Name: 만성 슈도모나스 녹농증 상처 감염의 지연 접종 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 학습하세요 면역정상 마우스에서 지연 접종을 통한 만성 슈도모나스 녹농균 상처 감염 모델을 구축하는 방법을. 이 프로토콜은 세균 병원성 및 숙주-병원체 상호작용 연구에 유용합니다.

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pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 발광 구조 벡터는 J. 하디의 은혜로운 선물이었습니다. 회로도는 BioRender.com 함께 만들어졌습니다. 우리는 상처 감염 모델에 대한 조언에 대한 G. Gurtner의 실험실에 감사드립니다. 우리는 또한 그의 기술 적 전문성에 대한 비보 이미징의 혁신을위한 스탠포드 센터에서 T. Doyle 감사합니다. 이 작품은 보조금 R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, 스탠포드 SPARK에서 보조금, 포크 의료 연구 신탁 및 낭포성 섬유증 재단 (CFF) P.L.B. C.R.D에 의해 지원되었다 T32AI070에 의해 지원되었다. 과학 및 공학에 대한 개빌란 스탠포드 대학원 펠로우십과 루버트 스트라이커 바이오-X 스탠포드 학제 간 대학원 동호회는 J.M.S를 지원.

여기에 설명된 모든 방법은 스탠포드 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 박테리아의 준비 와 성장
<ol><li>연구원의 기관 생물 안전 위원회 및 동물 사용 위원회 지침에 따라 BSL-2 예방 조치와 P. aeruginosa 및 동물과 함께 모든 작업을 수행. 마우스 접종을 포함하여 P. aeruginosa와관련된 모든 단계를 생물 안전 성 캐비닛에 수행하십시오.</li>
	<li>P. aeruginosa의 발광 PAO1:lux 변형은 요청에 따라 저희 실험실에서 구할 수 있습니다. 리소제니 브로스 (LB) 한천에 냉동 글리세롤 스톡으로 보관된 Streak PAO1. 발광 PAO1:lux 변형의 경우, LB 한천은 선택적 항생제 (100 μg / mL 카베니실린 및 12.5 μg / mL 카나마이신)를 포함해야합니다. 세균 인큐베이터에서 하룻밤 동안 37°C에서 자랍니다.</li>
	<li>분리된 콜로니를 선택하고 3 ml LB 배지, pH 7.4에서 37°C에서 하룻밤 동안 성장한다. 발광 균주의 경우, 국물은 100 μg / mL 카베니실린을 포함해야합니다. 흔들림, 에어로빅 조건하에서 자랍니다.</li>
</ol>2. 절차 준비
<ol><li>수술을 수행하는 모든 직원이 깨끗한 가운 / 실험실 코트, 얼굴 마스크, 헤어 그물 및 장갑을 착용하게하십시오.</li>
	<li>가위와 집게를 포함한 모든 수술 도구를 오토클레이브합니다. 무균 기술을 사용하여 동물 사이의 도구를 살균하십시오.</li>
	<li>에탄올로 수술 테이블을 청소하고 깨끗한 수술 장을 준비하십시오.</li>
</ol>3. 제모
<ol><li>1%-3% 이소플루란을 사용하여 8-12주 된 C57BL/6J 마우스를 마취시다. 조사관은 isoflurane를 사용할 때 마취에 대한 기관의 수의학 직원 지침을 따라야합니다.<ol>
<li>마취를 시작하여 1%-3% 이소플루란을 제공하고 산소 유량을 1.5L/min로 조정합니다.</li>
		<li>마취의 깊이를 평가하기 위해 마우스의 발가락을 꼬집습니다. 마우스가 더 이상 자극에 반응하지 않는 경우, 유도 챔버에서 제거하고 이소플루란 코 콘에 코와 수술 벤치에 배치.</li>
		<li>두 눈에 안구 윤활제를 바르습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>베이스라인 사전 프로시저 무게를 얻기 위해 마우스를 무게.</li>
	<li>마우스를 취약한 위치에 놓습니다. 마우스를 미리 데운 멸균 0.9% 염화나트륨, 각 측면에 250 μL로 피하 주사하여 총 500 μL.</li>
	<li>전기 면도기로 마우스의 등가 부위를 면도합니다. 면도는 상처의 모발 오염을 방지하기 위해 수술 실과 다른 위치에서 발생해야합니다.</li>
