Name: 관상 동맥 혈관 신생의 체외 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 학습하세요 관상 동맥 혈관 신생의 체외 모델을 이용하여 VEGF-A 자극에 대한 혈관 내피 세포의 반응을 연구하는 방법을. 이 기술은 심장 발달 및 재생 메커니즘 규명에 필수적인 도구입니다.

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저자는 지원 연구 환경을 제공 샤르마 연구소의 구성원에게 감사드립니다. 우리는 우리의 마우스 식민지를 유지하고 돌보는 다이앤 (디) R. 호프만에게 특별한 감사를 전하고 싶습니다. 우리는 또한 철저하게 원고를 교정하고 유용한 의견을 제공 필립 J. 스말디노 박사와 캐롤린 반 감사드립니다. 이 작품은 볼 스테이트 대학 프로보스트 사무실과 생물학학과에서 B.S에, 과학 수석 연구 보조금 기금 B.S에 인디애나 아카데미, NIH (RO1-HL128503) 및 뉴욕 줄기 세포 재단 기금K.R.

이 프로토콜에 있는 모든 동물의 사용은 볼 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 지침을 따랐습니다.
1. 시간 적정 임신을위한 마우스 브리더 를 구축하고 질 플러그를 감지
<ol><li>야생형 수컷 과 암컷 마우스로 마우스 사육 케이지를 설치한다. 사육 마우스의 나이가 6-8 주 사이인지 확인하십시오. 한 쌍 (1 남성과 1 암컷) 또는 번식을위한 트리오 (1 남성과 2 여성)로 설정합니다.</li>
	<li>다음 날 아침 질 플러그를 확인하십시오. 각진 금속 프로브를 사용하여 질 개구부에 삽입하여 깊은 플러그를 감지합니다. 양수 질 플러그의 아침을 배아일 0.5(e0.5)로 지정합니다. 참고: 질 플러그는 표면적일 수 있습니다(쉽게 볼 수 있음, 그림 1참조) 또는 깊지 않은(쉽게 볼 수 없는). 깊은 플러그의 존재는 프로브의 전체 삽입을 차단하는 반면 플러그의 부재는 저항없이 전체 삽입을 허용합니다.</li>
	<li>배아가 수확될 e11.5에 도달할 때까지 임신 시간을 유지합니다. 배아를 수확하기 전에 임신을 확인하려면 e7.5와 e11.5 사이의 암컷 마우스의 체중을 기록하십시오. 참고 : 어머니의 체중의 매일 증가는 성공적인 임신을 나타내는 반면, 체중의 변화는 실패 한 임신을 나타냅니다.</li>
</ol>2. 임신 한 마우스에서 배아 수확
참고 : 시작하기 전에 CO2 안락사 챔버, 70 % 에탄올, 종이 타월, 일반 집게, 미세 집게, 가위, 1x 멸균 인산 염기 완충 식염수 (PBS), 10cm 멸균 페트리 접시, 얼음이있는 용기, 천공 숟가락, 해부.
<ol><li>깨끗한CO2 안락사 챔버에 e11.5 임신 마우스를 놓고 그것을 희생하십시오. 마우스가 빠져나가는 것을 방지하기 위해 챔버의 뚜껑을 닫습니다.</li>
	<li>마우스가 안락사 챔버에서 고정된 후 CO2를켭니다. IACUC 권장 사항당CO2의 유량을 조절해야 합니다(즉, 분당 10-30% 변위). 마우스가 완전히 안락사 된 후, 죽음을 보장하기 위해 자궁 경부 탈구를 수행합니다.</li>
	<li>70% 에탄올로 마우스에 스프레이합니다. 집게를 사용하여 배 위에 피부를 들어 올리고, 가위를 사용하여 작은 절개를하고 절개를 측면으로 확장하십시오. 절개를 전방으로 확대하여 다이어프램까지 확대하고 배아를 함유하는 자궁경적을 노출한다(도2).</li>
	<li>자궁을 잡고 무료로 절단하여 배아 (자궁 경적 + 배아)의 문자열을 당깁니다. 배아의 끈을 얼음차가운 멸균 1x PBS에 놓습니다.</li>
	<li>자궁 경적으로부터 개별 배아를 해부하여 자궁근, 노른자 낭 및 양막을 하나씩 벗겨냅니다(그림 3A-F)를입체 현미경으로 합니다. 얼음에 멸균 1x PBS를 포함하는 페트리 접시에 천공 숟가락을 사용하여 청소 배아를 전송합니다. 배아를 차갑게 유지하십시오.</li>
</ol>3. e11.5 배아에서 하트 분리
참고 : 시작하기 전에 일반 집게, 미세 집게, 1x 멸균 PBS, 10cm 멸균 페트리 접시, 6cm 멸균 페트리 접시, 얼음이있는 용기, 천공 숟가락, 해부 입체 현미경 : 다음 장비 및 시약을 가지고 있는지 확인하십시오.
