인간의 혈류를 모방하는 흐름 루프 모델에서 혈액 접촉 임플란트의 혈적합성 테스트
2020년 3월 5일
이 프로토콜은 레이저 컷 신경 혈관 임플란트를 사용하여 혈액 접촉 장치의 포괄적 인 혈전 성 평가를 설명합니다. 신선한, 헤파린화 인간의 혈액과 흐름 루프 모델은 혈류를 모방하기 위해 적용됩니다. 관류 후, 다양한 혈액학적 마커를 분석하고 시험된 장치의 혈적합성 평가를 위해 혈액 수집 직후 얻은 값과 비교한다.
이 프로토콜은 국제 표준 기구 지침에 따라 혈액 접촉 장치의 혈중 호환성 조사를위한 모델을 제시합니다. 이 모델은 혈전 증시에 대한 낮은 배경과 항응고제의 낮은 농도가 혈액 파라미터의 광범위한 분석을 가능하게 하기 때문에 임플란트에 대응하는 생리적 조건을 모방하는 데 이상적입니다. 이 방법은 혈전 호환성을 평가하는 간단한 방법을 제공하기 때문에 생체 재료 연구에 이상적입니다.
또한, 그것은 전임상 연구에 사용할 수 있습니다. 헤파린 로딩의 경우, 최초 혼합 5, 000 국제 단위의 희석되지 않은 헤파린과 0.9% 염화 나트륨을 사용하여 헤파린 농도의 밀리리터당 15개의 국제 유닛을 획득한다. 다음으로, 희석된 헤파린 용액의 마이크로리터 900을 기증자 당 3개의 중성 모노베트에 추가하고 헤파린로드 모노벳을 섭씨 4도에 보관합니다.
혈액 샘플 수집 30분 전에 모노벳을 실온에 놓습니다. 모노베트가 따뜻해지자 기증자 당 3개의 모노벳에 9밀리리터의 혈액을 모아 각 기증자의 27밀리리터를 모두 단일 플라스틱 용기에 넣습니다. 흐름 루프를 준비하려면 신경혈관 레이저 절단 임플란트와 조건당 적어도 하나의 튜브를 적재하고 각 튜브의 한쪽 끝을 0.9%의 염화나트륨으로 채워진 저수지에 놓습니다.
언로드된 튜브를 저수지에 넣고 모든 튜브를 펌프 헤드에 연결합니다. 그런 다음 각 튜브의 다른 끝을 측정 실린더에 삽입하고 연막 펌프의 설정을 측정 실린더의 채우기 레벨을 확인하는 동안 타이머를 사용하여 분당 150 밀리리터의 유속으로 조정합니다. 혈우호환성 테스트를 위해 12밀리리터 주사기를 사용하여 각 튜브에 6밀리리터의 혈액을 채웁니다.
회로를 형성한 후 튜브를 연결하는 실리콘 길이0.5센티미터를 사용하여 튜브를 단단히 닫고 튜브를 섭씨 37도의 수조에 놓습니다. 그런 다음 60 분 튜브를 시작합니다. 전체 혈액 수 분석을 위해, EDTA를 포함하는 개별 monovettes에 관류 후에 각 관성 에서 1.2 밀리리터 또는 1.2 밀리리터의 혈액을 추가합니다.
모노벳을 5번 조심스럽게 반전시키고 각 샘플의 혈액 수 분석을 위해 바이알을 혈액 분석기로 로드합니다. 분석이 끝나면 단색을 얼음 위에 15-60분 간 놓습니다. 구연산 플라즈마 수집의 경우, 구연산염 함유 모노벳을 1.4 밀리리터의 무응응또는 퍼퓨즈 혈액으로 채우고 각 모노벳을 5번 조심스럽게 반전시다.
플라즈마를 원심분리하여 분리하고 혈장 분획의 3개의 250 마이크로리터 알리쿼트를 개별 1.5 밀리리터 반응 튜브로 옮긴다. 그런 다음 플라즈마 샘플을 액체 질소로 동결하고 분석 할 때까지 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. EDTA 플라즈마 수집의 경우, 혈액 카운트 측정 후 섭씨 4도 의 배양 후, 원심분리로 플라즈마를 분리하고 혈장 분획의 3 개의 250 마이크로 리터 알리쿼트를 개별 1.5 밀리리터 반응 튜브로 옮긴다.
그런 다음 액체 질소로 플라즈마 샘플을 영하 20도 저장합니다. CTAD 플라즈마 수집의 경우 CTAD 함유 모노벳을 2.7 밀리리터의 갓 뽑거나 침투한 혈액으로 채우고 튜브를 5번 조심스럽게 반전시십시오. 원심분리로 플라즈마를 수집하기 전에 15-60분 동안 단검을 얼음 위에 놓습니다.
