g의 젖은 무게)을 해부하고, coelomic 액체를 수집하고 멸균 유리 플라스크에 보관하십시오.</li>
		<li>
Coelomic 세포 제거: 50 mL 원심분리기 튜브에서 50 mL 원심분리기 튜브에서 5 분 동안 1,700 x g의 coelomic 유체를 원심 분리하고 상구체를 새로운 멸균 유리 플라스크로 옮니다. 다음으로, 해삼의 무세포 액을 수집합니다.</li>
		<li>
구성 요소 불활성화 보완: 해삼 coelomic 유체를 포함하는 멸균 유리 플라스크를 20-40 분 동안 40-50 °C 수조에서 배양하여 성분 불활성화 된 coelomic 유체를 보완합니다.</li>
		<li>
미생물 제거: 0.22 μm 멤브레인 필터를 통해 여과하여 박테리아와 클라미디아를 제거합니다. 다음으로, 0.1 μm 멤브레인 필터를 사용하여 여과하여 마이코플라즈마 및 기타 미세 입자를 제거하여 coelomic 유체 전처리 용액을 얻습니다.</li>
		<li>
살린 조정: 20% 고농도 의 전멸 및 여과 NaCl 용액 (전처리 된 coelomic 유체에 의해 희석) 또는 DDW (이중 증류수)를 추가하여 coelomic 유체 전처리 용액의 염도를 30 °F (살리노미터로 측정)로 조정하십시오. 해삼 coelomic 유체를 멸균 병으로 옮기고 병을 밀봉하고 유체를 4 °C에서 저장하여 추가 실험을 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
라이보비츠의 L-15 세포 배양 배지 최적화
	<ol>
<li>NaCl 의 5.05 g, KCl0.135 g, CaCl20.15 g, Na2SO4,MgCl20.975 g, 포도당 0.25 g, 타우린 6.25 mg을 50 mmmmmm에서 라이보비츠 의 L-15 배지 40 mL에서 희석합니다. 소금이 완전히 용해되었는지 확인하기 위해 셰이커의 튜브를 1 시간 동안 교반하십시오.</li>
		<li>이전에 준비된 Leibovitz의 L-15 배지에 2.5 mL의 L-글루타민(100 mg/mL)과 500 μL의 VE 용액(1.75 mg/L)을 넣고 0.22 μm 멤브레인 필터를 통해 배지를 추가로 걸으세요.</li>
		<li>신선한 Leibovitz의 L-15 배지와 이전에 준비된 100 mL의 coelomic 유체로 총 중간 부피를 500 mL로 조정하십시오. 다음으로 NaOH 용액을 사용하여 pH를 7.6으로 조정합니다. 작동 프로세스를 멸균 환경에서 유지합니다. coelomic 액체의 배합 비율은 10%-50%일 수 있고, 20%는 A. japonicus 장 세포 배양에 충분합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 장 세포 준비
<ol><li>
해삼 장 처리
	<ol>
<li>얼음 상자에 건강한 해삼을 마취. 전방 창자를 해부하고 수집한 다음 조직 샘플을 수직으로 절제하고 내부 내용물제거합니다.</li>
		<li>인산완충식염수(PBS)로 조직 샘플을 2회 세척하고 수성 에탄올 용액(75% 부피)에 침지하여 2s 이상소독합니다.</li>
		<li>에탄올을 제거하고 2.0 mL 멸균 미세 원심 분리 튜브로 조직 샘플의 약 100 mg을 전송하기 위해 PBS에서 세 번 조직 샘플을 세척.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 수집
	<ol>
<li>해삼 장 조직 블록에 미리 최적화된 배양 배지 1.5 mL을 추가하고 용액이 흐릴 때까지 멸균 된 수술 용가로 블록을 다진다. 참고 : 선택적 단순화 된 프로토콜의 경우, 해삼 장 조직 블록에 미리 최적화 된 배양 배지 0.5 mL를 추가하고 멸균 수술 가위로 블록을 1mm3으로잘라냅니다. 직접 배양 접시에 샘플을 전송하고 후속 배양 단계.</li>
		<li>트립신 400 μL (0.25%)을 추가하고, 반전으로 용액을 혼합하고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션한 다음 100 μm 셀 스트레이너를 사용하여 용액을 필터링합니다. 참고: 다른 조직 샘플을 치료할 때 세포 분산을 위한 트립신을 추가하는 것은 선택 사항입니다. 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)은 배양 배지에서Ca2+ 및 Mg2+로부터의 억제 활성을 감소시키기 위해 트립신 용액에 포함되어야 한다.</li>
		<li>여과액을 새로운 멸균 2.0 mL 마이크로 원심분리기 튜브로 수집하고, 1,700 x g에서 3 분 동안 원심 분리기를 넣고 상구체를 버린 다음 배양 배지에서 펠릿을 다시 일시 중단 (항생제보충제)하고 두 번 씻으십시오. 참고: 실험 시작 전에 2% 페니실린-스트렙토마이신 용액(10,000 U/mL 페니실린 및 10 mg/mL 스트렙토마이신)과 1% 젠타미신(4 mg/mL)으로 보충된 신선한 미리 최적화된 배양 배지를 준비합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 세포 배양
<ol><li>
인큐베이터 사전 설정: 세포 배양을 위한 인큐베이터를 미리 설정하고 18°C 및 포화 습도의 온도로 적어도 24시간 동안 미리 실행한다. 참고: 세포 배양 배지 특성에 따라CO2를 인큐베이터내로 공급; Leibovitz의 L-15의 기본 매체를 사용할 때는CO2를 공급할 필요가 없습니다.</li>
	<li>
1단계 세포 배양
	<ol>
<li>미생물의 성장을 억제하고 세포 배양의 초기 단계에서 증식을 촉진하기 위해 페니실린-스트렙토마이신 용액 10 mL(10,000 U/mL 페니실린 및 10 mg/mL 스트렙토마이신)과 0.5 mL의 젠타미신(40 mg/mL)을 모든 50 mL의 배양에 추가합니다. 또한, 인슐린 0.6 mL (10 mg/mL), 인슐린 과 같은 성장 인자 (0.1 μg / μL) 및 섬유 아세포 성장 인자 25 μL (0.1 μg / μL)으로 모든 500 mL 배양 매체를 보충하십시오.</li>
		<li>1.5 mL 튜브로 세포를 수집, 표시된 매체의 200 μL을 사용하여 그들을 다시 중단하고, φ 4cm 접시로 피펫.</li>
		<li>인큐베이터에서 세포를 배양하고 6h 후 세포 배양 접시에 표시된 배지의 2.0 mL를 추가합니다. 다음 단계에 도달할 때까지 매질의 절반을 매 12시간마다 변경한다. 참고 : 세포가 접시에 단단히 부착되지 않았기 때문에 매질 교체를 부드럽게 처리하십시오. 폴리-D-리신 코팅 접시는 접시 세포에 느슨하게 부착하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2단계 세포 배양
	<ol>
<li>배양 된 세포에 대한 항생제의 부작용을 줄이기 위해 배양 배지에서 표시된 항생제 (페니실린, 스트렙토 마이신 및 겐타미신)의 농도를 절반으로 줄입니다. 참고: 인슐린과 성장 인자의 사용은 세포 배양 조건에 따라 달라 지 고 선택 사항.</li>
		<li>세포 배양 배지를 대체; 세포 밀도에 따라 2~3일마다 배지 변경을 수행합니다. 참고 : 현미경으로 매일 배양 된 세포를 관찰하고 성장 조건을 기록하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 패시징 참고: 1차 세포 밀도가 60%에 도달할 때 세포를 통로 및 배양한다.<ol>
<li>실온에서 PBS를 사용하여 배양된 세포를 두 번 세척합니다. 트립신 용액 200 μL 추가 (0.25%) 각 접시에 수동으로 반기하여 바닥 전체가 덮여 있는지 확인합니다. 트립신 용액을 버리고 실온에서 5 분 동안 세포를 배양하십시오.</li>
		<li>세포를 파이펫팅하고 다시 중단시킴으로써 신선한 배양 배지의 1.0 mL로 세포를 세척한다. 0.5 mL의 세포 현탁액을 새로운 접시에 옮기고 1.5 mL의 신선한 배지를 추가하고 18 °C에서 세포를 배양하십시오. 참고 : 세포 스크레이퍼는 트립신 용액이 접시에서 세포를 소화하고 분리하지 못할 때 세포 수집에 사용할 수 있습니다 (일부 세포주가 너무 접착제입니다). 그러나 두 방법을 동시에 수행하지 마십시오.</li>
