Name: 유전자 발현 프로파일링을 위한 수정된 방법으로 시리얼 씨앗에서 고품질 전사 데이터 획득 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 배우세요 시리얼 씨앗에서 고품질 RNA를 분리하고 마이크로어레이 하이브리다이제이션을 수행하여 전사체 프로파일링을 완료하는 방법을. 이 기술은 쌀과 보리의 유전자 발현 변화를 비용 효율적으로 분석하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 CGIAR 주제 영역 글로벌 쌀 농식품 시스템 CRP, 쌀, 아프리카와 남아시아 (STRASA) 단계 III에 대한 스트레스 관용 쌀, 그리고 IZN (작물 식물 연구를위한 학제 센터, 할레 (Saale), 독일에서 지원되고있다. 우리는 그녀의 우수한 기술 지원에 대한 맨디 퓌프펠트와 박사 이사벨 마리아 모라 라미레즈 밀 칩과 정보와 경험을 공유에 감사드립니다. 론다 마이어 박사(RG 이종증, IPK Gatersleben, 독일)의 의견에 감사드리며 원고를 비판적으로 읽어 주셔서 감사합니다.

<ol><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+intact-tissue+sequencing+of+single-cell+transcriptional+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li>
<li>Püffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Developing+Rice+Grain+Transcriptome+Using+the+Agilent+Microarray+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform.</a> Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).</li>
<li>Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalyzing+plant+science+research+with+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Catalyzing plant science research with RNA-seq.</a> Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).</li>
<li>Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+methods+for+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq methods for transcriptome analysis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li>
<li>Radchuk, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+profiling+of+starch+biosynthesis+and+degradation+in+the+developing+barley+grain%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain.</a> Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).</li>
<li>Sreenivasulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+seeds%3A+deciphering+the+molecular+mechanisms+of+seed+storage%2C+dormancy+and+onset+of+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination.</a> Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).</li>
<li>Sreenivasulu, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed-development+programs%3A+a+systems+biology-based+comparison+between+dicots+and+monocots%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).</li>
<li>Butardo, V. M. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+Genetics+Identifies+a+Novel+Regulatory+Domain+of+Amylose+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis.</a> Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).</li>
<li>de Guzman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+glycemic+potential+of+rice+by+unraveling+compositional+variations+in+mature+grain+and+starch+mobilization+patterns+during+seed+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5854(2017).</li>
<li>Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+platforms+and+bioinformatics+tools+for+the+analysis+of+plant+transcriptome+in+response+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress.</a> Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).</li>
<li>Anacleto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+a+genome-wide+association+study+with+a+large-scale+transcriptome+analysis+to+predict+genetic+regions+influencing+the+glycaemic+index+and+texture+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2018).</li>
<li>Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+mapping+of+putative+regulator+genes+of+barley+grain+development+characterized+by+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling.</a> BMC Plant Biology. 9, 4(2009).</li>
<li>Druka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+gene+expression+from+seed+to+seed+through+barley+development%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+%26+Integrative+Genomics%22%5BJournal%5D)">An atlas of gene expression from seed to seed through barley development.</a> Functional & Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+Expression+Atlas+In+Reproductive+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rice Expression Atlas In Reproductive Development.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+gene+expression+atlas+covering+the+entire+life+cycle+of+rice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice.</a> The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).</li>
<li>Yamakawa, H., Hakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+of+rice+grain+filling-related+metabolism+under+high+temperature%3A+Joint+analysis+of+metabolome+and+transcriptome+demonstrated+inhibition+of+starch+accumulation+and+induction+of+amino+acid+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).</li>
<li>Shakoor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sorghum+bicolor+expression+atlas+reveals+dynamic+genotype-specific+expression+profiles+for+vegetative+tissues+of+grain%2C+sweet+and+bioenergy+sorghums%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums.</a> BMC Plant Biology. 14, 35(2014).</li>
<li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+reveals+key+differentially+expressed+genes+involved+in+wheat+grain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Journal%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development.</a> Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).</li>
<li>Kochevenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+QTL+hot+spots+for+malting+quality+in+two+elite+breeding+lines+with+distinct+tolerance+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 18 (1), 106(2018).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