각 중간 플라즈마 분획의 700마이크로리터를 개별 1.5 밀리리터 반응 튜브로 옮기고 충전된 반응 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 중간 분획의 100 마이크로리터 알리쿼트 2개를 개별 1.5 밀리리터 반응 튜브로 옮기고 액체 질소로 튜브를 영하 20도에서 보관할 수 있도록 동결합니다. 구연산 플라즈마 샘플의 TAT 수준을 측정하려면 96웰 의 평평한 바닥 플레이트와 50 마이크로리터의 혈장 표준, 플라즈마 제어 및 희석되지 않은 플라즈마 샘플의 각 웰에 50 마이크로리터를 플레이트의 적절한 우물에 중복하여 추가합니다.
접시를 밀봉 한 후, 부드러운 흔들림으로 15 분 동안 섭씨 37도에서 샘플을 배양하십시오. 인큐베이션이 끝나면, 각 웰에 100 마이크로리터의 퍼록시다아제 공액을 첨가하기 전에 잘 세척용 300 마이크로리터로 플레이트를 세 번 세척한다. 섭씨 37도에서 15분 간 배양한 후, 300마이크로리터의 신선한 세척용액으로 접시를 세 번 씻습니다.
마지막 세척 후, 실온에서 30 분 배양에 대한 잘 당 갓 준비 된 염색체 용액 100 마이크로 리터를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 각 우물에 100 마이크로리터의 정지 용액을 추가하고 각 샘플의 TAT 농도를 계산하기 위한 추세선으로 표준 곡선 데이터를 사용하여 490 내지 500 나노미터의 광미터에 광학 밀도를 판독한다. 전자 현미경 검사용 임플란트를 준비하려면 집게를 사용하여 튜브에서 임플란트를 제거하고 세척당 0.9 % 염화 나트륨으로 각 임플란트를 세 번 간략하게 헹구십시오.
마지막 세척 후, 칼슘과 마그네슘없이 PBS에 2 % 글루타랄데히드의 개별 용기에 임플란트를 저장 4 섭씨. 다음 아침, PBS의 개별 용기에 임플란트를 10분 동안 배양한 후 에탄올 농도에서 임플란트를 농도당 10분 동안 탈수합니다. 혈액 수집 및 관류 직후, 백색 또는 적혈구의 수 또는 헤마토크염 값에서 아무 변화도 검출되지 않습니다.
그러나, 헤모글로빈 수준의 감소는 흐름 루프 시스템 내의 관류 후 검출된다. 혈소판 수의 감소도 관찰되며, 이는 튜브 내에 코팅되지 않은 스텐트가 존재할 때 증가합니다. 특히, 혈액이 피브린 헤파린 코팅 스텐트로 배양 될 때이 손실은 감소된다.
TAT 복합 농도는 관류에 반응하여 약간 증가한다. 그러나 베어 메탈 스텐트가 추가되면 TAT가 크게 증가하여 응고 시스템의 심오한 활성화를 나타냅니다. 피브린 헤파린 코팅 스텐트를 사용하면 이러한 활성화가 방지됩니다.
관류는 코팅되지 않은 또는 피브린 헤파린 코팅 스텐트의 존재에 의해 영향을받지 않는 칭찬 폭포의 증가 활성화로 이어집니다. 유사하게, 호중구 과립구는 다형성 핵 호중구 엘라스테아제 수준의 정량화에 의해 입증된 바와 같이 활성화된다. 전자 현미경 검사를 스캔하여 시각화는 피브린 헤파린 코팅 스텐트에서 관찰되지 않는 관류 후 코팅되지 않은 스텐트의 표면에 혈액 세포와 단백질의 조밀 한 네트워크의 존재를 밝혀.
혈액이 샘플을 얻기위한 포함 기준을 충족하고 가능한 한 빨리 갓 그린 혈액을 사용하는 것이 가장 중요합니다. 인간의 혈액은 혈액 바이러스 및 그밖 에이전트를 포함할 수 있고 감염의 리스크를 전송할 수 있습니다 그래서 견본을 취급할 때 항상 적당한 PPE를 착용하십시오.
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개요
본 프로토콜은 레이저 절삭 신경혈관 이식체를 이용한 혈액 접촉 기기의 혈액 적합성 조사를 위한 모델을 제시합니다. 생리학적 조건을 모방하여 혈액 적합성을 효과적으로 평가합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 혈액 적합성 평가
- 생체 재료 연구
- 전임상 연구
배경
- 본 모델은 국제 표준 기구 지침을 준수합니다.