		<li>12 시간 후에 배지를 변경하고 상태를 평가하기 위해 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 추가 실험 적인 실험 적인 실험에 대 한 세포를 배양.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. A. japonicus 장 세포에서 세포 사멸 유도 및 검출
<ol><li>
세포 배양 및 덱사메타손 치료
	<ol>
<li>이전에 도입된 프로토콜에 따라 장 세포를 준비하고 웰당 2 x 106의 세포 부피에서 12 웰 플레이트에 세포를 드롭와이즈로 추가합니다.</li>
		<li>배양 3일 후, "1단계 세포 배양"의 단계를 따라, 세포를 PBS로 3회 세척하고 배지를 최적화된 배지로 대체한다(항생제 및 성장 인자 제외).</li>
		<li>배양 배지에서 덱사메타손(DXMS)을 희석하여 실험을 시작하기 전에 신선한 2 μM 및 200 μM DXMS 솔루션을 준비하였다.</li>
		<li>배양 배지의 동일한 부피로 성장 배양 된 세포에 다른 농도의 DXMS 솔루션을 추가; 대조군(CTL), 1 μM 및 100 μM DXMS를 포함한 3개의 실험군을 설정한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hoechst 염색 
	<ol>
<li>표시된 기간 (0 h, 24 h 및 48 h)에 대한 DXMS없이 배양 후 PBS로 세포를 세 번 씻으하십시오.</li>
		<li>Hoechst 33258 용액의 300 μL을 잘 12 웰 플레이트에 넣고 18 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>Hoechst 염색 용액을 제거하고 각 웰에 4% 파라포름알데히드 용액(PBS)의 300 μL을 추가하여 세포를 고정시다. 15분 동안 부드럽게 교반합니다. 주의 사항: 파라포름알데히드는 피부 접촉 이나 흡입에 의해 적당히 독성, 그리고 그것은 가능한 인간의 발암 물질로 지정 됩니다. 화학 연기 후드, 환기 저울 인클로저 또는 기타 보호 조치는 파라 포름 알데히드의 계량 및 취급 중에 사용해야합니다.</li>
		<li>고정 된 세포를 PBS에서 세 번 세척하십시오. 세포를 덮기 위해 세척 후 PBS를 버리지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
형광 현미경 분석
	<ol>
<li>수은 램프 전원, 형광광 전력 및 PC를 포함한 형광 현미경 하드웨어를 켭니다. 운영 체제 계정에 로그인하고 소프트웨어를 실행하고 구성을 확인합니다.</li>
		<li>준비된 플레이트를 현미경 단계에 놓습니다. 스테이지 컨트롤러를 사용하여 대물 렌즈 위에 샘플을 배치합니다.</li>
		<li>광 현미경의 밑에 관심 있는 세포를 찾아내고, 형광 현미경 검사법으로 전환하고, 매개변수를 조정해서 심상을 붙잡습니다. 참고: 핵 DNA에 결합된 Hoechst 33258 형광 신호를 관찰하기 위하여는, 형광 현미경 검사법은 대략 352 nm 및 461 nm에서 각각 여기와 방출로 실행되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone%2C+Haliotis+rufescens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Marine+Biology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li>
<li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins%3A+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860(2015).</li>
<li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Genomics%22%5BJournal%5D)">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718(2016).</li>
<li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+%28Lamarck%2C+1816%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li>
<li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+%28Crassostrea+gigas%29%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li>
<li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance%3A+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Zoology%22%5BJournal%5D)">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790(2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+D%3A+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li>
<li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+B%3A+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li>
<li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29+during+aestivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li>
<li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%3A+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+biology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li>
<li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li>
<li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+invertebrate+cell+culture%3A+a+decade+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li>
<li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220(2018).</li>
<li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture%3A+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li>
<li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li>
<li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Excli+Journal%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li>
<li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+proliferation%2C+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li>
<li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li>
<li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+long-term%2C+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li>
<li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cultures+from+marine+invertebrates%3A+new+insights+for+capturing+endless+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li>
<li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

