Name: 종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-07T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 학습하세요 정형 외 췌장 종양 생성 및 신속 소화를 통한 종양 침투 T 세포 분리 방법을. PMA와 이오노마이신으로 자극한 후 유세포 분석으로 세포내 사이토카인을 검출하여 췌장암 면역 반응을 평가합니다.

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우리는 동물 기술자 서비스 및 박사 Alzbeta Talarovicova (바트 암 연구소, 런던, 런던, 영국의 퀸 메리 대학)에게 직교 수술 중 도움을 감사드립니다. 우리는 또한 제니퍼 모튼 박사 (암 연구를위한 Beatson 연구소, 글래스고, 영국) 외과 기술에 그녀의 지도에 대한 박사 제니퍼 모튼 (Beatson 연구소, 글래스고, 영국) 외과 기술에 그녀의 지도에 대한 감사드리고 싶습니다, 박사 크리스티나 Ghirelli (바트 암 연구소, 런던, 런던, 런던, 영국의 퀸 메리 대학) 종양 소화에 대한 그녀의 조언과 박사 파비엔 맥클라나한 (바츠 암 연구소, 런던, 런던, 영국) 박사 파비엔 맥클라나한 (바츠 암 연구소, 런던, 런던, 영국) 박사 에 대한 그녀의 조언에 대한 그녀의 조언에 대한 그녀의 조언에 대한 그녀의 조언, 런던, 런던, 영국, 박사 파비엔 맥클라나한 (바츠 암 연구소, 영국, 영국) 우리는 또한 의학 연구 위원회 (MRC), 췌장암 연구 기금 (PCFR) 및 이 연구를 투자한 난소암 행동에 감사하고 싶습니다.

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췌장암의 생체내 모델은 질병 진행을 이해하고 새로운 치료 대상을 평가하는 귀중한 도구를 제공한다3. 특히 정형화 모델은4,27마우스의 큰 코호트에동시에적용될 수 있는 비용 효율적이고 재현 가능한 모델이다. 정형화 모델은 또한 종양 성장을 위한 톱니체 미세 환경 및 손상되지 않은 면역 계통을 제공하며, 피하 및 PDX 모델보다 더 적합합니다. 그러나, 우리는 면역 침윤의 몇몇 요소가 정형및 KPC 마우스, 금 표준 뮤린모델(10)사이에서 다를 수 있다는 것을 발견하였다. 이것에 대한 1개의 이유는 정형외 모형에서 보인 가속한 종양 성장일 수 있었습니다. 면역 세포 서브세트의 밀도에 있어서의 추가적인 차이는 정형및 피하 모델3,28사이에 기술되었다. 따라서, 형질전환 KPC 모델은 더 비싸고가변적인 6이지만,주요 발견은 가능한 경우 KPC 마우스의 작은 코호트에서 검증되어야 한다.
정형외과 수술을 위한 종양 세포의 제제는 프로토콜에서 중요한 단계이다. 세포는 항상 성장 및 마이코 플라즈마- 및 감염없는 로그 단계에 있어야합니다. 종양 세포 성장에 대한 우려가있는 경우 직교 수술은 연기해야합니다. 지하막의 사용은 그것 없이 세포를 주입하는 종양 발생률을 향상시키고29및 이에 따라 세포 누설을 감소시키고 따라서 peritoneal 확산27. 그러나, 일단 지하실 막에 중단, 종양 세포는 신속 하 게 주입 해야 (내 2 시간) 어떤 세포 손실을 피하기 위해. 종양을 생성하는 데 필요한 종양 세포의 수는 세포주 의존적일 가능성이 높으며, 세포 수의 범위는 또한 종점에 도달하는 시간을 결정할 수 있는 (예를 들어, 100 – 100,000에서) 시험되어야 합니다. 주사를 위해 마우스 당 1,000 개의 세포를 준비 할 때 오차 범위가있을 가능성이 높습니다. 따라서, 수술의 여러 일이 필요한 경우, 그룹의 치료는 배치 효과를 제어하기 위해 일에 걸쳐 동등하게 확산되어야한다. 대부분의 수술 단계는 환경 설정에 따라 수정할 수 있습니다. 그러나 복강에서 췌장을 교체하거나 복막을 닫을 때 지하 막을 방해하지 않도록주의해야합니다. 지하 막 누설은 급속하게 형성하고 동물을 더 일찍 희생할 필요가 있는 귀착될 수 있는 막 벽에 종양 세포 성장을 일으키는 원인이 될 수 있습니다.