	<li>제모 로션의 얇은 층을 적용합니다. 로션을 20-60s. 따뜻한 물에 적신 거즈로 머리카락과 과도한 로션을 제거하십시오. 제모 후, 절제 상처 절차를 진행하십시오.</li>
</ol>4. 전체 두께 절제 상처 수술
<ol><li>마우스의 중간 등쪽 영역에서 25 G 바늘을 사용하여 서지속 방출 buprenorphine 0.6-1 mg/kg을 피하 주사. 느린 방출 buprenorphine 이상 통증 완화를 제공 48-72 시간.</li>
	<li>수술 부위를 소독하십시오. 멸균 베타딘 면봉으로 등지 표면을 닦으소. 멸균 알코올 면봉으로 여분의 베타딘을 닦으소서. 이것은 3 번 (베타 딘과 알코올 을 번갈아 가며) 중앙에서 가장자리로 이동하여 스와핑해야합니다. 공기가 건조되도록 하십시오.</li>
	<li>멸균 거즈 또는 플라스틱 집착 랩을 사용하여 수술 부위를 둘러싼 드레이프를 만듭니다.</li>
	<li>스트레칭 피부 팽팽한 caudally. 멸균 6mm 직경의 피부 생검 펀치를 사용하여 왼쪽 등쪽 표피를 통해 초기 절개를 합니다. 오른쪽 등도 표피에 반복합니다.</li>
	<li>포셉을 사용하여 왼쪽 윤곽이 있는 상처 부위의 중앙에서 피부를 텐트로 막습니다. 가위를 사용하여 표피와 진피 층을 절제하십시오. 오른쪽 윤곽이 있는 상처 부위에서 반복하여 대칭적인 절제 상처를 만듭니다.</li>
	<li>멸균 식염수 50 μL로 상처를 씻으소서. 수술 부위와 주변 피부가 공기 건조되도록 하십시오. 그런 다음 상처와 도르섬을 투명 필름 드레싱으로 덮습니다.</li>
	<li>깨끗한 케이지에 마우스를 다시 놓습니다. 케이지 당 1 개의 동물을 집.</li>
	<li>가열 패드에 케이지를 놓고 마우스가 깨어날 때까지 모니터합니다.</li>
	<li>여러 동물에 위의 수술을 수행 할 때, 동물 사이의 모든 수술 기구를 청소하는 뜨거운 비드 소독기를 사용합니다.</li>
	<li>마우스가 수술 절차에서 회복하고 박테리아와 접종을 진행하기 전에 상처 위에 임시 상처 매트릭스의 형성을 위해 24 시간 허용.</li>
</ol>5. P. aeruginosa와 접종
<ol><li>하룻밤 PAO1:lux 배양을 OD600 = 0.05 lb 배지의 75 mL에서 100 μg/mL카르베니실린을 함유하고 배양이 초기 기하수계 단계에 있을 때까지 박테리아를 성장시다(OD600  0.3). 이 약 2-3 시간이 소요됩니다.</li>
	<li>PBS에서 (7.5 ± 2.5) x 102 CFU / mL의 농도로 PAO1 : 럭스를 희석하십시오. 충분한 부피를 보장하고 실험 후 도금을 허용하기 위해 과잉 접종을 준비해야합니다. 시설 간에 운송하는 경우(예: 실험실에서 사육장까지), 누출 방지 상자에 이중 봉쇄를 사용하면 Biohazard로 명확하게 표시되어 있습니다.</li>
	<li>동물 생물 안전 수준 2 (ABSL-2) 승인 된 생물학적 안전 캐비닛 (BSC)에서 승인 된 개인 보호 장비를 사용하여 P. aeruginosa 및 마우스와 함께 모든 작업을 수행하십시오. 계량 스케일과 같은 재사용 가능한 장비는 오염을 방지하기 위해 클링 랩으로 덮여있어야 합니다.</li>
	<li>위에서 설명한 바와 같이 3 % 이소플루란을 사용하여 마취하십시오. 마우스를 계량하고 무게를 기록합니다. 마우스를 미리 데운 멸균 0.9% 염화나트륨, 각 측면에 250 μL로 피하 주사하여 총 500 μL.</li>
	<li>마우스의 투명 필름 드레싱이 하룻밤 사이에 벗겨지면 결과있는 딱지를 조심스럽게 제거하고 새 드레싱을 입습니다.</li>
	<li>500 μL 결핵 27 G 안전 캡 주사기를 사용하여 PAO1:lux 서스펜션의 40 μL을 각 상처에 투명 필름 드레싱을 통해 주입합니다. 반대측에서 교차 오염을 방지하기 위하여 다른 마우스는 비 접종/PBS 상처 통제를 위해 이용되어야 합니다.</li>
	<li>가열 패드의 케이지에 마우스를 다시 놓고 깨어날 때까지 모니터합니다. 모든 마우스는 교차 오염을 방지하기 위해 별도의 케이지에 개별적으로 보관해야합니다.</li>