광범위한 연구 노력은 지난 수십 년 동안 세포주 확립에 전념해 왔지만, 해양 무척추 동물14,22로부터세포의 장기 배양에 진전을 이루기는 여전히 어렵다. 홀로투리안 조직을 재생시키는 것으로부터 배양된 세포는 장기간 생존가능하고 증식의 높은 활성이 특이적세포(17,23)에서검출될 수 있다고 보고되었다. 그러나, 정상적인 해양 무척추 동물 세포의 경우, 아직 실용적인 세포 배양 접근법이 설명되어 있지 않다. 여기에 제시된 프로토콜은 해양 무척추 동물 종 A. japonicus로부터장 세포를 배양하고 통과시키는 효율적이고 쉽게 해석 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 방법은 오징어 및 게와 같은 많은 다른 해양 무척추 동물 유기체의 1 차적인 세포 배양에 쉽게 적응될 수 있다.
<p class="jove_...

인위적으로 통제된 조건하에서 세포를 배양하는 것은 자연 환경이 아니라 생물학적 연구를 위한 균일한 실험 물질을 제공하며, 특히 실험실 환경에서 쉽게 배양할 수 없는 종에 대해 균일한 실험 물질을 제공합니다. 해양 무척추 동물은 모든 동물 종의 30 % 이상을차지하며,재생2,3,스트레스 반응 4 및 환경 적응5,6과같은 특정 생물학적 과정의 규제 메커니즘에 대한 연구를 수행하기위한 수많은 생물학적 물질을 제공합니다.
해삼, 아포스코푸스 japonicus,북태평양 해안을 따라 온대 바다를 서식하는 가장 연구 된 echinoderm 종 중 하나입니다. 그것은 잘 상업적으로 중요한 종으로 알려져 있으며, 특히 중국7,동아시아에서 대규모로 마리 컬쳐. A. japonicus에관한 수많은 과학적 질문, 억제 후 장 재생 기본 규제메커니즘을 포함 하 여 8 및 aestivation에서 변성9,대사 제어10,11,그리고 면역 반응12,13 열 또는 병원 성 스트레스 에서, 연구원의 관심을 끌고 있다. 그러나, 잘 연구된 모형 동물과 비교해, 기초 연구, 특히 세포 수준에, 고급 세포 배양 방법의 부족과 같은 기술적인 병목 현상에 의해 제한됩니다.
연구원은 세포주 를 확립하기 위하여 많은 노력을 바쳤습니다, 그러나 또한 많은 도전을 직면하고 어떤 해양 무척추 동물에게서 세포주도 아직14설치되지않았습니다. 그러나, 해양 무척추 동물에서 1 차적인 세포 배양은 지난 수십 년 동안15,16에서진보하고, 그(것)들은 세포 수준에 실험을 위한 기회를 제공했습니다. 예를 들어, A. japonicus로부터의 재생 인테신은 해양 무척추동물(17)의1차 세포 배양에 대한 실용적인 방법을 제공하는 장기 세포 배양용 세포의 공급원으로 활용되고 있다. 이 프로토콜은 결합및 최적화된 무척추동물 세포 배양 접근법과 해삼 또는 다른 해양 무척추동물에 대한 널리 적합한 1차 배양 방법을 개발하였다.
세포 사멸은 다양한 외인성 및 내인성 자극에 의해 유발되는 본질적인 세포 자살 프로그램입니다. 조율된 아포토시스는 많은 생물학적 계에18,19,및 수거 9 시 동안 해삼의 장 회귀에 연루되어있다. 관심있는 유기체에서 세포 사멸 과정을 조사하기 위해 Hoechst 염색 및 현미경 분석법을 포함한 일련의 방법이20개 확립되고 성공적으로 적용되었습니다. 여기에서, 우리는 해양 무척추 동물의 생물학 연구결과에 있는 1 차적인 세포의 유용성을 평가하기 위하여 해삼의 1 차배양된 장세포에서 apoptosis 유도 그리고 탐지를 실시했습니다. 일반적으로 사용되는 합성 글루코코르티코스테로이드(21) 중하나인 덱사메타손은 해삼에서 배양된 장세포에서 세포사멸을 유도하는데 사용되었으며, 현저한 Hoechst 33258 신호는 형광 현미경검사법에 의해 염색된 세포에서 성공적으로 검출되었다.