기재된 방법은 고수율 및 고품질 RNA 추출물에 대해 고도로 재현가능한 결과를제공한다(도 1). 우리의 경험에 근거하여, 우리는 분석을 위한 1개의 유전자형, 단계 또는 조건에 대한 3개의 생물학 복제를 추천합니다. 통계적으로 유의미한 차이를 검출할 수 있기 위하여는, mRNA의 일반적인 풍부를 고려되어야 합니다. 그러나 RNA 추출 단계에 대한 삼중 항에 200 mg 조직 샘플의 시작량이 필요합니다. 따라서 유전자 변형 식물 재료와 같은 제한된 양의 샘플이있는 실험의 경우이 방법이 적절하지 않을 수 있습니다.
마이크로어레이 혼성화 동안, 다음 단계는 가장 중요하다: (1) 개스킷 슬라이드에 샘플을 로딩(Step 4.7) 및 (2) 혼성화 후 어레이세척(단계 4.13 및 4.14). 기포 형성과 액체 유출을 방지하기 위해 시료 로딩을 매우 신중하게 수행해야 합니다. 로드된 샘플을 포함하는 개스킷 슬라이드에 마이크로어레이 슬라이드를 넣을 때주의가 필요합니다: DNA 측(점박이 프로브 포함)은 혼성화를 허용하기 위해 아래로 향해야 합니다. 마이크로어레이를 세척하려면 두 번째 세척 단계가 특히 중요합니다: 여기서 세척 버퍼 2에서 슬라이드를 제거하면 데이터 수집 및 분석을 방해할 수 있는 슬라이드의 버퍼 아티팩트를 피하기 위해 매우 느리게(10초) 수행해야 합니다.
다운스트림 생물정보학 분석을 받을 자격이 있는 혼성화 실험에서 결과를 얻으려면 몇 가지 중요한 기준을 따라야 합니다. 위의 프로토콜의 성능 이후에 생성되는 QC 보고서는 개선해야 할 점과 사용 가능한 상태에 있는 데이터를 잘 알 수있습니다(그림 3). 수신된 첫 번째 정보는 시각화된 그리드입니다(그림2). 여기서형광 판독에 대한 모든 영역이 제대로 정렬되었는지 직접 확인할 수 있습니다. 시각적으로 감지 가능한 시프트가 있는 경우 다른 모든 값(배경, 신호 강도 등)에 영향을 미치며 이 칩의 판독값을 사용할 수 없습니다. 개요(모든 이상값의 공간 분포)에서 결과에 영향을 미치는 오염(예: 먼지 또는 머리카락)을 쉽게 발견할 수 있습니다. 칩을 부드럽게 불고 재스캔하여 먼지를 제거할 수 있습니다. 위에서 언급한 신호 플롯의 히스토그램은 사소한 이상값만 있는 넓은 가우스 모양의 곡선을 생성해야합니다(그림 2). 분석된 조직에따라(그림 1),이 곡선은 다르게 보일 수 있으며 두 개의 피크, 또는 어깨가 있는 하나의 우세한 피크를 가지는 것처럼 보일 수 있다. 이는 데이터 품질에 영향을 미치지 않습니다. 강한 시프트 피크 또는 가장자리의 높은 신호만이 세척으로 제거할 수 없는 "녹색 괴물"(너무 높은 형광 강도)과 같은 문제를 나타내며 칩 제조업체에 보고해야 합니다. 또한 "중앙값 신호에 대한 공간 분포 그래프"는 공통 값에 따라 달라야 합니다. 이는 분석된 칩의 일반적인 강도 판독에 따라 40에서 100 사이의 범위에 있어야 합니다. 또 다른 중요한 품질 관리는 데이터의 스파이크 평가입니다: 신호 스파이크에 대한 로그 그래프는 선형 및 일반 라인을 생성해야 합니다. 마지막으로 "평가 메트릭" 표는 수신된 결과를 잘 신뢰할 수 있는 뷰를 제공합니다. 여기서 제조업체는 우수, 양호 및 평가로 분류될 수 있는 다양한 값을제공합니다(그림 3). 우리의 경험에 따르면, 값 중 일부는 항상 모든 칩에 적용 될 수 없습니다. 쌀 사용자 정의 칩의 경우 "nonControl 값"은 자주 범위를 벗어났지만 추가 데이터 처리에는 큰 영향을 미치지 않습니다. 또한, "NegControl"에 대한 범위는 칩의 조직, 유기체 및 일반 출력에 기초하여 <80까지 확장될 수 있다. 가치 E1 메드 CV에 대한 평가 범위는 우리의 경험에 따라 <8 대신 <9로 확장 될 수 있습니다. 이에 따라 모든 칩 판독 데이터를 적절하게 평가할 수 있습니다. 일반적으로 독립적 인 생물학적 복제가 항상 가장 신뢰할 수있는 결과를 준다는 것을 항상 명심해야합니다.
이 기술의 장점은 다른 방법에 비해 전사 프로파일링을 위한 비용 효율적이고 처리량이 높은 방법을 나타낸다는 사실에 있다. 또한 다운스트림 데이터 분석 파이프라인이 더 쉽고 확립됩니다. 장점에도 불구하고 분석 할 수있는 유전자의 수와 같은이 기술의 특정 한계가 있습니다. 마이크로어레이는 어레이에서 이전에 발견된 프로브유전자의 분석을 용이하게 할 수 있습니다. 따라서, 이 기술은 서열된 게놈 및 완전하게 추가된 유전자를 가진 식물 종에만 적용가능하다. 우리는 마이크로어레이 기반 전사체가 유전자 발현 프로파일링뿐만 아니라 유전자 조절 네트워크 분석 및 전사체 전체 협회 연구와 같은 다른 다운스트림 생물 정보학 파이프라인에도 매우 유용하고 관련성이 있을 것으로 구상합니다.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.
The&#160;names were&#160;corrected from:
Christianne&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreeenivasulu
to:
Christiane&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreenivasulu

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.

Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

전사체는 주어진 시간 및 특히 환경 및 성장 조건에서 유기체의 게놈에 의해 발현되는 리보핵산(RNA) 전사체의 완전한 세트를 나타낸다. 각 세포에는 그것의 현재 생리학 및 신진 대사 상태를 반영하는 그것의 개별 적인 전사체가 있습니다. 유사한 조직 또는 기관에서 유래한 세포의 집합은 전형적인 전사체 연구에서 사용되지만, 단세포 및 공간적으로 해결된 전사체학은 인기를 얻고 있다1. 전사성 분석은 특정 시점 및 정의된 성장 조건에서 선택된 조직에서 전체 RNA를 추출하는 것으로 시작합니다. 이를 위해, 시리얼 종자2와같은 전분 또는 당도가 높은 샘플로부터 총 RNA를 추출하기 위해 새롭게 개발된 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 다른 견본 중 전사체의 비교는 다른 풍부를 가진 RNA 분자의 확인에서 유래합니다. 이 RNA 분자는 분분하게 발현된 유전자 (DEGs)로 간주됩니다. 특정 마커 유전자로부터 유래된 풍부한 전사체는 발달 상태를 추정하거나 환경 변동에 대한 유기체의 반응을 결정하는 데 사용될 수 있다. 연구 하에 발달 시간 점에 걸쳐 그들의 전사체 풍부에 있는 검출 가능한 변경이 없는 유전자는 수시로 참조 또는 하우스키핑 유전자로 이용됩니다.
RNA는 전형적으로 북부 블로팅 및 정량적 역염합효소 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)과 같은 다양한 방법에 의해 검출되고 정량화되지만, 현재의 고처리량 전사체 는 마이크로어레이 기술뿐만 아니라 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)을 이용한 핵산 혼성화에 크게 의존한다. RNA-Seq는 다른 곳에서 검토된 바와 같이 높은 처리량 전사체 애플리케이션에 대한 몇 가지 이점을 제공하기 때문에 현재 매우 인기가있다3,4. 이전 기술이지만, 마이크로어레이 칩을 이용한 유전자 발현 프로파일링은 생물정보학에 대한 배경 지식이 적게 필요한 더 확립된 기술이기 때문에 여전히 널리 사용되고 있습니다. RNA-Seq에 비해 마이크로어레이 실험에서 생성된 데이터 세트는 더 작고 분석하기 쉽습니다. 또한, 특히 큰 샘플 수를 처리하는 경우 비용 효율적입니다. 우리의 실험실에서는, 우리는 일상적으로 마이크로어레이 기술을 사용하여 전사학 분석을 사용하여 곡물,5, 6,67,78,,9의성장, 발달 및 신진 대사에 관여하는 분자 네트워크 및 경로를 제어하는 중앙 규제 허브의 역할을 결정합니다.5 우리는 또한 정기적으로 비생물성 스트레스10에곡물 곡물의 반응의 기계론적 이해를 얻기 위해 게놈 전체 유전자 발현 프로파일링 연구를 수행하기 위해, 뿐만 아니라 전사체 전체 협회 (TWAS) 및 시리얼 곡물 품질과 영양에 대한 책임 있는 유전자를 식별하기 위한 연계 매핑 연구의 수행11,,12. 다른 그룹은 또한 보리 13, 쌀,14,15,16,사탕수수17,및 밀18에서개발 특이적 유전자 발현 아틀라스를 제공하는 마이크로어레이 기술을 사용했다.14,
이 출판물의 목적은 애질런트 마이크로어레이 플랫폼을 사용하여 시리얼 곡물의 전사 프로파일링을 위해 현재 실험실에서 사용하는 방법에 대한 간략한 텍스트 요약 및 자세한 시각적 설명을 제공하는 것입니다. 다른 마이크로어레이 플랫폼을 사용할 수 있지만 이 방법에서는 다루지 않습니다. 우리는 시리얼 씨앗을 개발하거나 발아시키는 RNA 추출에 대한 자세한 설명을 제시하여 프로토콜을 시작합니다. 우리의 경험에 기초하여, 시리얼 종자 조직을 사용할 때 다운스트림 전사성 분석에 대한 높은 품질및 높은 수량의 전사체를 획득하는 것은 종종 병목 현상이다. 우리는 몇몇 상업적으로 유효한 RNA 추출 키트를 시도했습니다, 그러나 아무도 만족스러운 결과를 제공하지 않았습니다. 따라서, 우리는 시판되는 키트를 사용하여 컬럼 정제를 실시한 후 조 RNA 추출물을 얻기 위해 화학 적 추출 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 전사체 프로파일을 생성하기 위해 상이한 다운스트림 애플리케이션에 사용될 수 있는 고품질 RNA2(그림 1)를정기적으로 그리고 재현가능하게 얻는다.

