Name: 인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 배우세요 인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화 방법을. 고밀도 단세포 배양 시스템으로 신경 전구세포로의 분화를 연구하고 약물 스크리닝 및 재생의학에 활용할 수 있습니다.

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우리는 FACS 분석에 도움을 준 칼 D. 보트너 박사 (NIEHS)에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 환경 보건 과학 연구소의 교내 연구 프로그램, 건강의 국립 연구소, AMJ에 Z01-ES-101585에 의해 지원되었다.

1. hESC 자격을 갖춘 지하 멤브레인 매트릭스 코팅 플레이트 준비
<ol><li>hESC 자격을 갖춘 지하 멤브레인 매트릭스(재료 표참조)를 적어도 2-3시간 동안 4°C에서 천천히 해동하여 겔형성을 피합니다.</li>
	<li>지하 멤브레인 매트릭스 코팅 플레이트를 준비하려면 차가운 DMEM/F12에서 매트릭스를 2% 최종 농도로 희석하십시오. 잘 혼합하고 희석 매트릭스 용액의 1 mL와 6 웰 플레이트의 각 우물을 코팅합니다.</li>
	<li>지하 멤브레인 매트릭스 코팅 플레이트를 실온(RT)에서 적어도 3시간 또는 4°C에서 밤새 배양한다. 참고: 지하 멤브레인 매트릭스가 있는 플레이트는 매트릭스 용액을 제거하고 플레이트를 사용하기 전에 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 단세포 hESC 배양에 콜로니 형 hESCs의 적응
<ol><li>지하 막 매트릭스에서 자란 식민지형 H9(WA09) hESCs의 피더 프리 배양액을 통과하기 위해, 웰로부터 배지를 흡인(도1A)9.</li>
	<li>DPBS 1mL로 1x를 씻으소서. 웰당 1 mL의 디스파스 용액 (1 U / mL)을 추가하고 20 분 동안 37 °C에서 배양하십시오.</li>
	<li>디스파스를 제거하고, DMEM/F12 2 mL로 세포를 1x 부드럽게 씻고, 배지를 제거하고, 각 접시에 2 mL의 DMEM/F12를 추가합니다.</li>
	<li>콜로니를 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 15mL 튜브로 옮겨가십시오.</li>
	<li>펠릿을 370 x g에서 2분 동안 원심분리하고 배지를 흡인한다.</li>
	<li>세포 펠릿을 단일 세포로 해리하려면 2 mL의 세포 분리 용액 (1x 농도, 재료 표참조)을 추가하고 37 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>370 x g에서 2 분 동안 원심 분리 세포를 제거하고 분리 용액을 제거하십시오.</li>
	<li>신선한 mTeSR1 인간 ESC 배지를 추가하고 상하로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 단일 세포로 해리시면 됩니다.</li>
	<li>단일 세포 형 배양에 콜로니 형 hESCs를 적응시키기 위해, 24 시간 동안 10 μM ROCK 억제제가 함유된 mTeSR1의 2 mTeSR1에서 각 웰-코팅된 6개의 웰 플레이트에 약 1.5-2.0 x 10hESCs를 플레이트(도1A).</li>
	<li>24시간 후, HESC 배지를 ROCK 억제제 없이 신선한 mTeSR1로 교체하고 hESC가 3일 동안 단일 세포 유형으로 성장하도록 한다. 매일 매체를 변경합니다.</li>
	<li>4일째에, 배양이 거의 100% 수렴에 도달할 때, 분리 용액에서 세포를 해리한 다음 단계 2.6에 설명된 대로 재플레이트합니다. 참고: ROCK 억제제는 단세포 형 hESC 배양의 초기 24시간 동안 세포 생존을 향상시킨다.</li>
</ol>3. 배아 체 형성 및 세 가지 세균 층으로 분화(그림 2)
<ol><li>EB를 형성하기 위해, 먼저 처음 24시간 동안 10 μM ROCK 억제제와 함께 mTeSR1 배지의 3 mL에서 세포를 재중단한 다음, 37°C 인큐베이터에서 60 mm 낮은 부착 접시로 밤새 배양하여 응집을 허용한다.</li>
	<li>24 시간 후, 작은 EB는 15 mL 튜브로 전송됩니다. EB가 튜브의 바닥에 정착하자 부드럽게 파이펫으로 매체를 제거합니다. EB 배지로 EB를 옮기십시오 (20% 녹아웃 혈청 대체품, 1x 글루타민 보충제 [재료 표참조], 1% NEAA [비필수 아미노산; 재료 표참조], 0.2% β-메르카페탄올)로 옮기고 7일 동안 낮은 부착 접시에서 확장할 수 있습니다. 상기 배지는 상술한 바와 같이 격일로 변경될 수있다(도 2A).</li>
