Name: 제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 배우세요 제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학법을 통해 단백질 발현을 관찰하는 방법을. 형광 표지 항체와 공초점 현미경을 활용하여 3차원 단백질 분포를 시각화하고 발달생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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NIH 보조금 8P20GM103436 14.

이 프로토콜에 설명된 제브라피쉬 사육 성인 및 배아와 함께 작업하는 절차는 머레이 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 배아 수집 및 고정
<ol><li>하룻밤 동안 시스템 물로 채워진 메쉬 또는 슬롯 라이너와 탱크에 성인 제브라피쉬 혼합 섹스 쌍 또는 그룹을 배치하여 산란 탱크를 준비합니다.</li>
	<li>불이 켜진 경우, 산란 탱크 물을 변경하여 담수계물을 제거합니다. 오전 9시에 조명이 켜진 14 h/10 h 의 밝은 어두운 주기를 사용하십시오.</li>
	<li>계란이 놓이면 성인을 홈 탱크로 돌려보릅니다.</li>
	<li>이송 파이펫을 사용하여 계란을 끌어 올려 수집하거나 메쉬 스트레이너에 부어.</li>
	<li>계란을 배아 배지(예: 0.5 mg/L 메틸렌 블루의 30% 다니오 또는 E2 배아 배지)로 채워진 페트리 접시에 옮기면 접시당 배아 수가 50개로 제한됩니다.</li>
	<li>죽었거나 분열하지 못한 계란을 제거합니다. 참고: 죽은 배아는 불투명해지고 종종 "흐린" 것처럼 보이기 때문에 쉽게 식별할 수 있습니다. 메틸렌 블루가 배아 배지에 첨가되면 죽은 배아는 진한 파란색 모양을 취합니다.</li>
	<li>원하는 단계에 도달할 때까지 28.5 °C에서 계란의 접시를 배양합니다. 이 실험을 위해, 배아를 23 hpf까지 올린다.</li>
	<li>선택적) 배아를 24 hpf에서 200 μM으로 200 μM으로 옮기고 1-페닐 2-티우레아(PTU)를 배아 배지에서 옮기면 멜라닌 발생을방지16,17. 대안적으로, 표백제 배아 후 고정(선택적 섹션 5 참조).</li>
	<li>매일 배아 배지 또는 PTU 배지를 변경하십시오.</li>
	<li>입체 현미경으로 초미세 팁 집게를 사용하여 해치되지 않은 배아를 초초리오네이트. 대안적으로, 화학적으로 배아를 실온에서 몇 분 동안 배아 배지에서 1 mg/mL Pronase로 배양하여 배아를 배양한다. Pronase에서 배아를 제거하고 배아 배지로 세 번 씻으하십시오.</li>
	<li>디코리오네이트 배아는 플라스틱에 달라붙을 것입니다. 배아 배지에 용해된 1-2%의 아가로즈로 코팅된 유리 또는 플라스틱 페트리 접시에 보관하십시오. 손상을 최소화하기 위해 불에 연마 된 파스퇴르 피펫을 사용하여 데코리오네이트 배아를 이동합니다.</li>
	<li>플라스틱 또는 화재 광택 파이펫을 사용하여 배아를 1.5 mL 원심 분리튜브로 옮김을 옮김.</li>
	<li>마이크로파이펫으로 배아 배지를 제거합니다. 각 유체 변경 후 배아를 덮을 만큼 충분한 액체만 둡니다.</li>
	<li>화학 연기 후드에 1x 인산완충 식염수(PBS)에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비합니다. 주의: PFA는 유해 물질입니다. 장갑을 착용하고 지정된 장소에서 오염된 액체및 고형물을 폐기하십시오.</li>
	<li>배아를 4% PFA에서 1-2시간 동안 실온에서 부드럽게 흔들어 고정시다. 대안적으로, 배아를 4°C에서 하룻밤까지 4시간 동안 고정한다.</li>
	<li>1x PBS + 1% 트리톤-X(PBTriton)에서 3회 5분 동안 세척하세요.</li>
	<li>배아를 즉시 사용하거나 최대 1주동안 4°C에서 보관하십시오.</li>
	<li>장기 보관을 위해 배아를 100% 메탄올(MeOH) 2시간 또는 -20°C에서 하룻밤 동안 탈수시합니다. 배아를 MeOH에서 -20°C에서 몇 개월 동안 저장하였다. 주의: MeOH는 유해 물질입니다. 장갑을 착용하고 지정된 장소에서 오염된 액체및 고형물을 폐기하십시오.</li>
</ol>2. 배아 준비
<ol><li>실온에서 직렬 배양을 통해 배아를 재수화하십시오.<ol>
<li>75% MeOH/25% 1x PBS로 5분 동안 배양하여 흔들어 주세요.</li>
		<li>50 % MeOH / 50 % 1 x PBS로 5 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>25% MeOH/75% 1x PBS를 5분 동안 배양하여 흔들어 주세요.</li>
		<li>100 % PBTriton에서 5 분 동안 인큐베이션, 흔들.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(선택 사항) 신선한 단백질타아제 K 원료(10 mg/mL)를 얼음에 10 μl의 단백질타아제 K 스톡(10 mg/mL)을 첨가하여 얼음 위에 신선한 단백질정제 K 작업 용액(10 μg/mL)을 준비합니다.<ol>
<li>피야테라제 K에서 최대 30분까지 소화하여 배아를 투과시켜 배아를 투과시합니다. 참고 : 제안 된 타이밍은 <24 hpf입니다 : 소화 없음; 24 hpf: 15 분 소화; 7 일 : 30 분 소화.</li>
		<li>PBTriton에서 배아를 헹구고 실온에서 20 분 동안 4 % PFA로 다시 고정하십시오.</li>
