레이저 캡처 미세 해부 및 미세 유체 qPCR을 결합하여 단일 세포의 전사 프로필을 분석: 오피오이드 의존에 대한 시스템 생물학 접근법

이것은 단 하나 세포 수준에서 유전자 발현을 이해하기 위한 매우 정확하고 비용 효과적인 방법입니다. 이 기술의 주요 장점은 96개의 샘플을 한 배치로 맞출 수 있다는 것입니다. 이 샘플의 높은 수는 우리가 해부학 특이성을 가진 세포 형형을 식별 할 수 있습니다.

이 방법의 파이프라인은 질병 또는 다른 장애, 어떤 기능에 개별 뉴런 또는 다른 세포 유형의 개별 세포 반응에 대해 문의하기 위해 모든 생물학적 문제, 모든 시스템, 모든 조직에 적용 될 수 있습니다. 그리고 그 세포 반응이 해부학적 아키텍처를 가지고 있는지 여부를 더 나아가 문의하십시오. 조직 수집 상자에서 뇌를 제거하고 극저스트척에 놓습니다.

일반 유리 슬라이드에 10 미크로네 섹션을 장착하여 편도체 또는 기타 바람직한 뇌 영역의 중앙 핵을 포함하는 10 개의 미크로네 섹션을 수집합니다. 즉시 유리 슬라이드를 마른 얼음 위에 놓는 금속 팬에 놓습니다. 가능한 한 빨리 영하 80도 냉동고에 뇌 섹션 슬라이드를 넣어.

에탄올 과 자일렌 탈수 계열을 수행하려면 먼저 슬라이드를 75%에탄올로 30초 간 담급하십시오. 바로 후 슬라이드를 95%에탄올로 30초 간 찍어 보세요. 그런 다음 슬라이드를 100% 에탄올에 30초 간 담급합니다.

마지막으로 슬라이드를 100%에탄올의 두 번째 용기에 직접 찍어 30초 간 담급합니다. 에탄올 탈수 계열에 이어 슬라이드를 갓 부어 자일렌에 1분간 담급드세요. 즉시 슬라이드를 자일렌의 두 번째 용기에 4분 간 담근 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 건조합니다.

형광을 사용하여 관심 영역에서 염색 된 세포 유형 과 핵을 식별하십시오. 단일 세포 풀렉션 샘플을 수행하는 경우 하나의 셀 또는 다중 셀을 선택합니다. 레이저 포획 마이크로 절또는 LCM 소프트웨어를 사용하여 관심 있는 세포를 표시합니다.

LCM 캡을 관심 영역의 슬라이스 위에 놓고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 선택한 단일 셀의 영역에 LCM 캡 접착제를 녹입니다. LCM 소프트웨어 도구를 사용하여 분석을 위해 수집할 개별 셀을 선택합니다. 선택된 세포는 쥐 두뇌 아틀라스와 bregma에 근거를 둔 편도체의 중앙 핵의 해부학 지역에 있어야 합니다.

세포는 인접한 스테인드 핵으로부터 적어도 3개의 미크론이어야 한다. 그런 다음 적외선 레이저를 발사하여 확인된 단일 세포를 수집합니다. QC 스테이션에 캡을 놓고 원하는 셀만 선택되었는지 확인합니다.

다른 세포가 실수로 선택된 경우, 캡이 QC 스테이션에 남아있는 동안 자외선 레이저는 원치 않는 세포를 파괴하는 데 사용할 수 있습니다. 세포가 수집된 곳에서 조직 섹션의 사진을 찍어 해부학 적 특이성을 문서화하십시오. 쥐 뇌 아틀라스를 사용하여 적절한 경우 bregma에서 슬라이스의 거리를 참조로 기록합니다.

QC 스테이션에서 LCM 캡을 제거하고 샘플 추출 장치를 연결합니다. 그런 다음 샘플에 리시스 버퍼링5.5 마이크로리터를 피펫합니다. 추출 장치를 0.5 밀리리터 미세 센심 분리기 튜브에 맞추고 15 분 동안 섭씨 75도의 핫 플레이트에 놓습니다.

시료와 리시스 버퍼를 저속으로 30초 동안 회전시키고 수집된 샘플을 섭씨 80도의 냉동고에 넣습니다. 동적 어레이 칩에 대한 단일 셀 mRNA의 사전 증폭을 수행하기 위해 먼저 새로운 96 x 96 PCR 플레이트의 각 웰에 5X VILO의 5 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 영하 80도에서 LCM 단세포 샘플을 제거하고 잠깐 해동시키십시오.

낮은 속도로 원심분리에 따라, PCR 플레이트에 용액 단세포 샘플의 5.5 마이크로리터를 추가하여 각 샘플을 자체적으로 잘 추가합니다. 샘플과 VILO와 PCR 플레이트를 열 사이클러에 넣고 1 분 반 동안 섭씨 65도에서 가열하십시오. 그런 다음 접시를 1, 300g, 섭씨 4도에서 1분 동안 회전시키고 접시를 얼음 위에 놓습니다.