<table><tbody><tr><td>&szlig;-메르캅토에탄올</td><td>Roth</td><td>4227.3</td><td>사용 직전에 300 ul을 20 mL RNA 추출 버퍼에 추가</td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>RNA 추출물의 품질과 양을 결정하기 위해</td></tr> 분쇄<tr><td>된 제빙기</td><td>다양한 브랜드</td><td></td><td>샘플 처리 중 샘플을 얼음에 유지하기 위해</td></tr><tr><td>Dewar 플라스크</td><td>다양한 브랜드</td><td></td><td>액체 질소 용기로 사용</td></tr><tr><td>에탄올, 절대</td><td>Roth</td><td>9065.1</td><td></td></tr><tr><td>유전자 발현 혼성화 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5242</td><td>키트 구성 요소: 2X Hi-RPM 혼성화 버퍼 25X 단편화 버퍼 10X 유전자 발현 차단제</td></tr><tr><td>유전자 발현 세척 버퍼 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5325</td><td>Kit 구성 요소: 유전자 발현 세척 버퍼 1 유전자 발현 세척 버퍼 2 Triton X-102</td></tr><tr><td>히트 블록</td><td>다양한 브랜드</td><td></td><td>1.5 ml 튜브에 대해 적어도 하나의 히트 블록과 2.0 ml 튜브에 대해 다른 하나를 가지는 것이 권장됩니다</td></tr><tr><td>. 하이브리드화 오븐</td><td>Agilent</td><td>G2545A</td><td>마이크로어레이 하이브리드화를 위해 설계된 스테인리스 스틸 오븐 Sheldon Manufacturing에서 하룻밤 사이에 마이크로어레이에서 샘플을 하이브리드화하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>하이브리드화 개스킷 슬라이드 키트</td><td>Agilent</td><td>G2534-60014</td><td></td></tr><tr><td>iQAir 공기 청정기</td><td></td><td></td><td>실험이 저오존 영역에서 수행되도록 하기 위해</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Roth</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>보푸라기가 없는 종이, Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>KC34155</td><td></td></tr><tr><td>Low Input Quick Amp 라벨링 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2305</td><td>키트 구성 요소: T7 Primer 5x First Strand Buffer 0.1M DTT 10 mM dNTP Mix AffinityScript RNAse Block Mix 5x Transcription Buffer NTP Mix T7 RNA Polymerase Blend Nuclease-free water Cyanine 3-CTP</td></tr><tr><td>Metal spatula, 작은</td><td></td><td></td><td>: 작은 금속 주걱이 마이크로분리 튜브에 들어갈 수 있는지 확인하여 샘플을 쉽게 퍼낼 수 있습니다.</td></tr><tr><td>마이크로어레이 스캐너</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Agilent SureScan 또는 Agilent C 마이크로어레이 스캐너 권장</td></tr><tr><td>마이크로분리관, 뉴클레아제 무함유</td><td>다양한 브랜드</td><td></td><td>2.0 mL 및 1.5 mL 용량</td></tr><tr><td>마이크로원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>1.5 ml 및 2.0 ml 마이크로분리관 각각 24개를 수용할 수 있는 로터가 있는 상온 및 저온 마이크로분리를 하나 이상 보유하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>미니 인큐베이터</td><td>Labnet</td><td>I5110-230V</td><td>작은 인큐베이터라면 누구나 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>모르타르 및 유봉</td><td></td><td></td><td>액체 질소를 사용한 극저온 분쇄를 견딜 수 있는 작은 세라믹 또는 대리석 모르타르 및 유봉.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Peqlab / Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Biozym</td><td>351900302</td><td></td></tr><tr><td>One-Color RNA 스파이크인 키트</td><td>Agilent</td><td>5188-5282</td><td>키트 구성 요소: One color RNA Spike-Mix Dilution Buffer</td></tr><tr><td>Ozone barrier slide cover kit</td><td>Agilent</td><td>G2505-60550</td><td>옵션이지만 강력히 권장되는</td></tr><tr><td>PCR 튜브, 0.2 mL, RNase-free</td><td>Stratagene</td><td>Z376426</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 뉴클레아제 프리, 필터 팁</td><td>다양한 브랜드</td><td></td><td>2, 20, 20, 100, 200 및 1000 ul 용량 수용</td></tr><tr><td>피펫터 세트</td><td>다양한 브랜드</td><td></td><td>2, 20, 20, 100, 200 및 1000 ul 용량의</td></tr><tr><td>경우 RNA 추출 버퍼</td><td>10 mM Tri-HCl pH 8.0 150 mM LiCl 50 mM EDTA 1.5% EDTA 15 ul/mL &beta;-mercaptoethanol</td><td></td><td>우리는 일상적으로 Roth 또는 Sigma 화학 물질을 사용합니다. &beta;-mercaptoethanol fresh daily</td></tr><tr><td>RNase-free DNase set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Kit components: RNeasy mini spin column (pink) 1.5 ml 수집 튜브 2 ml 수집 튜브 버퍼 RLT 버퍼 RW 버퍼 RPE 뉴클레아제가 없는 물</td></tr><tr><td>RNeasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74904</td><td>키트 구성 요소: RNeasy 미니 스핀 컬럼 (핑크) QIAshredder 스핀 컬럼 (보라색) 1.5 ml 수집 튜브 2 ml 수집 튜브 버퍼 RLT 버퍼 RLC 버퍼 RW1 버퍼 RPE DNA 마이크로어레이 스캐너용 뉴클레아제가 없는 워터</td></tr><tr><td>슬라이드 홀더</td><td>Agilent</td><td>G2505-60525</td><td></td></tr><tr><td>탈착식 랙이 있는 슬라이드 염색 접시</td><td>DWK Life Sciences 900200</td><td>Fisher Scientific 08-812</td><td>우리는 DWK Life Sciences Wheaton&trade를 추천합니다; 탈착식 랙이 있는 유리 20-슬라이드 염색 접시 (접시, 커버, 유리 슬라이드 랙 완비)</td></tr> <tr><td>염화나트륨</td><td>Roth</td><td>P029.1</td><td></td></tr><tr><td>초저온 냉동고</td><td>다양한 브랜드</td><td></td><td>-80°C에서 샘플을 저장할 수 있음; C</td></tr><tr><td>와류 믹서</td><td>다양한 브랜드</td><td></td> : <td>단일 튜브 와류 믹서 용 하나 이상, 여러 튜브를 와류 혼합 할 수있는 다른 하나</td></tr></tbody></table>