		<li>PBTriton에서 배아를 3회 3회 세척하고 실온에서 부드러운 흔들림으로 5분 간 세척합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 1 차 항체 배양
<ol><li>2 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA)의 유무에 관계없이 이차 항체 숙주 종(예: PBTriton에서 10% 염소 혈청)과 일치하는 상업적 차단 용액 또는 혈청을 선택한다.</li>
	<li>배아를 실온에서 1-3시간 동안 차단하거나 4°C에서 하룻밤 동안 흔들면서 차단용액으로 차단한다.</li>
	<li>1차 항체에서 배양하여 반동하는 동안 4°C에서 하룻밤 동안 PBTriton에서 차단 용액 또는 1% 혈청으로 희석하였다. 본 실험에서, 사용된 1차 항체는 항-NMDAR1, 항-팬-AMPA 수용체, 및 항포스-히스톤 H3였으며, 각각 PBTriton에서 1% 염소 혈청에서 1:500의 최종 농도로 희석하였다.</li>
	<li>흔들리는 동안 실온에서 10 분 동안 PBTriton에서 5 회 씻어 내주세요.</li>
</ol>4. 이차 항체 배양
<ol><li>원발성 항체및 원하는 파장의 숙주 종에 기초하여 이차 항체를 선택한다.</li>
	<li>이차 항체에 배양하여 반락 용액 또는 1% 혈청을 실온(또는 4°C에서 하룻밤)에서 2시간 동안 동안 흔들어 서 배양한다. 참고: 형광 이차 항체는 빛에 민감합니다. 우리는 1:500 염소 반대로 마우스 Alexa488를 PBTriton에 있는 1% 염소 혈청에 희석했습니다 사용했습니다.</li>
	<li>이 모든 후속 단계에 대한 빛 차단 상자로 알루미늄 호일 또는 커버튜브를 덮습니다.</li>
	<li>흔들리는 동안 실온에서 10 분 동안 PBTriton에서 세 번 씻으하십시오.</li>
	<li>배아배지에서 2% 아가로즈의 침대 위에 PBS에서 50% 글리세롤 용액으로 배아를 옮기고 문서화를 진행하거나 아래의 추가 처리 단계를 진행한다.</li>
</ol>옵션 단계
5. 표백
<ol><li>ddH2O의 810.7 μL, 89.3 μL의 2 M KOH, 및 30% H2O2의100 μL을 추가하여 1.5 mL 튜브에서 표백제를 준비한다.</li>
	<li>튜브를 세 번 뒤집어 혼합합니다.</li>
	<li>배아에 표백제 용액 방향의 피펫 1 mL.</li>
	<li>배아 튜브 캡을 열어 가스가 빠져나오도록 합니다. 벤치의 튜브를 가볍게 두드려 거품을 빼냅니다.</li>
	<li>표백 과정을 모니터링하고 (필요한 경우 현미경을 사용) 안료가 충분히 제거 될 때 반응을 중지 (약 5 24 hpf에 대한 분 또는 72 hpf에 대한 10 분).</li>
	<li>조심스럽게 마이크로 파이펫으로 표백 용액을 제거하고 PBTriton의 1 mL에서 배아를 세 번 헹구어. 참고: 배아는 이 단계에서 끈적끈적합니다.</li>
	<li>아래 문서 또는 추가 처리 단계로 진행하십시오.</li>
</ol>6. 배아 해부 및 탈교
<ol><li>노른자를 제거하려면, 소량 (~200 μL 또는 배아를 완전히 덮을 만큼 충분히 제한적이지만 부유 할 수있는 곳을 제한할 만큼 제한적)을 1x PBS를 우울증 슬라이드 또는 일반 유리 슬라이드로 옮니다.</li>
	<li>플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 1개 이상의 배아를 PBS 액적으로 이동합니다.</li>
	<li>초미세 집게와 00 개의 곤충 핀을 사용하여 노른자를 분해하고 배아의 복부 표면에서 노른자 과립을 매우 부드럽게 긁어 냅니다 (2014 년 Cheng et al., 2014 참조)18.</li>
	<li>노른자 과립을 제거하고 필요에 따라 PBS를 보충하십시오.</li>
	<li>배아가 노른자가 충분히 없을 때까지 반복합니다.</li>
</ol>7. 슬라이드에 플랫 장착
<ol><li>탈열 된 배아를 플라스틱 파이펫또는 트리밍 팁으로 1 mL 마이크로 파이펫으로 충전 된 유리 슬라이드로 옮기십시오 (전단 응력 감소). 200 μL 마이크로파이펫 팁 또는 곤충 핀으로 원하는 대로 방향을 지정합니다.</li>
	<li>김 닦음이나 종이 타월로 여분의 PBS를 제거하십시오.</li>
	<li>슬라이드와 커버슬립에 2-3 방울의 마운팅 미디어를 추가합니다.</li>
	<li>약 5-10분 동안 공기 건조.</li>
	<li>뚜껑 유리를 투명한 매니큐어로 슬라이드에 밀봉합니다. 참고 : 커버 유리의 가장자리는 완전히 매니큐어의 얇고 연속 층으로 덮여 있어야합니다.</li>
	<li>이미징 전에 약 10분 동안 건조시키십시오.</li>
</ol>8. 아가로즈에 장착
<ol><li>배아 배지에 0.5 g의 아가로스를 50 mL의 배아 배지를 마이크로파 안전 플라스크 또는 비커에 첨가하여 배아 배지에 1% 아가로스를 원하는 것보다 3배 이상 더 많이 준비한다.</li>
	<li>아가로즈가 완전히 녹을 때까지 전자레인지에서 30s마다 소용돌이치는 열을 가열합니다.</li>
	<li>1.5 mL 원심 분리기 튜브에서 1 mL aliquots를 만드십시오. 별칭을 실온에서 보관하십시오.</li>
	<li>가열하기 전에 캡 잠금 장치로 튜브 캡을 덮습니다.</li>
	<li>아가로즈 튜브를 부유식 튜브 홀더에 물이 반쯤 채워진 비커에 놓습니다.</li>
	<li>비커를 부동 튜브로 2-3분 간 또는 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 전자레인지에 돌리십시오.</li>
	<li>다듬어진 팁으로 플라스틱 파이펫 또는 200 μL 마이크로파이펫으로 배아를 브리지 슬라이드로 옮기십시오(전단 응력 감소).</li>