<table><tbody><tr><td>0.1 &뮤; m 필터</td><td>Millipore</td><td>SLVV033RS</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; M 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신</td><td>게놈</td><td>GNM25200</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m 필터</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>4cm 접시</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0124</td><td></td></tr> PBS 벤치탑 원심분리기<tr><td>의</td>4<td>% 파라포름알데히드 용액</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>80096618 Beckman</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>BeyoClick EdU-488 키트</td><td>Beyotime</td><td>C0071S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10005817</td><td></td></tr><tr><td>항온 인큐베이터</td><td>Lucky Riptile</td><td>HN-3</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>XW00500221</td><td></td></tr><tr><td>전기 자동 온도 조절 수조</td><td>senxin17</td><td>DK-S28</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td></td><td>80176961 75%</td></tr> <tr><td>섬유아세포 성장 인자(FGF)</td> <td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Leica DMI3000B</td><td>DMI3000B</td><td></td></tr><tr><td>Garamycin</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>XW14054101</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Sinopharm 화학 시약</td><td>63005518</td> Hoechst33258 <td></td></tr><tr><td>염색 용액</td><td>Beyotime</td><td>C1017</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td></td><td></td>XW1106168001</tr><tr><td>인슐린 유사 성장 인자(IGF)</td><td>PEPROTECH</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시노팜 화학 시약</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz의 L-15</td><td>Genom</td><td>GNM41300</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민(100 mg/mL)</td><td>Genom</td><td>GNM-21051</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td></td><td></td>XW77863031</tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10020518</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10019308</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td>pH7.2-7.4</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>게놈</td><td></td><td></td>GNM15140</tr><tr><td>PH 측정기</td><td>Bante</td><td>A120</td><td></td></tr><tr><td>타우린</td><td>SIGMA</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>VE</td><td>Seebio</td><td>185791</td><td></td></tr></tbody></table>