<ol><li>스테레오현미경으로 얼음으로 차가운 멸균 1x PBS로 새로운 페트리 접시를 설정합니다. 2.5단계에서 태아를 페트리 접시로 옮겨 심장을 해부한다.</li>
	<li>집게를 사용하여 배아의 머리를 제거합니다. 먼저 한 손으로 포셉 사이에 머리를 짜낸 다음 닫힌 집게를 사용하여 다른 손으로 머리를 긁어 냅니다(그림 4A-C).</li>
	<li>머리를 제거한 후, 배아를 한 손으로 배꼽에 포인치로 잡고 복부 쪽으로 배아를 배양한다(도4D).</li>
	<li>한편, 배아의 흉벽을 먼저 열어 미세한 집게를 이용하여 다이어프램 위 가슴에 작은 절개를 한다. 그런 다음 닫힌 집게를 삽입하고 집게를 열어 가슴 벽을 찢어 서 절개를 매우 신중하게 확대합니다. 심장을 손상시킬 수 있는 너무 깊게 밀어붙이지 않도록 하십시오. 집게의 도움으로 흉부 구멍에서 심장과 폐를 노출시키기 위해 가슴 벽을 넓게 열어 두십시오(그림 4E).</li>
	<li>미세 한 집게를 사용 하 여 부드럽게 앞쪽 (90°) 심장을 이동 하 고 등쪽 대강/정 경을 노출. 심장 기저부에서 등쪽 대흉/정맥을 포착하여 심장/폐를 앞쪽으로 당깁니다(그림4F-H). 참고: 심장의 등쪽쪽에 위치한 SV의 찢어짐을 피하기 위해 심장/폐를 당기면서 부드럽게 하십시오.</li>
	<li>혈액 세포를 제거하기 위해 차가운 1x PBS로 심장 / 폐를 헹구고.</li>
	<li>3.1-3.6 단계를 반복하여 나머지 배아에서 심장/폐를 제거합니다. 얼음에 고립 된 심장 / 폐를 유지해야합니다.</li>
</ol>4. e11.5 배아 마우스 하트에서 SV와 심실을 분리
<ol><li>3.7단계에서 심장/폐로 페트리 접시를 스테레오현미경 으로 배치하여 SV와 전체 심실을 분리합니다. 미세 한 집게를 사용 하 여 그들의 루트에서 폐의 부착 된 엽을 하나씩 벗겨.</li>
	<li>등쪽의 심장을 동양화하고 SV를 찢지 않고 SV를 전방으로 둘러싸는 심방과 인접한 조직을 제거합니다. 왼쪽 및 오른쪽 심방을 심장에서 제거하고 베이스를 잡고 미세 한 집게를 사용하여 긁어 냅니다(그림 5B). 유사한 기술을 사용하여 SV를 둘러싼 인접한 조직을 제거한다(도5C). 참고: 오른쪽 아트리움이 SV에 부착되어 있으므로 아트리움만 제거하도록 주의하십시오.</li>
	<li>SV를 분리하기 위해 먼저 등쪽 측면이 위를 향하도록 심장을 방향을 정하고 (SV가 등쪽 쪽에 있기 때문에) 집게로 심실에서 심장을 부드럽게 잡고이 위치에 심장을 유지하십시오. 참고 : SV는 심장의 등쪽의 심방 사이에있는 배아 심장의 유입 기관입니다.</li>
	<li>SV가 부착된 심장에서 조심스럽게 벗겨내거나 부착된 밑에 SV를 미세한 집게로 잡고 닫힌 집게로 긁어내어 SV를 제거합니다(그림5D,E).</li>
	<li>멸균 된 전사 파이펫을 사용하여 얼음 차가운 멸균 1x PBS로 분리 된 SV를 새로운 6cm 페트리 접시로 옮기고 페트리 접시를 SV로 레이블을 지정합니다.</li>
	<li>전체 심실을 분리하려면 SV를 제거 한 후 심장에서 유출 관 (대동맥 및 폐 트렁크)을 제거하십시오(그림 5F,G).</li>
	<li>멸균 전달 파이펫을 사용하여 얼음에 멸균 1x PBS를 포함하는 새로운 6cm 페트리 접시에 전체 심실을 옮기고 페트리 접시를 심실로 라벨링합니다. 얼음에 고립 된 SV와 심실을 유지합니다.</li>
	<li>4.1-4.7 단계를 반복하여 나머지 심장에서 SV와 심실을 분리합니다.</li>
</ol>5. 삽입 및 세포 외 매트릭스 코팅으로 조직 배양 플레이트 설정
참고 : 시작하기 전에, 다음과 같은 장비 및 시약을 가지고 있는지 확인 : 상업 적 세포 외 매트릭스 용액 (예를 들어, 마트릴), 8.0 μM 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 배양 삽입, 24 웰 플레이트, 37 ° C, 5 %CO2 인큐베이터.