- 혈전 형성 및 항응고제 농도를 최소화합니다.
- 신선한 헤파린 처리된 인체 혈액을 사용하여 테스트합니다.
- 관류 후 혈액학적 지표를 분석합니다.
연구 목적
- 혈액 접촉 기기의 혈액 적합성을 평가합니다.
- 생체 재료 평가를 위한 간단한 방법을 제공합니다.
- 신경혈관 이식체에 대한 전임상 연구를 촉진합니다.
사용된 방법
- 신선한 헤파린 처리된 인체 혈액을 이용한 흐름 루프 모델.
- 혈액 수집을 위한 헤파린 탑재 단일관 준비.
- 다양한 혈액학적 지표 분석.
- 혈액 수집의 기준치와 결과 비교.
주요 결과
- 혈액학적 지표를 기반으로 한 혈액 적합성 평가.
- 결과 비교는 기기 성능을 나타냅니다.
- 생체 재료 연구를 위한 모델의 효과성 입증.
- 전임상 연구에 사용될 가능성 확인.
결론
- 본 프로토콜은 혈액 적합성 평가를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 더 안전한 혈액 접촉 기기 개발을 지원합니다.
- 본 모델은 다양한 생체 재료 연구에 적용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Hemocompatibility testing is a critical gatekeeper in the development of blood-contacting implants, where thrombotic or inflammatory responses can derail clinical translation. This flow loop model provides a physiologically relevant, multiparametric assessment aligned with ISO 10993-4, enabling early de-risking of stent and catheter designs. By quantifying platelet, leukocyte, coagulation, and complement activation using fresh human whole blood, it delivers predictive confidence for go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of material-blood interactions to clarify thrombogenic and inflammatory pathways.
- Operational Value: Supports functional validation of biomaterials by linking surface properties to hematologic outcomes.
- Predictive Value: Generates quantitative biomarkers (e.g., TAT, β-TG, PMN-elastase, SC5b-9) for mechanistic de-risking of implant candidates.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized, reproducible blood perfusion conditions for consistent compound or coating evaluation.
- Quantitative Output: Delivers multiparametric readouts that enable dose-response screening of anticoagulant or anti-inflammatory modifications.
- Scalability: Uses a modular flow loop design adaptable to high-throughput screening of stent variants or biomaterial libraries.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human hemodynamics at 37°C and 150 mL/min to reflect neurovascular implant conditions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical studies by preserving blood physiology through gentle handling and heparinization.
- Risk-Adjusted Advancement: Identifies coating efficacy (e.g., fibrin-heparin) in reducing coagulation activation, informing preclinical candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early biomaterial screening, assay validation, and mechanistic profiling before animal studies.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about surface-mediated blood activation using clinically relevant flow conditions.
- Screening: Enables standardized assessment of hemocompatibility across material iterations with quantitative hematologic endpoints.
- Analytics: Measures platelet consumption, leukocyte activation, coagulation (TAT), and complement (SC5b-9) to compare device performance.
- Translational Research: Uses fresh human blood to enhance physiological relevance and reduce species-specific extrapolation risk.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating diverse blood-contacting devices across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in blood-device interactions through multiparametric, pathway-specific biomarkers.
- Operational Value: Ensures standardization via ISO 10993-4 alignment, reproducible flow rates, and controlled temperature.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by predicting thrombotic and inflammatory risk prior to costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of implant designs based on hemocompatibility profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hematologic assay handling and blood sample preparation to avoid preactivation.
- Depends on perfusion infrastructure including peristaltic pumps, temperature-controlled baths, and heparinized tubing.
- Necessitates cross-team standardization for blood collection, processing, and biomarker assay execution (e.g., ELISA for TAT, SC5b-9).
- Involves adaptation considerations when testing non-neurovascular implants due to flow rate and shear stress specificity.
- Limited by the need for fresh human blood and short ex vivo viability, constraining batch size and timing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:50
Heparin-Loaded Monovette Preparation and Blood Sampling
1:44
Flow Loop Preparation
2:24
Hemocompatibility Testing
2:51
Whole Blood Count Analysis
3:25
Citrate Plasma Collection
4:05
EDTA and Citrate, Theophylline, Adenosine, and Dipyridamole (CTAD) Plasma Collection
5:19
Thrombin-Anti-Thrombin III (TAT) Quantification
6:48
Scanning Electron Microscopy (SEM) Sample Preparation
7:30
Results: Representative Hemocompatibility Testing
9:02
Conclusion