이상적으로, 췌장 종양은 수확 후 빠르게 소화되고 즉시 생체 내 자극을 위해 준비되어야 한다. 그러나, 이것은 수확하는 종양의 큰 배치가 있는 경우에 가능하지 않을 지도 모릅니다, 이 경우에 종양은 얼음에 보관되고 배치에서 소화되어야 합니다. 소화 효소에 대한 노출의 유형, 농도 및 길이는모두 면역세포30,31,32에많은 수의 표면 분자에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 소화 시간은 또한 세포 사멸을 제한하기 위하여 의도적으로 짧습니다33. 소화 된 세포는 장기 저장을 위해 동결 매체에서 동결 될 수있다; 그러나 해동 시 일부 세포 손실이 발생합니다. 소화 과정은 종양 조각이 콜라게나제 배양 전에 충분히 다듬지 않고 단단한 종양 조각이 소화 후에 필터에 남아 있기 때문에 분명할 것입니다. 콜라게나아제 농도는 건강한 췌장 또는 초기 단계 종양으로 작업하는 경우 낮아질 수 있습니다. 건강한 췌장 덕트 세포를 추출에 대한 보고서는 상당히 낮은 농도를 사용34. 상피 세포 사멸의 높은 정도는 소화 동안 예상 될 수있다; 그러나, 면역 세포는 프로세스를 잘 용납 해야. 대체 방법은 유기체 성장을 위한 생존 가능한 상피 세포를 분리하는 존재(35) 또는 조직 구조를 보존하기 위해36.
자극 프로토콜에 대한 수정은 원하는 판독 및 면역 세포 분석(예를 들어, 대식세포 또는 B 세포)에 따라 용이하게 이루어질 수 있다. 범 자극 시약 PMA/요오마이신의 사용은 TCR 항원 특이성을 차별하지 않으므로 항원이 알려지지 않은 경우에 유용합니다. 그러나, IFN의 생산은 TCR약혼(37)과 밀접하게 연관되어 있으며, IFN 및 TNFα 생산 모두 PDAC 항종양반응(38)에서중요하다. PMA/요오마이신 자극은 종양 미세 환경 내의 T 세포에 의해 생성될 수도 있거나 생성되지 않을 수도 있는 사이토카인을 생성하는 T 세포의 최대 용량을 반영합니다. 내인성 생산은 자극없이 측정 될 수있다; 그러나, 레벨은 훨씬 낮거나 탐지 할 수 있습니다. T 세포를 자극 하는 대체 방법이 있다: 항 CD3/28 코팅 된 구슬, 또한 항원 또는 실제로 다른 면역 세포 인구를 필요로 하지 않는. 이 방법의 장점은 분리 방법없이 특정 T 세포 서브 세트에 의한 사이토 카인 생산의 정량화를 허용하는 것입니다. 세포 독성의 다른 마커 (그란자임 B 및 천포A), 활성 (IL-2) 또는 면역 억제 (IL-10) 또한21을첨가 할 수 있습니다. 그러나, 고품질 유동 세포 분석 항체는 모든 사이토카인 및 관심 요인을 검출하기 위하여 유효하지 않습니다. 따라서, ELISA와 같은 다른 적용이 필요한 경우 브레펠딘 A/모넨신을 포함하지 않고 자극을 수행할 수 있고, 사이토카인이 상판으로 방출될 수 있도록 한다. 그러나, 주의, 이것은 총 세포 사이토 카인 방출을 허용할 것이고 기여한 세포 집단을 결정하는 것은 가능하지 않을 것입니다.
IFNγ 생산은 항종양 T 세포 반응의 지배적특징이며, 종종 TCR 항원인식(37,38)의대용으로 사용된다. 항원 특이적 반응을 보다 정확하게 정의하는 다른 생체 내 방법은 Ovalbumin 또는 SV40과 같은 공지된 항원을 발현하는 종양 세포를 이용한다. 보편적 항원다음 T 세포 인식을 테스트하기 위해 ex vivo를 사용할 수 있거나 또는 TCR 제한 숙주 마우스와 조합하여 사용될 수 있다. 대안적으로, 항원이 알려지지 않은 경우, T 세포 클론 확장의 정량화는 벌크-TCR 염기서열 분석, 또는 최근에 는 단일 세포 TCR 염기서열분석(39,40)에의해 수행될 수 있다. 종양 내 T 세포 반응의 상태를 완전히 이해하려면, 고갈 또는 억제 수용체를 나타내는 마커도 다음을 측정해야 한다: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. 뿐만 아니라 이펙터 T 세포(CD44hi,CD62lo)의마커 및 증식 활성, Ki67+ 또는 CSFE 희석41,42,43,44. 전반적으로, 정형화 모델은 치료 전략을 빠르게 테스트하는 유용한 플랫폼을 제공하며, 특히 항종양 T 세포 반응을 조절할 수 있으며, 이는 형질전환, KPC, 마우스의 더 작은 코호트에서 검증될 수 있다.

