Name: 레이저 캡처 미세 해부 및 미세 유체 qPCR을 결합하여 단일 세포의 전사 프로필을 분석: 오피오이드 의존에 대한 시스템 생물학 접근법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 학습하세요 레이저 캡처 미세 해부와 미세 유체 RT-qPCR을 결합한 단일 세포 전사체 분석법을 통해 편도체 중심핵의 뉴런, 미세아교세포 및 성상아교세포에서 유전자 발현을 정밀하게 측정하는 방법을.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

여기에 제시된 작품은 JS와 RV에 수여 NIH HLB U01 HL133360을 통해 투자되었다, JS와 EVB에 수여 NIDA R21 DA036372, T32 AA-007463 SJO의 지원을 위해 얀 후크에 수여.

이 연구는 토마스 제퍼슨 대학과 드렉셀 대학 의과 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 권고에 따라 수행되었다. 프로토콜은 토마스 제퍼슨 대학과 의학 IACUC의 드렉셀 대학에 의해 승인되었다.
1. 동물 모델
<ol><li>2 개의 75 mg 느린 릴리스 모르핀 황산 염 펠 릿 또는 성인 남성 Sprague-Dawley 쥐에 피하 하 게 두 개의 위약 펠 릿을 삽입 합니다.<ol>
<li>경미한 멸균 수술에 가운과 장갑을 적절히 사용하십시오. 필요한 경우 쥐 도르섬을 클리퍼로 면도합니다.</li>
		<li>동물의 눈에 수의사 연고를 바르고 있습니다. 약 20 s의 이소플루란 흡입으로 쥐를 마취시다. 마취는 의식 상실로 확인됩니다.</li>
		<li>비드 멸균 무딘 가위로 쥐 도르섬에 중간 절개를하고 비드 살균 프로브로 신체 벽에서 진피를 분리하십시오. 비드 멸균 집게로 진피 아래에 펠릿을 삽입합니다. 절개를 멸균 바늘로 닫아 봉합합니다. 참고 : 전체 절차는 쥐 당 약 5 분이 소요됩니다. 신선한 멸균 장갑은 각 쥐에 사용됩니다.</li>
		<li>수술 후 회복을 위해 쥐를 격리 케이지에 넣습니다. 심장 박동과 규칙적인 호흡 리듬을 확인하십시오. 의식이 회복 될 때까지 쥐를 관찰하십시오. 수술 후 통증을 평가하십시오.</li>
		<li>쥐를 평가 8 수술 후 시간 및 모든 12 복구 및 감염 후 시간. 그들은 완전히 수술에서 회복 될 때 코호트의 나머지와 케이지에 쥐를 배치, 약 24 시간 수술 후.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피상성 날트렉손 주사 (75 mg/kg)를 모르핀 노출 6 일 후에 G 및 철수 코호트에 제공합니다. 참고: 이 대표적인 실험에는 4개의 쥐 코호트가 있었다(그림 1참조).</li>
</ol>2. 샘플 수확
<ol><li>펠릿 삽입 후 6일 간 뇌를 수확하거나 날트렉손 주사 후 24시간 동안 수확하십시오.<ol>
<li>약 30 s 또는 의식 상실이 발생할 때까지 이소플루란 챔버에 동물을 배치, 운동의 부족과 감소 호흡 속도에 의해 표시.</li>
		<li>날카로운 기요틴을 사용하여 동물을 빠르게 죽이게 하십시오.</li>
		<li>동물의 두개골에서 뇌를 해부.</li>
		<li>날카로운 핸드헬드 면도기를 사용하여 제거 된 뇌에 다음과 같은 총 절개를 만듭니다 : 첫째, 소뇌를 잘라 내고 폐기하십시오. 둘째, 뇌간을 전뇌와 가로 절개를 분리합니다. 셋째, 중추 시상 절개로 전뇌 및 / 또는 뇌간을 헤미크로.</li>
		<li>전뇌와 뇌간을 금형 바닥에 3-4cm의 최적 절삭 온도 화합물(OCT)이 있는 플라스틱 조직 내장 금형에 넣습니다. 나머지 샘플은 OCT로 덮습니다.</li>
		<li>즉시 드라이 아이스와 메탄올을 포함하는 욕조에 OCT로 덮여 샘플플라스틱 조직 포함 금형을 놓습니다. 메탄올이 조직 내장 곰팡이에 흘러 들어가지 않도록하십시오. 조직 수집이 완료 될 때까지 메탄올 - 얼음 욕조에서 뇌 샘플과 함께 포함 곰팡이를 유지 (~ 10-15 분 최대).</li>
		<li>가능한 한 빨리 뇌 샘플을 -80°C 냉동고에 넣습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동시에 창자 샘플을 수확.<ol>
<li>급속한 참수 후, 메스로 동물의 복부에 중간 절개를하십시오.</li>
		<li>소양(cecum)을 찾아 서갈 대장과의 연결을 끊는다.</li>
		<li>세칼 내용물15mL 원뿔형 튜브에 짜냅니다.</li>
		<li>즉시 원두 튜브를 드라이 아이스에 놓고 가능한 한 빨리 -80 °C 냉동고에 넣습니다. 참고 : 소장 내용물도 부정적인 대조군과 동일한 방법을 사용하여 수집 할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 슬라이스
<ol><li>저온 중지를 사용하여 편도된 쥐 전뇌를 슬라이스합니다.<ol>
<li>-80°C 냉동고에서 전뇌로 플라스틱 임베딩 몰드를 제거하고 -20°C 저온 가에 놓습니다.</li>
		<li>임베딩 몰드에서 OCT 내장 된 hemisected 전뇌 샘플을 제거합니다. 필요한 경우 면도기를 사용하여 플라스틱 임베딩 금형의 모서리를 수직으로 슬라이스합니다. OCT를 사용하여 저온 극저온 척에 코달 코로나 슬라이스로 로스트랄에 대한 전뇌를 마운트합니다. 참고: CeA를 식별하는 해부학 적 랜드 마크는 광학 관 및 줄무아 말단을 포함한다(그림 2B). 광학 관은 광학 chiasm에서 분기하고 두뇌가 꼬리에 rostral로 슬라이스로 등측 측을 추적합니다. 때 광학 관은 쥐 두뇌 지도책 -2.12 mm10에서보인 것과 유사한 형태학이 있을 때, 시험 조각은 현미경의 밑에 볼 수 있습니다. 광학 관 및 stria 말단 의 형태는 쥐 두뇌 지도책(10)에서 bregma 및 CeA가 줄무늬 단자 포위하는지 여부를 확인하기 위하여 검사될 수 있습니다.</li>
		<li>CeA를 포함하는 단면도에 도달할 때까지 편수된 전뇌 로스트랄에서 꼬리까지 10 μm 두께의 관상 동맥 부분을 슬라이스합니다. 참고: 단면의 너비와 높이는 약 200mm입니다.</li>