<ol><li>ECM 용액을 얼음에 해동시키십시오. 굳어지지지 않도록 ECM 용액을 얼음 위에 두십시오.</li>
	<li>PET 멤브레인 배양 인서트(공극 크기 = 8.0 μm, 여과 면적 = 0.3 cm2,필터 직경 = 6.5 mm)를 처리된 비조직 배양물 24개의 웰플레이트에 놓는다. SV 또는 내분부 혈관신생 분석에 대한 SV 또는 심실로 플레이트를 각각 라벨. 참고: 두 배양을 동시에 수행할 때 SV와 심실을 위한 별도의 플레이트에 인서트를 설정합니다. 모든 실험 샘플 및 컨트롤에 충분한 웰을 설정해야 합니다.</li>
	<li>ECM 용액이 해동된 후, 미리 냉각된 기저 매질(즉, EBM-2 기저 매물, 재료 표참조)에서 ECM 1:2를 충분한 부피(100 μL/삽입 x 삽입 수)로 즉시 희석합니다. 참고: 예를 들어, 6개의 인서트가 있는 경우 총 부피는 100 μL x 6 = 600 μL이 됩니다.</li>
	<li>갓 희석된 ECM 100 μL로 인서트를 멤브레인 위에 직접 첨가하여 코팅합니다. ECM이 고화될 수 있도록 플레이트를 37°C에서 30분 이상 배양합니다. 참고 : 이것은 오염을 피하기 위해 층류 조직 배양 후드에서 수행해야합니다.</li>
</ol>6. SV 및 전체 심실 문화
참고 : 시작하기 전에, 다음과 같은 장비와 시약을 가지고 있는지 확인 : 70 % 에탄올, 전송 파이펫, 입체 현미경, 집게, 층류 조직 배양 후드, 미세 혈관 내피 세포 보충 키트(재료의 표),기저 매체, 1x 멸균 PBS). 도 6은 SV 및 심실 배양물의 워크플로우를 나타낸다.
<ol><li>얼음에 보충 키트의 내용을 해동. 인증된 층류 조직 배양 후드 하에 500 mL의 기초 배지에 보충 키트의 모든 내용을 추가하여 완전한 배지를 준비한다. 매체를 잘 섞고 50 mL aliquots로 분배하십시오.</li>
	<li>70% 에탄올로 입체 현미경 및 주변 작업 영역의 베이스를 살균합니다.</li>
	<li>5.4단계에서 조직 배양판을 얻었다. 전사 파이펫의 도움으로, 조심스럽게 삽입 막의 상단에 단계 4.7에서 이식을 전송합니다. 입체 현미경과 깨끗한 집게의 도움으로, 그들은 인서트의 모서리에 붙어 또는 측면 벽에 부착되지 않도록 삽입의 중심에 이식을 배치합니다.</li>
	<li>이식을 배치하고 인서트를 중심으로 한 후 인서트를 조심스럽게 제거하고 플레이트의 뚜껑을 닫습니다.</li>
	<li>층류 조직 배양 후드 하에서, 삽입물의 기저 표면이 매체와 접촉하도록 공기-액체 계면에서 이식하는 배양에 웰에 미리 온화된 완전한 배지의 100 μL및 200 μL을 추가 그러나 상단 표면은 공기에 노출됩니다. 참고: 다른 크기의 인서트를 사용하는 경우 공기-액체 인터페이스를 얻기 위해 볼륨을 조정해야 합니다.</li>
	<li>300 μL의 PBS를 24개의 웰 플레이트의 사용하지 않은 우물에 넣고 뚜껑으로 덮습니다. 플레이트를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 배양하고, 5일 동안 배양을 성장시다.</li>
	<li>다음 날에, 정기적으로 배란 배양의 상태를 평가하기 위해 반전 된 빛 현미경의 밑에 배양을 관찰합니다. 이식이 수축 박동을 나타내고 모든 이식이 ECM에 내장 된 멤브레인의 바닥에 부착되어 있는지 확인하십시오. 부동 이식에 유의하십시오. 참고: 이식의 주기적인 수축은 이식이 살아 있음을 나타냅니다. 부동 이식은 분석에서 생략되어야 합니다.</li>
	<li>배양 상태를 평가한 후, 배양판을 인큐베이터에 다시 넣고 최대 5일 동안 배양을 계속 성장시다.</li>
</ol>7. VEGF-A를 가진 배양의 처리 (긍정적인 통제)
참고 : 시작하기 전에, 다음과 같은 장비와 시약을 가지고 있는지 확인 : 층류 조직 배양 후드, 1x PBS, 기저 매체 + 1 % 태아 소 혈청 (FBS), 기저 매체 + VEGF-A, 파이펫, 파이펫 팁.