이 방법은, T 세포 기능의 생체 분석 전을 포함하여 면역 세포 집단의 포괄적인 유동 세포 분석 분석을 위해 확립된 종양의 최소량의 세포 물질 및 후속 급속한 해리를 사용하여 정형외과 췌장 종양을 생성하는 수술적 시술부터 시작하여, T 세포 기능의 생체 분석까지의 상세한 것이다.
췌장 덕트 선암 (PDAC)은 5 년1생존 환자의 단지 8 %와 공격적인 암입니다. 환자의 20% 미만이 외과 절제술2를받을 자격이 있기 때문에, 신선한 참을성 있는 견본은 연구를 위해 쉽게 접근할 수 없고 따라서 생체 내 모형은 이 질병을 조사하기 위하여 필수적인 공구를 제공합니다. PDAC의 다중 뮤린 모델이 있습니다 : 직교, 피하, 형질전환, 정맥 및 환자 유래 이종이목 (PDX), 광범위하게 여기에 설명된 3. 여기에서 기술된 정형화 모델은 면역적격 마우스의 췌장으로 합성된 PDAC 세포를 주입할 수 있다. 이것은 야생형 또는 돌연변이 마우스의 큰 코호트에서 수행될 수 있고, 따라서 치료제의 비교를 위한 비용 효과적이고 일관된 모델을 제공한다. 중요한 것은, 정형화 모델은 종양 세포 성장을 위한 톱니체 미세 환경을 제공하고다른 4는 임상적으로 관련된 부위(예를 들어, 간)에 전이하여 피하 또는 화학적으로 유도된 모델보다 임상적으로 더 관련성이 높다. 직교 종양은 섬유아세포 및 세포외 기질 증착의 풍부를 가진 강한 desmoplastic 반응과 같은 PDAC의 중요한 특징을 표시합니다5. PDAC의 형질전환 모델은 뮤린 모델의 금 본위제이며 가장 일반적으로 사용되는 것은 췌장 별 Pdx-1-Cre 프로모터6하에서돌연변이 크라스G12D/+ 및 Trp53R172H/+를 표현하는 KPC 모델이다. 추가 KPC 및 기타 생체 내 PDAC 모델은 여기에서검토됩니다 7. KPC 마우스는 인간 PDAC6의특징을 충실하게 복제하는 질병 진행을 가진 췌장 종양을 자발적으로 개발한다. 그러나, 모든 형질전환 모형에 관해서는, 사육 프로그램은 비용이 많이 들고, 종양 진행은 가변적이고 그러므로 수시로 마우스의 큰 코호트가 필요합니다. PDX 모형은 그 때 면역 손상된 마우스에서 정형또는 더 수시로 피하로 성장되는 환자 파생한 종양 세포 또는 조각을 이용합니다. Xenograft 모델은 치료 화합물을 스크리닝하는 데 유용한 도구를 제공하고 환자 이질성을 고려합니다. 그러나, 그들은 완전한 면역 미세 환경을 제공하지 않으므로8,9.
일단 확립되면, 정형외 종양은 전형적으로 (사용된 세포주에 따라) 성장하고 진행을 추적하고 치료효능을결정하기 위해 초음파 또는 MRI에 의해 쉽게 영상화될 수 있는 큰 종양을 형성하는 데 약 1개월 이상이 소요된다4,5,10. 그러나, 일단 기하급수적으로 성장하면, 종양 성장의 마지막 단계가 급속할 수 있으므로 대부분의 치료 요법은 비교적 일찍 (예를 들어, 14 일)11,12. 면역 계통은 PDAC를 포함하여 종양 발달에 중요한 역할을 하며, 이는 T 세포의 상대적 빈약과 골수성 세포의 빈번한 존재와 함께 침투하는 면역억제 종양을 특징으로 한다13. PDAC에 있는 T 세포의 높은 존재는 더 나은예후를 수여합니다 14,15. 그러나, 단일 제제로서, 항-CTLA-416 및 항-PD-L117과같은 T 세포 면역억제를 완화시키는 면역 체크포인트 억제제는, PDAC 환자에서 임상적 이점을 나타내지 않았으며, 전체 적인 T 세포 반응성이 매우 낮기 때문이다. 그러나, 항CD40과 같은 주요 T 세포 반응을 나타내는 제제는, 항-PD-L1/CTLA-4저항성 18,19 및 백신 접종을 GM-CSF 분비 동종 PDAC 백신(GVAX)으로 극복할 수 있으며, 이는 PDAC종양(20)의면역원성을 증가시킬 수 있으며, 이는 T 세포 반응을 강화하는 것이 중요한 치료 적 길을 형성한다는 것을 나타낸다.