해삼 장 세포의 1 차적인 배양에 있는 세포자멸 유도 그리고 탐지

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

1 차 배양 세포는 생물학적 물질의 기능적 평가 또는 특정 생물학적 활동의 특성화를 위한 매우 중요한 도구로서 다양한 과학 분야에서 사용된다. 그러나, 보편적으로 적용 가능한 세포 배양 배지 및 프로토콜의 부족으로 인해, 해양 생물에 대한 잘 설명된 세포 배양 방법은 여전히 제한적이다. 한편, 해양 무척추 동물 세포의 일반적으로 발생하는 미생물 오염 및 다색 특성은 해양 무척추 동물에 대한 효과적인 세포 배양 전략의 수립을 더욱 방해합니다. 여기서, 우리는 해삼 Apostichopus japonicus에서장 세포를 배양하기위한 다루기 쉬운 방법을 설명합니다. 추가적으로, 우리는 1 차적인 배양된 장 세포에 있는 시험관 내 apoptosis 유도 그리고 탐지의 보기를 제공합니다. 더욱이, 본 실험은 적절한 배양 배지 및 세포 수집 방법에 대한 세부정보를 제공한다. 기재된 프로토콜은 에키노더마타, 연체루스카 및 갑각류를 포함한 해양 생물로부터 널리 이용 가능한 다양한 조직 샘플과 호환되며, 여러 체외 실험 응용 분야에 충분한 세포를 제공할 수 있다. 이 기술은 연구원이 해양 무척추 동물에서 1 차적인 세포 배양을 능률적으로 조작하고 세포에 표적으로 한 생물학 물질의 기능적인 평가를 촉진하기 위하여 가능하게 할 것입니다.

여기에서, 우리는 A. japonicus의 1 차적인 장 세포 배양을 설치하고 세포를 통과했습니다. 그림 1은 배양의 상이한 단계에서 둥근 세포를 나타낸다. 그리고 EdU 염색 검정은 나중 단계에서 이들 둥근 세포의 증식 활성을 밝히기 위한 직접적인 증거를제공한다(도 2). 우리는 또한 약간 프로토콜을 조정, 대신 여과 된 세포의 다진 조직 블록을 배양; 또한, 스핀들 세포 유형은 성공적으로 배양 될 수있다. 이 세포 모형은 장 조직 블록의 주위에 발생하고 배양의 4 일 후에 관찰될 수 있었습니다; 그러나, 그것은 통과되지 못했습니다(그림 3).
배양된 세포는 상이한 생물학적 실험 적용을 위해 사용될 수 있다. 우리는 다른 기간 동안 DXMS로 세포를 처리했고, 그 다음에 는 Apoptotic 세포 검출을...