	<li>곤충 핀을 사용하여 직사각형 커버 슬립에 배아를 배치하고 약 20 μL 용융 아가로스를 배아에 직접 추가합니다.</li>
	<li>00 개의 곤충 핀을 사용하여 커버 슬립에 가장 가까운 관심 영역을 신속하게 지향하고 있습니다. 참고: 이것은 거꾸로 된 마운트입니다.</li>
	<li>필요에 따라 각 사용과 전자레인지 사이에 아가로즈 튜브를 온수 튜브 플로트에 되돌려 주세요.</li>
	<li>아가로즈가 경화될 때 현미경을 이용한 이미지. 거꾸로 된 현미경에 사용하기 위해 장착 된 배아를 거꾸로 유지하십시오. 직립 현미경에 사용하기 위해 커버 슬립을 뒤집습니다 (아가로즈가 커버 슬립 아래에 있으므로)</li>
</ol>9. 브리지 슬라이드에 장착
<ol><li>브리지 슬라이드를 만들기 위해 접착제 사각형 은 슈퍼 접착제의 작은 점을 사용하여 유리 슬라이드에 립을 덮습니다. 참고: 커버슬립 사이에 는 최소 5mm 너비의 트로프가 있어야 합니다. 2개의 #1 커버립은 전형적으로 24-48 hpf 배아에 적합하고 3개의 커버립은 72 hpf를 위해 필요할 지도 모릅니다.</li>
	<li>1-2개의 탈종된 배아를 플라스틱 파이펫으로 다리미끄럼또는 트리밍팁으로 200 μL 마이크로파이펫으로 옮기십시오(전단 응력 감소).</li>
	<li>김 닦음이나 종이 타월로 여분의 액체를 제거하십시오.</li>
	<li>배아에 직접 ≥80% 글리세롤 한 방울을 추가합니다.</li>
	<li>직사각형 커버 유리로 덮습니다. 글리세롤의 물방울은 커버 유리를 만져야합니다.</li>
	<li>배아의 측면에 글리세롤의 여백으로 배아를 완전히 덮기 위하여 필요에 따라 커버 유리와 슬라이드 사이 공간에 더 많은 글리세롤을 추가하십시오.</li>
	<li>직사각형 커버 유리를 부드럽게 밀어 배아를 이미징을 위해 제자리로 굴리십시오.</li>
</ol>10화 DAB 염색
참고: 이 섹션은 위의 4.2단계 이후 시작하여 4단계의 나머지 부분을 대체합니다.
<ol><li>배아를 반옥시다제-이차 항체로 차단 용액에 배합하여 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 흔들어.</li>
	<li>PBTriton에서 실온에서 10 분 동안 세 번 씻으소서.</li>
	<li>배아를 배양 판 또는 우울증 슬라이드로 전사 파이펫으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을</li>
	<li>ddH2O와 0.3% 과산화수소 의 50 μL을 1% DAB(3,3'diaminobenzidine)의 50 μL을 혼합하고 PBS로 1 mL로 가져온다. 주의: DAB는 유해 물질입니다. 장갑을 착용하고 DAB 오염 된 액체 및 고형물을 지정된 장소에서 폐기하십시오.</li>
	<li>위에서 준비한 DAB 용액으로 HRP 염색 배아를 덮고 현미경으로 색 발달(전형적으로 1-5분)을 모니터링합니다.</li>
	<li>원하는 색상 발달 수준에 도달한 후 PBS에서 배아를 간단히 헹구어 보시고 자합니다.</li>
	<li>배아를 고정하기 전에 1.5 mL 튜브로 다시 옮김을 옮김시.</li>
	<li>실온에서 4% PFA에서 15-20분 동안 배아를 다시 고정시.</li>
	<li>PBTriton에서 배아를 3회 5분 동안 세척합니다.</li>
	<li>설명서를 진행합니다.</li>
</ol>11. 슬라이드에 장착된 염색 단면 조직을 위한 수정된 프로토콜
<ol><li>파프 펜으로 염색할 조직을 둘러싸는다.</li>
	<li>슬라이드를 습한 챔버로 옮김으로 옮김.</li>
	<li>슬라이드에 직접 1mL의 PBS를 추가합니다.</li>
	<li>실온에서 7분 동안 배양하여 임베딩 배지를 제거합니다.</li>
	<li>슬라이드를 반전하여 PBS를 붓습니다.</li>
	<li>TNT 버퍼의 최대 1 mL에서 1 분 재수화 (100 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20).</li>
	<li>실온에서 1시간 동안 최대 1mL의 차단 용액(상업용 또는 10% 혈청 + 2% BSA)을 차단합니다.</li>
	<li>1% 혈청 또는 차단 용액을 4°C에서 희석한 1차 항체에서 하룻밤 동안 배양한다.</li>
	<li>실온에서 TNT 버퍼의 최대 1mL에서 5회 세척하십시오.</li>
	<li>실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 이차 항체로 배양합니다. 챔버를 호일로 덮거나 어두운 뚜껑을 사용하십시오.</li>
	<li>실온에서 TNT로 5회 세척하십시오. 마지막 세척을 붓습니다.</li>
	<li>장착 매체와 커버 슬립 2-3 방울로 마운트합니다. 5-10 분 앉아 보자.</li>
	<li>투명 매니큐어를 사용하여 커버 유리를 슬라이드에 밀봉합니다. 이미징 전에 완전히 건조시키십시오.</li>
</ol>12. 문서
<ol><li>랩 노트북에 전체 프로시저 및 편차를 기록합니다.</li>
	<li>1차 항체의 농도, 이름, 카탈로그 번호, 제조사 및 로트 수를 기록한다.</li>
	<li>적절하게 장착된 샘플을 현미경 단계에 놓습니다. 관심 지역을 찾습니다.</li>
	<li>비교적 밝은 예제를 선택합니다. 카메라 노출과 게인을 설정하여 신호가 포화되지 않고 충분히 밝아지않도록 합니다.</li>
	<li>실험용 항체 표지 배아와 대조군 항체(예: IgG) 배아를 비교할 때 동일한 노출 설정을 사용하여 동일한 관심 영역의 염색 강도를 비교합니다.</li>
</ol>