항종양 T 세포 반응에 중요한 것은 T 세포 수용체 (TCR)를 통해 종양 유래 항원의 인식과 세포 독성 사이토 카인 및 과립의 후속 생산이다. T 세포 항원 인식은 TCR 염기서열 화에 의해 결정될 수 있지만, 이러한 접근법은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요된다. 그러나, 종양 침투 T 세포 서브세트의 정량화는 항종양 반응의 좋은 표시를 제공한다. 탈과립, 사이토카인 생산 및 기타 세포 독성 인자의 관점에서 T 세포 활성 ex vivo의 추가 검사는 더 깊은 기능적 분석을 제공한다. 이러한 분석은 신선한 종양 샘플에서 수행될 수 있으며 T 세포 기능의 많은 매개 변수는 유세포 측정에 의해 빠르게 측정될 수 있다.
CD8+ 및CD4+ T 세포는 면역 반응을 약하게 하기 위해 IFNγ 및 TNFα 와 같은 사이토카인을생성한다(21). IFN은 표적 세포에 대한 MHCI 상향 조절을 유도하고, 면역 세포의 분화 및 모집을 유도하며, 세포 사멸을 돕습니다. IFNγCD8+ T 세포에 의한 생산은 항종양 반응의 일부가 되는 것을 잘 특징으로 하며 종양회귀(22,23)와상관관계가 있다. TNFα는CD8+ 및CD4+ T 세포 모두에 의해 생성된 또 다른 전염증성 사이토카인이다. 그것은 TCR 의존적 활성화 및 T 세포의 증식을 향상시켜 항 종양 반응을 돕습니다. TCR 결합 시, 세포독성CD8+ T 세포는 탈과립을 겪을 수 있으며, 여기서 세포독성 분자를 포함하는 미리 형성된 분비 리소좀은 표적 세포 분해를 유발하기 위해 면역학적 시냅스내로방출된다(21). 이 분자는 표적 세포막에 결합하는 단백질인 Perforin을 포함하며, 그 후 막 무결성을 방해하고 그란자임 B와 같은 다른 세포독성 분자의 확산21 또는 내분비증24를 표적 세포의 세포질로 직접 침투시키는 모공을 형성합니다. Granzyme B는 표적 세포 내의 다중 단백질의 분해를 제정하는 프로테아제이며, 세포사멸(21)을초래한다. 이러한 분자의 방출은 세포 표면에 내인성의 외세포증을 필요로하며, 여기서 내인성 마커 CD107a (LAMP-1라고도 함)는 세포막25에일시적으로 통합된다.
T 세포에 의한 사이토카인 분비의 측정은 많은 수의 샘플에서 동시에 쉽게 수행 할 수없는 유동 보조 세포 선별 또는 비드 기반 분리 측정법에 의해 격리가 필요합니다. 그러나 세포내 사이토카인의 측정은 사전 절연 단계를 필요로 하지 않으며 한 번에 여러 샘플에서 쉽게 수행될 수 있으므로 처리량이 높은 접근 방식을 사용할 수 있습니다. 사이토카인이 T 세포에 의해 급속히 분비되기 때문에 세포 내 수준은 탐지할 수 없으므로 T 세포는 기저 사이토카인 생산을 증가시키기 위해 자극을 필요로 합니다. 항원 구동 사이토카인 생산을 평가하기 위해, TCR에 의해 인식된 항원시험관내 프라이밍 APC에 의해 T 세포에 제시되어야 한다. 항원 특이성이 알려져 있지 않은 경우에, 광범위한 자극 접근이 요구됩니다. TCR 자극은 사이토카인 생산 및 증식을 유도하는 TCR 활성화 및 비용 모방을 모두 제공하는 안티 CD3/28 비드를 사용하여 모방될 수 있습니다. 그러나, 더 비용 효율적인 대안은 PMA와 요오마이신의 사용, 함께 광범위 하 게 합성 및 세포 내 사이 토 카인의 릴리스로 이어질 신호 경로 활성화. 특히, PMA는 단백질 키나아제 C(PKC)를 활성화하고 이오노마이신은 세포내Ca2+ 이온을 일으켜 세포 신호화 증가를 유도합니다. 사이토카인의 세포내 함량을 보존하기 위해, 이 자극은 골지의 단백질을 차단하고 따라서 세포 외 방출을 방지하는 단백질 수송 억제제 brefeldin A 및 monensin와 효과적으로 결합될 수 있습니다. PMA/이오노마이신의 사용은 T 세포를 자극하기 위한 잘 확립된 방법이며 세포외 방출과 세포내 사이토카인26사이에 강한 상관관계가 있다. PMA와 요오마이신을 가진 T 세포의 자극은 또한 세포막에 리소좀 인신 매매를 증가시키고 이렇게 CD107a는 세포로 재활용되기 전에 세포 표면에 일시적으로 통합됩니다. 자극 동안 항 CD107a 항체를 포함시킴으로써, 탈과립활성(25)의마커로서 이를 사용할 수 있다.