		<li>일반 유리 슬라이드에 10 μm 섹션을 해동하여 CeA 또는 바람직한 뇌 영역을 포함하는 10 μm 섹션을 수집합니다. 즉시 유리 슬라이드를 드라이 아이스 위에 놓는 금속 팬에 놓습니다. 가능한 한 빨리 -80 °C 냉동고에 뇌 섹션슬라이드를 넣어. 참고: 동일한 슬라이드에 여러 조각을 배치할 수 있습니다. 동일한 슬라이드의 슬라이스에 대해 다른 세포 유형 얼룩을 사용하는 경우, 소수성 펜을 사용하여 슬라이드에서 세포 유형 별 항체 용액을 분리할 수 있도록 슬라이스 사이에 약 100mm를 둡니다. 슬라이스의 각 측면에 슬라이드의 가장자리에서 약 20mm를 둡니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 면역 형광 염색
<ol><li>면역형광을 사용하여 선택한 뇌 세포(예: 뉴런, 미세글리아, 성상세포 등)에 대한 전뇌 부분을 염색합니다.<ol>
<li>-80°C 냉동고에서 CeA의 10 μm 섹션으로 하나 이상의 슬라이드를 제거합니다.</li>
		<li>30s에 75% 에탄올로 슬라이드를 고정합니다.</li>
		<li>1x 인산완충염 (PBS)에서 2 % 소 혈청 항원 (BSA)으로 30 s의 슬라이스를 차단합니다. PBS로 1x를 씻으소서.</li>
		<li>슬라이드에 1차 항체 용액을 2분 동안 추가합니다. 2% BSA 용액으로 1x세척하십시오. 참고: 1차 항체 용액은 위의 차단 단계에 대해 2% 1차 항체, 1% RNase Out 및 동일한 BSA PBS 용액의 96%로 구성된다(단계 4.1.3). 대표적인 실험은 항-NeuN 항체, 항-Cd11β 항체 및 항-GFAP 항체를 다음과 같은 수량으로 사용하였다: 1차 3 μL, RNA 억제제의 1.88 μL, 및 BSA 용액의 145.12 μL.</li>
		<li>이차 항체 용액을 슬라이드에 3 분 동안 추가하십시오. PBS로 1x 씻어. 참고: 이차 항체 용액은 염소 항 마우스 488 nm 형광 태그(1:500), RNA 억제제 2.5 μL, DAPI 1.3 μL(1:10,000), 및 2% BSA의 196.5 μL로 구성된다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 에탄올 과 자일렌 탈수 시리즈
<ol><li>슬라이드를 30초 동안 75% 에탄올에 담그고, 슬라이드를 30초 동안 95% 에탄올로 담근 직후, 슬라이드를 30초 동안 100% 에탄올로 찍어 30초 동안 100% 에탄올을 넣은 후, 슬라이드를 30초 동안 100% 에탄올을 함유한 두 번째 용기에 담급깁니다.</li>
	<li>에탄올 탈수 시리즈에 이어, 슬라이드를 갓 붓고 자일렌에 1 분 동안 담그고 즉시 슬라이드를 자일렌의 두 번째 용기에 4 분 동안 담급입니다.</li>
	<li>자일렌 욕조에서 슬라이드를 제거하고 5 분 동안 어둠 속에서 공기건조시키십시오.</li>
	<li>슬라이드를 건조기에서 5분 간 더 건조시도록 놓습니다.</li>
</ol>6. 레이저 캡처 미세 해부
<ol><li>얼룩이 진 경우, 현미경으로 슬라이드를 배치하고 해부학 적 랜드 마크 (즉, 광학 치아와 줄무늬 말단)를 사용하여 관심 영역 (CeA)을 찾습니다.</li>
	<li>관심 있는 지역에서 염색된 세포 모형 및 그것의 핵을 확인하기 위하여 형광을 이용하십시오. 단일 셀 풀백 샘플을 수행하는 경우 하나의 셀 또는 여러 셀을 선택합니다. LCM 소프트웨어를 사용하여 관심 있는 셀을 표시합니다.</li>
	<li>LCM 캡을 관심 영역의 슬라이스 위에 놓습니다.</li>
	<li>적외선(IR) 레이저의 테스트 샷을 사용하여 IR 레이저 강도, 크기 및 지속 시간을 조정하여 LCM 캡 접착제가 선택한 단일 셀의 영역에만 녹도록 합니다. 이렇게 하면 선택한 셀 이외의 다른 셀이 수집되지 않습니다. 참고: 본 대표적인 실험에서, 동일한 세포 유형의 10개의 세포 풀은 동일한 처리를 가진 견본 사이 유전자 발현에 있는 세포 간 가변성을 제한하기 위하여 단 하나 견본으로 이용되었습니다. 그러나, 이 방법은 진정한 단세포 실험1,3에사용될 수 있다.</li>
	<li>LCM 소프트웨어 도구를 사용하여 분석을 위해 수집할 개별 셀을 선택합니다(그림2C). 선택된 세포는 쥐 뇌 지도10 및 bregma10에기초하여 CeA (또는 선택의 뇌 영역)의 해부학 영역에 있어야 합니다. 세포는 인접한 염색된 핵으로부터 적어도 3 μm이어야 한다.</li>
	<li>식별된 단일 셀을 수집하기 위해 IR 레이저를 발사합니다.</li>
	<li>품질 관리(QC) 스테이션에 캡을 놓고 원하는 셀만 선택되었는지 확인합니다. 다른 세포가 실수로 선택된 경우, 캡이 QC 스테이션에 남아있는 동안 자외선 레이저를 사용하여 원치 않는 세포를 파괴 할 수 있습니다.</li>
	<li>세포가 수집 된 곳에서 조직 섹션의 사진을 찍어 해부학 적 특이성을 문서화하십시오. 쥐 뇌 아틀라스를기준(10)으로사용하여 적절한 경우 bregma로부터 슬라이스의 거리를 기록한다.</li>
	<li>QC 스테이션에서 LCM 캡을 제거하고 샘플 추출 장치를 부착하고 샘플에 5.5 μL의 포염 버퍼를 피펫합니다. 참고: 용해 완충액은 0.5 μL의 용해 증강제와 5 μL의 재서스펜션 버퍼로 구성됩니다.</li>
	<li>ExtracSure 장치를 0.5 mL 미세 원심 분리기 튜브에 장착하고 핫플레이트에 15 분 동안 75 °C에 놓습니다.</li>
	<li>샘플 및 용해 버퍼를 저속(0.01-0.02 x g)에서30s로 회전시키고 수집된 샘플을 -80°C 냉동고에 넣습니다.</li>
</ol>7. 단세포 미세 유체 RT-qPCR
<ol><li>96.96 동적 어레이 칩용 단일 셀 mRNA의 전암화<ol>