<ol><li>기저 배지 + 1% FBS 및 기저 배지 + VEGF-A를 준비한다.<ol>
<li>기저 배지 + 1% FBS를 준비하려면 먼저 필요한 제어 웰의 수를 결정합니다. 예를 들어, 3개의 제어 웰이 있는 경우 300 μL/well x 3 = 900 μL이 필요한 총 부피입니다. 기저 배지 + 1% FBS를 만들기 위해 891 μL의 기저 배지에 FBS 9 μL을 추가합니다.</li>
		<li>기저 배지 + VEGF-A를 준비하려면, 먼저 VEGF-A 배지가 필요한 웰의 총 수를 결정한다. 3개의 웰이 있는 경우, 300 μL/well x 3 = 900 μL은 총 부피이고 50 ng/well x 3 = 150 ng VEGF-A입니다. 기초 배지 + VEGF-A를 만들기 위해 900 μL의 기초 배지에 VEGF-A 150 ng를 첨가합니다. 참고: 각 실험에 대해 충분한 수의 작은 aliquot를 보장하기 위해 계산된 것보다 더 큰 부피로 이 솔루션을 조립합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2일째에는 두 챔버(인서트와 웰)에서 미디어를 제거합니다. 인서트가 100 μL이고 웰에 200 μL을 추가하여 300 μL의 1x PBS로 배양을 세척합니다. 플레이트를 몇 번 단단히 소용돌이시키고 PBS를 제거합니다.</li>
	<li>기저 배지 300 μL + 1% FBS (삽입에 100 μL, 우물에 200 μL)를 추가하여 24 시간 동안 배양을 굶어 넣습니다.</li>
	<li>기아 후 3일째, 기저 배지 300 μL + 1% FBS(삽입부에 100 μL, 우물에 200 μL)를 추가하여 대조군 우물과 기초 배지 + VEGF-A(50 ng/well)를 각각 치료 용정에 넣습니다.</li>
	<li>치료 후, 인큐베이터에서 배양을 계속 성장시다.</li>
</ol>8. 고정 및 면역 염색
참고 : 시작하기 전에, 다음과 같은 장비 및 시약을 가지고 있는지 확인하십시오 : 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA), 1 x PBS, 1 차 및 이차 항체, 셰이커, PBS (PBT)에서 0.5 % 난외 계면 활성제.
<ol><li>배양 6일째에, 배지를 제거하고 실온(RT)에서 1x PBS로 배양한다.<ol>
<li>4% PFA 용액 200 μL을 웰에 추가하고 100 μL을 인서츠에 추가하여 배양을 고정합니다. 흔들면서 20 분 동안 4 °C에서 배양을 수정하십시오.</li>
		<li>20 분 고정 후, 연기 후드의 배양물에서 PFA를 제거하고 200 μL을 웰에 추가하고 100 μL을 삽입에 추가하여 1x PBS로 배양을 씻습니다.</li>
		<li>흔들면서 각각 3회, 10분씩 반복해서 바하십시오. 그런 다음 면역 염색을 수행하십시오. 참고: 모든 세척 단계는 RT의 벤치탑에서 수행됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>차단 용액에서 1 차 항체 (항 VE-Cadherin, 항 ERG 1/2/3)를 희석합니다 (5 % 당나귀 혈청, 0.5 % PBT). 1차 항체 용액 300 μL을 추가합니다(하단 우물에 200 μL, 인서츠에 100 μL). 흔들면서 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항체에서 배양배양한다. 참고: 항-VE-카데린 내피 세포막에 라벨을 붙이는 데 사용되며, 내피 세포의 혈관신생 콩나물을 시각화하기 위해 내피 세포 핵에 라벨을 붙이는 데 사용됩니다.</li>
	<li>다음날, 0.5% PBT로 배양판을 10배 세척하고 흔들어 10분마다 PBT를 변경한다.</li>
	<li>차단 용액에서 이차 항체(당나귀 항래성 알렉사 플루어 488 및 당나귀 항토끼 알렉사 플루르 555)를 희석한다. 8.2단계에서와 같이 이차 항체의 300 μL을 추가하고 흔들면서 4°C에서 밤새 배양하였다. 다음날, PBT에서 이차 항체를 10배 세척하고, 10분마다 PBT를 변화시다. 참고 : 최소 10 배의 세척을하지만 더 많은 세척이 더 좋습니다. 세스가 완료되면 배양은 슬라이드에 장착될 때까지 1x PBS로 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>9. 슬라이드, 이미징 및 분석에 문화 를 장착
참고 : 시작하기 전에, 다음과 같은 장비와 시약을 가지고 있는지 확인: 미세 집게, 슬라이드, 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 커버 립, 및 공초점 현미경장착 매체. 이차 항체 염색 후, 다음 단계를 사용하여 이미징을 위해 배양을 슬라이드에 장착합니다.