이 방법은 단세포 현탁액을 제공하기 위해 종양을 빠르게 소화한다. 이 시점에서 개별 모집단은 유세포 측정을 위해 직접 염색되거나 유동 보조 세포 선별 또는 자기 비드 분리와 같은 다운스트림 방법에 의해 정제될 수 있습니다. 유세포 분석 분석을 위한 단일 세포 현탁액의 준비는 다중 면역 세포 집단 및 그들의 표현형 마커의 높은 처리량 분석을 허용하여 면역 세포 수와 표현형의 정확한 정량화를 제공합니다.
마지막으로, 여기에 기술된 소화 프로토콜은 세포 표면 마커 손실을 방지하고 면역 세포 생존능력을 유지하여 면역 세포가 필요에 따라 추가적인 세포 정화 단계및 배양을 겪을 수 있도록 합니다. 그러나,이 방법은이 소화에서 상피 세포를 유도하기 위한 테스트되지 않았습니다.

<table><tbody><tr><td>6/0 게이지 코팅 된 비크릴 흡수성 봉합사</td><td>Ethicon</td><td>W9500T</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 기공 크기 세포 여과기</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>11597522</td><td></td></tr><tr><td>9mm 클레이 아담스 클립</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015A</td><td></td></tr><tr><td>안티 CD107a PE (클론 1D4B)</td> <td>Biolegend</td><td>121612</td><td>1:100 배양 배지</td></tr><tr><td>안티 CD16 / CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>최종 희석시 사용 1:200</td></tr><tr><td>안티 CD3 PerCP eFluor710 (클론 17A2)</td> <td>Biolegend</td><td>46-0032</td><td>최종 희석 시 사용 1:50</td></tr><tr><td>anti-CD4 FITC (clone GK1.5)</td><td>eBioscience</td><td>11-0041</td><td>Use at final dilution 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103140</td><td>Use at final dilution 1:200</td></tr><tr><td>anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100738</td><td>Use at final dilution 1:100</td></tr><tr><td>anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2)</td><td>Biolegend</td><td>505826</td><td>최종 희석시 사용 1:50</td></tr><tr><td>anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (클론 MP6-X)</td><td>Biolegend</td><td>506314</td><td>최종 희석시 사용 1:50</td></tr><tr><td>BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration</td><td>BD Biosciences</td><td>354248</td><td>얼음에 부분 표본을 넣고 -20 &deg에 보관; C</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>세포 자극 칵테일 (500x) (phorbol 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA) 및 이오노마이신)</td> <td>eBioscience</td><td>00-4970-03</td><td>1x 최종 농도 PMA 0.081 &mu; M, 이오노마이신 1.34 &mu; M</td></tr><tr><td>Clay Adams Autoclip Applier</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015B</td><td></td></tr><tr><td>Clay Adams Autoclip remover</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015B</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type V from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9263</td><td>2 mg/mL in media</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고포도당(4.5g/L) L-Glutamine</td><td>PAA</td><td>E15-810</td><td></td></tr><tr><td>DNase (소 췌장 Type II-S에서 추출한 Deoxyribonuclease I) 0.15 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td>소화 매체의 최종 농도 0.025 mg/mL</td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye 506 (FVD506)</td><td>eBioscience</td><td>65-0866</td> PBS Foetal calf-serum (FCS)<td>에서 1:200에 사용</td></tr> <tr><td></td><td>GE