	<li>7일째에는 요리에서 EB를 모아 15mL 튜브로 옮김을 옮김을 넣습니다. 파이펫으로 배지를 부드럽게 제거하고 EB를 지하 멤브레인 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트로 옮김을 옮김.</li>
	<li>EB 배지에서 12일 동안 EB를 플레이트에 부착하고 배양하도록 허용하고, 그 동안 3개의 세균 층으로 분화한다(도2B). 격일로 매체를 변경합니다. 참고: 셀을 집계하는 동안 부착이 낮은 접시는 EB 부착을 방지하는 데 도움이 됩니다.</li>
</ol>4. 단세포 형 hESCs를 NPC로 의 분화(그림 3)
<ol><li>NPC 분화를 유도하기 위해, 1 mL의 분리 용액 (1x)으로 단세포 형 hCS를 해리하고 37 °C에서 10 분 동안 배양합니다.</li>
	<li>세포를 370 x g에서 2분 동안 원심분리하고 상상으로 분리하여 제거한다. DMEM/F12 1mL를 추가하고 부드러운 파이펫팅으로 셀을 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>10 μM ROCK 억제제함유 mTeSR1의 2 mL에서 2 x 105 세포의 밀도에서 6 개의 웰 플레이트를 지하 막 매트릭스 코팅하였다.</li>
	<li>24시간 후, 배양 배지를 신경 유도 배지(DMEM와 1% B27 에서 비타민 A를 뺀 것)로 1 μM 도르소모르핀과 5 μM SB431542로 보충하였다.</li>
	<li>신경 유도의 처음 4 일 동안 격일로 배지를 변경한 다음 7 일째에 합류에 도달 할 때까지 매일(그림 3B). 참고: (1) 도르소모르핀은 ALK2,3,6 수용체를 표적으로 하여 BMP 경로를 억제하고 또한 AMPK를 억제한다; SB431542는 ALK5,7을 표적화함으로써 TGFβ/액티빈 경로의 억제제이다. (2) 동일한 프로토콜을 다른 ESC 라인(WA01)으로 테스트하여 WA0916과유사한 결과를 산출했습니다. (3) 우리는 일반적으로 지하 막 매트릭스에 대한 Matrigel을 사용했다; 그러나, 세포는 겔트렉스에서 배양되고 여러 NPC 마커의 발현에 의해 지시된 바와 같이 매우 유사한 결과를 가진 NPC로 분화될 수있다(도 4D,E). 마트릴과 동일한 방식으로 겔트렉스를 처리합니다(섹션 1 참조).</li>
</ol>5. NPC 확장 및 냉동 보존
<ol><li>신경 유도 7일 후, 1 mL의 분리 용액(1x)으로 세포를 해리시키고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>세포를 370 x g에서 2분 동안 원심분리하고 상상으로 분리하여 제거한다. NPC 팽창 매체 1mL를 추가하고(재료 표참조) 부드러운 파이펫팅으로 셀을 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>플레이트 1 x 105 세포 의 2 mL의 NPC 팽창 배지에 지하 막 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트.</li>
	<li>문화가 거의 90 %의 동률에 도달 할 때 통로 NPC는 필요에 따라 여러 번. 처음 3-4대항 동안, 세포 사멸을 방지하기 위해 초기 24시간 동안 10 μM ROCK 억제제추가. 이러한 대구 후, 세포는 ROCK 억제제 없이 배양및 배양될 수 있다. 확장 기간 동안 격일로 미디어를 변경합니다.</li>
	<li>문화가 합의에 도달할 때 NPC를 냉동 보존합니다.<ol>
<li>동결 보존을 위해, 37°C에서 5분 동안 1 mL의 분리 용액(1x)에서 세포를 해리한 다음, 370 x g에서 2분 동안 원심분리 서스펜션을 제거하여 분리 용액을 제거한다.</li>
		<li>1 x 10 6 셀/mL에서 NPC를 해리하고 1 mL aliquots를 극저온에 분배하기 위해 셀 동결 용액(재료 표참조)을 추가합니다.</li>
		<li>냉동 용기에 cryovials를 놓고 -80 °C 냉동실에 밤새 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>액체 질소에 저온 을 저장합니다.</li>
</ol>6. 폴리 L-오르니틴 (PLO) 및 라미닌 코팅 플레이트의 준비
<ol><li>PLO/라미닌 코팅 플레이트를 준비하려면 PLO 스톡 용액을 PBS 또는 물로 10 μg/mL의 최종 농도로 희석합니다. 잘 섞어서 6개의 웰 플레이트를 1 mL의 희석된 PLO 용액으로 코팅합니다.</li>
	<li>37°C에서 2시간 이상 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양한다.</li>
	<li>PBS로 잘 씻으시다.</li>