이 프로토콜은 해삼 Apostichopus japonicus에서 장 세포를 배양하는 다루기 쉬운 방법을 제공하며 에키노더마타, 연체 동물 및 갑각류를 포함한 해양 생물에서 널리 이용 가능한 다양한 조직 샘플과 호환됩니다.

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

이 프로토콜은 해양 무척추 동물을 위한 다루기 쉽고 널리 호환되는 1차 세포 배양 방법을 제공한다. 이 기술은 연구원에게 비교적 오랜 시간 동안 해양 무척추 동물 세포를 배양하는 방법을 제공합니다. 세포의 배양은 해양 생물학 연구에서 다른 추가 생물학적 실험 응용 프로그램에 대한 일관된 유전 적 배경을 제공해야합니다.이 분야에 대한 새로운 연구에 따르면, 우리는 표시된 단순화 된 프로토콜이 운동하기에 좋은 선택이되어야한다고 믿습니다. 마취 후, 전위 내자를 해부하고 수집한 다음, 조직 샘플을 수직으로 절제하고 내부 내용을 제거합니다. PBS에서 조직 샘플을 두 번 세척하고 75% 에탄올 용액에 2초 이상 침수하여 소독합니다.그런 다음 PBS에서 조직 샘플을 세 번 세척하여 에탄올을 제거하고 약 100 밀리그램의 조직 샘플을 2 밀리리터 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 전달합니다. 해삼 장 조직 블록에 미리 최적화된 배양 배지 1.5밀리리터를 넣고 용액이 흐릴 때까지 살균 수술 가위로 블록을 다진다. 0.25%의 트립신400마이크로리터를 추가합니다.반전으로 용액을 섞고 실온에서 5분 동안 인큐베이션합니다. 그런 다음 100 미크론 세포 스트레이너를 사용하여 용액을 필터링하고 새로운 멸균 2 밀리리터 마이크로 원심 분리튜브에서 여과물을 수집합니다. 선택적 단순화 프로토콜의 경우 배양 된 미디어에서 절단 된 조직 블록을 직접 요리로 옮기고 배양 할 수 있습니다.1700xG에서 튜브를 3분 동안 원심분리하고, 상류제를 폐기한 다음, 항생제로 배양 배지에서 펠릿을 다시 중단하고 배양 배지로 두 번 세척한다. 세포 배양을 위한 인큐베이터를 미리 설정하고, 섭씨 18도의 온도와 포화 습도로 적어도 24시간 동안 미리 실행한다. 그런 다음 표시된 배지의 200 마이크로 리터를 사용하여 세포를 다시 중단하고 4 센티미터 요리로 옮습니다.인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 6 시간 후, 인큐베이터에서 그들을 데리고 세포 배양 요리에 표시된 매체의 두 밀리리터를 추가합니다. 매 12 시간, 매체의 절반을 변경합니다.5~7일 후에 세포가 분열되기 시작합니다. 배지에 표시된 항생제, 페니실린, 연쇄상 구균 및 젠타미신의 농도를 절반으로 줄임으로써 항생제의 부작용을 줄입니다. 2~3일마다 세포 배양 배지를 교체한다.1 차 세포 밀도가 60 %에 도달하면 세포 통과를 실시합니다. 먼저, 실온에서 PBS를 사용하여 배양 된 세포를 두 번 씻

apoptosis-induction-detection-primary-culture-sea-cucumber-intestinal

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 마우스 배아의 프로그래밍 세포 죽음의 영역 (PCD)와 LysoTracker라는 높은 가용성 염료를 사용하여 배아 줄기 (ES) 세포 문화를 차별화를 시각화하는 간단한 프로토콜을 제시한다.