	<li>케이지 바닥에 음식 펠릿 사이에 끼어 있는 고칼로리 영양 보충제 페이스트를 제공합니다.</li>
	<li>남은 접종을 사용하여 LB 한천 접시를 줄무늬로 놓습니다. 투여 된 박테리아의 수를 확인하기 위해 식민지를 계산합니다.</li>
</ol>6. 감염된 상처의 생체 내 이미징
<ol><li>보조 용기 사용을 포함하여 이미징 기기에서 마우스를 수송하기 위한 BSL-2 격납 프로토콜을 따르십시오. 유도 챔버 또는 이미징 기기로 마우스를 옮기는 동안 동물 침구를 옮기거나 떨어뜨리지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>3.1단계에서 기재된 바와 같이 유도 챔버에서 흡입된 1%-3% 이소플루란으로 마우스의 마취를 유도한다.</li>
	<li>일단 마우스가 마취되면, 이소플루란 코 콘에 코를 가진 광학 화상 진찰 시스템의 화상 진찰 실에 있는 경향이 있는 위치에 놓습니다.</li>
	<li>소프트웨어 프로그램을 엽니다.</li>
	<li>획득 파라미터는 동시에 이미지화되는 동물의 수와 생물 발광의 강도에 따라 달라집니다. 설정하는 기본 매개변수에는 노출 시간, 비닝, f/stop 및 시야(FOV)가 포함됩니다. 기본 시작 설정은 노출 시간 30초, 비닝 로우(2), f/stop 1.2 및 FOV 25입니다. 연구원의 필요에 따라 필요에 따라 이러한 설정을 조정합니다.</li>
	<li>이미징 프로그램을 사용하여 발광 데이터를 분석합니다(재료 표참조). 발광은 마우스의 컬러 사진에 중첩된 가짜 색 이미지로서 표현될 것이다.<ol>
<li>상처 부위에 관심 영역(ROI)을 생성하고 감지된 평균 플럭스(광자/초)를 측정합니다. 데이터는 광도(광자/초/cm²/스테라디안)로 보고될 수도 있지만 카메라에서 이미징 플랫폼의 거리가 이미징 사이에 일정하게 유지되는 한 플럭스는 충분합니다.</li>
		<li>이미징 플랫폼의 임의 영역에 ROI를 생성하여 배경을 측정합니다. 초분의 배경 광자 수를 뺍니다.</li>
		<li>추가 분석을 위해 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>감염 진행을 추적하기 위해 매일 위에서 설명한 대로 이미징을 수행합니다.</li>
</ol>7. 수술 후 관리
<ol><li>연구원의 IACUC 프로토콜에 의해 설정 된 지침에 따라 마우스를 모니터링 합니다. 우리는 실험이 끝날 때까지 매일, 그 다음 격일로 처음 4 일 동안 모든 마우스를 모니터링합니다. BSC에서 수술 후 처음 4 일 동안 하루에 한 번 마우스를 무게. 감염 후 1일과 2일에 0.9% 염화나트륨 250 μL을 피하주사합니다.</li>
	<li>구치진 자세, 처진 털, 혼수, 호흡 곤란, 안면 찡그린 얼굴, 체중 감소를 포함하여 마우스의 통증/고민 징후를 확인합니다.</li>
	<li>동물이 건강이 악화되는 징후를 보이는 경우 수의사와 상의하십시오. 통증/고민의 악화 징후와 20% 이상의 체중 감소를 보이는 마우스는 안락사되어야 합니다.</li>
</ol>8. 상처 절제
<ol><li>실험의 끝에서,CO2 흡입을 사용하여 마우스를 희생하고, 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다. 기관의 ABSL-2 프로토콜에 따라 동물 시체를 폐기하십시오.</li>
	<li>BSC에서 멸균 가위와 집게를 사용하여 상처 베드를 절제하십시오. 각 상처 베드를 1mL 멸균 PBS에 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브에 놓습니다. 상처 조직을 가위로 잘라내소. 모든 상처는 감염된 것으로 간주되지 않더라도 ASBL-2로 치료해야합니다.</li>
	<li>4 °C에서 2 시간 동안 300 rpm에서 셰이커에 인큐베이션합니다. 10 s에 대 한 각 튜브를 소용돌이 하 고 연속적으로 PBS에서 세균 유출물을 희석. LB 한천에 희석된 세균 유출물을 플레이트하여 세균 부담을 열거한다.</li>
	<li>상처의 발광 신호가 배경 발광 이상이고 더 많은 박테리아가 PBS로 접종 된 상처보다 상처 유출물에서 발견되면 감염된 상처를 고려하십시오.</li>
</ol>