<li>전암화(각 프라이머 500 nM 농도)를 위한 프라이머 풀에서 분석되는 모든 유전자에 대해 전진 및 역방향 mRNA qPCR 유전자 프라이머를 결합한다. 예를 들어, 80 μL에서 100 μM 프라이머의 1 μL 플러스 DNA 현탁액 완충액의 120 μL. 참고: 대표적인 실험에 사용되는 프라이머 서열은 O'Sullivan 등에서 찾을 수있습니다. 4.</li>
		<li>새로운 96 x 96 PCR 플레이트에 각 웰에 5x VILO 1 μL을 추가합니다.</li>
		<li>-80°C에 저장된 샘플에서 LCM 단일 세포 샘플을 제거하고, 짧은 해동을 하고, 원심분리기를 저속(0.01-0.02 x g)으로짧게 하고, 용해된 단일 세포 샘플의 5.5 μL을 PCR 플레이트에 추가합니다. 각 샘플은 자체 웰에 추가됩니다.</li>
		<li>샘플과 VILO가 있는 PCR 플레이트를 열전자전거에 넣고 65°C에서 1.5분 동안 가열합니다. </li>
		<li>10x cDNA 합성 마스터 믹스의 0.15 μL, 0.12 μL T4 유전자 32 단백질, 및 0.73 μL의 DNA 현탁액 완충액을 각각 잘 첨가합니다.</li>
		<li>PCR 플레이트를 열전도에 넣고 다음 프로토콜을 실행합니다: 5분 동안 25°C, 30분 동안 50°C, 25분 동안 55°C, 5분 동안 60°C, 10분 동안 70°C, 4°C에서 끝까지 실행한다.</li>
		<li>각 우물에 7.5 μL의 타크 폴리머라제 마스터 믹스를 추가합니다.</li>
		<li>프라이머 풀의 1.5 μL을 각 우물에 추가합니다(위 참조).</li>
		<li>PCR 플레이트를 열병기에서 놓고 다음과 같은 전암화 프로토콜을 실행합니다: 95°C에서 10분 동안, 5초 동안 96°C의 22 사이클, 60°C를 4분 동안 실행합니다.</li>
		<li>엑소뉴클레아제 I 반응 완충액 10x, 1.2 μL 외핵구 I, 및 4.2 μL의 DNA 현탁액 완충액을 각각 잘 첨가한다.</li>
		<li>PCR 플레이트를 열전도사이클러에 놓고 다음 프로토콜을 실행합니다: 37°C에서 30분, 80°C에서 15분.</li>
		<li>각 우물에 TE 버퍼 54 μL을 추가합니다. PCR 플레이트를 1,300 x g에서 5분간 회전시. 다음 단계로 즉시 계속하면 4°C에서 보관하십시오. 다음 단계를 위해 12시간 이상 기다리는 경우 -20°C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>96.96 동적 어레이 칩용 샘플 플레이트를 준비합니다.<ol>
<li>새로운 96 웰 PCR 플레이트에 20x DNA 결합 염료의 0.45 μL과 낮은 ROX 마스터믹스의 4.55 μL을 각 웰에 추가합니다.</li>
		<li>각 우물에 3 μL의 미리 증폭 된 샘플을 추가하고 PCR 플레이트를 1,300 x g에서돌린 다음 얼음위에 접시를 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>96.96 동적 배열 칩에 대한 분석 판을 준비합니다.<ol>
<li>새로운 96 웰 PCR 플레이트에서, 2x GE 분석 로딩 시약의 3.75 μL및 1.25 μL의 DNA 현탁액 버퍼를 각각의 웰에 추가합니다.</li>
		<li>각각의 해당 웰에 2.5 μL의 10 μM qPCR 프라이머를 추가합니다. PCR 플레이트를 1,300 x g에서 5분 동안 돌이내게 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>96.96 동적 어레이 칩을 로드하고 실행합니다.<ol>
<li>제어 라인 유체로 칩을 프라이밍합니다.</li>
		<li>IFC 컨트롤러 HX에 칩을 놓고 프라임(136X) 스크립트를 실행합니다.</li>
		<li>96.96 동적 어레이 칩의 해당 샘플 웰에 PCR 샘플 플레이트의 샘플 6 μL을 추가합니다.</li>
		<li>96.96 동적 어레이 칩에서 PCR 분석 판에서 샘플의 6 μL을 해당 분석 우물에 추가합니다.</li>
		<li>바늘을 사용하여 96.96 다이나믹 어레이 칩의 우물에 기포를 터뜨립니다.</li>
		<li>96.96 동적 어레이 칩을 IFC 컨트롤러 HX에 넣고 로드 믹스(136x) 스크립트를 실행합니다.</li>
		<li>IFC 컨트롤러 HX에서 칩을 제거하고 보호 스티커를 벗기고 96.96 동적 어레이 칩을 미세 유체 RT-qPCR 플랫폼에 넣습니다. GE Fast 96 x 96 PCR 프로토콜(30사이클)을 실행합니다. 참고: 결과의 RNA 질 그리고 타당성은 젤 전기 영동을 통한 분석 검증, 용융 온도 곡선, 견본 및 분석 법 복제 및 표준 희석 계열 플롯을 포함하여 다중 방법에 의해 평가됩니다. 추가적으로, 전사 사실 인정은 서쪽 얼룩 및 면역 형광 분석법을 포함하여 두뇌 hemisection에 독립적인 방법에 의해 유효할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>8. 미세 유체 RT-qPCR로 세균 풍부도 측정
<ol><li>대변 DNA 추출 키트의 지시에 따라 세균 DNA를 추출합니다.</li>
	<li>qPCR을 사용하여 세균 DNA 농도를 추정합니다.</li>
	<li>추출된 박테리아 DNA를 새 PCR 플레이트에 추가합니다. 추출된 세균 DNA 1 μL과 9 μL의 DNA 서스펜션 버퍼를 첨가합니다.</li>
	<li>48.48 동적 배열 칩에 대한 분석 판 준비(단계 7.2.1-7.2.2 참조)</li>
	<li>48.48 동적 어레이 칩에 대한 샘플 플레이트 준비(단계 7.3.1-7.3.2 참조)<ol>
<li>새로운 96웰 PCR 플레이트에 20x DNA 결합 염료0.45 μL과 48개의 웰에 낮은 ROX 마스터믹스 4.55 μL을 추가합니다.</li>
		<li>세균 DNA를 함유한 PCR 플레이트에서 시료 3 μL을 48개의 웰에 넣고 PCR 플레이트를 1,300 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>48.48 동적 어레이 칩을 로드하고 실행합니다(단계 7.4.1-7.4.7 참조).</li>
</ol>