	<li>10 μg /mL에서 차가운 PBS 또는 물에 라미닌 스톡 용액을 희석하십시오. 라미닌 용액을 잘 섞는다. PBS를 제거하고 즉시 라미닌 용액의 1 mL로 각 잘 코팅. 플레이트를 4°C로 유지하고 1주일 이내에 사용하십시오. PBS로 세척하고 즉시 배양 매체를 추가합니다. 참고 : PLO / 라미닌 코팅 플레이트가 마르지 않도록하십시오.</li>
</ol>7. hESC 유래 NPC를 도파민성 뉴런으로 분화(그림 6A)
<ol><li>약 50 %의 밀도로 NPC 팽창 매체에서 PLO / 라미닌 코팅 접시의 플레이트 NPC.</li>
	<li>24시간 후, 배지를 DA1 배지(2 mM 글루타민 보충제, 1x NEAA, 1x B27, 200 ng/mL SHH 및 100 ng/mL FGF8를 함유하는 신경기분저 배지)로 변경하고 격일로 배지를 변경합니다.</li>
	<li>그들은 합류에 도달 할 때 통로 문화. 분리 액(1x)의 1 mL로 세포를 해리하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>세포를 370 x g에서 2분 동안 원심분리하고 상상으로 분리하여 제거한다. DA1 배지 1mL를 추가하고 부드러운 파이펫팅으로 셀을 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>PLATE 1 x 105 세포를 PLO/라미닌 코팅 6웰 플레이트에 DA1 배지의 2 mL에.</li>
	<li>10일 후, DA2 배지로 변경(2 mM 글루타민 보충제, 1x NEAA, 1x B27, 200 μM 아스코르브산, 20 ng/mL BDNF, 및 20 ng/mL GNDF)을 매일 추가로 20일 동안 배지를 변경한다(그림6A). 참고: DA2 배지에 매일 신선한 아스코르브산을 첨가하세요. 처음 14 일 안에, 분화한 세포는 90% confluency에 도달할 때 통과되어야 합니다, 그러나 그 후에 더 이상.</li>
</ol>8. ESC에서 파생된 NPC를 성상세포로 분화
<ol><li>약 50 %의 밀도로 NPC 팽창 배지에서 PLO / 라미닌 코팅 플레이트상의 플레이트 신경 전구 세포.</li>
	<li>24시간 후, 배지를 성상 세포 배지(DMEM/F12 배지 1:100 N2, 1:100 B27, 200 ng/mL IGF, 10 ng/mL 액티빈 A, 10 ng/mL 이저린 β-1, 및 8 ng/mL bFGF)로 변경하고 격일로 배지를 변경한다.</li>
	<li>그들은 합류에 도달 할 때 통로 문화. 분리 액(1x)의 1 mL로 세포를 해리하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>세포를 370 x g에서 2분 동안 원심분리하고 상상으로 분리하여 제거한다. 성상 세포 배지 1 mL를 추가하고 부드러운 파이펫팅으로 세포를 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>PLATE 1 x 105 세포를 PLO/라미닌 코팅 6웰 접시에 성상 세포 배지 2 mL에 놓습니다.</li>
	<li>총 5-6주 동안 분화를 계속할 수있습니다(그림 6B).</li>
</ol>9. 면역형광 염색
<ol><li>각 세포 유형에 대해 전술한 바와 같이 35 mm μ-dish에서 배양 세포. 배지를 흡인하고 접시 당 4 % PFA 용액 의 1 mL을 추가하고 RT에서 20 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>PBS로 5분 동안 2x를 씻으소서. 참고 : 세포가 고정되면 분석 판을 파라 필름으로 밀봉하고 4 °C에서 보관 할 수 있습니다. 고정 후 1 주 이내에 항체로 얼룩을 지습니다.</li>
	<li>접시당 차단 용액(PBS의 염소 또는 당나귀 혈청)을 300 μL 추가하고 RT에서 30-60분 동안 배양합니다.</li>
	<li>5 분 동안 PBS로 접시2x를 씻으소서.</li>
	<li>1차항체(표 1)용액(차단 용액에서 희석)의 300 μL을 넣고 RT에서 1.5시간 또는 4°C에서 밤새 배양합니다.</li>
	<li>10 분 동안 PBS로 2 x를 씻으소서.</li>
	<li>300 μL의 형광-컨쥬게이션 이차항체(표 1)를차단 용액에 넣고 RT에서 1시간 동안 어둠 속에서 배양한다.</li>
	<li>PBS로 세포를 2x 10 분 동안 씻으소서.</li>
	<li>Hoechst 염색 용액 (PBS에서 1 μM 최종 농도)을 추가하여 핵을 염색합니다. RT에서 5 분 동안 어둠 속에서 세포를 배양하십시오.</li>
	<li>세포를 5분 동안 PBS로 1x 세척한 다음 500 μL의 PBS를 추가합니다. 접시를 어둠 속에서 유지한 다음 공초점 현미경으로 형광을 관찰합니다(그림 2B, 그림 5C, 그림 6A및 그림 7B).</li>
</ol>