유전자 발현 프로파일링을 위한 수정된 방법으로 시리얼 씨앗에서 고품질 전사 데이터 획득

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

유전자 발현의 특성화는 RNA 품질에 의존한다. 발아, 개발 및 성숙한 시리얼 씨앗에서 고품질 RNA의 추출은 종종 높은 전분과 당도에 의해 방해됩니다. 이들 화합물은 추출된 총 RNA의 수율 및 품질을 모두 감소시킬 수 있다. 총 RNA의 양 및 질의 악화는 이후에 하류 전사체 분석에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 이는 시험중인 샘플의 유전자 발현 프로필의 공간 및/또는 시간적 변이를 정확하게 반영하지 못할 수 있다. 이 프로토콜에서는 시리얼 곡물의 전체 전사체 분석에 사용할 수 있는 충분한 양과 품질을 가진 총 RNA의 추출을 위한 최적화된 방법을 설명합니다. 기재된 방법은 개발, 발아 및 성숙한 시리얼 종자의 전사체 프로파일링에 사용되는 여러 다운스트림 애플리케이션에 적합합니다. 마이크로어레이 플랫폼을 이용한 전사체 프로파일링의 방법이 도시된다. 이 방법은 특별히 기재된 게놈 서열을 가진 곡물의 유전자 발현 프로파일링을 위해 고안되었다. 마이크로어레이 처리에서 최종 품질 관리에 이르는 상세한 절차에 대해 설명합니다. 여기에는 cDNA 합성, cRNA 라벨링, 마이크로어레이 혼성화, 슬라이드 스캐닝, 기능 추출 및 데이터 품질 검증이 포함됩니다. 이 방법에 의해 생성된 데이터는 발아 시, 다양한 입자 발달 단계 또는 상이한 생체 또는 비생물적 스트레스 조건에서 곡물의 전사체를 특성화하는 데 사용될 수 있다. 여기에서 제시된 결과는 상분적으로 표현된 유전자의 결정 (DEGs), 유전자 조절 네트워크의 특성화 및 전사체 전체 협회 연구 (TWAS)를 수행과 같은 다운스트림 생물 정보학 분석을 위한 고품질 전사학 데이터를 예시합니다.