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<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+trigger+antiviral+immunity+and+prevent+clearance+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li>
</ol>

저자는 공개할 경쟁적인 재정적 이익이 없습니다.

우리는 새로운 지연 접종 P. aeruginosa 상처 감염 모델을 개발했습니다. 절제 상처 후 24 시간까지 박테리아와 접종을 연기하는 전략은 1 주 기간 동안 상처 감염의 평가를 가능하게합니다. P. aeruginosa의발광 균주를 사용하여 감염 과정 전반에 걸쳐 감염 진행을 추적 할 수 있습니다. 다른 P. aeruginosa 감염 모형에 비해 감염의 더 긴 과정은 P. aeruginosa 상처 감염을 표적으로 하는 호스트 병원체 상호 작용 및 새로운 치료를 공부를 위한 새로운 기회를 허용할 것입니다. 예를 들어, 우리는 이미 P. aeruginosa가 숙주 면역 계통14를회피하는 것을 허용하는 항바이러스 면역 반응을 자극하는 Pf 박테리오파지의 역할을 입증하기 위하여 이 모델을 이용했습니다.
절제 상처 수술과 세균 접종 사이의 회복 시간 24 시간을 ...

슈도모나스 aeruginosa (P. aeruginosa)인간의 건강과 질병에 대한 관련성을 증가와 그람 음성 막대 모양의 박테리아입니다. 그것은 면역 손상환자에서특히 상처 감염을 포함, nosocomial 설정에서 광범위한 사망률과 사망률에 대한 책임이1,2. 이 병원체의 다제내성 균주의 출현은 P. aeruginosa 독성, P. aeruginosa 항생 저항의 기계장치 및 이 치명적인 감염의 예방 및 처리를 위한 새로운 방법에 기여하는 요인에 대한 조사를 위한 추가 자극을 제공했습니다3. 이와 같이, 이러한 연구 질문을 조사 하기 위한 도구로 만성 상처 감염의 동물 모델에 대 한 필요성은 그 어느 때 보 다 더 큰 되었습니다.
불행하게도, P. aeruginosa 감염의 많은 동물 모델은 패혈증4,5로인한 감염의 급속한 해상도 또는 급속한 감소로 급성 감염을 시뮬레이션하는 경향이 있으며, 이는 이러한 감염의 종종 만성 적 특성을 적절히 시뮬레이션하지 못한다. 이러한 단점을 해결하기 위해 일부 모델은 한천 비드, 실리콘 임플란트 또는 알긴산 겔6,7,8과같은 이물질의 이식을 활용한다. 다른 모델은 고령, 비만 또는 당뇨병으로 인해 면역 손상되는 마우스를 사용하거나, 사이클로포스파미드 유도 호중구 감소증9,10,11,12와같은 약리학적 수단을 통해 사용한다. 그러나, 외국 물자 또는 면역 손상된 호스트의 사용은 가능성이 그렇지 않으면 일반적인 면역 계통을 가진 호스트에 있는 만성 상처 감염에서 관련시킨 병리생리학의 이해를 얻기 어렵게 만드는 현지 선동적인 프로세스를 변경합니다.
우리는 절제 상처 후 박테리아와 지연 접종을 포함 하는 쥐에 P. aeruginosa 상처 감염의 만성 모델을 개발 했습니다. 연기된 접종은 적어도 7 일까지 연장하는 세균성 부담을 평가하는 실험을 허용합니다. 이 모형은 P. aeruginosa 만성 감염의 병인 그리고 새로운 처리 둘 다 조사하기를 위한 새로운 기회를 엽니다.

<table><tbody><tr><td>0.9% 염화나트륨 주사</td><td>Hospira</td><td>2484457</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 멸균 바늘</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1 1/5 멸균 바늘</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>알코올 면봉</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Aura 이미징 소프트웨어</td><td>스펙트럼 기기 이미징</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Frederick Company</td><td>19-065534</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀 SR LAB</td><td>Zoopharm</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 