태아의 프로그래밍 셀 죽음을 감지 할 LysoTracker의 이용 및 배아 줄기 세포를 차별화

특정 유전적 교란이나 독소에 대한 노출은 정상적인 발달 과정을 방해하여 특정 세포 유형의 사멸로 이어질 수 있습니다. 제브라피시 배아에서 전체 마운트 면역형광에 의한 활성화된 Caspase 3 분석은 특이적으로 세포사멸을 겪고 있는 세포의 단계 및 조직 특이적 국소화를 보여줍니다.

활성화된 카스파아제 3을 검출하기 위한 전체 마운트 면역형광에 의한 제브라피시 배아의 세포사멸 분석

아나스타시스라는 용어는 죽어가는 세포가 말기에 세포 자살 과정을 역전시키고 스스로 회복하여 궁극적으로 살아남는 현상을 말합니다. 여기에서는 아나스타시스를 겪는 세포를 검출하고 추적하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략

여기에서는 인접한 사멸 또는 죽어가는 세포와의 물리적 상호 작용에 의해 생존 가능한 세포에서 유도되는 세포 내 신호 전달 이벤트를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 죽은 세포의 식세포 흡수 또는 용해성 매개체의 방출과 대조적으로 죽은 세포의 수용체 매개 인식에 의해 유도되는 신호 전달 이벤트에 중점을 둡니다.

세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

교류 cytometry 또는 차등 원심 분리를 사용 하 여 워크플로 검색, 계량 및 apoptotic 시체는 apoptotic 샘플 고 순도 분리 개발 된다.

검색 및 Apoptotic 몸 높은 순도 절연

여기의 미리 활성화 CD8 세포 독성을 조사 하는 프로토콜 설명 apoptotic 암 세포를 통해 실시간으로 현미경을 감지 하 여 암 세포에 대 한+ T 세포. 이 프로토콜 골수성 세포 유도 된 T 세포 억제 뒤에 메커니즘을 조사 하 고 면역 진압 골수성 세포의 봉쇄를 통해 T 세포를 보충 하기 위한 화합물을 평가할 수 있습니다.

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

여기서, 우리는 사 멸 티 모 세포와 복 막 대 식 세포를 준비 하 고 efferocytosis 및 특정 억제제의 효율성을 분석 하 사 멸 티 모 세포의 침 지에 관한 프로토콜을 제시 한다. 이 프로토콜은 인공 구슬과 박테리아를 포함 한 다른 입자의 세포 매개 클리어런스에 광범위 한 응용 프로그램을가지고 있습니다.

대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포 침 몰의 실험 분석

제시된 프로토콜은 유세포측정을 사용하여 배양된 마우스 장용체에서 증식 및 죽은 세포의 수를 정량화합니다. 이 방법은 약물 치료가 오르가노이드 증식 및 생존에 미치는 영향을 평가하는 데 도움이 된다.

엔터로이드에서 증식 및 죽은 세포의 정량화

이 프로토콜은 극성이 역인 작은 장 장내염을 활용하여 정점 표면에 접근 할 수있는 apical-out 괴사 장염 (NEC) 인 - 접시 모델을 설명합니다. 우리는 NEC 관련 상피 파괴를 검출하기위한 면역 형광 염색 프로토콜 및 NEC-in-a-dish 프로토콜을 실시한 apical-out enteroids의 생존력을 결정하는 방법을 제공합니다.

체외 괴사성 장염의 Apical-Out Enteroid 모델

이 프로토콜은 사이토카인(cytokine)과 같은 세포독성 섭동(cytotoxic perturbagens)에 반응하여 인간 결장 오가노이드에서 세포 사멸을 조사하고 정량화하는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 접근법은 형광 세포 사멸 염료(SYTOX Green Nucleic Acid Stain), 생 형광 현미경 및 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 세포독성 자극에 대한 단일 오가노이드 반응을 정량화합니다.

Live Fluorescence Microscopy를 사용한 인간 결장 오가노이드의 Cytokine 유도 세포 사멸 정량화

학습하세요 해삼 Apostichopus japonicus 장 세포의 1차 배양 및 증식 방법을 통해 해양 무척추동물 세포 배양 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 해양 생물학 연구에 필수적인 장기 배양과 세포자멸 유도 실험을 가능하게 합니다.

해삼 장 세포의 1 차적인 배양에 있는 세포자멸 유도 그리고 탐지

더 많은 동영상 탐색