<ol><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+drive+cell+phenotype+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Inputs drive cell phenotype variability.</a> Genome Research. 24, 930-941 (2014).</li>
<li>Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+functional+gene+regulatory+network+phenotypes+underlying+single+cell+transcriptional+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Transcriptional+Analysis+Reveals+Novel+Neuronal+Phenotypes+and+Interaction+Networks+Involved+in+the+Central+Circadian+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Glia+and+Neuron+Gene+Expression+in+the+Central+Amygdala+in+Opioid+Withdrawal+Suggests+Inflammation+With+Correlated+Gut+Dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).</li>
<li>Buettner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+analysis+of+cell-to-cell+heterogeneity+in+single+cell+RNA-sequencing+data+reveals+hidden+subpopulations+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells.</a> Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).</li>
<li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunolology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).</li>
<li>SEQC/MAQC-III Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+RNA-seq+accuracy%2C+reproducibility+and+information+content+by+the+Sequencing+Quality+Control+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium.</a> Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).</li>
<li>Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+inflammation+and+dysbiosis+in+human+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease.</a> Physiological Reports. 5, (2017).</li>
<li>Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysbiosis+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Dysbiosis in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 53, 1-4 (2004).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%3A+Hard+Cover+Edition%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition</a>. , (2006).</li>
</ol>