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면역화학은 유기체에 관심 있는 거의 모든 단백질의 주공간적 발현을 특성화하는 데 사용할 수 있는 다목적 도구이다. 면역 조직 화학은 다양한 조직 및 모델 유기체에 사용됩니다. 이 프로토콜은 제브라피시에 사용하도록 최적화되었습니다. 상이한 종의 면역조직화학은 조직의 두께 및 조성으로 인한 종 및 내인성 과산화증의 존재에 따라 다른 고정 및 취급 기술, 차단 용액을 필요로 할 수 있습니다. 제브라피시의 IHC는 암24,대사질환25,신경질환26,그리고 인간의 건강과 의외로 많은 다른 분야에 대한 이해를 증진시키는 데 필수적이다. IHC의 한 가지 주요 장점은 절차가 ISH와 같은 다른 기술에 비해 상대적으로 짧고 기술적으로 까다롭지 않다는 것입니다. 그러나, 표본의 나이, 표적으로 되는 항원 및 항체에 근거를 둔 최적화를 요구하는 수많은 단계가 있습니다.
이...

제브라피쉬(Daniorerio)는짧은 생성 시간, 급속한 발달 및 유전 기술의 어메니티를 포함한 여러 가지 이유로 생물학적 과정의 연구를 위한 강력한 모델로 부상했습니다. 그 결과, 제브라피쉬는 독성 연구 및 약물 발견을 위해 처리량이 높은 소분자 스크린에 일반적으로 사용됩니다. Zebrafish는 한 번에 50-300 개의 알을 일상적으로 생산할 수 있고 광학적으로 명확한 배아가 외부에서 개발되어 개발 과정의 효율적인 시각화를 허용하는 것을 감안할 때 개발 프로세스 연구를위한 매력적인 모델입니다. 그러나, 초기 연구는 역유전 기술을 확립하는 도전 때문에 N-ethyl-N-n-n-nitrosourea (ENU) 또는 그밖 돌연변이원을 사용하여 앞으로 유전 스크린에 주로 의존했습니다. 대략 2십년 전, morpholinos는 표적으로 한 유전자를 녹다운하기 위하여 zebrafish에서 처음으로 이용되었습니다1. 모르폴리노는 초기 발달 단계에서 배아로 미세 주입 다음 표적 mRNA의 번역을 억제하는 작은 안티센스 올리고뉴클레오티드입니다. morpholinos의 주요 약점은 세포가 분열하고 일반적으로 72 시간 후 수정 (hpf)에 의해 효과를 잃을 때 희석된다는 것입니다. 모르폴리노는 제브라피시 유전자 파괴를 위한 강력한 도구로 남아 있지만, 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴클레아제(TALENs), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFNs), 클러스터된 정기적으로 간격이 짧은 팔린드로믹 반복(CRISPRs)이 최근에는 제브라피시 게놈2,3을직접 표적으로 하는 데 사용되고 있다. 이러한 역유전적 전략은 전방 유전학 및 높은 처리량 스크린과 함께 유전자 발현 및 기능을 연구하는 강력한 모델로 zebrafish를 확립했습니다.
유전자 기능을 연구하는 능력은 일반적으로 유전자 또는 유전자 생성물 발현의 시간적 분포에 대한 평가를 필요로 한다. 초기 발달 도중 그 같은 발현 패턴을 구상하기 위하여 일반적으로 이용되는 2개의 기술은 기업 혼성화 (ISH) 및 전체 마운트 면역성 화학 (IHC)에서 입니다. situ 혼성화는 1969년에 처음 개발되었고 유기체4에서mRNA 발현을 검출하기 위해 표지된 안티센스 RNA 프로브의 사용에 의존한다. 대조적으로, 표지된 항체는 단백질 발현을 구상하기 위하여 면역성 화학에서 이용됩니다. 검출을 위한 단백질 표지의 아이디어는 1930년대5로 거슬러 올라가고 첫번째 IHC 실험은 FITC 표지된 항체가 감염한 조직에 있는 병원성 박테리아를 검출하기 위하여 이용될 때 1941년에 간행되었습니다6. ISH와 IHC는 이후 수십 년 동안 크게 진화하고 개선되었으며 현재 분자 및 진단 연구 실험실7,8,9,10,11에서일상적으로 사용됩니다. 두 기술 모두 장점과 단점이 있지만 IHC는 ISH에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 실질적으로, IHC는 ISH보다 훨씬 적은 시간이 소요되며 일반적으로 1차 항체의 비용에 따라 저렴하다. 또한, mRNA 발현은 항상 단백질 풍부도의 약 3분의 1만이 mRNA풍부도 12에의해 설명될 수 있다는 것을 마우스 및 인간에서 입증된 바와 같이 단백질 발현의 신뢰할 수 있는 메트릭이 아니다. 이러한 이유로 IHC는 가능한 경우 ISH 데이터를 확인하는 중요한 보충 자료입니다. 마지막으로, IHC는 ISH13,14및15로결정할 수 없는 세포내 및 공동 지역화 데이터를 제공할 수 있습니다. 여기서, 우리는 제브라피시 배아 및 유충 전체에서 면역조직화학에 의해 단백질을 안정적으로 검출하는 단계별 방법을 설명한다. 이 기술의 목적은 전체 배아에서 관심 있는 단백질의 공간적 및 시간적 발현을 결정하는 것이다. 이 기술은 항원 특이적 1 차 항체 및 형광 태그이 붙은 이차 항체를 이용합니다. 이 프로토콜은 슬라이드 장착 조직 섹션에 사용하고 형광 대신 발색 기질과 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 제브라피시 골격 근을 개발하는 것은 아세틸 콜린 수용체 이외에, ionotropic 글루타메이트 수용체를 표현한다는 것을 보여줍니다. NMDA 형 글루타메이트 수용체 소단위는 23 hpf에서 세로 근육에서 검출할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>아가로스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일, 헤비 듀티</td><td>커클랜드</td><td></td><td>어떤 브랜드든 대체될 수 있습니다:</td></tr><tr><td>Anti-NMDA 항체</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), 클론 RR002</td><td>Millipore Sigma</td><td>05-598</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MABN832 소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>질산칼슘 [Ca(NO3)2]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4955</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브, 1.5mL</td><td>Axygen</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>투명 매니큐어</td><td>Sally Hanson</td><td></td><td>모든 매니큐어 또는 경화제는 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>우울증 (오목한) 슬라이드</td><td>전자 Miscroscopy Sciences</td><td>71878-01</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidine</td><td>Thermo Scientific</td><td>1855920</td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium, Danieau, 30 %</td><td></td><td></td> <td>17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES.</td></tr><tr><td>배아 배지, E2</td><td></td><td></td><td>7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 &mu; M KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L 메틸렌 블루</td></tr><tr><td>플로팅 튜브 홀더</td><td>Thermo Scientific</td><td>59744015</td><td></td></tr><tr><td>형광 복합 현미경</td><td>Leica Biosystems</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>형광 실체현미경</td><td>Leica Biosystems</td><td>M165-FC</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립 18mm x 18mm</td><td>Corning</td><td>284518</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립 22mm x 60mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-050-222</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 솔루션</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>뚜껑이 있는 습한 챔버</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소, 30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>면역 팝 펜</td><td>Vector labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>곤충 핀, 크기 00</td><td>스톨팅</td><td>5213323</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘 (MgSO4 &middot; 7H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>메쉬 스트레이너</td><td>Oneida</td><td></td><td>모든 브랜드로 대체될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 튜브 캡 잠금</td><td>장치 Research Products International</td><td>145062</td><td></td></tr><tr><td>전자 레인지</td><td>Toastmaster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8765</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Millipore Sigma</td><td>S02L1ML</td><td></td></tr><tr><td>Nutating mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-044</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>04042-500</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>PBTriton</td><td></td><td></td><td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Permount 마운팅 매체</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시(유리)</td><td>Pyrex</td><td>3160100</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시(플라스틱)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>1-페닐 2-티오우레아</td><td>아크로스 유기물</td><td>207250250</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS), 10x, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS),</td><td>dH2O 염화칼륨(KCl)에 희석된 10x 스톡으로 만든 1x</td><td></td><td></td> 1xSigma</tr> <tr><td></td><td>Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼륨(KOH)</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성 (KH2PO4)시</td><td>그마 알드리치</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>프로나제</td><td>시그마 알드리치</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 K</td><td>인비트로젠</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>시그마 알드리치</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성(Na2HPO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>산란 탱크, 뚜껑 및 인서트 포함</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>SuperBlock PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>37515</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost + 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Superglue gel</td><td>3M Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNT</td><td></td><td></td><td>100mM 트리스, pH 8.0; 150mM 염화나트륨; 0.1% 트윈20; dH2O</td></tr><tr><td>전사 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>트리클로로아세트산(Cl3CCOOH)</td><td>시그마 Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base,</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr>, <tr><td>TritonX-100</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr>, <tr><td>Tween20</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td>으로 제작</td></tr><tr><td>초미립자 집게</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>물, 초순수/이중 증류</td><td>Fisher Scientific</td><td>W2-20</td><td></td></tr></tbody></table>