수컷 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>일회용 생검 펀치, 6mm</td><td>Integra</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>파인 가위 - 텅스텐 카바이드</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬 건조 살균기</td><td>하버드 장치</td><td>61-0183</td><td></td></tr><tr><td>과립 한천</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9744</td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Milliard</td><td>804879481218</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기(28G 바늘</td><td>포함) BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Lago X 이미징 시스템</td><td>스펙트럼 기기 이미징</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Leur-Lok 1mL 주사기</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Mini Arco Animal Trimmer</td><td>Wahl Professional</td><td>919152</td><td></td></tr><tr><td>Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil</td><td>Church and Dwight</td><td>N/A</td><td>모든 약국에서 구할 수</td></tr> 있음 <tr><td>팔각형 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11041-08</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>프레스 및 씰 클링 랩</td><td>Glad</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SafetyGlide 인슐린 주사기(30G 바늘</td><td>BD</td><td>포함) 305934</td><td></td></tr><tr><td>Safetyglide 인슐린 주사기, 1/2mL, 30G x 5/16 TW</td><td>BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>스케일</td><td>Ohaus Scout Pro</td><td>SP202</td><td></td></tr><tr><td>보조 영양 보충제</td><td>Henry Schein 동물 건강</td><td>29908</td><td></td></tr><tr><td>테가덤, 6cm x 7cm</td><td>3M</td><td>1624W</td><td></td></tr></tbody></table>

만성 슈도모나스 녹농증 상처 감염의 지연 접종 모델

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

슈도모나스 녹농균(P.aeruginosa)은특히 당뇨병 및 입원 환자에서 만성 상처 감염의 설정에서 인간의 건강과 질병에 대한 관련성을 증가시키는 주요 항균 병원체이다. 상처 병인의 조사와이 병원체에 대한 새로운 치료법의 개발을 돕기 위해 만성 감염 모델이 절실히 필요합니다. 여기서, 우리는 전체 두께 의외감 후 24시간 지연된 접종을 사용하는 프로토콜을 기술한다. 이 때 존재하는 잠정적인 상처 매트릭스의 감염은 감염의 급속한 통관 또는 보급을 포리스트로 하고 대신 이물질 또는 면역 억제의 이식의 필요 없이 7-10 일 지속되는 만성 감염을 설치합니다. 이 프로토콜은 인간에 있는 수술 후 감염의 전형적인 시간적 과정을 모방합니다. 발광 P. aeruginosa 긴장의 사용 (PAO1:lux) P. aeruginosa 상처 감염에 대 한 세균 성 부담의 정량적 매일 평가 에 대 한 허용. 이 새로운 모형은 만성 P. aeruginosa 상처 감염을 위한 세균성 병인 그리고 새로운 치료의 발달의 조사에 있는 유용한 공구일지도 모릅니다.