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

단세포 생물학은 세포 표현형의 이질성과 조직 기능의 견고성을 입증했습니다. 이 사실 인정은 거시와 마이크로 규모 둘 다에 생물학 시스템의 조직에 통찰력을 제공했습니다. 여기서, 우리는 비교적 저렴한 비용으로 해부학적 특이성 및 전사 정확도를 제공하는 단일 세포 전사체 측정을 얻기 위해 LCM 및 미세 유체 qPCR이라는 두 가지 방법의 조합을설명한다(도 1). 우리 그룹은 시스템 생물학 접근법을 취하고 종종 동일한 동물의 여러 조직을 측정합니다. 우리는 생물학 시스템이 전사 수준에서 각종 도전에 어떻게 반응하는지 결정하는 데 유연하고 유익한 이 방법을 찾아내십시오. 추가적으로, 우리는 기준선 조건에 있는 셀 방식 표현형의 해부학 매핑에서 이 방법을 이용합니다.
우리는 CeA가 오피오이드 의존성과 철수에 어떻게 반응하는지 탐구하는 최근 간행물의 데이터 및 수정 된 수치를 제공합니다4. ...

단일 세포의 유전자 발현 프로파일을 측정하는 것은 조직 내에서 광범위한 표현형 이질성을 입증하였다. 이 복잡성은 조직 기능을 통제하는 생물학 네트워크의 우리의 이해를 복잡하게 했습니다. 우리 그룹과 다른 사람들은 많은 조직과 조건에서이 현상을탐구했다1, 2,3,4,5,6. 이러한 실험은 유전자 발현 네트워크의 조절이 이러한 이질성의 근간을 이룬다는 것을 시사할 뿐만 아니라, 단일 세포 분해능이 조직 수준의 분해능이 인식되지 못하는 조직 기능의 복잡성을 드러낸다. 실제로, 세포의 단지 작은 소수민족은 특정 조건 또는 도전에 반응할 수 있습니다, 그러나 전반적인 생리학에 그 세포의 충격은 실질적일지도 모릅니다. 또한 다중 세포 유형 및 조직에서 고차원 데이터 세트에 다변량 방법을 적용하는 시스템 생물학 접근법은 시스템 전반의 치료 효과를 해명할 수 있습니다.
우리는 이러한 데이터 세트를 얻기 위해 LCM 및 미세 유체 RT-qPCR을 결합합니다. 우리는 형광 활성화 세포 선별 (FACS)를 통해 단 하나 세포를 집합하고 RNA 염기서열 분석 (RNA-seq)를 사용하여 그들의 전사체를 측정하는 것과는 대조적으로 여기에서 이 접근을 취합니다. FACS에 비해 LCM의 장점은 단일 세포의 정확한 해부학적 특이성을 LCM으로 비교적 그리고 절대적으로 문서화할 수 있다는 것입니다. 또한, RNA-seq는 RT-qPCR, 미세유체 RT-qPCR이 저렴하고 더 높은 감도 및 특이성을 가지는 더 많은 특징을 측정할 수 있는 반면7.
이러한 대표적인 실험에서, 우리는 편도체(CeA) 및 장내 미생물 풍부의 중앙 핵에서 쥐 신경, 마이크로글리아 및 성상세포 유전자 발현에 대한 오피오이드 의존성 및 날트렉손 침전된 오피오이드 의 효과를조사하였다 4. 4개의 처리 단을 분석하였다: 1) 위약, 2) 모르핀, 3) 날트렉손, 및 4) 철수(도 1). 우리는 오피오이드 의존성이 유전자 발현을 실질적으로 변경하지 않았다는 것을 발견했지만, 오피오이드 금단은 특히 선동적인 유전자, Tnf의 발현을 유도하였다. 성상 세포는 가장 영향을 받는 세포 유형이었다. 장내 미생물군유전체는 오피오이드 인출에 의해 심오하게 영향을 받았는데, 이는 장이뇨증8,9의확립된 마커인 박테로이드 비율에 대한 Firmicutes의 감소에 의해 나타났다.

<table><tbody><tr><td>20X DNA 결합 염료</td><td>Fluidigm</td><td>100-7609</td><td>NA</td></tr><tr><td>2x GE 분석 로딩 시약</td><td>Fluidigm</td><td>85000802-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>48.48 유전자 발현을 위한 동적 어레이 IFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-48.48</td><td>NA</td></tr><tr><td>96.96 유전자 발현을 위한 동적 어레이 IFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anti-CD11&beta; 항체</td>: <td>Genway Biotech</td>, <td>CCEC48</td>, <td>Microglia Stain,</td></tr><tr><td>Anti-NeuN 항체, 클론: A60</td>, <td>EMD, Millipore</td>, <td>MAB377</td>, <td>신경 세포, 염색,</td></tr><tr><td>ArcturusXT, 레이저 캡처 미세해부 시스템</td>, <td>Arcturus</td><td>NA</td><td></td></tr>, NA, <tr><td>Biomark, HD</td><td>, Fluidigm,</td><td>NA</td>, <td>RT-qPCR 플랫폼</td></tr>, <tr><td>소 혈청, 항원</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>CapSure 매크로 LCM 캡</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LCM0211</td><td>NA</td></tr><tr><td>CellDirect 원스텝 qRT-PCR 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11753500</td><td>용해 완충액 용액 구성 요소</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>DNA 현탁액 완충액</td><td>TEKnova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>엑소뉴클레아제 I</td><td>New Englnad BioLabs, Inc.</td><td>M0293S</td><td>NA</td></tr><tr><td>ExtracSure 샘플 추출 장치</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LCM0208</td><td>NA</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td>일반 유리 슬라이드</td></tr><tr><td>GeneAmp 얇은 벽 반응관</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8010611</td><td></td></tr><tr><td>GFAP 단클론 항체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21294</td><td>성상세포 염색</td></tr><tr><td>염소 안티-마우스 IgG (H+L), Superclonal&trade; 재조합 2차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A28175</td><td>Seconadry 항체</td></tr><tr><td>IFC 컨트롤러</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA RNaseOut</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox</td><td>Bio-Rad</td><td>PN 172-5211</td><td>Rox master mix</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td><td>ThermoFisher 과학</td><td>11754250</td>에는 <td>VILO 및 SuperScript</td></tr><tr><td>T4 유전자 32 단백질</td>이 포함되어 있습니다<td>.</td><td>M0300S</td><td></td></tr><tr><td>NA TaqMan 프리앰프 마스터 믹스</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4391128</td><td>NA</td></tr><tr><td>TE 버퍼</td><td>TEKnova</td><td>T0225</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

레이저 캡처 미세 해부 및 미세 유체 qpcr을 결합하여 단일 세포의 전사 프로필을 분석: 오피오이드 의존에 대한 시스템 생물학 접근법

Combining Laser Capture Microdissection and Microfluidic qPCR to Analyze Transcriptional Profiles of Single Cells: A Systems Biology Approach to Opioid Dependence