Healthcare</td><td>A15-104</td><td>RPMI</td></tr><tr><td>에서 10%해밀턴 주사기 700 시리즈, 25 &mu; L 부피, 22s 게이지 바늘 베벨 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>10100332</td><td></td></tr><tr><td>세포 내 고정 완충액 및 세포 내 투과 완충액</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td>투과 완충액을 H2O</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>PAA</td><td>15140122</td><td>100 units/mL 페니실린, 100 &mu; g/mL 스트렙토마이신</td></tr><tr><td>단백질 수송 억제제 칵테일 (500x) (브레펠딘 A 및 모네신)</td><td>eBioscience</td><td>00-4980-03</td><td>1x 최종 농도 브레펠딘 A 10.6 &mu; M, 모넨신 2 &mu; M</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (0.3 g/L 글루타민 함유)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>수술용 메스 블레이드 No.10</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 용액 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>594-18C</td><td>트립신(0.1%) EDTA(0.4%) 최종 농도</td></tr><tr><td>U-바닥 96 마이크로웰 플레이트</td><td>VWR</td><td>734-2080</td><td></td></tr><tr><td>범용 면 팁 애플리케이터 - 6 인치 x 100</td><td>Medisave</td><td>UN982</td><td></td></tr><tr><td>V-바닥 96 마이크로웰 플레이트</td><td>VWR</td><td>735-0184</td><td></td></tr></tbody></table>

종양 침투 t 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 ex 생체 특성의 생성

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

췌장암의 생체 내 모델은 질병 역학, 면역 침투 및 새로운 치료 전략을 연구하기위한 귀중한 도구를 제공합니다. 정형외 무린 모델은 면역 적격 마우스의 큰 코호트에서 동시에 수행 될 수 있으며, 상대적으로 저렴하고 톱니 질 조직 미세 환경을 보존합니다. 정형외 종양 내의 T 세포 침투 및 세포 독성 활성의 정량화는 항종양 반응의 유용한 지표를 제공한다.
이 프로토콜은 5 μL 지하 막에서 췌장으로 직접 재중단된 적은 수의 합성 종양 세포를 주사함으로써 정형외과 췌장 종양의 외과적 생성방법을 설명한다. 정형외 종양을 낳는 마우스는 종점에 도달하는 데 약 30 일이 걸리며, 이 시점에서 종양은 종양 침투 T 세포 활성의 특성화를 위해 수확 및 처리될 수 있다. 콜라게나아제와 DNase를 이용한 빠른 효소 소화는 종양에서 단세포 현탁액을 추출하는 것을 허용합니다. 종양에서 추출된 면역 세포의 생존 가능성 및 세포 표면 마커가 보존됩니다. 그러므로, 배양 또는 RNA 추출을 위한 면역 세포의 교류 지원 세포 선별, 면역 세포 집단의 유량 세포 분석 분석을 포함하여 다중 다운스트림 신청에 적합합니다. 여기서, 우리는 전체 세포 독성의 척도로서 세포내 사이토카인 정량화(IFNγ 및 TNFα) 및 탈과립 활성(CD107a)에 대한 T 세포 집단의 생체 내 자극을 기술한다. 전체 종양 다이제스트는 5시간 동안 포르볼 마이리스테이트 아세테이트 및 요오마이신으로 자극하였고, 사이토카인 생산 및 탈과립을 업조절하기 위해 항 CD107a 항체의 존재. 마지막 4시간 동안 브레펠딘 A 및 모넨신을 첨가하여 세포외 수송을 차단하고 사이토카인 검출을 최대화하기 위해 수행되었다. 세포의 엑스트라-세포 내 염색은 유세포 분석 분석을 수행한 후, IFNγ+, TNFα+ 및 CD107a+ CD4+ 및CD8+T 세포의 비율을 정량화하였다.
이 방법은 종양 미세 환경의 포괄적인 분석을 수행하기 위한 시작 기반을 제공한다.

1000 개의 TB32048 세포를 췌장에 주입 한 후, 정형 종양은 약 30 일이 걸리며 개발합니다(도 1A, B). 수술 중 지하 막 누설은 큰 종양이 피부를 통해 눈에 띄게 보이는 각벽에 직접 형성될 수 있습니다(그림 1C). 우리는 연구 결과에서 이 마우스를 제거할 것입니다. 그러나, 좋은 수술 기술로 누설의 부각이 최소화됩니다. 종점에서 수확된 정형파종양은 C57BL/6 야생형 마우스에서 상당한 크기로 성장할 수있다(도 1D). 수확된 정형암 종양은 단세포 현탁액을 달성하기 위해 콜라게나제/DNase에서 20분 동안 소화를 필요로한다(그림 2). 이 시점에서, 종양 유래 세포는 2 x 106 세포 /well에서 U 바닥 판에 도금 될 수 있습니다. 도금된 세포의 수는 샘플 내의 T 세포의 보급에 따라 변경될 수 있다; T 세포가 고밀도인 경우 셀 수를 낮출 수 있습니다. 제어 비장 또는 림프절 샘플은 자극을 위해 이 시점에서 도금될 수 있습니다. 각각의 웰은 5시간 동안 PMA 및 요오마이신으로 자극되고 1시간 배양 후, 브레펠딘 A 및 모넨신은 사이토카인의 세포외 방출을 차단하기 위해 첨가된다(도2). 배양 후, 샘플은 유세포 분석에 의한 분석을 위해 세포외 전형및 세포내 사이토카인에 대해 염색된다(그림2).