이 방법은 상당한 양의 오염 전분 또는 설탕을 포함하는 시리얼 종자 샘플을 추출하는 데 최적화되어 있습니다. 그것은 하루에 24 종자 샘플에서 총 RNA를 추출하도록 설계되었습니다. 하루에 지속적으로 수행해야 하지만 프로토콜 전체에서 선택적 중지 및 일시 중지 지점이 식별됩니다. 대안적으로, 리더는 그들의 바람직한 RNA 추출 키트 또는 수동 화학적 추출 방법을 사용할 수 있다. 그러나, 우리의 이전 경험에 따라, 상업적으로 사용 가능한 식물 RNA 추출 키트 는 전분, 단백질, 설탕 및/또는 지질 오염의 상당한 금액으로 인해 씨앗에 적합 하지 않습니다. 기재된 방법에서, 원유 RNA의 화학적 추출은 상업적RNA 추출 키트를 이용한 컬럼 정제가 뒤따른다. 이것은 전형적으로 더 높은 질 및 수율을 가진 RNA를 제공합니다. 도 1은 여기에 설명된 방법을 사용하여 RNA 추출의 품질을 테스트하기 위해 BioAnalyzer 실행의 결과를 보여줍니다. 결과는 보리 잎(낮은 전분 함량 샘플을 나타내는 샘플 1 및 2) 및 보리 종자(높은 전분 함량 샘플을 나타내는 샘플 3 및 4)에 대해 제시된다. 모든 샘플에 대한 RNA 무결성(RIN) 값은 10입니다.
도 1은 정제된 RNA 추출물의 대표적인 겔을 나타내며, 여기서 품질은 바이오분석기를 사용하여 시험하였다. 샘플 1과 2는 엽록체에서 추가 rRNA 밴드가 분명한 보리 잎과 같은 낮은 전분 함량 샘플에 대한 전형적인 결과입니다. 시료 3 및 4는 보리 종자와 같은 높은 전분 함량 샘플에 대한 대표적인 결과이며, 18S 및 28S rRNA를 나타냈다. 엽록체 rRNA로 인해 잎 샘플과 같은 녹색 식물 조직에 대해서는 자동화된 RIN 값을 계산할 수 없습니다. 그러나, 무결성 및 높은 품질은 일반적으로 낮은 분자 얼룩으로 나타나는 어떤 분해 제품의 부재에 의해 시각적으로 확인 될 수있다. 보리 종자 와 같은 고전분 종자 샘플에 대한 RIN 값은 전형적으로 이 백서에 기재된 프로토콜을 사용하여 10이다.
또한, 우리는 또한 여기에 맥아 품질19의분석에 사용되는 두 개의 엘리트 보리 근친 선 (소피아라와 빅토리아나)의 시간 과정 실험의 대표적인 데이터를 제시한다. 맥아 처리 중에 전분은 설탕으로 변환됩니다. 따라서, 견본은 전분과 설탕 내용의 다양한 비율을 가진 조직을 나타냅니다. 산업용 맥아 가공공정이 발아 공정과 유사하기 때문에 맥아 품질이 다른 두 보리 라인의 전사체를 분석했습니다. RNA는 생물학적 삼중체에서 의imbibition 후 2, 24, 48, 72, 120, 144 및 196 h에서 발아 씨앗으로부터 추출되었다. 맞춤형 보리 마이크로어레이 칩에 대한 RNA 제제 및 혼성화를 전술한 바와 같이 수행하였다. 도 2는 검출된 신호에 대한 품질 관리(QC)보고서(도 3)및 히스토그램 플롯에 주어진 마이크로어레이 혼성화로부터 판독된 정규화된 그리드를 나타낸다. 그리드는 교정에 사용되는 배경 및 스파이크 인 읽기 점을 포함하여 칩의 각 모서리에서 파생 된 신호의 예를 제공합니다. 히스토그램은 각각의 신호 강도가 있는 검출 가능한 점의 편차를 나타냅니다. 성공적인 혼성화는 그림과 같이 사소한 이상값만 있는 넓은 가우시안 모양의 곡선을 제공합니다. 혼성화가 실패하면 한쪽쪽으로 강한 변화가 생길 수 있습니다("녹색 괴물").
마지막으로, 허용 가능한 값의 대표적인 결과는 그림 3의열 4에 나와 있습니다. 수행된 실험의 신뢰성을 나타내기 위해 GeneSpring 소프트웨어를 사용하여 결과를 추가로 평가합니다. 수집된 데이터는 주 성분 분석(PCA)으로 표시됩니다. PCA는 선택한 점(유전자)의 값을 벡터로 통합합니다. 사용되는 평가된 점의 수는 수백 개에서 전체 칩까지 다양할 수 있으며 사용되는 소프트웨어에 따라 다릅니다. 각 칩(샘플)은 분석된 도트에 대한 통합 신호 강도로부터 초래된 하나의 값(벡터)을 초래한다. 따라서 그래프(PCA)의 상대적 위치는 샘플이 서로 유사성을 나타낸다. 샘플이 가까울수록 더 비슷합니다. 