각각의 웰에 10X cDNA 합성 마스터 믹스, T4 유전자 32 단백질 및 DNA 서스펜션 버퍼를 추가합니다. 샘플 플레이트인 PCR 플레이트를 열순환기에 넣고 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 실행합니다. 사이클 후 96웰 PCR 플레이트에 Taq 폴리머라제 용액 9마이크로리터를 각 웰에 추가합니다.

9개의 마이크로리터는 Taq 폴리머라제 마스터 믹스의 7.5 마이크로리터와 프라이머 풀의 1.5 마이크로리터로 구성됩니다. 이제 PCR 플레이트를 열순환기에 배치하고 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 사전 증폭 프로그램을 실행합니다. 사전 증폭 프로토콜에 따라, 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 6개의 마이크로리터의 엑소뉴클레아제 용액을 첨가한다.

엑소뉴클레아제 용액은 10X 엑소뉴클레아제-1 반응 완충제, 1.2 마이크로리터의 엑소뉴클레아제-1, DNA 서스펜션 버퍼4.2 마이크로리터로 구성된다. PCR 플레이트를 열순환기에 놓고 텍스트 프로토콜에 나열된 프로그램을 실행합니다. 마지막으로, 54 마이크로리터의 TE 버퍼를 각 샘플 플레이트 에 추가합니다.

PCR 플레이트를 1, 300회 g에서 5분간 회전시합니다. 즉시 다음 단계로 계속하는 경우 섭씨 4도에 보관하십시오. 샘플 플레이트 2인 새로운 96웰 PCR 플레이트에 DNA 결합 염료 및 마스터 믹스 용액 5마이크로리터를 추가합니다.

샘플 플레이트 1에서 미리 증폭된 시료 3개를 샘플 플레이트 2의 해당 우물에 넣습니다. PCR 플레이트를 1, 300배 g로 돌린 다음 접시를 얼음 위에 놓습니다. 분석 플레이트 2인 새로운 96웰 PCR 플레이트에 각 웰에 5개의 마이크로리터를 추가합니다.

분석 로딩 솔루션은 2X GE 분석 로딩 시약의 3.75 마이크로리터와 1.25 마이크로리터의 DNA 서스펜션 버퍼로 구성되어 있습니다. 그런 다음 분석 플레이트에서 10 마이크로 몰라 qPCR 프라이머의 2.5 마이크로 리터를 분석 판 2에 해당 잘 첨가하십시오. PCR 플레이트를 1, 300회 g에서 5분간 회전시합니다.

동적 어레이 칩을 로드하고 실행하려면 먼저 제어 라인 유체로 칩을 프라임합니다. 그런 다음 칩을 IFC 컨트롤러 HX에 넣고 프라임 136X 스크립트를 실행합니다. 96 by 96 동적 어레이 칩의 샘플 플레이트 2에서 6개의 마이크로리터를 해당 샘플 웰에 넣습니다.

이제 96 by 96 동적 어레이 칩의 해당 분석 우물에 분석 플레이트 2의 6 마이크로 리터를 추가합니다. 96 x 96 동적 어레이 칩의 우물에 모든 기포를 팝업 바늘을 사용합니다. 그런 다음 칩을 IFC 컨트롤러 HX에 넣고 로드 믹스 136X 스크립트를 실행합니다.

다음으로 IFC 컨트롤러 HX에서 칩을 제거합니다. 96 by 96 동적 어레이 칩을 미세 유체 RT-qPCR 플랫폼에 배치하고 GE 고속 96 by 96 PCR 프로토콜을 실행합니다. 단일 세포의 선택은 시각적으로나 분자적으로 모두 검증되었다. 시각적으로, 세포 형태는 세포 수집 전에 조회되었다.

여기에 편도체의 중앙 핵을 포함하는 단화 된 쥐 전뇌슬라이드의 대표적인 이미지가 있습니다. 후속 이미지는 전사 분석을 위해 단일 세포의 선택과 조직에서 제거된 것을 보여줍니다. 분자적으로, 세포 유형 특이적 마커는 각각의 세포 유형에서 증가된 발현을 입증하였다.

구체적으로, NeuN의 증가된 발현은 성상세포에서 뉴런, 마이크로글리아의 Maf 및 Gfap에서 관찰되었다. 열지도는 40개의 분석된 유전자에 걸쳐 모든 견본의 표정을 보여줍니다. 행은 인장 풀린 샘플이며, 숫자는 샘플 클러스터를 나타내고 컬럼은 유전자입니다.

다변량 분석 방법은 철수 군의 성상세포가 가장 영향을 받는 세포 유형이었다는 것을 보여줍니다. 다른 연구의 맥락에서 이러한 데이터에 따라, 성상 세포는 가능성이 오피오이드 철수 동안 편도체의 중앙 핵에 염증에 중요한 역할을. 이 기술에 대해 기억해야 할 가장 중요한 것은 적절한 파이펫팅을 사용하여 기포 수를 제한하는 것입니다.

이러한 실험에서 전사 결과는 동일한 조직에 면역 형광 또는 서양 블롯과 같은 단백질 측정 방법을 사용하여 검증 될 수있다.