정형외 종양을 낳은 마우스로부터의 비장 및 종양의 샘플을 유세포측정에 의해 분석하였다. 비장 및 직교 종양에 대한 유동 세포 분석분석에 사용되는 게이팅 전략은 FSC-A, SSC-A, FSC-A/FSC-H 및 SSC-A/SSC-W에 의한 이물질을 제외한 후, 죽은 세포 또는 사멸세포를 고정 가능한 생존성 염료에 대해 양성으로한다(그림 3A). 면역 세포는CD45+로그 때 게이트되고, T 세포는CD4+ 및CD8+ 서브세트가 정의되는CD3+로 더 게이트된다(도3A). 형광 마이너스 1 (FMO)는 게이팅에 대한 배경 형광을 결정하기 위해 수행되고 브레펠딘 A / monensin 만 제어는 사이토 카인의 기저 생산을 결정하기 위해 수행됩니다(그림 3B-D).
IFNγ의 경우, 브레펠딘 A/모넨신을 배양한 결과 비장 및 종양 샘플 모두에서 FMO 대조군을 통해 IFNγ가 증가하지 않았다. 그러나, PMA 및 요오마이신의 첨가는 비장 및 종양 유래CD4+ 및CD8+ T 세포 모두에서 검출가능한 세포내 IFN의%를 증가시켰다.
양성 대조군으로 사용되는 비장 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 종양-침윤 T 세포 서브세트보다 상대적으로 높은 IFNγ 생산을 가지며, 평균 6.60±1.5% 및 12.97±3.4%와 비교하여 4.81±1.0% 및 4.13±1.3% 내의 면역억제가 발생한다.(4.13±1.3% 종양 이외) 종양이 발생한다. TNFα에 대해 동일한 전략을 사용하여, 우리는 비장 CD4+ T 세포의 높은 비율이 종양 침투 CD4+ T 세포 (22.45 ±5.4 %)에 비해 세포 내 TNFα (65.93 ± 2.3%)에 대해 양성이라는 것을 시각화했습니다. 비장 및 종양 침투 CD8+ T 세포는 TNFα의 유사한 수준을 생성한다 (25.15 ± 3.7 % 및 19.91 ± 5.1 %, 각각)(그림 3C, 도 4B).
마지막으로, CD107a는 세포독성 과립 및 사이토카인의 외신방증 동안 세포 표면상에서 일시적으로 발현되는 내인성 마커이며, 이와 같이 세포독성에 대한 대리 마커로서 사용된다. 자극 동안 CD107a에 대한 염색의 이점은 모든 일시적 세포 표면 발현 CD107a가 형광 항체에 의해 포착될 것이라는 것이다. CD107a의 기저 수준은 브레펠딘 A/모넨신 만 처리된 세포에 나타내진다. 비장 CD8+ T 세포의 경우, PMA/이오노마이신을 가진 자극은 CD107a의 수준을 증가시키고,CD8+ 세포에서 가장 강한 업레귤레이션으로 23.95±3.5% CD107a+ 5.8±1.9%에 비해, 비장CD8+ 증변률을 나타냈다. 한편, 비장 및 종양 침투CD4+는 CD107a 9.37±1.5% 및 11.50±1.8%의 유사한 수준을 발현하였다(도3D 및 4C).