기술 복제는 생물학적 복제보다 더 가까워야 하며, 샘플의 생물학적 복제는 서로 다른 시간 지점, 조직 또는 조건의 샘플보다 서로 더 가깝게 클러스터되어야 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig1.jpg"> 그림 1: 바이오분석기를 통해 RNA의 품질을 확인한 후 얻은 전기동아 파일 실행 요약. 샘플 1 및 2는 엽록체로부터의 추가리보좀 밴드에 의해 지시된 바와 같이 보리 잎 조직이다. 샘플 3 및 4는 18S 및 28S rRNA 대역을 도시한 보리 종자 조직이다. RIN 인자는 잎과 같은 녹색 조직에 대해 항상 계산되지는 않지만 젤에 따르면 RNA의 품질이 매우 좋습니다. 샘플 3 및 4의 RIN 값은 10입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig2.jpg"> 도 2: 성공적인 보리 마이크로어레이 혼성화로부터의 QC 보고서. A +는 칩의 모든 모서리에서 그리드에서 감지된 신호를 나타냅니다. 히스토그램은 배경 빼기 후 로그백으로 신호 강도 (형광)에 따라 분류 된 신호의 수를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig3.jpg"> 그림 3: 혼성화 및 스캐닝 후 품질 관리(QC)의 요약. 하이브리드 슬라이드의 값은 열 2(값)에 지정되고 허용 가능한 값의 범위는 열 4에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>세척 챔버 어셈블리</td>
			<td>콘텐츠 및 레이블</td>
			<td>목적</td>
		</tr>
<tr>
<td>디쉬 1</td>
			<td>비어 있는 다음 날까지 실험실 벤치에 두십시오.</td>
			<td>마이크로어레이 슬라이드를 분해하는 데 사용되는 세척 버퍼 1로 채우기</td>
		</tr>
<tr>
<td>디쉬 2</td>
			<td>하나의 마이크로어레이 슬라이드 랙과 작은 자기 교반 막대를 추가합니다. "세척 버퍼 1"로 라벨을 붙인 다음 날까지 실험실 벤치에 둡니다.</td>
			<td>다음날 세척 버퍼 1로 마이크로어레이 슬라이드를 세척하는 데 사용됩니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>디쉬 3</td>
			<td>작은 마그네틱 교반 막대 1개를 넣고 "세척 버퍼 2"로 라벨을 부착하고 37°C 미니 인큐베이터에 넣습니다.</td>
			<td>37 °C 미니 인큐베이터 내부에 다음날 세척 버퍼 2로 마이크로 어레이 슬라이드를 세척하는 데 사용됩니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 세척 챔버 어셈블리의 제조.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>접시</td>
			<td>워시 버퍼</td>
			<td>온도</td>
			<td>시간</td>
		</tr>
<tr>
<td>디스어셈블리</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">주위</td>
			<td rowspan="2">가능한 한 빨리</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4.13단계)</td>
		</tr>
<tr>
<td>첫 세척</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">주위</td>
			<td rowspan="2">1분</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4.14단계)</td>
		</tr>
<tr>
<td>세컨드 워시</td>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">37 °C</td>
			<td rowspan="2">1분</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4.15단계)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 세척 챔버 어셈블리에 대한 인큐베이션 온도 및 시간.