<ol><li>미세 한 집게를 사용 하 여 삽입에서 조심스럽게 막을 벗겨 하 고 아래로 막 측면을 배치 하 고 배양 배양 위쪽으로 배치 하 여 슬라이드에 전송. 복제 샘플을 동일한 슬라이드에 배치하고 슬라이드를 컨트롤 또는 VEGF-A로 레이블을 지정합니다. DAPI를 사용하여 몇 방울의 장착 매체를 멤브레인에 직접 떨어뜨리고 커버 슬립으로 슬라이드를 덮습니다. 참고: 커버슬립을 배치하는 동안 기포를 피하십시오.</li>
	<li>명확한 매니큐어로 슬라이드의 가장자리를 밀봉하고 건조시키십시오. 참고: 슬라이드는 장기 보관을 위해 -20 °C에 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>공초점 현미경을 사용하여 이미지 슬라이드.</li>
	<li>분석을 수행하여 혈관신생 성장의 길이를 측정합니다. 내피 세포의 거리를 측정하여 혈관 신생 자성장 길이를 정량화 (Ve-Cadherin +/ERG 1/2/3+) 심실 배양에서 ERG의 내부 경계에서 확장 및 SV 배양에서 SV 이식의 중심에서.<ol>
<li>피지 / ImageJ를 사용하여 정량화를 수행하려면 먼저 FIJI 소프트웨어를 다운로드하십시오.</li>
		<li>FIJI에서 이미지 파일 열기: 파일 | 오픈 | 폴더 | 파일 이름 | 을 엽니다.</li>
		<li>분석으로 이동 | 측정 설정 | 둘레 를 선택합니다.</li>
		<li>주 창에서 직선 도구를 선택합니다.</li>
		<li>9.4단계에서 제안된 대로 새싹의 길이에 걸쳐 선을 그립니다.</li>
		<li>분석으로 이동 | 측정. 참고: 길이 측정이 새 창에 표시됩니다.</li>
		<li>무작위로 선택된 시야를 3개 이상 나타내는 이미지에서 정량화를 수행합니다. 새싹 길이 를 평균화± 표준 편차로 보고한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

SV 및 엔도 전구 조직으로부터 관상 동맥 혈관을 성공적으로 성장시키는 가장 중요한 단계 중 일부는 다음과 같습니다: 1) SV 배양을 위한 SV 조직을 올바르게 식별하고 격리하는 단계; 2) 정확한 엔도 배양을 위해 e11-11.5의 나이 사이의 배아로부터의 심실을 사용하는 단계; 3) 해부 기간 내내 멸균 상태를 유지하고 조직을 항상 차갑게 유지; 및 4) 배지에 부동하는 조직을 피하기 위해 ECM 코팅 막에 부착된 이식을 유지한다.
첫째, SV 조직의 격리는 어려울 수 있습니다. SV는 폐 소엽 안에 숨겨진 왼쪽과 오른쪽 심방 사이의 심장의 등쪽 쪽에 놓여 있다는 것을 깨닫는 것이 중요합니다. 따라서 분리 및 분리가 어렵습니다. 대신, 전체 심장 /폐 뽑아 먼저 추출해야합니다. SV는 조심스럽게 폐 소엽을 제거하고 미세 집게의 도움으로 인접한 조직을 청소하여 뽑기에서 분리됩니다. 또한 SV를 잃지 않도록 인접한 조직을 청소하는 동안 매우 주의해야합니다.
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심혼의 혈관은 일반적으로 관상 동맥 혈관에게 불립니다. 이 혈관은 동맥, 정맥 및 모세 혈관으로 구성됩니다. 개발 하는 동안, 높은 분기 모 세 혈관 먼저 설립, 관상 동맥과 정 맥으로 리모델링1,2,3,4,5. 이들 초기 모세혈관은 내피카슘, 부비동(SV) 및 내막부(Endo) 조직1,6,7,8에서발견되는 내피전구 세포로부터 구축된다. SV는 배아 심장의 유입 기관이며 엔도는 심장 루멘의 내벽입니다. SV 및 엔도에서 발견되는 내피 전구 세포는 관상 동맥 혈관구조의 대부분을 구축하는 반면, 프로피카슘은 그것의 상대적으로 작은 부분에기여한다 2. 관상 동맥 혈관의 모세관 네트워크가 기존의 전구체 세포에서 심장에서 성장하는 과정을 관상 동맥 혈관 신생이라고합니다. 관상 동맥 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나이며이 질병에 대한 효과적인 치료법이 부족합니다. 관상 동맥 혈관 신생의 상세한 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 것은 손상된 관상 동맥을 복구하고 재생하는 새롭고 효과적인 치료법을 설계하는 데 유용 할 수 있습니다.
최근에는 관상 동맥 선박이 어떻게 개발되는지에 대한 이해가 급증하면서 새로운 도구와 기술의 개발을 통해 부분적으로 달성되었습니다. 특히, 생체내 계보 라벨링 및 첨단 영상 기술은 관상동맥 혈관의 세포 기원 및 분화 경로를 밝히는 데 매우 유용하여9,10,11,12. 이러한 생체 내 도구의 장점에도 불구하고 속도, 유연성 및 접근성 측면에서 는 한계가 있습니다. 따라서, 견고한 시험관 내 모델 시스템은 생체 내 시스템을 보완하여 관상 동맥 혈관신생의 세포 및 분자 메커니즘을 높은 처리량 방식으로 해명할 수 있다.