전반적으로 이러한 결과는 정형외 종양이 췌장으로 종양 세포의 매우 낮은 수 (1,000)의 주입으로부터 생성 될 수 있음을 강조한다. 이들 종양은 생체내 자극을 위한 T 세포의 분리를 위해 빠르게 소화될 수 있다. 세포내 사이토카인의 검출이 가능하고 이차 림프기관의 T 세포에 비해 침투 T 세포의 면역 억제의 기저 수준을 강조한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig01.jpg"> 그림 1: 정형외 췌장 종양의 생성. (A) 생체 내 실험 일정. (B)복강 내 의 직교 종양의 거시적 외관 (왼쪽) 및 종양이 표시된 절제 후 (오른쪽) 반으로 절단되었습니다. (C)수술 중 지하 막 누출의 증거는 피부 (위 사진)를 통해 볼 수있는 종양이 발생하고 각벽 (아래 사진)에 형성될 수 있습니다. (D)종점에 도달한 마우스로부터 수확한 정형외 췌장 종양 가중치(n=22). 각 데이터 포인트는 개별 마우스를 나타내고, 막대 그래프는 평균 ±SEM을 나타낸다. 이 그림의 데이터는 이전에 게시된 작업10에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig02.jpg"> 도 2: 생체 내 T 세포 자극에 대한 정형외 종양 처리의 회로도. 수확 후, 췌장 종양은 37 °C에서 20 분 동안 콜라게나아제 (2 mg / mL) 및 DNase (0.025 mg / mL)에서 빠르게 소화됩니다. 이에 따라, 세포는 완전한 RPMI 매체에서 2 x 10 6/mL에서 재중단되고 U-바닥 플레이트에서 도금된다. PMA 및 이오노마이신의 자극 칵테일이 5시간 동안 첨가되고, 이 때 항마우스 CD107a 항체는 또한 배양에 첨가될 수 있다. 1 시간 배양 후 세포 내 수송 차단제, brefeldin A 및 monensin이 첨가됩니다. 생체 내 자극 후 세포는 20 분 4 °C에 대한 고정 가능한 생존 성 염료 (PBS)로 염색을위한 V 바닥 플레이트로 전달됩니다. 세포는 FACS 버퍼로 세척하고 15 분 동안 항 CD16 /32 (FcR 블록)에서 배양 한 다음 세포 외 형광 컨쥬게이션 항체로 추가로 30 분 동안 배양합니다 (FACS 버퍼에서). 세포는 FACS 버퍼에서 다시 세척되고 20 분 동안 세포 내 고정 버퍼에서 다시 중단됩니다. 그 후, 세포는 FACS 버퍼에서 한 번 세척되고 1x 투과 버퍼에 한 번 세척됩니다. 세포는 1 시간 동안 세포 내 형광-컨쥬게이스 항체에서 RT에서 1 시간 동안 재중단된다 (1x 투과 완충제에서). 세포는 24 시간 이내에 유동 세포계에 취득FACS 버퍼에 다시 중단하기 전에 1x 투과 버퍼에 한 번 세척. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig3.jpg"> 도 3: 생체외 의 유세포분석비장-및 종양 유래 T세포를 자극하였다. (A)비장 (양성 대조군) 및 직교 종양 샘플에 사용되는 유세포 분석 게이팅 전략. 세포는 FSC-A/SSC-A를 사용하여 파편에서 구별되고 단일 세포는 FSC-A/FSC-H 및 SSC-A/SSC-W를 사용하여 더욱 단리됩니다. 죽은 세포 또는 세포 사멸 세포는 고정 가능한 생존 성 염료 -FVD506을 사용하여 제외되고 면역 세포는 CD45+에의해 게이트됩니다. 이 CD3+ T 셀 및 CD4+ 및 CD8+ 하위 집합에 따라 정의됩니다. 데이터는 BD 포르테사에서 획득되었습니다. (B)IFNγ+ CD4+ 및 CD8+ T 세포를 정량화하는 데 사용되는 게이팅 전략. 형광 마이너스 하나 (FMO) 제어는 배경 형광을 결정하기 위해 완전히 자극 샘플 (PMA / 요오마이신 / brefeldin A / monensin)에 사용됩니다. 브레펠딘 A/모넨신 전용 제어(B+M만 해당)는 기저 사이토카인 생성을 결정하는 데 사용됩니다. 완전 자극된 샘플은 IFNγ+ T 세포 %를 계산하는데 사용된다. (C)TNFα+ CD4+ 및 CD8+ T 세포를 정량화하는 데 사용되는 게이팅 전략. FMO 대조군은 배경 형광을 결정하기 위해 완전히 자극된 샘플(PMA/요오마이신/브레펠딘 A/모넨신)에 사용됩니다. 브레펠딘 A/모넨신 전용 제어(B+M만 해당)는 기저 사이토카인 생성을 결정하는 데 사용됩니다. 완전 자극된 샘플은 다음 % TNFα+ T 세포를 계산하는데 사용된다. (D)CD107a+ CD4+ 및 CD8+<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig04.jpg"> &lt;&lt;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig04large.jpg" target="_blank"></a>

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