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

면역 조직 화학은 일반적인 발달 및 질병 상태 둘 다 도중 단백질 발현 그리고 현지화를 탐구하기 위하여 널리 이용되는 기술입니다. 많은 면역 조직 화학 프로토콜이 포유류 조직 및 조직 섹션에 최적화되었지만, 이러한 프로토콜은 종종 비 포유류 모델 유기체에 대한 수정 및 최적화가 필요합니다. Zebrafish는 발달 과정의 분자, 유전 및 세포 생물학적 메커니즘을 조사하기 위해 기본, 생물 의학 및 번역 연구에서 모델 시스템으로 점점 더 많이 사용되고 있습니다. Zebrafish는 모델 시스템으로서 많은 이점을 제공하지만 최적의 단백질 검출을 위해 수정된 기술이 필요합니다. 여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레에 있는 전체 마운트 형광 면역성 화학을 위한 우리의 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 사용할 수 있는 여러 가지 장착 전략과 각 전략이 제공하는 장점과 단점에 대한 개요를 설명합니다. 우리는 또한 단면된 애벌레 조직에서 전체 마운트 조직 및 형광 검출에 있는 발색성 기단의 검출을 허용하기 위하여 이 프로토콜에 수정을 기술합니다. 이 프로토콜은 많은 발달 단계 및 배아 구조의 연구에 광범위하게 적용 가능하다.

전체 마운트 면역히스토화학은 항체를 사용하여 손상되지 않은 동물에서 단백질 발현의 공간 패턴을 검출합니다. 면역히스토화학의 기본 워크플로우(그림 1에묘사됨)는 제브라피시 사육, 배아 사육, 배아 사육 및 준비, 비특이적 항원 차단, 항원 특이적 1차 항체를 사용하여 관심 있는 단백질을 표적으로 하고, 표지된 이차 항체로 1차 항체를 검출하고, 시편을 장착하고, 발현을 문서화하는 것을 포함한다.
전체 마운트 면역 히스토화학은 제브라피시 발달 중 공간 및 시간 단백질 발현을 연구하는 데 유용한 도구입니다. Zebrafish는 19 hpf 이전에 시작하여 갭 접합에 의해 매개된 자발적인 수축을 나타낸다 - 운동 뉴런 접촉 전19. zebrafish 신경 근육 접합, 다른 척...

여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레의 전체 준비에 있는 단백질의 형광 항체 중재한 검출을 위한 프로토콜을 제시합니다.