luxABCDE 리포터 시스템(PAO1:lux)을 코딩하는 플라스미드와 함께 PAO1의 발광 균주를 사용하여, 우리는 마우스에 절제상처를 수행하고, 플랑크토닉 P. aeruginosa 24 시간 후에 이러한 상처를 접종하고, 시간이 지남에 따라 세균 부담을 측정하였다(도1 및 그림 2). 이미징 광학 시스템을 사용하여 얻어진 대표적인 이미지는 이러한 모델이 검출 가능한 발광을 초래한다는 것을보여준다(도 3A). 감염은 3일째에 정점에 이르렀고 생물 발광 및 식민지 수모두에 기초하여 7일 후 접종 을 지속하였다(그림3B-C). 이 모델을 사용하여 박테리아의 변형과 마우스 배경에 따라 7...

우리는 면역 적격 마우스에서 만성 상처 감염을 생성하기위한 지연 접종 프로토콜을 설명합니다.

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

이 프로토콜은 이물질 이식 또는 면역 억제없이 만성 슈도모나스 아에루기노사 상처 감염에 대한 모델을 설명하기 때문에 중요합니다. 슈도모나스 아에루기노사를 24시간 동안 전두께절상처후 24시간 동안 접종을 지연시킨 후 박테리아의 신속한 클리어런스와 보급을 막아 7~10일 간 지속되는 감염을 확립한다. 이 독특한 모델은 세균성 병원성, 숙주 병원체 상호 작용 및 만성 슈도모나스 아루기노사 상처 감염에 대한 새로운 치료법의 개발을 위한 유용한 도구가 될 것입니다.절차의 데모에 나를 지원 댄 리우, 볼리키 연구소에서 의대생이 될 것입니다. 절차를 시작하기 전에, 베이스 라인 무게를 얻고 경향이 위치에 마우스를 배치하기 위해 마취 8 ~ 12 주 된 마우스의 무게. 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 각 측면에 0.9%의 미리 따뜻해지는 멸균 살균소 250 마이크로리터로 마우스를 피하한다.전기 면도기를 사용하여 마우스의 등대 부위에서 머리카락을 제거하고 노출된 피부에 얇은 탈모 크림층을 적용합니다. 20~60초 후에는 따뜻한 물에 촉촉해진 거즈로 모발과 여분의 로션을 제거합니다. 전체 두께 절제 상처 수술의 경우, 먼저 25 게이지 바늘을 사용하여 마우스의 중간 등쪽 영역에서 1킬로그램당 0.6~ 1밀리그램을 피하하고 세 가지 대체 멸균 베타딘과 알코올 면봉으로 수술 부위를 원형으로 닦아냅니다.수술 부위에 플라스틱 집착 랩 드레이프를 놓고 피부를 팽팽하게 펴보시고 있습니다. 피부가 건조되면, 멸균 6 밀리미터 직경의 피부 생검 펀치를 사용하여 왼쪽 등색 표피를 통해 초기 절개를 하고 오른쪽 등색 표피에 두 번째 절개를 합니다. 집게를 사용하여 왼쪽 윤곽이 있는 상처 부위의 중앙에서 피부를 텐트화하고 가위를 사용하여 표피와 진피 층을 소비합니다.대칭 절제적 상처를 만들기 위해 오른쪽 윤곽 상처 부위에 절개를 반복 한 후, 멸균 식염수의 50 마이크로 리터와 두 상처를 씻어. 수술 부위와 주변 피부가 건조되면 상처와 dorsum을 투명 필름 드레싱으로 덮고 마우스를 완전한 재조정이 있을 때까지 모니터링할 수 있는 가열 패드에 깨끗한 케이지에 놓습니다. 수술 후 24시간, 재마취된 마우스를 다시 계량하고 양면 양쪽에 0.9%의 미리 따뜻진 멸균 살균소 250마이크로리터로 동물을 피하시 주입한다.다음으로, 발광 P.aeruginosa 균주 현탁액100마이크로리터를 27게이지 바늘이 장착된 500 마이크로리터 결핵 안전 캡 주사기에 적재하고 각 상처에 투명 필름 드레싱을 통해 40 마이크로리터의 박테리아 서스펜션을 주입한다. 