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<li>Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+FGF2+and+BMP+controls+the+self-renewal%2C+dormancy+and+differentiation+of+rat+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).</li>
<li>Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+that+induces+human+embryonic+stem+cells+to+differentiate+into+neural+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro.</a> Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).</li>
<li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Activin%2FNodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

다양한 계보로 hESCs를 분화하고 충분한 수의 분화 세포를 생성하기 위한 확장 가능하고 효율적인 방법은 약물 스크리닝 및 줄기 세포 치료에 중요한 기준입니다. 다양한 단세포 통과 방법이 발표되었으며, 이 때 세포는 생존을 향상시키기 위해 ROCK 억제제 또는 다른 소분자의 존재에서 배양되지만, 이들 배양 방법의 최종 제품은 콜로니 형 hESCs17,18,19,20, 21이다. 이전에 발표된 방법19,20,21,22에</su...

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 3 개의 1 차적인 세균 층으로 분화하는 잠재력을 가지고, 그 때 각종 다능성 전구 세포 계보로 분화합니다. 이 혈통은 이후에 인체에 있는 모든 세포 모형을 초래합니다. 시험관 내 hESC 배양 시스템은 인간 배아 발달을 연구하는 능력을 변화시켰으며 이러한 과정이 생물학적 및 분자 수준에서 어떻게 조절되는지에 대한 새로운 통찰력을 얻기위한 귀중한 도구로 사용되었습니다. 유사하게, 인간 환자에서 분리된 체세포 를 재프로그래밍해서 생성된 유도된 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 연구 결과는 각종 질병에 새로운 통찰력을 제공합니다. 또한, hESCs로부터 유래된 전구 및 분화 세포는 줄기세포 치료 및 약물스크리닝1,2,3,4와관련된 연구에 유용할 수 있다.
hESCs는 광범위한 자기 갱신 능력을 가진 다중 전위 세포인 신경 전구 세포 (NPC)로 분화하도록 유도될 수 있습니다. 이어서, 이들 세포는 뉴런, 성상세포 및 올리고엔드로시트5,6으로분화될 수 있다. NPC는 또한 신경 발달 생물학 및 각종 신경 질병의 시험관 내 연구를 위한 세포 시스템을 제안합니다. 그러나, 현재 의 식민지 형 배양 방법은 HCS와 NPC로의 분화를 수반하며 종종 배아체(EB) 및 로제트 형성5,7,8,9뿐만아니라 공동배양을 수반한다. 이 프로토콜은 더 낮은 생존율 및 자발적인 분화를 전시하고 더 많은 시간 소모적입니다.
여기서 제시된 개선되고 견고한 배양 시스템은 쉽게 확장 가능하고 hESCs10의고밀도 단세포 형 배양을 사용한다. 로키나아제(ROCK) 억제제의 포함은hESC10,11,12,13,14의단일 세포 형 배양 동안 생존 효율을 현저히 향상시킨에 기여했다. 이러한 문화 시스템에서 는 hESCs를 쉽게 유지 관리하고 확장할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 고도로 순수한 NPC의 생산을 허용하는 hESCs의 단일 세포 형 배양으로부터 NPC를 생성하는 효율적인 방법을 제시합니다.
요약하자면, hESCs를 이용한 단세포 형 배양 프로토콜은 NPC를 포함한 다양한 계보로 이들 세포의 분화를 연구하는 매력적인 모델을 제공한다. 이 프로토콜은 쉽게 확장 가능하기 때문에 재생 요법 및 약물 스크리닝과 관련된 연구를 위한 세포 생성에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>35mm m-접시</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>세포 배양 접시</td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104-500</td><td>세포 분리 솔루션</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D 시스템</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>시그마 