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

전체 마운트 면역 조직 화학은 표지된 항체를 사용하여 조직 또는 유기체에서 직접 단백질의 공간 및 측현관찰을 허용하는 비교적 빠르고 간단한 기술이다. 이 기술의 유용성은 제1단을 단면할 필요 없이 온전한 조직 또는 유기체의 염색을 허용하고 공초점 현미경 검사를 사용하여 단백질 발현 패턴의 3차원 표현을 생성하는 데 사용될 수 있다는 것이다. 면역히스토케는 질병의 근간이 되는 병인학 및 분자 메커니즘을 이해하기 위해 생의학 연구에서 널리 사용됩니다.그것은 또한 병리학 적인 견본에 있는 종양을 확인하는 귀중한 진단 공구입니다. 먼저 시스템 워터와 메쉬 또는 슬롯 라이너로 채워진 산란 탱크를 준비합니다. 하룻밤 탱크에 그룹으로 성인 제브라 피시 혼합 섹스 쌍을 배치합니다.14시간/10시간 빛/어두운 주기를 사용하여 9a.m 켜집니다. 다음 주 아침, 불이 켜진 후 산란 탱크 물을 신선한 시스템 물로 바꿔 대변을 제거합니다. 계란이 놓이면 성인을 홈 탱크로 돌려놓습니다.전송 파이펫을 사용하여 계란을 끌어서 수집합니다. 50개의 달걀을 배아 배지로 반쯤 채워진 각 페트리 요리에 옮긴다. 죽었거나 분열하지 못한 불투명하고 흐린 계란을 제거하십시오.수정 후 23 시간까지 28.5섭씨에서 계란 의 접시를 배양하십시오. 배아가 수정 후 24시간 이상 더 오래된 경우, 피펫이 배아 배지에서 200 마이크로몰라 PTU로 배아를 전달하여 멜라노발생을 예방한다. 스테레오 현미경으로 초미세 팁 집게를 사용하여 해치지 않은 배아를 비초합니다.불을 닦은 파스퇴르 파이펫을 사용하여 손상을 최소화하고, 배아 매체에 용해된 1-2%의 아가로즈로 코팅된 유리 또는 플라스틱 페트리 접시로 옮겨넣습니다. 그런 다음 플라스틱 또는 화재 광택 파이펫을 사용하여 배아를 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. 마이크로피펫으로 배아 배지를 제거합니다.배아를 덮기위해 충분한 액체만 둡니다. 실온에서 부드러운 흔들림으로 1~2시간 동안 4%의 PFA로 배아를 수정합니다. 다음으로, 배아를 1X PBS에서 3회, PBTriton은 5분간 세척합니다.배아를 즉시 사용하거나 최대 1주일 동안 섭씨 4도에 보관하십시오. 장기 보관을 위해, 탈수하고 영하 20도에서 100% 메탄올에 배아를 저장합니다. 배아를 재수화하려면 최종 세척을 위해 메탄올및 PBS 및 PBTriton의 양이 감소하여 실온에서 각각 5분 씩 직렬 배큐어를 수행하십시오.원고에 따라 배아 준비를 진행한다. 예를 들어 PBTriton의 10%염소 혈청과 BSA의 밀리리터당 2밀리그램 이내염소 혈청과 일치하는 차단 용액을 선택한다. 배아가 들어 있는 튜브에 블로킹 용액의 0.5 밀리리터를 추가하고 실온에서 1~3시간 동안 로커에 튜브를 놓습니다.그런 다음 1 차적인 항체에 있는 배아를 흔들면서 섭씨 4도에서 막는 용액및 PBTriton 에 희석된 배양합니다. 아침에는 PBTriton에서 배아를 5회 씩 흔들어 보며 실온에서 각각 10분 동안 세척합니다. 그런 다음 488 나노미터에서 1차 항체 및 원하는 파장의 숙주 종에 기초하여 이차 항체를 선택한다.배아를 포함하는 관에 차단 용액에 희석된 이차 항체를 추가합니다. 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 흔들면서 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오. 그 후, 알루미늄 호일과 흔들로 덮여있는 동안 실온에서 각각 10 분 동안 PBTriton에서 배아를 세 번 씻으라.파이펫을 사용하면 배아 배지에서 2%의 아가로즈를 침대 위로 PBS에서 50% 글리세롤 용액으로 배아를 전달합니다. 노른자를 제거하려면 1X PBS의 200 마이크로리터를 우울증 슬라이드 또는 일반 유리 슬라이드로 옮기십시오. 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 하나 이상의 배아를 PBS 액적으로 이동합니다.초미세 집게와 이중 제로 곤충 핀을 사용하여 노른자를 분해하고 배아의 복부 표면에서 노른자 과립을 매우 부드럽게 긁어냅니다. 노른자 과립을 제거하고 필요에 따라 PBS로 보충하십시오. 장착 후 현미경 단계에 샘플을 놓습니다.비교적 밝은 예제를 선택하여 관심 영역을 찾습니다. 카메라 노출을 조정하고 게인을 조정하여 신호가 포화 없이 충분히 밝을 수 있도록 합니다. 실험적인 항체 표지배아 사이를 비교할 때 항체 배아를 통제할 때, 동일 노출 설정을 사용합니다.전체 마운트 면역 히스토케의 이 프로토콜은 제브라피시 발달을 이용한 공간 및 측두단백질 발현연구를 위한 귀중한 도구이다. NMDA 형 글루타민산체의 GluN1 서브유닛은 수정 후 23시간 후 제브라피시 근육을 개발하는 동안 글루타민산 수용체 하위 단위의 발현을 드러냈다. 72시간 후 수정 배아의 냉동 섹션은 슬라이드에 장착되고 확산 되는 세포의 마커인 인-H3를 위해 면역 염색되었습니다.몇몇 세포는 인-H3를 발현하고 발현은 심실 영역에서 가장 주목할 만했습니다. 마우스 IgG 대조체 항체 및 1차 항체를 제외한 것은 비특이적 발현의 낮은 수준을 드러냈다. 검출을 보장하고 비특이적 얼룩을 최소화하기 위해 1차 항체 호스트 종을 기반으로 적절한 차단 용액과 이차 항체를 선택하는 것이 중요합니다.면역히스토케는 관찰된 신호가 실제로 관심 있는 단백질인지 확인하기 위해 검증되어야 한다. 후속 실험은 일반적으로 유전자 또는 환경적으로 변형된 유기체를 사용하는 것을 포함합니다. 면역 히스토케는 연구원에게 그 자리에서 단백질을 관찰할 수 있는 능력을 부여하며, 특히 배아 발달 중에 기본 및 적용 생물학 모두에서 수많은 시스템에 대한 이해를 크게 가속화합니다.메탄올과 포름알데히드는 독성이 있으며 신중하게 처리해야합니다. 폐기물은 제도적 절차에 따라 수거및 폐기해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