여기서, 우리는 관상 동맥 혈관신생의 시험관내 모델을 기술한다. 우리는 두 개의 전구 조직, SV 및 엔도에서 관상 동맥 혈관을 성장하는 시험관 내 배양 시스템을 개발했습니다. 이 모델을 통해, 우리는 시험관 내 조직 배양 배양이 성장 배지에 의해 자극될 때 관상 동맥 혈관 새싹을 성장한다는 것을 보여준다. 추가적으로, 배양 배양은 혈관 내피 성장 인자 A(VEGF-A)에 의해 자극될 때 대조군과 비교하여 급속히 성장하며, 매우 강력한 혈관신생 단백질이다. 더욱이, 우리는 SV 배양으로부터의 혈관신생 싹이 생체내SV 혈관신생과 유사한 기전인 정맥탈분화(COUP-TFII 발현의 손실)를 겪는다는 것을 발견하. 이러한 데이터는 시험관 내 배원 배양 시스템이 생체 내에서 발생하는 혈관신생 사건을 충실하게 회복한다는 것을 시사한다. 집합적으로, 여기에 기술되는 혈관신생의 시험관내 모델은 높은 처리량 및 접근 가능한 방식으로 관상 동맥 혈관신생의 세포 및 분자 기전을 조사하는 데 이상적입니다.

<table><tbody><tr><td>100 x 20 MM 조직 배양 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>877222</td><td>프로토콜에서 페트리 접시</td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td>로 언급됨 <td>Fisher Scientific</td><td>08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>8.0 uM PET 멤브레인 배양 인서트</td><td>Millipore Sigma</td><td>MCEP24H48</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555</td><td>Fisher Scientific</td><td>A31572</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-rat 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>각진 금속 프로브</td><td>미세 과학 도구</td><td>10088-15</td><td>각도 45도, 딥 플러그 감지에 사용</td></tr><tr><td>Anti-ERG 1/2/3 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab92513</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Anti-VE-Cadherin 항체</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB550548</td><td>1차 항체, 제조업체 BD BioSciences</td></tr><tr><td>CO2 가스 탱크</td><td>다양한 공급업체</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>13998223</td><td>For 37 &deg; C, 5% CO2 배양</td></tr><tr><td>해부 입체마이크로솜</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>Leica S9i 실체현미경</td></tr><tr><td>EBM-2 기저 매체</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>내피 세포 성장 기저 매체</td></tr><tr><td>ECM 솔루션</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>상업적으로 알려진 Matrigel</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td>미세혈관 내피 세포 보충제 키트; 이것은 EBM-2에 혼합되어 EGM-2 완전한 매체</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003IR</td><td></td></tr><tr><td>FiJi</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>이미지 처리 소프트웨어 (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td></tr><tr><td>Fine</td><td>Forceps Fine science tools</td><td>11412-11</td><td>배아에 사용됩니다. 해부</td></tr><tr><td>Fisherbrand 스트레이트 블레이드 작동 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-808-4</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH-302-5601LR</td><td></td></tr><tr><td>층류 조직 배양 후드</td><td>Fisher Scientific</td><td>다양한 모델 사용 가능</td><td></td></tr><tr><td>DAPI가 있는</td> <td>Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td> Vectashield 장착</tr><tr><td>파라포름알데히드 (PFA)</td><td>전자 현미경/피셔</td><td>50-980-494</td><td>이것은 32%에서 사용할 수 있습니다; 4%로 희석해야</td></tr> 합니다.<tr><td>천공된 스푼</td><td>미세 과학 도구</td><td>10370-18</td><td>용액에서 배아/조직을 제거하는 데 유용</td></tr><tr><td>재조합 쥐 VEGF-A 165</td><td>PeproTech</td><td>450-32</td><td></td></tr><tr><td>표준 집게, Dumont #5</td><td>미세 과학 도구</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Sure-Seal 마우스/쥐 챔버</td><td>Easysysteminc</td><td>EZ-1785</td><td>안락사 챔버</td></tr></tbody></table>

관상 동맥 혈관 신생의 체외 모델

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

여기서, 우리는 관상 동맥 혈관신생을 연구하기 위한 시험관 내 배양 분석방법을 기술한다. 관상 동맥 혈관은 심장 근육을 공급하고 임상적으로 중요합니다. 이 혈관에 있는 결점은 환자에 있는 심근 경색 그리고 심부전으로 이끌어 낼 수 있는 동맥 경화증과 같은 가혹한 건강 리스크를 나타냅니다. 따라서 관상 동맥 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 그것의 임상 중요성에도 불구 하 고, 상대적으로 작은 진전 손상 된 관상 동맥을 재생 하는 방법에 만들어졌다. 그럼에도 불구하고, 최근 관상동맥 혈관 발달의 세포 기원 및 분화 경로를 이해하는 데 진전이 이루어지고 있다. 연구원이 형광성으로 선조 세포에 라벨을 붙이고, 그들의 운명을 따르고, 생체 내에서 자손을 시각화 할 수있는 도구와 기술의 출현은 관상 동맥 혈관 발달을 이해하는 데 중요한 역할을했습니다. 생체 내 연구는 가치가 있지만 실험 설계의 속도, 접근성 및 유연성 측면에서 한계가 있습니다. 양자택일로, 관상 동맥 혈관 신생의 정확한 시험관 내 모형은 이 한계를 우회하고 연구원이 속도와 융통성 있는 중요한 생물학 질문을 심문하는 것을 허용할 수 있습니다. 적절한 시험관 내 모델 시스템의 부족은 관상 동맥 혈관 성장의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 진행을 방해 할 수있다. 여기서, 우리는 많은 관상 동맥이 발생하는 부비동(SV) 및 심내막(Endo)으로부터 관상동맥 혈관을 성장시키는 체외 배양 시스템을 설명한다. 우리는 또한 문화가 정확하게 생체 내 메커니즘의 일부를 재현 것을 확인했다. 예를 들어, 우리는 SV다운조절 COUP-TFII 발현으로부터의 배양물에서 혈관신생 콩싹이 생체내에서 관찰되는 것과 유사하다는 것을 보여준다. 또한 생체 내에서 잘 알려진 혈관 신생 인자 인 VEGF-A가 SV 및 엔도 문화 모두에서 혈관 신생을 강력하게 자극한다는 것을 보여줍니다. 종합적으로, 우리는 관상 동맥 혈관 신생을 공부하기 위하여 시험관 내 배양 모형을 고안했습니다.