알드리치</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제 (-Vit A)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>응용 생물학적 재료</td><td>Z100065</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18C</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>DAMON/ICE</td><td>428-6759</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher</td><td>4110</td><td></td></tr><tr><td>Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Basement membrane matrix (여기 대부분의 프로토콜에 사용됨)</td></tr><tr><td>Cryostor CS 10</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7930</td><td>세포 동결 용액</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Tocris</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-16A</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003HI</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>응용 생물학적 재료</td><td>Z101705</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>응용 생물학적 재료</td><td>Z101057</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex 매트릭스</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1569601</td><td>기저막 매트릭스</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050061</td><td>글루타민 보충제, 100X</td></tr><tr><td>H9 (WA09) 인간 배아 줄기 세포주</td><td>WiCell</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>Heregulin b-1</td><td>Peprotech</td><td>100-3</td><td></td></tr><tr><td>IGF</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 세럼 교체용</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td>hESC 배양 배지</td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502001</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SHH</td><td>응용 생물학적 재료</td><td>Z200617</td><td></td></tr><tr><td>Stemdiff 신경 전구 매체</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5833</td><td>NPC 확장 배지</td></tr></tbody></table>

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 시험관 내 분화는 생물학적 및 분자 수준 모두에서 인간의 발달을 연구하는 능력을 변형시키고 재생 응용 프로그램에 사용하기 위해 세포를 제공했습니다. 콜로니 형 배양을 이용한 hESC 배양에 대한 표준 접근법은 미분화 hESCs 및 배아 체(EB) 및 상이한 세균 층으로의 분화를 위한 로제트 형성을 유지하기 위해 비효율적이고 시간이 많이 소요된다. 여기서 제시된 것은 콜로니형 배양 대신 hESC를 이용한 단일 세포 배양 방법이다. 이 방법을 사용하면 콜로니 형 hESCs에 필적하는 수준에서 hESC 마커의 발현을 포함하여 미분화 hESCs의 특성 특징을 유지 보수 할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 1주일 이내에 NPC를 생산하는 단일 세포 형 hCS로부터 신경 전구 세포(NPC) 생성을 위한 효율적인 방법을 제시한다. 이 세포는 몇몇 NPC 마커 유전자를 높게 표현하고 도파민성 신경세포 및 성상세포를 포함하여 각종 신경 세포 모형으로 분화할 수 있습니다. hESCs를 위한 이 단세포 배양 시스템은 이 프로세스의 분자 기계장치, 특정 질병의 연구 및 약 발견 스크린을 조사하는 데 유용할 것입니다.