곡물의 전사체 프로파일링을위한 방법이 제시된다. 마이크로어레이 기반 유전자 발현 프로파일링은 시리얼 곡물로부터 고품질의 총 RNA를 분리하는 것으로 시작하여 cDNA 생성을 계속합니다. cRNA 라벨링 및 마이크로어레이 혼성화 후 신호 감지 및 품질 관리를 위한 권장 사항이 제공됩니다.

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

이 마이크로어레이 혼성화 방법은 알려진 게놈과 유기체로부터 많은 수의 샘플을 비교하는 데 유용합니다. 높은 처리량 시퀀싱 접근 방식에 비해, 이 방법에 의해 생성된 데이터의 양은 훨씬 더 쉽게 처리되고, 더 비용 효율적인 방법으로 분석될 수 있다. 절차를 시연하는 것은 게이틀벤의 IPK에서 로지스의 연구 그룹에서 일하는 박사 후 과학자 인 크리스티안 세일러 박사가 될 것입니다.유전자 발현 혼성화 키트를 사용하여 마이크로어레이 혼성화를 수행하기 전에 제조업체의 사양에 따라 10X 차단제를 준비하고 200 마이크로리터 부피를 통해 결과 차단제를 알리쿼트한다. 그런 다음 차단제를 사용 전까지 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. 마이크로어레이 혼성화 당일, 얼음에 10X 차단제의 200 마이크로리터 알리쿼트 1개를 해동하고 혼성화 오븐을 섭씨 65도, 열블록을 섭씨 60도로 예열한다.제조업체에서 설명한 대로 각 샘플에 대한 조각화 믹스를 준비하고 샘플을 소용돌이에 부드럽게 혼합합니다. 소용돌이 후, 잠시 60섭씨 열 블록에서 정확히 30 분 동안 배양하기 전에 미세 원심 분리기에서 샘플을 아래로 회전합니다. 인큐베이션의 끝에서, 즉시 2X 유전자 발현 혼성화 버퍼의 25 마이크로 리터로 단편화를 중지하기 전에 얼음에 각 튜브를 냉각, 튜브 당 분당 높은 회전.부드러운 파이펫팅과 섞어 거품을 소개하지 않도록 세심한 주의를 기울이고, 주변 실온에서 튜브를 원심분리합니다. 스핀이 끝나면 모든 튜브를 얼음에 즉시 놓고 각 샘플을 가능한 한 빨리 마이크로어레이 슬라이드에 로드합니다. 다음으로 각 혼성화 믹스의 44마이크로리터를 각 개스킷중앙에 천천히 분배하여 거품을 유입하지 않도록 주의하고, 사용하지 않은 유정에 44마이크로리터의 하이브리드화 버퍼를 추가합니다.즉시 마이크로어레이 슬라이드를 개스킷 슬라이드 위에 올바른 방향으로 배치하여 액체를 흘리지 않도록 주의하고 혼성화 조립을 단단히 닫습니다. 어셈블리를 회전하여 고정기기의 부족을 확인하고 혼성화 챔버 어셈블리를 혼성화 오븐 회전기로 배치합니다. 회전 속도를 분당 10회전으로 설정한 다음 정확히 17시간 동안 섭씨 65도에서 혼성화를 시작합니다.샘플이 혼성화되는 동안 테이블에 설명된 대로 적절한 세척 버퍼에 세 개의 세척 접시 어셈블리를 준비합니다. 정확히 17시간 동안 혼성화한 후, 보풀 프리 페이퍼가 늘어선 실험실 벤치에 하나의 하이브리드화 챔버를 분해하고 완충제의 전체 슬라이드를 잠크지 않고 비스듬히 기울어진 위치에 마이크로어레이 바코드가 있는 세척 버퍼 1개를 함유한 접시에 마이크로어레이 샌드위치 1개를 전달합니다. 집게를 사용하여 두 개의 유리 슬라이드를 분리하고 개스킷 슬라이드가 접시 바닥에 부드럽게 떨어지면서 마이크로 어레이 슬라이드에 단단히 그립을 유지합니다.마이크로어레이 슬라이드를 옆으로 천천히 들어 올려 공기에 최소한의 노출로 2접시의 마이크로어레이 랙으로 즉시 이동합니다. 8개의 슬라이드가 랙을 따라 고르게 배치되면 랙 홀더를 부착하고 전체 접시 2개의 설정을 자기 교반기로 옮길 수 있습니다. 정확히 1분 동안 설정을 부드럽게 저어줍니다.시료가 교반되는 동안, 37도 섭씨 인큐베이터에서 제2자교교로 접시 3편을 옮겨줍니다. 그런 다음 거품을 형성하지 않고 3 접시에 37도 세척 버퍼 2를 부드럽게 추가합니다. 교반 인큐베이션이 끝나면 슬라이드 랙을 부드럽게 천천히 옮기고 3접시에 넣고 랙 홀더를 제거합니다.정확히 1 분 동안 저은 후, 천천히 부드럽게 접시에서 슬라이드 랙을 제거하고 조심스럽게 각 슬라이드의 양쪽을 건조, 건조로 슬라이드 상자에 각 슬라이드를 배치 보풀 무료 종이를 사용합니다. 슬라이드가 15분 동안 건조할 수 있도록 허용한 후 각 마이크로어레이 슬라이드를 슬라이드 홀더로 옮기고 바코드가 켜진 바코드 에 따라 조립된 슬라이드 홀더를 스캔 슬라이드 및 시퀀스로 로드합니다. 그런 다음 슬라이드를 즉시 스캔합니다.이 그림에서, RNA 추출의 품질을 테스트하기 위한 실행으로부터의 대표적인 결과가 나타난다. 보리 잎과 같은 낮은 전분 함량 샘플의 전형적인 분석에서 엽록소에서 추가 리보소말 RNA 밴드가 분명합니다. 보리 씨와 같은 높은 전분 함량 샘플은 18 및 28S 리보소말 RNA를 전시합니다.엽록소 리보소말 RNA로 인해 잎 샘플과 같은 녹색 식물 조직에 대해 자동화된 RNA 무결성 번호 값을 계산할 수 없습니다. 본 대표적인 분석에서, 맞춤형 보리 마이크로어레이 칩에 대한 RNA 제제 및 혼성화가 입증된 바와 같이 수행되었다. 그리드는 보정에 사용되는 판독 점의 배경 및 스파이크를 포함하여 칩의 각 모서리에서 파생된 신호의 예를 보여 주며 있습니다.히스토그램은 각각의 신호 강도가 있는 검출 가능한 점의 편차를 나타냅니다. 관찰된 바와 같이, 성공적인 혼성화는 사소한 이상치만으로 광범위한 가우시안 모양의 곡선을 제공합니다. 여기에 검출된 신호에 대한 품질 관리 보고서가 표시됩니다.혼성 슬라이드의 값은 열 2에 주어지며 허용 가능한 값의 범위가 열 4에 표시됩니다. 이 방법은 게놈에 대한 실질적인 정보가 제공되는 모든 유기체에 대한 실험 설정을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 실험실에서 성장 스트레스 유도 후 발생하는 쌀과 보리의 전사적 변화를 비교하고 분석할 수 있었습니다.

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Research

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