생체 내에서 SV 혈관신생의 가장 눈에 띄는 특징 중 하나는 특정 경로를 따르고 고정관상 정적인 시간 및 위치1에서발생하는 세포 탈분화 및 재분화 이벤트를 수반한다는 것이다. 초기 SV 세포가 심실로 성장함에 따라 COUP-TFII(그림 7)와같은 정맥 마커 생성을 중단합니다. 그 후, 관상 동맥 새싹은 심근 의 표면 또는 심근 깊은 두 개의 이동 경로를 합니다. 표면 혈관은 결국 혈관을 침입하는 동안 정맥이된다 동맥과 모세혈관이된다 1,6,7. 이 구별은 심혼이 증가하고 관상 동맥 이 확장될 때 보존됩니다.
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관상 동맥 혈관신생의 시험관내 모델은 관상 동맥 혈관신생의 세포 및 분자 기전의 발견을 위해 이용될 수 있다. 부비동 및 심내막 조직의 체외 배원 배양은 VEGF-A에 반응하여 견고한 성장을 나타내고 생체 내에서와 같이 COUP-TFII 발현의 유사한 패턴을 표시한다.

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

우리의 프로토콜은 연구원이 유기체 의 외부 관상 동맥 혈관 신생의 분자 메커니즘을 조사 할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 관상 동맥 혈관 신생 의 메커니즘의 연구를 용이하게, 유기체 내부 관상 동맥 혈관 신생의 과정을 정확하게 모델링한다는 것입니다. 먼저 배아의 날 11.5배의 배아를 70%로 운반하는 임신한 마우스를 살포하여 시작합니다.집게로 배 위로 피부를 들어 올리고, 가위를 사용하여 복부 피부와 복막 절개를 횡격막까지 앞쪽으로 만들어 자궁 경적을 노출시합니다. 자궁을 잡고, 조직을 자유롭게 자르고 자궁 경적을 꺼냅니다. 배아의 끈을 스테레오 현미경으로 얼음 차가운 멸균 PBS에 넣고 각 배아에서 자궁 근육, 노른자 낭 및 양막 덮개를 벗깁니다.각 배아가 고립되면 천공 숟가락을 사용하여 조직을 얼음에 멸균 PBS가 함유된 새로운 페트리 접시로 옮기습니다. 배아 심장 조직을 수확하기 위해, 현미경의 밑에 새로운 Petri 접시로 해부되는 첫번째 태아를 전송하고, 복부 측에 태아를 놓습니다. 미세 한 집게를 사용하여 가슴에 작은 절개를 하고 다이어프램 위에 약간 부착하고 닫힌 포셉을 절개에 삽입하여 절개를 확대합니다.집게를 사용하여 가슴 벽을 열어 심장과 폐를 노출시키고, 두 번째 한 쌍의 집게를 사용하여 심장을 앞쪽으로 90도 움직여 등쪽 대오르타와 정맥을 노출시합니다. 그런 다음, 심장의 기지에서이 혈관을 잡고, 조심스럽게 심장과 폐를 앞쪽으로 끌어 내어 차가운 PBS로 조직을 헹구는다. 모든 심장 조직이 수확되면 심장 샘플을 현미경 아래에 놓고 각 심장에서 폐 엽을 제거하십시오.등쪽 의 첫 번째 심장을 방향을 지정하고, 심장을 바닥에 잡고, 심장에서 SV를 둘러싼 인접한 조직에서 왼쪽과 오른쪽 아리아를 긁어 미세 한 집게를 사용합니다. SV를 분리하려면 심장 등쪽을 위로 향하게 합니다. 조심스럽게 심혼에서 SV를 제거하고 멸균 전달 파이펫을 사용하여 격리 된 조직을 얼음에 차가운 멸균 PBS가 함유 된 새로운 6 센티미터 페트리 접시에 넣습니다.전체 심실을 분리하려면 유출관을 제거하고 새로운 멸균 이송 파이펫을 사용하여 얼음 에 얼음 냉멸 균 PBS가 들어있는 별도의 6센티미터 페트리 접시에 심실을 배치합니다. SV와 전체 심실 배양을 설정하려면 먼저 24개의 웰 배양 판당 8마이크로미터 모공 PET 배양 삽입물의 멤브레인을 코팅하고, 문화당 100마이크로리터가 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양당 100마이크로리터를 넣습니다. 