해부학적으로 인접한 단일 세포에서 심오한 전사 이질성은 강력한 조직 기능이 세포 표현형 다양성에 의해 달성될 수 있음을 시사한다. 생물학적 시스템의 네트워크 역학을 조사하는 단세포 실험은 생물학적으로 의미 있는 해상도에서 다양한 조건에 대한 세포 및 조직 반응을 입증합니다. 본 명세서에서, 우리는 해부학적으로 특정 한 위치에서 단 하나 세포를 집합하고 정확하게 그들의 유전자 발현 단면도의 부분 집합을 측정하기 위한 우리의 방법을 설명합니다. 우리는 레이저 포획 미세 해부 (LCM)와 미세 유체 역 전사 정량 중합효소 연쇄 반응 (RT-qPCR)을 결합합니다. 우리는 또한 이 미세 유체 RT-qPCR 플랫폼을 사용하여 장 내용물의 미생물 풍부를 측정합니다.

단일 세포의 선택은 시각적으로 그리고 분자적으로 모두 검증되었다. 시각적으로, 세포 형태는 세포 수집 전에 볼 수 있었다. 수집된 세포는 QC 스테이션및 세포핵 얼룩(DAPI)에서 단일 세포 선택 마커 형광과 중첩된 후 볼 수 있었다. 그림 2A는 CeA를 포함하는 척랫래전뇌를 가진 슬라이드의 대표적인 이미지를 나타낸다. 후속이미지(도 2B-D)는전사분석을 위한 단일 세포 및 이들의 제거를 조직으로부터의 선택과 보여준다. 분자적으로, 세포 유형 별 마커는 그 세포 유형에서 증가된 발현을 입증하였다(도1C). 뉴런, 마이크로글리아, 성상세포를 살펴보고 NeuN, Maf및 Gfap의</e...

이 프로토콜은 레이저 포획 미세 분면을 사용하여 높은 정확도와 해부학 적 특성으로 편도체의 중앙 핵에서 단일 뉴런, 마이크로 글리아 및 성상 세포를 수집하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 우리는 이 세포의 전사체의 부분 집합을 측정하기 위하여 미세 유체 성 RT-qPCR의 우리의 사용을 설명합니다.

레이저 캡처 미세 해부 및 미세 유체 qPCR을 결합하여 단일 세포의 전사 프로필을 분석: 오피오이드 의존에 대한 시스템 생물학 접근법

Profound transcriptional heterogeneity in anatomically adjacent single cells suggests that robust tissue functionality may be achieved by cellular ...