여기에 제시된 것은 hESCs의 단일 세포 형 배양및 신경 전구 세포로의 효율적인 분화의 유지 및 확장을 위한 개선된 프로토콜이며, 이는 이어서 다양한 다운스트림 신경 계보로 분화되고, 도파민성 뉴런과 성상 세포를 포함.
대표적인 상 대비 이미지는 단일 세포 형 배양에 대한 콜로니 형 hESCs의 적응 동안 상이한 단계에서 세포 형태를보여준다(도 1A). 단세포 배양 조건을 통해, 적응된 hESCs가 고밀도로 유지될 수 있었고, 그 후 합류에 도달할 때 쉽고 효율적으로 배양할 수 있었다는 것을 알 수있었다(도 1A, B). 이들 세포는 콜로니 형 hESCs의 전형적인 세포 주기 특성(즉, 짧은 G1 상 및 S상에서 세포의 높은 비율)을 유지하였다(도1<stron...

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

인간 배아 줄기 세포는 신경 전구 세포로 분화하고 뉴런 성상세포 및 올리고드엔드로시테로 분화하도록 유도될 수 있다. 그러나, 인간 배아 줄기세포및 신경전구세포로의 분화에 대한 형배양방법은 매우 비효율적이고 생체내 공동배양 시스템에서 개방되어 인간 배아 줄기세포를 이용한 고밀도 단일세포형 배양을 이용하여 용이하게 확장가능한 개선되고 견고한 배양시스템을 제시한다. 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 형 배양은 신경 전구 세포및 후속 분화를 포함한 다양하고 뚜렷한 분화 계보를 따라 다단계 분화를 조절하는 분자 메커니즘을 연구하는 신속하고 효율적인 시스템을 제공합니다.인간 배아 줄기 세포를 준비하여 시작 지하 막 매트릭스 코팅 플레이트. 지하 멤브레인 매트릭스 용액을 섭씨 4도에서 적어도 2~3시간 또는 하룻밤 동안 천천히 해동합니다. 해동하면, 차가운 DMEM/F-12에서 매트릭스를 잘 혼합하고, 6웰 플레이트의 각 웰을 희석용액의 1밀리리터로 코팅합니다.코팅된 플레이트를 실온에서 최소 3시간 또는 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 배양합니다. 지하 막 매트릭스에서 자란 콜로니 타입 H9 인간 배아 줄기 세포의 피더 없는 배양을 통과시키고, 우물에서 배지를 흡인시키고 DPBS의 1밀리리터로 한 번 세척한다. Dispase 용액 1밀리리터를 각 웰에 넣고 20분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.Dispase를 제거하고 DMEM / F-12의 두 밀리리터로 한 번 부드럽게 세포를 씻으십시오. 세척 후, 매체를 제거하고 각 우물에 DMEM / F-12의 두 밀리리터를 추가합니다. 콜로니를 위아래로 부드럽게 분리하여 15 밀리리터 튜브로 옮겨 넣습니다.2 분 동안 370 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다. 매체를 흡인합니다. 그런 다음 세포 분리 용액 의 2 밀리리터를 추가하고 10 분 동안 섭씨 37도에서 배양하여 세포 펠릿을 단일 세포로 분리합니다.원심분리를 반복하고 분리 용액을 제거합니다. mTeSR-1 인간 ESC 배지에서 셀을 부드럽게 위아래로 피펫하여 재연합니다. 콜로니 타입의 인간 배아 줄기세포를 단일 세포형 배양에 적응시키기 위해, 10마이크로몰라 ROCK 억제제함유 mTeSR-1의 2밀리리터로 코팅된 지하막 매트릭스 코팅 플레이트의 각 웰에 약 1.5~200만 개의 세포를 플레이트한다.24시간 후, 락 억제제 없이 배지를 신선한 mTeSR-1로 교체하십시오. 세포가 매일 매체를 변경하는 3 일 동안 단일 세포 유형으로 성장하도록 허용합니다. 4일째에, 분리용액에서 세포를 분리하고 이전에 설명한 대로 다시 플레이트한다.원고 지시에 따라 세포를 다시 중단하고 배양한 후 작은 배아 몸을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 바닥에 정착시키고 파이펫으로 배지를 부드럽게 제거합니다. EB 매체로 옮기고 7일 동안 낮은 부착 요리로 확장할 수 있도록 합니다. 신경 전구 세포 또는 NPC 분화를 유도하기 위해 단일 세포 유형의 인간 배아 줄기 세포를 분리 용액 1 밀리리터로 분리하고 10 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.370배 g에서 2분간 세포를 원심분리합니다. 분리 용액 상수분리를 제거합니다. 그런 다음 DMEM/F-12의 세포를 다시 일시 중단합니다.