세균 현탁액이 잘 혼합되어 투명 드레싱이 그대로 되었는지 확인하십시오. 바늘 베젤 쪽으로 한 번만 투명 드레싱을 천공하십시오.그런 다음 모니터링을 통해 가열 페이지에 마우스를 케이지로 되돌리고 케이지 바닥에 있는 음식 펠릿 사이에 끼어있는 고칼로리 영양 보충제 페이스트를 제공합니다. LB 한천 판에 남은 접종을 접시에 대고 식민지를 세어 투여된 박테리아의 수를 확인합니다. 감염된 상처의 생체 내 이미징의 경우, 이미징 기기에서 마우스를 수송하기 위한 생체 안전 수준 2 개 봉쇄 프로토콜을 따르고 마취 된 마우스를 이미징 챔버 내의 경향이있는 위치에 놓습니다.이미징 소프트웨어에서, 실험에 적합한 노출 시간, 비닝, f-스톱 및 시야를 설정합니다. 다음으로 상처 부위에 관심 영역을 만들고 초당 광자에서 검출된 평균 플럭스를 측정합니다. 배경을 측정하려면 이미징 플랫폼의 임의 영역에 대한 관심 영역을 만들고 초당 광자의 배경 수를 뺍니다.실험이 끝나면 바이오 안전 캐비닛에서 멸균 가위와 집게를 사용하여 상처 침대를 소비하고 각 침대를 멸균 PBS 1밀리리터에 1밀리리터의 폴리프로필렌 튜브에 배치합니다. 상처 조직을 가위로 다진 후 2시간 동안 분당 300회 회전하여 4°C에서 셰이커에 티슈 조각을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 각 튜브는 PBS에서 세균 유출물을 연렬 희석시키고 LB 천에 희석된 세균 유출물을 도금하여 세균부담을 정량화하기 전에 10초 동안 각 튜브를 소용돌이시다.이미징 광학 시스템을 사용하여 얻은 이 대표적인 이미지는 이 모델이 검출 가능한 발광을 초래한다는 것을 보여줍니다. 이 실험에서, 감염은 3일째에 접종을 하고 생물 발광과 식민지 수를 둘 다에 근거하여 7일 포스트 접종을 지속했습니다. 상처로부터 분리된 박테리아의 배양은 상처당 정량화된 식민지 형성 단위가 검출된 발광과 상관관계가 있음을 더욱 보여준다.비록 초기 급속 한 체중 감소 즉시 주입 후, 식염 수 주사 와 보충 영양 그들의 초기 무게에 쥐를 복원할 수 있습니다. 상기 50%의 상처가 실질적으로 감염될 것으로 계산된 접종용량은 밀리리터당 제2식민지 형성 단위로 약 7.7배 10배로 결정되었다. 밀리리터당 10배 이상 높은 용량은 밀리리터당 100%의 감염률을 초래한다.다양한 국소 및 전신 치료는 슈도모나스 아에루기노사에 대한 새로운 잠재적 인 치료를 조사하기 위해 상처 및 접종 절차 후 적용 될 수있다. 슈도모나스 아에루기노사 및 감염된 마우스와의 모든 작업은 연구원의 기관 생체 안전 및 동물 사용 위원회 지침에 따라 BSL-2 안전 예방 조치로 수행되어야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: 드 브리스, C. R., et.al. 만성 Pseudomonas aeruginosa 상처 감염의 지연 접종 모델. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 투명 필름 드레싱으로 덮인 두 개의 전층 등 피부 상처를 가진 쥐에 발광성 Pseudomonas aeruginosa 를 지연 접종하는 과정을 보여줍니다. 이로 인해 바이오필름 형성과 만성 감염 형성이 촉진됩니다. 정기적인 생물발광 모니터링을 통해 박테리아 부담을 정량화하고 감염 진행 상황을 시간에 따라 추적할 수 있습니다.