zebrafish 배아 심장의 immunostaining를 수행하는 빠른 방법이 설명되어 있습니다. 전체 마운트 immunostaining 접근 방식에 비해,이 방법은 크게 크게 감소 처리 시간 이내에 심장에 세포 / subcellular 구조를 공개 고해상도 이미지를 얻는 수있는 항체의 침투를 증가시킵니다.

해부 Zebrafish 배아 심장의 Immunostaining

제브라 피쉬, 작은 열대어, 척추 발달과 질병 중 유전자 기능 연구를위한 대중적인 모델이되고있다. 표적 유전자의 시간적, 공간적 표현에 의해 결정될...

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

이러한 확산, 패턴, 차별화, 그리고 축삭지도 등의 발달 과정은 쉽게 제브라 피쉬의 척수에서 모델링 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 이러한 이벤트의 시각화를 최적화하는 제브라 피쉬 배아에 대한 설치 절차를 설명합니다.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

제브라 피쉬 배아 발달 생물학 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 배아 동안, 제브라 피쉬의 샘플 관찰 및 분석을위한 세 가지 차원의 과제를 제시하는 노른자 대량으로 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 현장 (WISH) 스테인드 제브라 피쉬 배아 표본 전체 마운트의 2 차원 평면 장착 준비를 만드는 방법에 대해 설명합니다.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

기술은 전체 제브라 피쉬 배아에서 포스 항원을 발현 사이 다음 주 섬모와 같은 작은 세포 구조에서 두 색 형광 공 초점 현지화를 수행 할 수 있도록 서술되어있다. 고정 및 이미징 기술은 위치 특정 단백질의 모양이나 활성화 동력학을 정의 할 수있다.

전체 마운트 Zebrafish의 태아의 섬모 기관에서 면역 염색 포스 - 항원 결정기

속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

이 프로토콜은 초기 단계 제브라피시 배아의 저온 절에 대한 순차적 면역 형광 및 면역 히스토화학을 입증하여 특정 세포 집단에서 정확한 동국화 분석을 가능하게합니다.

냉동 제브라피시 배아의 순차적 면역형광 및 면역성화학

이 문서에서는 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위해 깨지기 쉬운 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대해 설명합니다. 이 저가형 방법은 모든 반전된 현미경에 이미징을 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다.

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

이 프로토콜은 제브라피쉬 배아 절편의 현장 혼성화와 면역조직화학을 결합하여 이미지를 얻는 방법을 설명합니다. 저온 절개 전에 제자리 하이브리드화를 수행한 후 항체 염색을 수행했습니다. 항체가 부족한 경우 제브라피쉬에서 두 유전자의 발현 패턴을 감지하는 것이 유용합니다.

현장 Cryosectioned Zebrafish 배아에서 면역조직화학과 결합된 혼성화

여기에 제시된 것은 3차원 형광 현미경을 사용한 유충 제브라피쉬의 생체 내 전뇌 이미징을 위한 프로토콜입니다. 실험 절차에는 샘플 준비, 이미지 획득 및 시각화가 포함됩니다.

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

배우세요 제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학법을 통해 단백질 발현을 관찰하는 방법을. 형광 표지 항체와 공초점 현미경을 활용하여 3차원 단백질 분포를 시각화하고 발달생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

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