지하 막 매트릭스에 세포를 플레이트는 10 마이크로 몰라 ROCK 억제제와 mTeSR-1의 2 밀리리터에서 잘 당 두 번 10 의 밀도에서 5 세포의 밀도로 6 웰 플레이트를 코팅. 24시간 후, 배양 배지를 1개의 마이크로몰러 도르소모핀과 5개의 마이크로몰어 SB431542로 보충된 신경 유도 매체로 대체한다. 신경 유도의 처음 4 일 동안 격일로 매체를 변경 한 다음 7 일째에 합류 할 때까지 매일.7일간의 신경 유도 후, 분리 용액 1밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양하여 세포를 분리합니다. 세포를 370배 g로 원심분리하고 분리용액상수체를 제거한다. NPC 확장 매체의 밀리리터 1밀리리터를 넣고 셀을 위아래로 부드럽게 피펫하여 다시 일시 중지합니다.그런 다음 지하 멤브레인 매트릭스에 NPC 팽창 배지의 2 밀리리터에서 잘 당 10에서 다섯 번째 세포에 1회 플레이트6웰 플레이트를 코팅하였다. 배양이 90%에 도달할 때 필요에 따라 세포를 통과하여 처음 3~4개의 통로 동안 10개의 마이크로몰라 ROCK 억제제를 추가합니다. 확장 기간 동안 격일로 매체를 변경합니다.PLO 라미닌 코팅 플레이트를 준비하려면 PBS 또는 물에 있는 PLO 스톡 솔루션을 밀리리터당 10 마이크로그램의 최종 농도로 희석한 다음 잘 섞은 다음 6웰 플레이트의 각 웰을 용액 1밀리리터로 코팅합니다. 접시를 섭씨 37도에서 최소 2시간 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, PBS로 각 우물을 씻고 원고 의 방향에 따라 준비된 라미닌 용액 1 밀리리터로 코트 직후에 잘 씻으실 수 있습니다.최대 1주일 동안 접시를 섭씨 4도까지 유지하십시오. NPC를 도파미너기뉴런으로 분화하기 위해, 24시간 후 약 50%의 밀도로 NPC 팽창 배지에서 PLO 라미닌 코팅 요리의 세포를 플레이트, 배지를 DA1로 변경하고 그 후 매일 배지를 변경한다. 그들은 합류에 도달 할 때 문화를 통과하기 위해, 분리 용액의 1 밀리리터로 세포를 분리하고 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양.그런 다음 원심 분리를 370 배 g로 분리하고 분리 용액 상수 분리를 제거합니다. PLO 라미닌 코팅 6웰 플레이트에 있는 배지의 2밀리리터에서 10번 DA1 배지의 1밀리리터에서 세포를 10번 플레이트로 재연한다. NPC를 성상세포로 분화하기 위해 PLO 라미닌 플레이트 및 NPC 팽창 배지의 세포를 50%의 밀도로 플레이트화하여 24시간 후 성상세포 배지로 배지를 변경하고, 이전에 설명한 바와 같이 세포를 전달한다.콜로니 타입의 인간 배아 줄기세포가 단일 세포형 배양에 적응했을 때, 세포가 고밀도로 유지될 수 있었고, 이어서 수렴에 도달할 때 쉽고 효율적으로 서브배양을 할 수 있었다. 이들 세포는 짧은 G1 상 및 S 상에서 세포의 높은 비율과 같은 식민지 형 인간 배아 줄기 세포의 전형적인 세포 주기 특성을 유지했다. 정량적 PCR 분석은 또한 식민지 형 세포의 것과 비교할 수있는 수준에서 ESC 마커를 표현하는 것을 확인했습니다.더욱이, 단일 세포 인간 배아 줄기 세포는 3개의 세균 층:엔도름, 중피 및 자궁 절제술에서 세포를 포함하는 배아 체를 형성할 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 그 때 는 전형적인 인간 배아 줄기 세포 형태와 NPC 형태의 출현에 의해 표시된 바와 같이 단일 세포 형 인간 배아 줄기 세포가 NPC로 효율적으로 분화되었다는 것을 입증하였다. 분화는 시그니처 NPC 마커의 증가된 발현에 의해 지원되었고 면역염색 및 FACS 분석에 의해 확인되었다.동일한 분석은 또한 SOX1, PAX6 및 NCAM 단백질에 대해 양성으로 염색된 세포의 90% 이상을 보여주었다. 더욱이, 유래된 NPC는 특징적인 형태화의 출현과 계보 특이적 마커의 발현에 의해 나타난 바와 같이 도파민성 뉴런 및 성상세포로 분화할 수 있었다. 이 절차를 시도할 때, 건강하고 미분화된 인간 배아 줄기 세포 배양을 유지하기 위해 인간 배아 줄기 세포를 고밀도로 판화하는 것이 필수적이다.이 프로토콜은 기본 연구, 약물 화면 및 신경 퇴행성 의학의 적용을 위해 확장 가능한 전조 및 분화 세포의 간단하고 견고하며 확장 가능한 생산을위한 플랫폼을 제공합니다.