만성 Pseudomonas aeruginosa 피부 상처 감염의 마우스 모델 개발 

우리는 마우스 모델에서 지속적인 장기 만성 녹농균기도 감염을 확립하는 한천 비즈 방법을 서술.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

우리는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 기관내 주입에 의한 쥐 폐 손상 모델을 개발했습니다. 이 모델은 폐렴 중 폐 손상을 모방하며 임상적으로 관련이 있습니다.

녹농균 유발 폐 손상 모델

숙주-병원체 상호 작용에 대한 체외 연구는 특정 면역 반응의 특성을 규명할 수 있지만 복잡한 반응의 영향을 관찰하려면 생체 내 모델이 필요합니다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 노출 후 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 매개 폐 감염을 사용하여 인공호흡기 관련 폐렴 병원성과 관련된 미생물 상호 작용에 대한 쥐 모델을 확립했습니다.

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

여기는 실시간, 비-침략 적, 발광 녹 농 균의 biofilm 상처 감염의 모니터링을 위한 털 쥐를 활용 하 여 새로운 당뇨병 murine 모델에 설명 합니다. 이 메서드는 다른 세균성 종 및 다 종 biofilms를 포함 하 여 유전자 변형된 미생물의 감염을 평가 하 고 antibiofilm 전략의 효능 테스트에 적용할 수 있습니다.

라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링

여기는 Candida albicans 피부 주입 후 피부 샘플의 조직학 및 분자 분석을 허용 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜 피부의 구조적 무결성을 유지 하 고 병원 체 분포 및 조직 상주 또는 새로 채용 면역 세포의 지역화에 대 한 수 있습니다.

깊은 피부 주입으로는 모델 조직학 분석 Candida albicans 피부 감염의

만성 상처는 전체 두께 의 상처 후 산화 스트레스의 높은 수준을 유도하여 당뇨병 마우스 모델에 급성 상처에서 개발된다. 상처는 카랄라제와 글루타티온 과산화효소에 대한 억제제로 처리되어 피부 미생물군유전체에 존재하는 박테리아에 의한 치유 및 생물막 발달을 방해합니다.

당뇨병 마우스에서 만성 상처를 만드는 프로토콜

위험한 병원체에 의한 보철 관절 주위 감염(PJI)은 임상 정형외과에서 흔합니다. 기존의 동물 모델로는 PJI의 실제 상황을 정확하게 시뮬레이션할 수 없습니다. 여기에서 우리는 PJI에 대한 새로운 치료제를 연구하고 개발하기 위해 Candida albicans 생물막 관련 PJI 마우스 모델을 구축했습니다.

마우스의 보철 관절 Candida albicans 감염 모델

항생제에 내성이 있는 만성 상처는 의료 시스템에 큰 위협이 됩니다. 생물막 감염은 완고하고 적대적이며 기능적 상처 봉합 부족을 유발할 수 있습니다. 우리는 생물막에 감염된 전층 만성 상처의 임상적으로 관련된 돼지 모델을 보고합니다. 이 모델은 기계론적 연구뿐만 아니라 중재 테스트에도 강력합니다.

생물막 감염 및 보이지 않는 상처의 돼지 모델

현재 만성 세균 감염에 대한 약물 스크리닝에 적합한 생체 내 모델이 부족합니다. 여기에서는 제브라피시 유충에서 지속적인 감염을 일으키기 위해 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 임상 격리 물질에 의한 상처 감염에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Wounded Zebrafish 유충에서 지속적인 녹농 균 감염 모델링

학습하세요 면역정상 마우스에서 지연 접종을 통한 만성 슈도모나스 녹농균 상처 감염 모델을 구축하는 방법을. 이 프로토콜은 세균 병원성 및 숙주-병원체 상호작용 연구에 유용합니다.

만성 슈도모나스 녹농증 상처 감염의 지연 접종 모델

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