매트릭스가 고화되면, 전송 파이펫을 사용하여 각 삽입에 각 각 파기를 전송하고 현미경으로 플레이트를 이동합니다.깨끗한 집게를 사용하여 각 삽입의 중앙에 이클을 배치하여 측면 벽에 부착되지 않았는지 확인하고 추가 PBS를 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 라미나르 유동 조직 배양 후드 하에서 뚜껑을 닫은 채 플레이트를 옮기고, 각 삽입에 미리 따뜻워진 완전 배지 100마이크로리터와 각 삽입물 아래에 200마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 사용되지 않는 우물에 PBS 300 마이크로리터를 추가하고 5 일 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 넣습니다.문화의 둘째 날에 VEGF-A 치료의 경우, 각 배양의 양 챔버에서 배지를 제거하고 각 삽입에 PBS의 100 마이크로 리터를 추가하고, 각 우물에 PBS의 마이크로 리터 200 마이크로 리터를 추가합니다. 플레이트를 몇 번 소용돌이치고, PBS를 1%의 태아 소 세럼으로 보충한 기저 배지 300마이크로리터로 교체하여 배양을 시작하고 접시를 인큐베이터로 되돌리십시오. 기아 후 3일째에는 VEGF-A밀리리터당 50나노그램을 대조유우물및 기초배지에 신선한 기저형 배지 플러스 세럼 300마이크로리터를 첨가하고, 플레이트를 세포 배양 배양기로 반납한다.문화의 여섯 번째 날에는 PBS로 챔버를 세척하고 각 우물에 4 %의 파라 포름 알데히드의 200 마이크로 리터와 각 삽입에 고정 100 마이크로 리터로 문화를 수정합니다. 섭씨 4도에서 20분 후, 실온에서 흔들리며 세척당 10분 동안 PBS 300 마이크로리터로 배양을 씻으실 수 있습니다. 마지막 세척 후, 우물에 1 차 적인 항체 용액의 300 마이크로 리터를 추가하고 흔들로 섭씨 4도에서 하룻밤 문화를 삽입합니다.다음날 아침, PBS의 비이온 계면활성제에서 10회 세척하여 10분마다 세척용액을 변경한 후 적절한 플루오로퍼리 공주 2차 항체300마이크로리터로 10분마다 흔들고 있다. 다음 날, 시연된 바와 같이 비이온 계면활성제로 신선한 PBS로 문화를 10회 세척합니다. 마지막 세척 후, 미세 한 집게를 사용하여 각 삽입에서 멤브레인을 조심스럽게 껍질을 벗기고 멤브레인을 개별 유리 현미경 슬라이드에 놓고 옆으로 식히십시오.뚜껑 슬립에 DAPI 보충 장착 매체로 샘플을 덮고 뚜껑 전표의 가장자리를 명확한 매니큐어로 밀봉합니다. 매니큐어가 건조되면 공초점 현미경 검사법에 의해 슬라이드를 이미지합니다. 초기 SV 세포가 심장 심실로 성장함에 따라 Coup-TF2와 같은 정맥 마커 생성을 중단합니다.배양 5일 후, SV 내피 세포가 싹트고 막으로 이동합니다. 배아 심혼에서와 같이, 혈관이 SV에서 멀리 이동함에 따라 Coup-TF2 발현이 감소된다. VEGF-A로 자극 하는 배양 밀도 와 길이 모두에서 혈관 형성 콩나물의 증가 성장을 전시. VEGF-A에 의해 자극된 추가 SV 배양은 대조군에 비해 새싹 길이가 거의 3배 증가하는 것을 보여주며, 이는 SV와 내피칸티움의 내피 새싹이 VEGF-A에 반응한다는 것을 시사한다.심장과 폐를 꺼내고, 아리아를 제거하고, SV를 둘러싼 인접 조직을 청소하면서 SV 조직을 잃지 않는 것이 중요합니다. 살아있는 화상 진찰 실험은 관상 동맥 혈관 신생을 시각화하고 프로세스 도중 세포 및 분자 역학의 세부 사항을 포착하기 위하여 수행될 수 있습니다. 이 기술은 관상 동맥 혈관 신생의 잠재적인 분자 메커니즘을 평가하고 일반적으로 혈관 신생을 연구하기위한 모델 시스템으로 매우 유용합니다.

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