이것은 단 하나 세포 수준에서 유전자 발현을 이해하기 위한 매우 정확하고 비용 효과적인 방법입니다. 이 기술의 주요 장점은 96개의 샘플을 한 배치로 맞출 수 있다는 것입니다. 이 샘플의 높은 수는 우리가 해부학 특이성을 가진 세포 형형을 식별 할 수 있습니다.이 방법의 파이프라인은 질병 또는 다른 장애, 어떤 기능에 개별 뉴런 또는 다른 세포 유형의 개별 세포 반응에 대해 문의하기 위해 모든 생물학적 문제, 모든 시스템, 모든 조직에 적용 될 수 있습니다. 그리고 그 세포 반응이 해부학적 아키텍처를 가지고 있는지 여부를 더 나아가 문의하십시오. 조직 수집 상자에서 뇌를 제거하고 극저스트척에 놓습니다.일반 유리 슬라이드에 10 미크로네 섹션을 장착하여 편도체 또는 기타 바람직한 뇌 영역의 중앙 핵을 포함하는 10 개의 미크로네 섹션을 수집합니다. 즉시 유리 슬라이드를 마른 얼음 위에 놓는 금속 팬에 놓습니다. 가능한 한 빨리 영하 80도 냉동고에 뇌 섹션 슬라이드를 넣어.에탄올 과 자일렌 탈수 계열을 수행하려면 먼저 슬라이드를 75%에탄올로 30초 간 담급하십시오. 바로 후 슬라이드를 95%에탄올로 30초 간 찍어 보세요. 그런 다음 슬라이드를 100% 에탄올에 30초 간 담급합니다.마지막으로 슬라이드를 100%에탄올의 두 번째 용기에 직접 찍어 30초 간 담급합니다. 에탄올 탈수 계열에 이어 슬라이드를 갓 부어 자일렌에 1분간 담급드세요. 즉시 슬라이드를 자일렌의 두 번째 용기에 4분 간 담근 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 건조합니다.형광을 사용하여 관심 영역에서 염색 된 세포 유형 과 핵을 식별하십시오. 단일 세포 풀렉션 샘플을 수행하는 경우 하나의 셀 또는 다중 셀을 선택합니다. 레이저 포획 마이크로 절또는 LCM 소프트웨어를 사용하여 관심 있는 세포를 표시합니다.LCM 캡을 관심 영역의 슬라이스 위에 놓고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 선택한 단일 셀의 영역에 LCM 캡 접착제를 녹입니다. LCM 소프트웨어 도구를 사용하여 분석을 위해 수집할 개별 셀을 선택합니다. 선택된 세포는 쥐 두뇌 아틀라스와 bregma에 근거를 둔 편도체의 중앙 핵의 해부학 지역에 있어야 합니다.세포는 인접한 스테인드 핵으로부터 적어도 3개의 미크론이어야 한다. 그런 다음 적외선 레이저를 발사하여 확인된 단일 세포를 수집합니다. QC 스테이션에 캡을 놓고 원하는 셀만 선택되었는지 확인합니다.다른 세포가 실수로 선택된 경우, 캡이 QC 스테이션에 남아있는 동안 자외선 레이저는 원치 않는 세포를 파괴하는 데 사용할 수 있습니다. 세포가 수집된 곳에서 조직 섹션의 사진을 찍어 해부학 적 특이성을 문서화하십시오. 쥐 뇌 아틀라스를 사용하여 적절한 경우 bregma에서 슬라이스의 거리를 참조로 기록합니다.QC 스테이션에서 LCM 캡을 제거하고 샘플 추출 장치를 연결합니다. 그런 다음 샘플에 리시스 버퍼링5.5 마이크로리터를 피펫합니다. 추출 장치를 0.5 밀리리터 미세 센심 분리기 튜브에 맞추고 15 분 동안 섭씨 75도의 핫 플레이트에 놓습니다.시료와 리시스 버퍼를 저속으로 30초 동안 회전시키고 수집된 샘플을 섭씨 80도의 냉동고에 넣습니다. 동적 어레이 칩에 대한 단일 셀 mRNA의 사전 증폭을 수행하기 위해 먼저 새로운 96 x 96 PCR 플레이트의 각 웰에 5X VILO의 5 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 영하 80도에서 LCM 단세포 샘플을 제거하고 잠깐 해동시키십시오.낮은 속도로 원심분리에 따라, PCR 플레이트에 용액 단세포 샘플의 5.5 마이크로리터를 추가하여 각 샘플을 자체적으로 잘 추가합니다. 샘플과 VILO와 PCR 플레이트를 열 사이클러에 넣고 1 분 반 동안 섭씨 65도에서 가열하십시오. 그런 다음 접시를 1, 300g, 섭씨 4도에서 1분 동안 회전시키고 접시를 얼음 위에 놓습니다.각각의 웰에 10X cDNA 합성 마스터 믹스, T4 유전자 32 단백질 및 DNA 서스펜션 버퍼를 추가합니다. 샘플 플레이트인 PCR 플레이트를 열순환기에 넣고 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 실행합니다. 사이클 후 96웰 PCR 플레이트에 Taq 폴리머라제 용액 9마이크로리터를 각 웰에 추가합니다.9개의 마이크로리터는 Taq 폴리머라제 마스터 믹스의 7.5 마이크로리터와 프라이머 풀의 1.5 마이크로리터로 구성됩니다. 이제 PCR 플레이트를 열순환기에 배치하고 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 사전 증폭 프로그램을 실행합니다. 사전 증폭 프로토콜에 따라, 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 6개의 마이크로리터의 엑소뉴클레아제 용액을 첨가한다.엑소뉴클레아제 용액은 10X 엑소뉴클레아제-1 반응 완충제, 1.2 마이크로리터의 엑소뉴클레아제-1, DNA 서스펜션 버퍼4.2 마이크로리터로 구성된다. PCR 플레이트를 열순환기에 놓고 텍스트 프로토콜에 나열된 프로그램을 실행합니다. 마지막으로, 54 마이크로리터의 TE 버퍼를 각 샘플 플레이트 에 추가합니다.PCR 플레이트를 1, 300회 g에서 5분간 회전시합니다. 즉시 다음 단계로 계속하는 경우 섭씨 4도에 보관하십시오. 샘플 플레이트 2인 새로운 96웰 PCR 플레이트에 DNA 결합 염료 및 마스터 믹스 용액 5마이크로리터를 추가합니다.샘플 플레이트 1에서 미리 증폭된 시료 3개를 샘플 플레이트 2의 해당 우물에 넣습니다. PCR 플레이트를 1, 300배 g로 돌린 다음 접시를 얼음 위에 놓습니다. 분석 플레이트 2인 새로운 96웰 PCR 플레이트에 각 웰에 5개의 마이크로리터를 추가합니다.분석 로딩 솔루션은 2X GE 분석 로딩 시약의 3.75 마이크로리터와 1.25 마이크로리터의 DNA 서스펜션 버퍼로 구성되어 있습니다. 그런 다음 분석 플레이트에서 10 마이크로 몰라 qPCR 프라이머의 2.5 마이크로 리터를 분석 판 2에 해당 잘 첨가하십시오. PCR 플레이트를 1, 300회 g에서 5분간 회전시합니다.동적 어레이 칩을 로드하고 실행하려면 먼저 제어 라인 유체로 칩을 프라임합니다. 그런 다음 칩을 IFC 컨트롤러 HX에 넣고 프라임 136X 스크립트를 실행합니다. 96 by 96 동적 어레이 칩의 샘플 플레이트 2에서 6개의 마이크로리터를 해당 샘플 웰에 넣습니다.이제 96 by 96 동적 어레이 칩의 해당 분석 우물에 분석 플레이트 2의 6 마이크로 리터를 추가합니다. 96 x 96 동적 어레이 칩의 우물에 모든 기포를 팝업 바늘을 사용합니다. 그런 다음 칩을 IFC 컨트롤러 HX에 넣고 로드 믹스 136X 스크립트를 실행합니다.다음으로 IFC 컨트롤러 HX에서 칩을 제거합니다. 96 by 96 동적 어레이 칩을 미세 유체 RT-qPCR 플랫폼에 배치하고 GE 고속 96 by 96 PCR 프로토콜을 실행합니다. 단일 세포의 선택은 시각적으로나 분자적으로 모두 검증되었다. 시각적으로, 세포 형태는 세포 수집 전에 조회되었다.여기에 편도체의 중앙 핵을 포함하는 단화 된 쥐 전뇌슬라이드의 대표적인 이미지가 있습니다. 후속 이미지는 전사 분석을 위해 단일 세포의 선택과 조직에서 제거된 것을 보여줍니다. 분자적으로, 세포 유형 특이적 마커는 각각의 세포 유형에서 증가된 발현을 입증하였다.구체적으로, NeuN의 증가된 발현은 성상세포에서 뉴런, 마이크로글리아의 Maf 및 Gfap에서 관찰되었다. 열지도는 40개의 분석된 유전자에 걸쳐 모든 견본의 표정을 보여줍니다. 행은 인장 풀린 샘플이며, 숫자는 샘플 클러스터를 나타내고 컬럼은 유전자입니다.다변량 분석 방법은 철수 군의 성상세포가 가장 영향을 받는 세포 유형이었다는 것을 보여줍니다. 다른 연구의 맥락에서 이러한 데이터에 따라, 성상 세포는 가능성이 오피오이드 철수 동안 편도체의 중앙 핵에 염증에 중요한 역할을. 이 기술에 대해 기억해야 할 가장 중요한 것은 적절한 파이펫팅을 사용하여 기포 수를 제한하는 것입니다.이러한 실험에서 전사 결과는 동일한 조직에 면역 형광 또는 서양 블롯과 같은 단백질 측정 방법을 사용하여 검증 될 수있다.