efficient-neural-differentiation-using-single-cell-culture-human

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

만능 인간 줄기 세포의 neuronal 차별화 (hPSCs)에 대한 프로토콜은 종종 시간이 소요되어 있으며 상당한 세포 배양 기술을 필요로합니다. 여기, 우리는 통제 된 방식으로 인간의 뉴런의 간단 신속하고 효율적인 생성을 허용하는 multititre 판 형식으로 작은 분자 기반의 차별화 절차를 적응하고 있습니다.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

이 비디오는 인간 배아 줄기 세포(hESCs)가 영양 세포나 중간 단계를 사용하지 않고 신경 전구 세포로 직접 분화되는 과정을 보여줍니다. 뼈 형태 유전 단백질(BMP)의 선택적 억제와 성장 인자-베타 또는 TGF-β 신호 전달 경로의 변형은 hESC를 신경 전구 세포(NPC)로 분화시킵니다.

인간 배아 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화

이 비디오는 배아 줄기 세포를 기능하는 시냅스를 가진 뉴런의 네트워크 집단으로 분화하는 기술을 보여줍니다. 배아 줄기 세포가 뉴런으로 분화하고, 뉴런 네트워크 형성을 유도하고, 네트워크 뉴런으로 배양을 풍부하게 하는 단계를 간략하게 설명합니다.

마우스 배아 줄기세포를 네트워크화된 뉴런 집단으로 분화(Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population)

직접 방법 말초 혈 세포로부터 농축 조혈 전구 세포로부터 인간 신경 줄기 세포를 유도하기 위해 개발되었다.

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

분화된 인간 신경 줄기세포(hNSCs)에서 miRNA의 변화를 특성화하기 위한 목적으로 3차원 시스템에서의 hNSC 분화, miRNA PCR 어레이에 의한 microRNA 발현 변화 평가, miRNA 표적 예측을 위한 컴퓨터 분석 및 이중 루시페라제 분석에 의한 검증에 대해 설명합니다.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

이 프로토콜은 무혈청 단층 방법을 사용하여 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 전구 세포는 성숙한 신경 세포 유형을 유도하거나 신경 사양 과정을 연구하는 데 사용할 수 있으며 복합 스크리닝을 위한 멀티웰 형식 확장에 적합합니다.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

우리는 매달려 드롭 방법을 사용하여 신경 세포로 마우스 배아 줄기 세포의 체외 분화에 대한 절차를 설명합니다. 또한 RT-qPCR, 면역형광, RNA-seq 및 유동 세포종을 통해 포괄적인 현상 분석을 수행합니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

본 프로토콜은 높은 반복성과 효율성으로 망막 오가노이드의 접착 및 융합을 감소시키는 최적화된 3D 신경 망막 유도 시스템을 설명합니다.

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

배우세요 인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화 방법을. 고밀도 단세포 배양 시스템으로 신경 전구세포로의 분화를 연구하고 약물 스크리닝 및 재생의학에 활용할 수 있습니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

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