combining-laser-capture-microdissection-microfluidic-qpcr-to-analyze

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

레이저 microdissection은 현지화된 RNAi를 받게 Drosophila 날개 디스크의 특정 구획에있는 유전자 발현 프로 파일링을 분석에...

레이저 Microdissection는 세포의 하위 집합 유전자 발현 프로 파일링에 적용 Drosophila 윙 디스크

이 문서에서 우리는 쥐를 기본의 연결을 문화와 아르나의 증폭을 사용하여 후속 transcriptome 분석에서 단일 세포의 수확을위한 간단한 방법을 설명합니다. 이러한 접근 방식은 모든 세포 유형에 generalizable있다.

단일 셀 Transcriptome 분석

마우스 뇌의 특정 영역별 RNA 발현 프로파일링을 위해서는 정밀하고 재현 가능한 조직 수집 전략이 필요합니다. 본 문서에서는 관상면 뇌 절단과 조직 코어러(corer) 보조 미세 절제술을 모두 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 결과 샘플에서 얻은 총 RNA의 수율과 품질은 상술한 방법의 유용성을 입증합니다.

총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법

우리는 정량 실시간 PCR 및 / 또는 전체를 게놈 microarrays를 사용하여 후속 유전자 발현 분석을위한 부상을 쥐의 뇌의 냉동 섹션에서 hippocampal 뉴런 또는 단일 뉴런의 풍부한 인구를 얻기 위해 레이저 캡처 microdissection (LCM)를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection

개별 도파민 뉴런의 단리 또는 직접 또는 간접 면역과 복측 피개 영역은 레이저 미세 절제를 캡처하여 설명된다. 적외선 레이저를 이용하여 유리 슬라이드 조직으로부터 단리 및 적외선 및 자외선 레이저의 조합을 이용하여 막 slide에서 파라미터 논의된다.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

여기에서는 전사 프로파일링을 위한 특정 식물 세포 유형의 레이저 보조 미미해부에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 종과 세포 유형에 적합하지만, 십자화과 속 Boechera에서 유성 생식 및 종말 생식에 중요한 암컷 생식세포의 접근하기 어려운 세포에 초점을 맞추고 있습니다.

개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

대량 유전자 식 측정 클라우드 개별 셀 차이 이종 세포 인구에서. 여기, 우리는 프로토콜 설명 어떻게 단일 셀 유전자 표정 분석 및 인덱스에 대 한 분류로 개화 활성화 셀 정렬 (FACS)이 윤곽을 그리 다 결합 될 수 있다 및 immunophenotypically 특성 분자로 뚜렷한 세포 인구.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

이 프로토콜은 마우스 배아의 신선한 냉동 섹션에서 연골과 뼈의 분리를 위한 레이저 포획 미세 분부를 설명합니다. 연골과 뼈는 크레실 바이올렛 염색에 의해 빠르게 시각화되고 전사분석을 위한 고품질 RNA를 산출하기 위하여 정확하게 집합될 수 있습니다.

유전자 발현 분석을 위한 마우스 배아 연골 및 뼈의 레이저 포획 미세 해부

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

레이저 포획 미세 해부와 미세 유체 RT-qPCR의 조합은 단일 뉴런 및 아교 세포에서 전사체를 측정 할 때 해부학 적 및 생물 공학적 특이성을 제공합니다. 정신 질환에 대한 시스템의 생물학적 접근 방식으로 창의적인 방법을 적용하면 중독에 대한 신경 염증 보상 가설과 같은 이해와 치료의 돌파구로 이어질 수 있습니다.

해부학적으로 특이적인 단일 세포 유전자 발현 방법을 사용한 중독 행동의 반보상 동인 조사

이 프로토콜은 레이저 캡처 미세해부를 사용하여 파라포름알데히드 고정 및 최적 절단 온도 화합물이 포함된 마우스 간 조직의 조직학적 영역에서 RNA를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 표적 하류 유전자 발현 분석을 가능하게 합니다.

RNA 분석을 위한 파라포름알데히드 고정 마우스 간 조직의 레이저 캡처 미세 해부

학습하세요 레이저 캡처 미세 해부와 미세 유체 RT-qPCR을 결합한 단일 세포 전사체 분석법을 통해 편도체 중심핵의 뉴런, 미세아교세포 및 성상아교세포에서 유전자 발현을 정밀하게 측정하는 방법을.

레이저 캡처 미세 해부 및 미세 유체 qPCR을 결합하여 단일 세포의 전사 프로필을 분석: 오피오이드 의존에 대한 시스템 생물학 접근법

더 많은 동영상 탐색